CH638776A5

CH638776A5 - Peptides related to somatostatin

Info

Publication number: CH638776A5
Application number: CH360879A
Authority: CH
Inventors: Dimitrios Sarantakis
Original assignee: American Home Prod
Priority date: 1978-04-24
Filing date: 1979-04-17
Publication date: 1983-10-14
Also published as: FR2425426A1; DE2916536A1; JPS54145630A; FR2425426B1; IT7922062A0; NL7902932A; IT1166758B

Description

La présente invention est relative à des peptides synthétiques apparentés à la somatostatine du point de vue structural, ainsi qu'à des produits utilisés dans la synthèse de ces peptides. Dans les composés suivant l'invention, la chaîne peptidique de somatostatine est modifiée aux positions 4, 5 et 13, les positions 1, 2, 8 et 14 étant de préférence modifiées également. The present invention relates to synthetic peptides structurally related to somatostatin, as well as to products used in the synthesis of these peptides. In the compounds according to the invention, the somatostatin peptide chain is modified at positions 4, 5 and 13, positions 1, 2, 8 and 14 being preferably also modified.

La somatostatine est le disulfure cyclique de tétradécapeptide de la formule: Somatostatin is the cyclic tetradecapeptide disulfide of the formula:

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp S H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp S

I (I) I (I)

\ \

HO-Cys-Ser-Thr-Phe-Thr-Lys HO-Cys-Ser-Thr-Phe-Thr-Lys

Ce peptide I a été identifié comme étant le facteur d'inhibition de la libération de la somatotropine, qui est sécrété par l'hypothalamus et règle la sécrétion de l'hormone de croissance pituitaire (somatotropine), [voir Brazeau et col., «Science», 179, 77 (1973), Burgus et col., «Proc. Nat. Acad. Sci.» (USA), 70,684 (1973), et Ling et col., «Biochemica! and Biophysical Res. Communication», 50, 127 (1973)]. La forme réduite de la somatostatine est le tétradécapeptide linéaire de la formule: This peptide I has been identified as the factor inhibiting the release of somatotropin, which is secreted by the hypothalamus and regulates the secretion of pituitary growth hormone (somatotropin), [see Brazeau et al., " Science ", 179, 77 (1973), Burgus et al.," Proc. Nat. Acad. Sci. " (USA), 70.684 (1973), and Ling et al., "Biochemica! and Biophysical Res. Communication ”, 50, 127 (1973)]. The reduced form of somatostatin is the linear tetradecapeptide of the formula:

SH SH SH SH

I I I I

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

(II) (II)

La forme réduite II a été préparée par une synthèse complète, [voir Rivier et col., «C.R. Acad. Sci. Ser. p. Sei. Natur.» (Paris), 27(5, 2737 (1973), et Sarantakis et McKinley, «Biochem. and Biophys. Res. Communications», 54,234 (1973)], et cette forme réduite II peut être convertie en la somatostatine I par oxydation, de manière qu'une liaison de pontage se forme entre les deux radicaux sulfhydryle des deux restes d'aminoacides de cystéinyle dans le tétradécapeptide. The reduced form II was prepared by a complete synthesis, [see Rivier et al., “C.R. Acad. Sci. Ser. p. Sei. Natur. " (Paris), 27 (5, 2737 (1973), and Sarantakis and McKinley, "Biochem. And Biophys. Res. Communications", 54.234 (1973)], and this reduced form II can be converted into somatostatin I by oxidation, so that a bridging bond is formed between the two sulfhydryl radicals of the two residues of cysteinyl amino acids in the tetradecapeptide.

On a préparé par voie de synthèse et on retrouve dans la littérature chimique divers polypeptides que l'on peut considérer comme étant des modifications structurales de la somatostatine. Ces polypeptides présentent certaines caractéristiques structurales en commun avec la somatostatine et diffèrent de celle-ci en ce que des Various polypeptides have been prepared synthetically and found in the chemical literature which can be considered to be structural modifications of somatostatin. These polypeptides have certain structural characteristics in common with somatostatin and differ from it in that

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

3 3

638 776 638,776

restes d'aminoacides spécifiques ou des groupes fonctionnels particuliers, présents à l'origine dans la molécule de somatostatine, sont ou bien manquants ou bien remplacés par d'autres restes d'aminoacides ou groupes fonctionnels. La présente invention se rapporte à de nouveaux polypeptides synthétiques, actifs du point de vue biologique, que l'on peut considérer comme étant une modification structurale de la somatostatine. Les polypeptides suivant la présente invention diffèrent de la somatostatine sous les rapports suivants: residues of specific amino acids or particular functional groups, originally present in the somatostatin molecule, are either missing or replaced by other amino acid residues or functional groups. The present invention relates to novel synthetic biologically active polypeptides which can be considered to be a structural modification of somatostatin. The polypeptides according to the present invention differ from somatostatin in the following respects:

a) le segment Ala'-Gly1 est présent, manquant ou remplacé par un segment Gly-Gly-Gly ou Ala-D-Ala, ou le radical acétyle ou benzoyle; a) the Ala'-Gly1 segment is present, missing or replaced by a Gly-Gly-Gly or Ala-D-Ala segment, or the acetyl or benzoyl radical;

b) le reste Cys3 est présent ou remplacé par un reste d'acide ß-mercaptopropionique ; b) the residue Cys3 is present or replaced by a residue of β-mercaptopropionic acid;

c) le reste Lys4 est remplacé par un reste Arg ou His; c) the Lys4 residue is replaced by an Arg or His residue;

d) le reste Asn5 est remplacé par un reste His, Glu, Tyr, Trp, ou Phe; d) the residue Asn5 is replaced by a His, Glu, Tyr, Trp, or Phe residue;

e) le reste Trp8 est présent ou remplacé par un reste D-Trp ou 6-F-D-Trp; e) the Trp8 residue is present or replaced by a D-Trp or 6-F-D-Trp residue;

f) le reste Ser13 est remplacé par un reste de D-a-aminoacide, et g) le reste Cys14 est présent ou remplacé par le reste D-Cys. f) the residue Ser13 is replaced by a residue of D-a-amino acid, and g) the residue Cys14 is present or replaced by the residue D-Cys.

Des modifications à la somatostatine, ne comportant pas de segment Ala'-Gly2 ni de groupe amino N-terminal, ont été signalées par Rivier et col., «J. Med. Chem.», 18,123 (1975). Le remplacement du reste Trp8 par le reste D-Trp a été prévu par Rivier et col., «Biochem. Biophys. Res. Commun.», 65, 746 (1975). Des modifications à la somatostatine, dans lesquelles le segment Lys4-Asns a été remplacé par d'autres restes aminoacides, ont été décrites dans le brevet belge N° 839405. Une modification à la somatostatine, dans laquelle la D-sérine est substituée au reste Ser13, a été décrite par Coy et col., «58th Annual Meeting of the Endocrine Society», San Francisco, Californie, Abstract 305, p. 209. La D-Trp8, D-Cys14-somatostatine a été décrite par Brown et col., «Science», 196, 1467 (1977) et Meyer, «Biochem. Biophys. Res. Commun.», 74, 630 (1977). Changes to somatostatin, lacking an Ala'-Gly2 segment or an N-terminal amino group, have been reported by Rivier et al., "J. Med. Chem. ”, 18.123 (1975). The replacement of the remainder Trp8 with the remainder D-Trp was planned by Rivier et al., "Biochem. Biophys. Res. Commun. ”, 65, 746 (1975). Modifications to somatostatin, in which the Lys4-Asns segment has been replaced by other amino acid residues, have been described in Belgian Patent No. 839405. A modification to somatostatin, in which D-serine is substituted for the rest Ser13, has been described by Coy et al., "58th Annual Meeting of the Endocrine Society", San Francisco, California, Abstract 305, p. 209. D-Trp8, D-Cys14-somatostatin has been described by Brown et al., "Science", 196, 1467 (1977) and Meyer, "Biochem. Biophys. Res. Commun. ”, 74, 630 (1977).

