CN101778859B - 改良的用于生产核苷酸糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于生产核苷酸糖的方法(例如，大规模工艺过程)，所述核苷酸糖用聚合物修饰基团，例如聚(环氧烷)部分(例如，聚(乙二醇)或聚(丙二醇)部分)进行修饰。本发明的典型工艺过程包括阴离子交换色谱法，随后为超滤操作程序，例如切向流过滤。本发明的工艺过程以出乎意料地高纯度和高总产率提供经修饰的核苷酸糖。

Description

改良的用于生产核苷酸糖的方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2007年6月12日提交的美国临时专利申请号60/943,527、2007年8月27日提交的美国临时专利申请号60/968,274和2007年9月5日提交的美国临时专利申请号60/970,247的优先权，这些文献中的每一篇通过提及而以其整体合并入本文以用于所有目的。
发明领域
本发明涉及制备糖-核苷酸的方法，其中糖部分用聚合物修饰基团进行修饰。
发明背景
经由酶促催化的反应(例如，使用糖基转移酶)和/或其他合成方法生产的核苷酸糖常常以复杂的混合物的形式获得，所述复杂的混合物不仅包含所需化合物而且还包含污染物，例如未反应的糖、盐、丙酮酸盐、磷酸盐、核苷、核苷酸、蛋白质等。这些污染物的存在对于许多下游应用来说是不希望的。通常使用一个或多个色谱纯化步骤来去除副产物。常用的色谱方法是反相色谱法。然而，由于昂贵的分离介质和预填充柱的有限供应，反相色谱法对于大规模应用来说常常是不可行的。此外，对于反相色谱法，为了最佳分离和解析通常需要有机溶剂。对于可用于产生核苷酸糖并且从复杂的反应混合物中分离出它们的在成本和时间方面有效的工艺过程以及纯化方法存在有需要。本发明解决了这个和其他需要。
发明概述
本发明提供了用于生产核苷酸糖的方法(例如，大规模工艺过程)，所述核苷酸糖用聚合物修饰基团进行修饰。示例性的修饰基团包含至少一个聚合物部分，其选自聚(环氧烷)部分，例如聚(乙二醇)(PEG)和聚(丙二醇)(PPG)部分。特别地，本发明提供了用于生产经修饰的胞苷一磷酸-唾液酸(CMP-SA)的工艺过程。可以使用本发明的方法来生产的示例性的经修饰的核苷酸糖包括CMP-SA-PEG-10kDa、CMP-SA-PEG-20kDa和CMP-SA-甘油-PEG-40kDa(关于示例性的CMP-SA-PEGs，参见图2)。
经修饰的核苷酸糖在例如糖缀合(例如，糖PEG化(GlycoPEGylation))过程中使用。已经描述了用于合成经修饰的核苷酸糖(例如，CMP-SA-PEGs)的各种方法。参见例如，于2002年10月9日提交的WO2003/31464、于2004年4月9日提交的WO2004/99231和于2006年11月3日提交的WO2007/056191，这些文献的公开内容通过提及而以其整体合并入本文以用于所有目的。
经修饰的核苷酸糖可以通过下列方式来制备：使掺入了反应性官能团(例如，氨基)的核苷酸糖衍生物与反应性聚合物试剂(例如PEG-对硝基苯基(pNP)碳酸酯)进行反应。例如，CMP-SA-PEGs，诸如CMP-SA-PEG-10kDa、CMP-SA-PEG-20kDa和CMP-SA-甘油-PEG-40kDa可以通过使CMP-SA-甘氨酸(GSC)与掺入了对硝基苯基碳酸酯部分的PEG试剂进行反应来制备。根据这个实施方案的示例性的合成途径概述在图2中。出乎意料地，本发明人发现，在PEG-对硝基苯基(pNP)碳酸酯(例如，mPEG-对硝基苯基)和核苷酸糖衍生物(例如，CMP-SA-甘氨酸)之间的偶联反应过程中，在水性溶剂系统中约8.0至约8.8的pH范围是关键性的。经优化的pH范围在很大程度上减少了由于反应伙伴的水解而引起的副产物形成，并因此显著增加终产物的产率和纯度。