La présente invention concerne un peptide répondant à la formule III suivante: The present invention relates to a peptide corresponding to the following formula III:

CH2 CH2 (III) CH2 CH2 (III)

I I I I

X-CHCO-X , -X2-Phe-Phe-X3-Lys-Thr-Phe-Thr-X4-NH-CH-COOH dans laquelle: X-CHCO-X, -X2-Phe-Phe-X3-Lys-Thr-Phe-Thr-X4-NH-CH-COOH in which:

X représente H, -NH2, -NH-Gly-Ala, -NH-D-Ala-Ala, -NH-Gly-Gly-Gly, -NH-acétyle, ou -NH-benzoyle; X represents H, -NH2, -NH-Gly-Ala, -NH-D-Ala-Ala, -NH-Gly-Gly-Gly, -NH-acetyl, or -NH-benzoyl;

X, représente His ou Arg; X represents His or Arg;

X2 représente His, Glu, Tyr, Trp, ou Phe; X2 represents His, Glu, Tyr, Trp, or Phe;

X3 représente Trp, D-Trp, ou 6-F-D-Trp, et X3 represents Trp, D-Trp, or 6-F-D-Trp, and

X4 représente un D-a-aminoacide; X4 represents a D-a-amino acid;

ainsi que les sels d'addition d'acide non toxiques, acceptables du point de vue pharmaceutique, de ces composés. as well as the non-toxic, pharmaceutically acceptable acid addition salts of these compounds.

En outre, l'invention englobe également la forme linéaire des composés de la formule III, c'est-à-dire les composés réduits non cycliques de formule IV, qui diffèrent en ce qu'ils comportent deux groupes de sulfhydryle libres, ainsi que les sels d'addition non toxiques de ces composés. In addition, the invention also encompasses the linear form of the compounds of formula III, i.e. the non-cyclic reduced compounds of formula IV, which differ in that they have two free sulfhydryl groups, as well as the non-toxic addition salts of these compounds.

SH SH SH SH

I I I I

ch2 ch2 (IV) ch2 ch2 (IV)

I I I I

X-CHCO-X i -X2-Phe-Phe-X3-Lys-Thr-Phe-Thr-X4-NH-CH-COOH X-CHCO-X i -X2-Phe-Phe-X3-Lys-Thr-Phe-Thr-X4-NH-CH-COOH

Les peptides linéaires de formule IV sont des dérivés précurseurs du peptide cyclique de formule III. The linear peptides of formula IV are precursor derivatives of the cyclic peptide of formula III.

Tous les aminoacides et les restes d'aminoacides, optiquement actifs dans les polypeptides envisagés dans le cas présent, sont dans la configuration naturelle ou L, à moins d'indications contraires. Les symboles identifiant les aminoacides et les restes d'aminoacides dans les polypeptides décrits sont les symboles adoptés par le «IUPAC-IVB Committee on Biochemical Nomenclature Recommendation» (1971) et décrits dans «Archives of Biochemistry and Biophysics», 150,1-8 (1972). Le symbole 6-F-D-Trp désigne le D-tryptophane, dans lequel la position 6 est substituée par du fluor. Le terme D-a-aminoacide désigne un a-aminoacide optiquement actif dans lequel le carbone en a se trouve dans la configuration D. Des exemples préférés de ces D-aminoacides sont: D-proline, D-alanine, D-valine, D-leucine, D-isoleucine, D-sérine, D-thréonine, D-méthionine, D-acide aspartique, D-acide glutamique, D-lycine, D-arginine, D-aspa-ragine, D-histidine, D-thryptophane, D-phénylalanine et D-tyrosine. All the amino acids and the amino acid residues, optically active in the polypeptides envisaged in the present case, are in the natural configuration or L, unless otherwise indicated. The symbols identifying the amino acids and the amino acid residues in the polypeptides described are the symbols adopted by the "IUPAC-IVB Committee on Biochemical Nomenclature Recommendation" (1971) and described in "Archives of Biochemistry and Biophysics", 150,1-8 (1972). The symbol 6-F-D-Trp denotes D-tryptophan, in which the 6 position is substituted by fluorine. The term Da-amino acid denotes an optically active α-amino acid in which the carbon has α is in the D configuration. Preferred examples of these D-amino acids are: D-proline, D-alanine, D-valine, D-leucine , D-isoleucine, D-serine, D-threonine, D-methionine, D-aspartic acid, D-glutamic acid, D-lycine, D-arginine, D-aspa-ragine, D-histidine, D-thryptophan, D -phenylalanine and D-tyrosine.

Il sera évident, pour les spécialistes en ce domaine, que le carbone a des restes de cystéine (correspondant aux restes Cys3 et Cys14 de la somatostatine) comporte un atome de carbone asymétrique, et que des isomères optiques de ces restes d'aminoacides sont possibles. Dans les peptides illustrés par les formules présentées dans le cas présent (formules III, IV ou V), le reste Cys3 peut être dans la configuration naturelle (configuration L), tandis que le reste Cys14 peut être ou bien dans la configuration naturelle (configuration L) ou bien dans une configuration non naturelle (configuration D). It will be obvious to specialists in this field that the carbon has residues of cysteine (corresponding to the residues Cys3 and Cys14 of somatostatin) has an asymmetric carbon atom, and that optical isomers of these amino acid residues are possible. . In the peptides illustrated by the formulas presented in the present case (formulas III, IV or V), the remainder Cys3 may be in the natural configuration (configuration L), while the remainder Cys14 may be or else in the natural configuration (configuration L) or in an unnatural configuration (configuration D).

Les composés des formules III et IV empêchent les sécrétions de l'hormone de croissance, de l'insuline et du glucagon, ce qui a été démontré par des procédés d'essais pharmacologiques classiques, et ils sont intéressants pour régler le glucose dans le sérum, au cours du traitement du diabète. Ces composés montrent également une période d'activité prolongée. The compounds of formulas III and IV prevent the secretions of growth hormone, insulin and glucagon, which has been demonstrated by conventional pharmacological test methods, and they are useful for regulating glucose in serum , during the treatment of diabetes. These compounds also show an extended period of activity.

Une forme de réalisation préférée des composés de la formule III et de la formule IV est celle pour laquelle X représente NH2; X, représente le reste Arg; X2 représente le reste His; X3 représente le reste D-Trp, et X4 représente le reste D-Tyr. Le procédé de préparation des composés de cette forme de réalisation est décrit dans les exemples 1 et 2. Une autre forme de réalisation préférée des composés des formules III et IV est celle pour laquelle X représente NH2; X; représente le reste Arg; X2 représente le reste Glu; X3 représente le reste D-Trp, et X4 représente le reste D-Tyr, ces composés empêchant la libération de l'hormone de croissance et de l'insuline sans empêcher fortement la libération du glucagon. La préparation des composés de cette forme de réalisation est décrite par les exemples 3 et 4. Une autre forme de réalisation préférée des composés des formules III et IV est celle pour laquelle X représente NH2; X! représente le reste His; X2 représente le reste His; X3 représente le reste D-Trp, et X4 représente le reste D-Ser, ces composés empêchant la libération de l'hormone de croissance et du glucagon sans empêcher fortement la libération de l'insuline. La préparation des composés de cette formule de réalisation est décrite dans les exemples 5 et 6. On peut préparer d'autres composés en utilisant des méthodes similaires ou des modifications évidentes de celles-ci. On peut préparer des composés d'une forme de réalisation désirée, en utilisant la technique y exemplifiée, par la substitution d'un aminoacide protégé désiré à un fragment particulier tel qu'illustré. A preferred embodiment of the compounds of formula III and of formula IV is that for which X represents NH2; X represents the remainder Arg; X2 represents the His residue; X3 represents the D-Trp residue, and X4 represents the D-Tyr residue. The process for preparing the compounds of this embodiment is described in Examples 1 and 2. Another preferred embodiment of the compounds of formulas III and IV is that for which X represents NH2; X; represents the remainder Arg; X2 represents the Glu residue; X3 represents the D-Trp residue, and X4 represents the D-Tyr residue, these compounds preventing the release of growth hormone and insulin without strongly preventing the release of glucagon. The preparation of the compounds of this embodiment is described by Examples 3 and 4. Another preferred embodiment of the compounds of formulas III and IV is that for which X represents NH2; X! represents the remainder His; X2 represents the His residue; X3 represents the D-Trp residue, and X4 represents the D-Ser residue, these compounds preventing the release of growth hormone and glucagon without strongly preventing the release of insulin. The preparation of the compounds of this embodiment is described in Examples 5 and 6. Other compounds can be prepared using similar methods or obvious modifications thereof. Compounds of a desired embodiment can be prepared, using the technique exemplified therein, by the substitution of a desired protected amino acid for a particular fragment as illustrated.

On prépare les polypeptides de la présente invention par le procédé en phase solide suivant les techniques connues d'une façon générale en pratique pour établir une séquence d'aminoacides au départ d'un aminoacide de départ à C terminal, supporté par une résine. De telles techniques ont été décrites par J.M. Stewart et col., «Solid Phase Peptide Synthesis», Freeman and Co., San Francisco, 1969. Dans l'application à la synthèse des polypeptides des formules III et IV, l'aminoacide à C terminal de départ est la L- ou D-cys-téine, et le support de résine est de préférence une résine de polystyrène chlorométhylée. Les groupes de chlorométhyle forment des sites pour la liaison de L- ou D-cystéine au support de résine par voie d'une formation d'ester. The polypeptides of the present invention are prepared by the solid phase method according to techniques generally known in the art for establishing an amino acid sequence from a C-terminal starting amino acid supported by a resin. Such techniques have been described by JM Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", Freeman and Co., San Francisco, 1969. In the application to the synthesis of polypeptides of formulas III and IV, the amino acid C starting terminal is L- or D-cys-teine, and the resin support is preferably a chloromethylated polystyrene resin. The chloromethyl groups form sites for the binding of L- or D-cysteine to the resin support by way of an ester formation.

Dans la mise en œuvre de la synthèse, la résine de polystyrène chlorométhylée est estérifiée avec de la D- ou de la L-cystéine, protégée en a-amino et en sulfhydryle, par exemple Boc-Cys(SMBzl)-OH suivant le procédé de Gisin, «Helv. Chim. Acta.», 56,1476 (1973). L'aminoacide protégé est lié par formation d'ester entre le groupe carboxyle de la L- ou de la D-cystéine et un groupe chlorométhyle In the implementation of the synthesis, the chloromethylated polystyrene resin is esterified with D- or L-cysteine, protected with α-amino and with sulfhydryl, for example Boc-Cys (SMBzl) -OH according to the process by Gisin, "Helv. Chim. Acta. ”, 56,1476 (1973). The protected amino acid is linked by ester formation between the carboxyl group of L- or D-cysteine and a chloromethyl group

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4 4

de la résine. Le groupe protecteur de a-amino est ensuite séparé avec de l'acide trifluoroacétique dans du chlorure de méthylène, de l'acide trifluoroacétique seul ou de l'acide chlorhydrique dans du dioxanne. La suppression de la protection est réalisée à une température comprise entre environ 0°C et la température ambiante. On peut utiliser d'autres réactifs et conditions classiques de scission pour la séparation des groupes protecteurs particuliers en a-amino, et ce comme décrit notamment par E. Schröder et K. Lübke, «The Peptides», 1, 72-75 (Academic Press, 1965). Après séparation du groupe protecteur en a-amino, les aminoacides protégés suivants sont combinés individuellement à la séquence supportée par la résine, et ce en série. A titre de variante, on peut préparer de petits fragments de peptide par la méthode en solution et on peut les introduire dans la réaction en phase solide dans l'ordre désiré. Chaque aminoacide protégé ou chaque séquence d'aminoacides protégés est introduit dans la réaction en phase solide en un excès d'environ 4 fois. La combinaison est réalisée dans du diméthylformamide, du chlore de méthylène ou un mélange de ces deux solvants. Le succès de chaque réaction de combinaison, à chaque stade de la synthèse, est déterminé par la réaction à la nihydrine, telle que décrite par E. Kaiser et col., « Analyt. Biochem.», 34, 595 (1970). Lorsqu'une combinaison incomplète se développe, la réaction est répétée avant que le groupe protecteur en a-amino soit séparé pour l'introduction de la séquence suivante d'aminoacides. Le diisopropylcarbodiimide constitue le réactif de combinaison préféré, bien que d'autres agents seront évidents pour les spécialistes en ce domaine. resin. The α-amino protecting group is then separated with trifluoroacetic acid in methylene chloride, trifluoroacetic acid alone or hydrochloric acid in dioxane. The protection is removed at a temperature between about 0 ° C and room temperature. One can use other reagents and conventional conditions of cleavage for the separation of the particular protective groups into a-amino, and this as described in particular by E. Schröder and K. Lübke, "The Peptides", 1, 72-75 (Academic Press, 1965). After separation of the protecting group into α-amino, the following protected amino acids are combined individually with the sequence supported by the resin, and this in series. Alternatively, small peptide fragments can be prepared by the solution method and can be introduced into the solid phase reaction in the desired order. Each protected amino acid or each protected amino acid sequence is introduced into the solid phase reaction in about 4-fold excess. The combination is carried out in dimethylformamide, methylene chlorine or a mixture of these two solvents. The success of each combination reaction, at each stage of the synthesis, is determined by the nihydrin reaction, as described by E. Kaiser et al., "Analyt. Biochem. ”, 34, 595 (1970). When an incomplete combination develops, the reaction is repeated before the α-amino protecting group is separated for the introduction of the next sequence of amino acids. Diisopropylcarbodiimide is the preferred combination reagent, although other agents will be apparent to those skilled in the art.

Après que la séquence désirée d'aminoacides a été synthétisée, le Polypeptide est séparé du support de résine par traitement avec de l'acide fluorhydrique et de l'anisole pour obtenir le polypeptide linéaire totalement débarrassé de sa protection. Le disulfure cyclique est produit par oxydation du polypeptide linéaire, par exemple par traitement avec du K4Fe(CN)6 ou par contact avec de l'air. After the desired amino acid sequence has been synthesized, the Polypeptide is separated from the resin support by treatment with hydrofluoric acid and anisole to obtain the linear polypeptide completely stripped of its protection. Cyclic disulfide is produced by oxidation of the linear polypeptide, for example by treatment with K4Fe (CN) 6 or by contact with air.

On produit des sels d'addition d'acide non toxiques des polypeptides linéaires et cycliques par des procédés bien connus en pratique, en partant d'acides organiques ou minéraux qui ne sont pas toxiques et qui sont acceptables pour les besoins pharmaceutiques, par exemple les acides chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, phos-phorique, polyphosphorique, maléique, acétique, citrique, benzoï-que, succinique, malonique, ascorbique, etc. Non-toxic acid addition salts of the linear and cyclic polypeptides are produced by methods well known in the art, starting from organic or inorganic acids which are not toxic and which are acceptable for pharmaceutical purposes, e.g. hydrochloric, hydrobromic, sulfuric, phos-phoric, polyphosphoric, maleic, acetic, citric, benzoic, succinic, malonic, ascorbic acids, etc.

Les groupes protecteurs utilisés dans la totalité de la synthèse en phase solide sont bien connus en pratique. Dans le choix d'un groupe protecteur particulier de chaîne latérale, à utiliser dans la synthèse des peptides suivant la présente invention, les règles suivantes doivent normalement être suivies: a) le groupe protecteur de chaîne latérale doit être stable vis-à-vis du réactif et sous les conditions de réaction choisies pour la séparation du groupe protecteur en a-amino à chaque étape de la synthèse; b) le groupe protecteur doit conserver ses propriétés protectrices (c'est-à-dire ne pas être séparé sous les conditions de la combinaison), et c) le groupe protecteur de chaîne latérale doit être séparable à la fin de la synthèse comportant la séquence désirée d'aminoacides sous des conditions de réaction qui ne modifient pas la chaîne peptidique. The protecting groups used throughout the solid phase synthesis are well known in the art. In the choice of a particular side chain protecting group, to be used in the synthesis of the peptides according to the present invention, the following rules must normally be followed: a) the side chain protecting group must be stable with respect to the reagent and under the reaction conditions chosen for the separation of the protective group into α-amino at each stage of the synthesis; b) the protecting group must retain its protective properties (i.e. not be separated under the conditions of the combination), and c) the side chain protecting group must be separable at the end of the synthesis comprising the desired sequence of amino acids under reaction conditions which do not alter the peptide chain.

Les groupes protecteurs préférés pour les aminoacides utilisés dans la synthèse en phase solide sont les suivants: a) pour un groupe a-amino: t-butyloxycarbonyle (Boc); b) pour un groupe hydroxyle de chaîne latérale: benzyle (Bzl); c) pour un groupe hydroxyle aromatique de chaîne latérale: 2,6-dichlorobenzyle (Cl2Bzl); d) pour un groupe carboxyle de chaîne latérale: benzyle (Bzl); e) pour un groupe w-amino de chaîne latérale: 2-chlorobenzyloxycarbonyle (Clz); f) pour les atomes d'azote de guanidine en chaîne latérale: tosyle (Tos); g) pour l'azote d'imidazole secondaire: tosyle (Tos), et h) pour un groupe mercapto de chaîne latérale: p-méthoxybenzyle (MBzl). The preferred protective groups for the amino acids used in solid phase synthesis are the following: a) for an a-amino group: t-butyloxycarbonyl (Boc); b) for a side chain hydroxyl group: benzyl (Bzl); c) for an aromatic side chain hydroxyl group: 2,6-dichlorobenzyl (Cl2Bzl); d) for a side chain carboxyl group: benzyl (Bzl); e) for a side chain w-amino group: 2-chlorobenzyloxycarbonyl (Clz); f) for the nitrogen atoms of guanidine in the side chain: tosyle (Tos); g) for the secondary imidazole nitrogen: tosyle (Tos), and h) for a side chain mercapto group: p-methoxybenzyl (MBzl).

En plus des polypeptides actifs du point de vue pharmacologi-que, répondant aux formules III et IV, la présente invention englobe également les nouveaux composés de peptidorésine répondant à la formule V : In addition to the pharmacologically active polypeptides corresponding to formulas III and IV, the present invention also encompasses the new peptidoresin compounds corresponding to formula V:

S-Z I S-Z I

ch2 I ch2 I

Y-CHCO-Y1-Y2-Phe-Phe-X3-Y3-Y4-Phe-Y4 O Y-CHCO-Y1-Y2-Phe-Phe-X3-Y3-Y4-Phe-Y4 O

I II I II

Y5-NH-CHCO-CH2 (V) Y5-NH-CHCO-CH2 (V)

I I

(résine de polystyrène) CH2 (polystyrene resin) CH2

I I

S-Z S-Z

dans laquelle: in which:

a) X3 représente Trp, D-Trp, ou 6-F-D-Trp; a) X3 represents Trp, D-Trp, or 6-F-D-Trp;

b) Y représente H, -NH(R), -NH-Gly-Ala(R), -NH-Gly-Gly-Gly(R), -NH-D-Ala-Ala(R), -NH-acétyle, ou -NH-benzoyle; b) Y represents H, -NH (R), -NH-Gly-Ala (R), -NH-Gly-Gly-Gly (R), -NH-D-Ala-Ala (R), -NH-acetyl , or -NH-benzoyl;

c) Yi représente His(Rt) ou Arg(Rj); c) Yi represents His (Rt) or Arg (Rj);

d) Y2 représente His(Rj), Glu(R2), Tyr(R3), Trp, ou Phe; d) Y2 represents His (Rj), Glu (R2), Tyr (R3), Trp, or Phe;

e) Y3 représente Lys(R4); e) Y3 represents Lys (R4);

f) Y4 représente Thr(R5); f) Y4 represents Thr (R5);

g) Y5 représente D-Pro, D-Ala, D-Val, D-Leu, D-isoleu, D-Ser(Rs), D-Thr(R5), D-Asp(R2), D-Glu(R2), D-Lys(R4), D-Arg(Rj), D-Asn, D-His(Ri), D-Trp, D-Phe, ou D-Tyr(R3), et h) Z est le groupe protecteur formé par le radical p-méthoxybenzyle; g) Y5 represents D-Pro, D-Ala, D-Val, D-Leu, D-isoleu, D-Ser (Rs), D-Thr (R5), D-Asp (R2), D-Glu (R2 ), D-Lys (R4), D-Arg (Rj), D-Asn, D-His (Ri), D-Trp, D-Phe, or D-Tyr (R3), and h) Z is the group protector formed by the p-methoxybenzyl radical;

R est un groupe protecteur en a-amino, et Ku R2, R3, R4 et Rs représentent chacun un groupe protecteur de chaîne latérale, à savoir: R is an α-amino protecting group, and Ku R2, R3, R4 and Rs each represent a side chain protecting group, namely:

R[ est un groupe protecteur d'atome d'azote de guanidine ou d'imidazole, R [is a protecting group for the nitrogen atom of guanidine or imidazole,

R2 est un groupe protecteur d'acide carboxylique, R2 is a protecting group for carboxylic acid,

R3 est un groupe protecteur de groupe hydroxyle aromatique, R3 is an aromatic hydroxyl group protecting group,

R4 est un groupe protecteur (a-amino, et R4 is a protecting group (a-amino, and

Rs est un groupe protecteur de groupe hydroxyle aliphatique. Rs is a protecting group for an aliphatic hydroxyl group.

Les groupes protecteurs préférés sont ceux dans la formule des quels: Preferred protecting groups are those in the formula of which:

r = r =

t-butyloxycarbonyle ; t-butyloxycarbonyl;

r, = r, =

tosyle; tosyle;

r2 = r2 =

benzyle(ester); benzyl (ester);

R3 = R3 =

2,6-dichlorobenzyle ; 2,6-dichlorobenzyl;

r4 = r4 =

2-chlorobenzoyloxycarbonyle, et 2-chlorobenzoyloxycarbonyl, and

Rs = Rs =

benzyle(éther). benzyl (ether).

Dans les composés de la formule V, la résine de polystyrène peut être un support de résine approprié quelconque traditionnellement utilisé en pratique pour la synthèse en phase solide des polypeptides, mais il s'agit de préférence d'un polystyrène qui a été réticulé avec de 0,5 à environ 3% de divinylbenzène et qui a été chlorométhylé ou hydroxyméthylé pour créer des sites pour la formation d'ester entre la L- ou D-cystéine protégée en a-amino introduite au départ et le support de résine. Une résine de polystyrène chlorométhylée est disponible sur le marché en provenance de la société Bio Rad Laboratories, Richmond, Californie, et la préparation d'une telle résine a été décrite par Stewart et col., «Solid Phase Peptide Synthesis», Freeman and Co., San Francisco, 1969, Chap. 1, pp. 1-6. Dans la formule V, le groupe In the compounds of formula V, the polystyrene resin may be any suitable resin support traditionally used in practice for the solid phase synthesis of polypeptides, but it is preferably a polystyrene which has been crosslinked with 0.5 to about 3% of divinylbenzene and which has been chloromethylated or hydroxymethylated to create sites for the formation of ester between the L- or D-cysteine protected in α-amino initially introduced and the resin support. A chloromethylated polystyrene resin is available on the market from the company Bio Rad Laboratories, Richmond, California, and the preparation of such a resin has been described by Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", Freeman and Co ., San Francisco, 1969, Chap. 1, pp. 1-6. In formula V, the group

-C-0-CH2-II -C-0-CH2-II

O O

représente la liaison d'ester entre le groupe carboxyle en C terminal du polypeptide et l'un des nombreux groupes de méthylène introduits à l'origine dans les fragments de phényle de la chaîne de polystyrène par les chlorométhylations. represents the ester bond between the C-terminal carboxyl group of the polypeptide and one of the many methylene groups originally introduced into the phenyl moieties of the polystyrene chain by chloromethylations.

Les composés décrits ici peuvent être administrés à des mammifères à sang chaud, par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire ou orale, pour régler le glucose du sérum dans le traitement du diabète ou de l'hyperinsulinémie. La dose requise variera avec l'état particulier que l'on traite, la gravité de cet état et la durée du traitement. The compounds described herein can be administered to warm-blooded mammals, intravenously, subcutaneously, intramuscularly or orally, to regulate serum glucose in the treatment of diabetes or hyperinsulinemia. The dose required will vary with the particular condition being treated, the severity of the condition and the duration of treatment.

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

.40 .40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

5 5

638 776 638,776

On peut administrer l'ingrédient actif seul ou en combinaison avec des supports ou excipients acceptables du point de vue pharmaceutique. Des compositions pharmaceutiques appropriées seront évidentes pour les spécialistes en ce domaine. The active ingredient can be administered alone or in combination with pharmaceutically acceptable carriers or excipients. Appropriate pharmaceutical compositions will be apparent to those skilled in the art.

Des procédés de fabrication et d'utilisation des composés suivant la présente invention sont présentés par les exemples suivants. Methods of making and using the compounds according to the present invention are presented by the following examples.

Exemple 1 : Example 1:

tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-mêthoxybcnzyl-L-cystéinyl-Nz-tosyl-L-arginyl-Nim-tosyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl-Nc-2-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysyl-0-benzyl-L-thrèonyl-L-phénylalanyl-O-benzyl-L-thrêony 1-0-2,6-dichloro-benzyl-D-tyrosyl-S-p-méthoxybenzyl-L-cystéinylester avec polystyrène hydroxyméthylé tert.-Butyloxycarbonyl-Sp-methoxybcnzyl-L-cysteinyl-Nz-tosyl-L-arginyl-Nim-tosyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-Nc-2-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysyl -0-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threony 1-0-2,6-dichloro-benzyl-D-tyrosyl-Sp-methoxybenzyl-L-cysteinylester with hydroxymethylated polystyrene

Une résine de polystyrène chlorométhylée [Lab Systems, Inc.] (0,75 méq./g) est estérifiée avec le sel de césium de Boc-Cys(SMBzl)-OH suivant le procédé de Gisin, «Helv. Chim. Acta.», 56,1976 ( 1973 ). L'aminoacide-résine est ensuite traité suivant le programme A (présenté par la suite), du Boc-D-Tyr(Cl2Bzl)-OH étant utilisé comme aminoacide protégé dans la phase 9 de ce programme. Ce programme A est ensuite répété suivant les nécessités afin d'incorporer successivement les aminoacides suivants dans la peptidorésine: A chloromethylated polystyrene resin [Lab Systems, Inc.] (0.75 meq / g) is esterified with the cesium salt of Boc-Cys (SMBzl) -OH according to the method of Gisin, "Helv. Chim. Acta. ”, 56.1976 (1973). The amino acid-resin is then treated according to program A (presented below), Boc-D-Tyr (Cl2Bzl) -OH being used as protected amino acid in phase 9 of this program. This program A is then repeated as necessary in order to successively incorporate the following amino acids into the peptidoresin:

Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Thr (Bzl) -OH

Boc-Phe-OH Boc-Phe-OH

Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Thr (Bzl) -OH

Boc-Lys(Clz)-OH Boc-Lys (Clz) -OH

Boc-D-Trp-OH Boc-D-Trp-OH

Boc-Phe-OH Boc-Phe-OH

Boc-His(T os)-OH Boc-His (T os) -OH

Boc- Arg(T os)-OH Boc- Arg (T os) -OH

Boc-Cys(SM Bzl)-OH Boc-Cys (SM Bzl) -OH

Programme A : Méthode pour la suppression de la protection du groupe a-amino et pour la combinaison des aminoacides protégés sur l'ensemble Boc-Cys(SMBzl)-0-CH2-(résine protégée): Program A: Method for removing protection from the a-amino group and for combining protected amino acids on the Boc-Cys (SMBzl) -0-CH2- (protected resin) set:

1. lavage avec du chlorure de méthylène (CH2C12) trois fois; 1. washing with methylene chloride (CH2C12) three times;

2. traitement avec de l'acide trifluoroacétique-chlorure de méthylène (9/1, volume/volume) contenant 5% de 1,2-éthanedithiol, pendant 5 min; 2. treatment with trifluoroacetic acid-methylene chloride (9/1, volume / volume) containing 5% of 1,2-ethanedithiol, for 5 min;

3. répétition de la phase 2 pendant 25 min; 3. repetition of phase 2 for 25 min;

4. lavage avec du CH2C12 trois fois; 4. washing with CH2C12 three times;

5. lavage avec du diméthylformamide (DMF); 5. washing with dimethylformamide (DMF);

6. traitement avec 12% de triéthylamine dans du DMF pendant 3 min; 6. treatment with 12% triethylamine in DMF for 3 min;

7. lavage avec du DMF; 7. washing with DMF;

8. lavage avec du CH2C12 trois fois; 8. washing with CH2C12 three times;

9. traitement avec 4 équivalents de l'aminoacide protégé, approprié dans du CH2C12-DMF, et agitation pendant 5 min; 9. treatment with 4 equivalents of the protected amino acid, suitable in CH2C12-DMF, and stirring for 5 min;

10. addition, en deux portions, sur une période de 30 min, de 5 équivalents de diisopropylcarbodiimide dissous dans du CH2C12 en laissant la réaction se développer pendant 6 h; 10. addition, in two portions, over a period of 30 min, of 5 equivalents of diisopropylcarbodiimide dissolved in CH2Cl2, allowing the reaction to develop for 6 h;

11. lavage avec du DMF trois fois; 11. washing with DMF three times;

12. lavage avec du CH2C12 trois fois; 12. washing with CH2C12 three times;

13. essai par réaction à la nihydrine suivant le procédé de Kaiser et col., «Annal. Biochem.», 34, 595 (1970). Dans le cas d'une réaction incomplète, on répète les phases 9 à 13 précédentes. 13. test by reaction with nihydrin according to the method of Kaiser et al., "Annal. Biochem. ”, 34, 595 (1970). In the case of an incomplete reaction, the preceding phases 9 to 13 are repeated.

Exemple 2: Example 2:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-cystèinyl-L-arginyl-L-histidyl-L- Cyclic disulfide (1-12) of L-cysteinyl-L-arginyl-L-histidyl-L-

phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyi- phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyi-

L-phénylalanyl-L-thréonyl-D-tyrosyl-L-cystéine L-phenylalanyl-L-threonyl-D-tyrosyl-L-cysteine

Un mélange de la peptidorésine de l'exemple 1 (12 g), d'anisole (20 ml) et d'acide fluorhydrique liquide (200 ml) est laissé au repos dans un bain de glace (à l'exclusion d'air) pendant 50 min, puis on sépare l'excès d'acide fluorhydrique sous vide. Le reste est extrait avec de l'acide acétique aqueux à 20% et on verse l'extrait dans 5 1 d'eau désaérée. Le pH de l'eau est amené à 7,4 par addition d'hydr-oxyde d'ammonium dilué, et le mélange est oxydé par addition d'une solution de K3Fe(CN)6 (1,5 g dans 500 ml d'eau). Le mélange d'oxydation est acidifié avec de l'acide acétique glacial jusqu'au pH de 5 et l'excès d'oxydant est séparé par addition du composé Bio Rad AG 3. La matière peptidique est absorbée sur une résine Am-berlite CG-50 (dans la forme H+), puis elle est éluée avec un mélange d'eau, d'acide acétique et de pyridine (66/4/30 en volume/ volume). Les fractions contenant la matière peptidique sont rassemblées et lyophilisées pour donner un produit brut que l'on applique à une colonne de Sephadex G-25 (2,5 x 160 cm), en éluant avec une solution aqueuse à 10% d'acide acétique. Les fractions 113 à 133 sont récoltées et lyophilisées, pour donner le peptide cité en rubrique, à raison de 855 mg. A mixture of the peptidoresin of Example 1 (12 g), anisole (20 ml) and liquid hydrofluoric acid (200 ml) is left to stand in an ice bath (excluding air) for 50 min, then the excess hydrofluoric acid is separated under vacuum. The rest is extracted with 20% aqueous acetic acid and the extract is poured into 5 l of deaerated water. The pH of the water is brought to 7.4 by addition of dilute ammonium hydroxide, and the mixture is oxidized by addition of a solution of K3Fe (CN) 6 (1.5 g in 500 ml of 'water). The oxidation mixture is acidified with glacial acetic acid to a pH of 5 and the excess oxidant is separated by adding the compound Bio Rad AG 3. The peptide material is absorbed on an Am-berlite CG resin -50 (in the H + form), then it is eluted with a mixture of water, acetic acid and pyridine (66/4/30 in volume / volume). The fractions containing the peptide material are combined and lyophilized to give a crude product which is applied to a column of Sephadex G-25 (2.5 x 160 cm), eluting with a 10% aqueous solution of acetic acid. . Fractions 113 to 133 are harvested and lyophilized, to give the peptide mentioned in the title, at a rate of 855 mg.

Chromatographie en couche mince: plaques de verre enrobées d'Avicel, pulvérisation au chlorox, Rf (n-butanol-eau-acide acétique glacial, 4/1/1, volume/volume): 0,41. Thin layer chromatography: glass plates coated with Avicel, spraying with chlorox, Rf (n-butanol-water-glacial acetic acid, 4/1/1, volume / volume): 0.41.

Analyse des aminoacides: Thr (2): 1,87; Phe (3): 3; Cys (2): 1,49; Tyr (1): 0,87; Lys (1): 1,02; His (1): 0,89; Arg (1): 1,01 ; Trp (1): 0,67. Amino acid analysis: Thr (2): 1.87; Phe (3): 3; Cys (2): 1.49; Tyr (1): 0.87; Lys (1): 1.02; His (1): 0.89; Arg (1): 1.01; Trp (1): 0.67.

Exemple 3: Example 3:

tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-mêthoxybenzyl-L-cystèinyl-Ns-tosyl-L-arginyl-k-benzyl-L-glutamyl-L-phénylalanyl-L-phènylalanyl-D-tryptophyl-Ne-2-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysyl-0-benzyl-L-thrèonyl-L-phènylalanyl-0-benzyl-L-thréonyl-0-2,6-dichloro-benzyl-D-tyrosyl-S-p-mèthoxybenzyl-L-cystêinylester avec polystyrène hydroxyméthylé tert.-Butyloxycarbonyl-Sp-methoxybenzyl-L-cysteinyl-Ns-tosyl-L-arginyl-k-benzyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-Ne-2-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysyl -0-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-0-benzyl-L-threonyl-0-2,6-dichloro-benzyl-D-tyrosyl-Sp-methoxybenzyl-L-cysteinylester with hydroxymethylated polystyrene

On prépare la peptidorésine précédente d'une façon semblable à celle de l'exemple 1, en substituant l'aminoacide requis au point approprié dans la synthèse. The preceding peptidoresin is prepared in a similar manner to that of Example 1, substituting the amino acid required at the appropriate point in the synthesis.

Exemple 4: Example 4:

Sel triacêtate de disulfure cyclique ( 1-12) de L-cystéinyl-L-arginyl-L-a-glutamyl-L-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-trypto-phyl-L-lysyl-L-thrëonyl-L-phénylalanyl-L-thrèonyl-D-tyrosyl-L-cystèine Cyclic disulfide triacetate salt (1-12) of L-cysteinyl-L-arginyl-La-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-trypto-phyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L -threonyl-D-tyrosyl-L-cysteine

Le dodécapeptide précédent est préparé au départ de la peptidorésine de l'exemple 3 d'une façon semblable à celle de l'exemple 2. The preceding dodecapeptide is prepared starting from the peptidoresin of example 3 in a manner similar to that of example 2.

Chromatographie en couche mince: plaques de verre préalablement enrobées d'Avicel. Rf (n-butanol-eau-acide acétique glacial, 4/1/1, volume/volume): 0,57; Rf (n-butanol-acétate d'éthyle-eau-acide acétique glacial, 1/1/1/1, volume/volume): 0,85; Rf (alcool amylique tertiaire-pyridine-eau, 7/7/6, volume/volume): 0,92. Thin layer chromatography: glass plates previously coated with Avicel. Rf (n-butanol-water-glacial acetic acid, 4/1/1, volume / volume): 0.57; Rf (n-butanol-ethyl acetate-water-glacial acetic acid, 1/1/1/1, volume / volume): 0.85; Rf (tertiary amyl alcohol-pyridine-water, 7/7/6, volume / volume): 0.92.

Analyse des aminoacides: Thr (2): 1,96; Glu (1): 1,04; Cys (2): 1,79; Tyr (1): 1,02;-Phe (3): 3; Lys (1): 1,04; Trp (1): 1,09; Arg (1): 1,01. Amino acid analysis: Thr (2): 1.96; Glu (1): 1.04; Cys (2): 1.79; Tyr (1): 1.02; -Phe (3): 3; Lys (1): 1.04; Trp (1): 1.09; Arg (1): 1.01.

Exemple 5: Example 5:

tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-méthoxybenzyl-L-cystéinyl-N'm-tosyl-L-histidyl-N'"'-tosyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl-Ne-2-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysyl-0-benzyl-L-thréonyl-L-phênylalanyl-O-benzyl-L-thrêonyl-O-benzyl-D-séryl-S-p-méthoxybenzyl-L-cystéinylester avec polystyrène hydroxyméthylé tert.-Butyloxycarbonyl-Sp-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N'm-tosyl-L-histidyl-N '"' - tosyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-Ne-2- chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-D-seryl-Sp-methoxybenzyl-L-cysteinylester with hydroxymethylated polystyrene

La peptidorésine précédente est préparée d'une façon semblable à celle de l'exemple 1, en substituant l'aminoacide requis au point approprié de la synthèse. The above peptidoresin is prepared in a similar manner to that of Example 1, by substituting the required amino acid at the appropriate point in the synthesis.

Exemple 6: Example 6:

Sel triacêtate de disulfure cyclique ( 1-12) de L-cystèinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-L-phènylalanyl-L-thréonyl-D-sêryl-L-cystêine La peptidorésine de l'exemple 5 précédent est traitée d'une façon semblable à celle prévue dans l'exemple 2 pour donner le composé cité en rubrique. Cyclic disulfide triacetate salt (1-12) of L-cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl -D-sêryl-L-cystêine The peptidoresin of Example 5 above is treated in a similar manner to that provided in Example 2 to give the compound mentioned in the heading.

5 5

10 10

13 13

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

638 776 638,776

Chromatographie en couche mince: plaques de verre préalablement enrobées de gel de silice. Rf (n-butanol-acétate d'éthyle-eau-acide acétique glacial, 1/1/1/1, volume/volume): 0,52. Thin layer chromatography: glass plates previously coated with silica gel. Rf (n-butanol-ethyl acetate-water-glacial acetic acid, 1/1/1/1, volume / volume): 0.52.

Plaques de verre préalablement enrobées d'Avicel. Rf (n-butanoi-eau-acide acétique glacial, 4/5/1, volume/volume): 0,60; Rf (alcool amylique tertiaire-pyridine-eau, 7/7/6, volume/volume) : 0,76. Glass plates previously coated with Avicel. Rf (n-butanoi-water-glacial acetic acid, 4/5/1, volume / volume): 0.60; Rf (tertiary amyl alcohol-pyridine-water, 7/7/6, volume / volume): 0.76.

Analyse des aminoacides: Thr (2): 1,98; Ser (1): 0,98; Cys (2): 1,64; Phe (3): 3; Lys (1): 1,1 ; His (2): 2,1; Trp (1): 0,84. Amino acid analysis: Thr (2): 1.98; Ser (1): 0.98; Cys (2): 1.64; Phe (3): 3; Lys (1): 1.1; His (2): 2.1; Trp (1): 0.84.

Exemple 7: Example 7:

L'aptitude des composés suivant l'invention à empêcher les sécrétions de l'hormone de croissance, de l'insuline et du glucagon peut être démontrée par le procédé d'essai suivant: The ability of the compounds according to the invention to prevent secretions of growth hormone, insulin and glucagon can be demonstrated by the following test method:

On subdivise des rats albinos mâles en deux groupes (par exemple 9 rats par groupe). On administre à chaque animal du sodium pentobarbital (Nembutal) dans le péritoine à une dose de 50 mg/kg. Après 15 min, les rats d'un groupe reçoivent une injection sous-cutanée du composé essayé en solution saline (normalement 5 à 200 (ig, kg), tandis que les rats de l'autre groupe (groupe témoin) reçoivent la solution saline seule. 10 min plus tard, on administre à chaque animal une injection de 0,5 ml d'arginine (300 mg/ml, pH de 7,2) dans le cœur. 5 min après l'injection de l'arginine, les animaux sont décapités et on récolte leur sang dans du Trasylol-EDTA (acide éthylène diamine tétraacêtique). Une petite quantité appropriée de chaque échantillon est tirée pour déterminer l'hormone de croissance, le glucagon et l'insuline par une titration radio-immuno-logique. L'hormone de croissance est déterminée par la méthode de Sinha et col., «Endocrinol.», 91, 784 (1972); le glucagon est déterminé par la méthode de Faloona et Unger, «Methods of Hormone Radioimmunoassay», Jaffe et col., Ed., Academic Press, New York, 1974, pp. 317-330, tandis que l'insuline est déterminée par la méthode de Haies et Rändle, «Biochem. J.», 88, 137 (1963). Les concentrations de l'hormone de croissance, du glucagon et de l'insuline dans le sang, pour les animaux ayant reçu le composé essayé, sont comparées par des méthodes statistiques classiques aux concentrations dans le sang pour le groupe témoin. Une inhibition est démontrée par une diminution significative de la concentration d'hormone. Male albino rats are subdivided into two groups (for example 9 rats per group). Each animal is given pentobarbital sodium (Nembutal) in the peritoneum at a dose of 50 mg / kg. After 15 min, the rats of one group receive a subcutaneous injection of the test compound in saline solution (normally 5 to 200 (ig, kg), while the rats of the other group (control group) receive the saline solution. 10 min later, each animal is given an injection of 0.5 ml of arginine (300 mg / ml, pH 7.2) into the heart 5 min after the injection of arginine, animals are decapitated and their blood is collected in Trasylol-EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid). A suitable small amount of each sample is drawn to determine growth hormone, glucagon and insulin by radioimmunoassay. Growth hormone is determined by the method of Sinha et al., "Endocrinol.", 91, 784 (1972); glucagon is determined by the method of Faloona and Unger, "Methods of Hormone Radioimmunoassay", Jaffe et al., Ed., Academic Press, New York, 1974, pp. 317-330, while insulin is determined by the Haie method s and Rändle, "Biochem. J. ", 88, 137 (1963). The concentrations of growth hormone, glucagon and insulin in the blood, for the animals having received the test compound, are compared by standard statistical methods to the concentrations in the blood for the control group. An inhibition is demonstrated by a significant decrease in the concentration of hormone.

Les résultats de l'essai pour les peptides des exemples 2, 4 et 6 sont présentés ci-après. The results of the test for the peptides of Examples 2, 4 and 6 are presented below.

Exp. Exp.

Composé Compound

Dose (Hg/kg) Dose (Hg / kg)

HC HC

(ng/kg) (ng / kg)

Insuline (|iU/ml) Insulin (| iU / ml)

Glucagon (Pg/ml) Glucagon (Pg / ml)

A AT

Témoin Witness

508 ± 13 j. 508 ± 13d.

298 ±33 154±39 298 ± 33 154 ± 39

61 ± 8* 61 ± 8 *

Exemple 2 Example 2

100 100

181 ±47 ' 181 ± 47 '

. 22 ± 7 . 22 ± 7

B B

Témoin Exemple 2 Witness Example 2

400 400

234±36* 67 ±13 234 ± 36 * 67 ± 13

187+21* 70 ±23 187 + 21 * 70 ± 23

41 ± 5, 9± 1 41 ± 5, 9 ± 1

E E

Témoin Witness

— -

354 ±57* 354 ± 57 *

336 ±31 * 336 ± 31 *

62 ±10 62 ± 10

Exemple 4 Example 4

200 200

81+ 6 81+ 6

128±33 128 ± 33

41 ±14 41 ± 14

Exp. Exp.

Composé Compound

Dose (Hg/kg) Dose (Hg / kg)

HC (ng/kg) HC (ng / kg)

Insuline (nU/ml) Insulin (nU / ml)

Glucagon (Pg/ml) Glucagon (Pg / ml)

F F

Témoin Exemple 6 Witness Example 6

100 100

363 ± 74 * 83± 16 ' 363 ± 74 * 83 ± 16 '

75± 8 60 ±10 75 ± 8 60 ± 10

162±29* 55 ±12 162 ± 29 * 55 ± 12

HC = hormone de croissance t = p<0,05 * = p<0,01 HC = growth hormone t = p <0.05 * = p <0.01

L'aptitude des composés de l'invention à assurer une inhibition prolongée de l'hormone de croissance peut être démontrée par le procédé d'essai suivant. The ability of the compounds of the invention to provide prolonged inhibition of growth hormone can be demonstrated by the following test method.

On subdivise des rats albinos mâles en deux groupes (9 rats par groupe). Les rats d'un groupe reçoivent une injection sous-cutanée du composé essayé (normalement 1 mg/kg) en solution saline, tandis que les rats de l'autre groupe reçoivent une injection sous-cutanée de la solution saline seule (groupe témoin). 20 min avant la fin de la période d'essai (2 à 4 h après injection), chaque animal reçoit une injection, dans le péritoine, de sodium pentobarbital à raison de 50 mg/kg. A la fin de l'expérience, des échantillons de sang sont prélevés de chaque animal par ponction cardiaque et chaque échantillon est mélangé avec du Trasylol-EDTA. Une petite quantité de chaque échantillon est titrée pour ce qui concerne l'hormone de croissance par une titration radio-immunologique. Les concentrations d'hormone de croissance dans le sang pour les animaux ayant reçu le composé essayé sont comparées par des méthodes statistiques classiques aux concentrations d'hormone de croissance que l'on a chez les animaux témoins. Les composés, considérés comme à longue durée d'action, créent une diminution significative de la concentration d'hormone de croissance dans le sang à une dose de 1 mg/ kg au moins 2 h après l'injection. Male albino rats are subdivided into two groups (9 rats per group). Rats in one group receive a subcutaneous injection of the test compound (normally 1 mg / kg) in saline, while rats in the other group receive a subcutaneous injection of saline alone (control group) . 20 min before the end of the test period (2 to 4 h after injection), each animal receives an injection, in the peritoneum, of sodium pentobarbital at the rate of 50 mg / kg. At the end of the experiment, blood samples are taken from each animal by cardiac puncture and each sample is mixed with Trasylol-EDTA. A small amount of each sample is titrated for growth hormone by radioimmunoassay. The concentrations of growth hormone in the blood for the animals having received the test compound are compared by conventional statistical methods with the concentrations of growth hormone which are found in the control animals. The compounds, considered to be long-acting, create a significant decrease in the concentration of growth hormone in the blood at a dose of 1 mg / kg at least 2 h after injection.

Lorsqu'on l'essaie suivant le procédé d'essai décrit ci-dessus, le composé de l'exemple 2 donne les résultats suivants: When tested according to the test method described above, the compound of Example 2 gives the following results:

Exp. Exp.

Composé Compound

Dose (Hg/kg) Dose (Hg / kg)

Temps (h) Time (h)

HC dans plasma (ng/ml) HC in plasma (ng / ml)

C VS

Témoin Witness

_ _

2 2

213 + 14** 213 + 14 **

Exemple 2 Example 2

1000 1000

2 2

89 ± 5 89 ± 5

Témoin Witness

— -

4 4

182±12„ 182 ± 12 „

Exemple 2 Example 2

1000 1000

4 4

101 ± 13 101 ± 13

D D

Témoin Witness

— -

5 5

337 ± 36 . 337 ± 36.

Exemple 2 Example 2

1000 1000

5 5

230± 31 230 ± 31

Témoin Witness

— -

6 6

234 ±24 234 ± 24

Exemple 2 Example 2

1000 1000

6 6

172+34 172 + 34

HC = hormone de croissance ** = p< 0,001 f = p<0,05 HC = growth hormone ** = p <0.001 f = p <0.05

6 6

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

Ces résultats démontrent que le composé de l'exemple 2 assure une inhibition prolongée de l'hormone de croissance. These results demonstrate that the compound of Example 2 provides prolonged inhibition of growth hormone.

Claims

638,776

1. Compounds corresponding to the formulas:

s s

I I

CH2 CH2 (III)

I I

X-CHCO-XrXrPhe-Phe-Xj-Lys-Thr-Phe-Thr-X ^ NH-CH-COOH

or

SH SH

I I

ch2 ch2 (iv)

I I

X-CHCO-X1-X2-Phe-Phe-X3-Lys-Thr-Phe-Thr-X4-NH-CH-COOH

in which:

X represents H, -NH2, -NH-Gly-Ala, -NH-D-Ala-Ala, -NH-Gly-Gly-Gly, -NH-acetyl or NH-benzoyl;

Xj represents His or Arg;

X2 represents His, Glu, Tyr, Trp, or Phe;

X3 represents Trp, D-Trp, or 6-F-D-Trp, and X4 is a D-a-amino acid;

as well as their non-toxic acid addition salts, acceptable in pharmacy.

2. Compound according to claim 1, characterized in that it is cyclic disulfide (1 -► 12) of L-cysteinyl-L-arginyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl -L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-D-tyrosyl-L-cysteine.

2

3. Compound according to claim 1, characterized in that it is L-cysteinyl-L-arginyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl -L-phenylalanyl-L-threonyl-D-tyrosyl-L-cysteine.

4. Compound according to claim I, characterized in that it is cyclic disulfide (1 -► 12) of L-cysteinyl-L-arginyl-La-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl -L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-D-tyrosyl-L-cysteine.

5. Compound according to claim 1, characterized in that it is L-cysteinyl-L-arginyl-La-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl -L-phenylalanyl-L-threonyl-D-tyrosyl-L-cysteine.

6. Compound according to claim 1, characterized in that it is cyclic disulfide (1 - »12) of L-cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl -L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-D-seryl-L-cysteine.

7. Compound according to claim 1, characterized in that it is L-cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl -L-phenylalanyl-L-threonyl-D-seryl-L-cysteine.

8. A process for preparing a compound according to claim 1, characterized in that a peptidoresin of formula V is subjected:

S-Z I

CH2 I

Y-CHCO-Y i - Y 2-Phe-Phe-X3-Y 3-Y4-Phe-Y4 O

I II

Y5-NH-CHCO-CH2

I

(polystyrene resin) CH2

in which: S-Z

a) X3 represents Trp, D-Trp, or 6-F-D-Trp;

b) Y represents H, -NH (R), -NH-Gly-Ala (R), -NH-Gly-Gly-Gly (R), -NH-D-Ala-Ala (R), -NH-acetyl , or -NH-benzoyl;

c) Y represents His (R,) or Arg (R,);

d) Y2 represents His ^), Glu (R2), Tyr (R3), Trp, or Phe;

e) Y3 represents Lys (R4);

f) Y4 represents Thr (R5);

g) Y5 represents D-Pro, D-Ala, D-Val, D-Leu, D-isoleu, D-Ser (Rs), D-Thr (R5), D-Asp (R2), D-Glu (R2 ), D-Lys (R4), D-Arg (Rt), D-Asn, D-His ^ j), D-Trp, D-Phe, or D-Tyr (R3), and h) Z is the group protector formed by the p-methoxy-benzyl radical;

R is an a-amino protecting group,

Ri is a protecting group for the nitrogen atom of guanidine or imidazole,

R2 is a protecting group for carboxylic acid,

R3 is an aromatic hydroxyl protecting group, R4 is an amino amino protecting group, and R5 is an aliphatic hydroxyl protecting group, on a cleavage reaction of all the protecting groups and the resin.

9. Peptidoresin of formula V given in claim 8, for the implementation of the method according to claim 8.

10. Peptidoresin according to claim 9, characterized in that r represents t-butyloxycarbonyl; ri represents tosyle; r2 represents benzyl (ester); r3 represents 2,6-dichlorobenzyl; r4 represents 2-chlorobenzyloxycarbonyl, and rs represents benzyl- (ether).