本发明描述了这样的工艺过程，其合并了更少的生产步骤并且以相比于已知方法而言经改善的纯度和总产率提供经修饰的核苷酸糖(例如，CMP-SA-PEGs)。典型的工艺过程合并了(a)阴离子交换色谱法(AEX)，其可用于例如去除基于PEG的杂质。阴离子交换色谱法之后为(b)使用膜过滤(即，超滤)，例如切向流过滤(tangential flow filtration，TFF)，来使该经部分纯化的产物溶液脱盐。本发明的代表性工艺过程描绘在图1中。在一个实例中，TFF步骤使用这样的膜，所述膜具有比待纯化的经修饰的核苷酸糖的分子量显著更小的分子量截止值(molecular weightcutoff，MWCO)。例如，对于CMP-SA-PEG-10kDa、CMP-SA-PEG-20kDa和CMP-SA-甘油-PEG-40kDa，使用具有约10kDa至约1kDa的分子量截止值的膜。该经改良的工艺过程不需要在阴离子交换色谱法之前的超滤(例如，TFF)。取而代之，可以通过使存在于反应混合物中的部分溶剂(例如，THF)蒸发来减少粗制反应混合物的体积。在一个实例中，使用旋转蒸发来完成所述蒸发。然后，在对混合物实施阴离子交换色谱法之前，可以使该体积减少的混合物进行过滤以去除颗粒，例如通过0.22μm滤器。在一个实例中，以大于约90％(w/w)的纯度获得通过本发明的方法生产的经修饰的核苷酸糖(例如，CMP-SA-PEGs)，并且以约60至约80％的产率得到分离。
在各种实例中，本发明提供了制备组合物的方法，所述组合物包含与聚合物修饰基团共价连接的经修饰的核苷酸糖，其中所述聚合物修饰基团包含至少一个线性或支化的聚(环氧烷)部分。所述方法包括：(i)使包含所述经修饰的核苷酸糖的反应混合物与阴离子交换介质相接触；(ii)从所述阴离子交换介质中洗脱出所述经修饰的核苷酸糖，从而形成包含所述经修饰的核苷酸糖的洗出液级分；和(iii)使所述洗出液级分脱盐。所述方法优选地在阴离子交换色谱法之前不包括超滤(例如，TFF)。
在一个具体的实例中，本发明的方法包括：(i)使包含伯氨基的核苷酸糖衍生物与掺入了对硝基苯基碳酸酯部分的经活化的聚(环氧烷)部分在对于在所述核苷酸糖衍生物的氨基和所述聚(环氧烷)部分之间形成共价键来说足够的条件下相接触。所述接触在具有约8.0至约8.8的pH的水性溶剂存在下发生。形成反应混合物，其包含经修饰的核苷酸糖。所述方法进一步包括：(ii)使所述反应混合物与阴离子交换介质接触，和(iii)从所述阴离子交换介质中洗脱出所述经修饰的核苷酸糖，从而形成包含所述经修饰的核苷酸糖的洗出液级分。所述方法可以进一步包括：(iv)使用膜过滤来使所述洗出液级分脱盐；和(v)从所述洗出液级分中去除水。所述方法优选地在步骤(i)之前不包括超滤。
本发明进一步提供了通过本发明的方法生产的经修饰的核苷酸糖。
附图简述
图1是本发明的示例性生产工艺过程的图解。
图2是合成流程图，其概述了用于合成掺入了线性的(例如，CMP-SA-PEG-10kDa和CMP-SA-PEG-20kDa)和支化的(例如，CMP-SA-PEG-甘油-40kDa)PEG部分的CMP-SA-PEGs的示例性方法。在图2中，n是选自1-2500的整数。
图3是概括了在核苷酸糖PEGs(例如，CMP-SA-PEGs)的合成过程中形成的副产物的图解，所述合成使用牵涉核苷酸糖衍生物(例如，CMP-SA-甘氨酸)和PEG-对硝基苯基碳酸酯试剂(例如，mPEG-pNF)的偶联反应。在mPEG-对硝基苯基碳酸酯的水解过程中可以形成杂质mPEG-OH和对硝基苯酚(PNP)。经由CMP-SA甘氨酸和/或CMP-SA-PEG的水解可以形成CMP。通过CMP-SA-PEG的水解可以形成SA-PEG。在图3中，n是选自1-2500的整数。
图4是在CMP-SA-PEG-10kDa的纯化过程中获得的阴离子交换色谱图，所述纯化使用实施例2.2中所描述的Q Sepharose Big Beads色谱柱和分阶碳酸氢钠洗脱方案(5mM NaHCO3，0.6CV；30mM，3CV；和1M，7CV)。保留时间为：SA-PEG-10kDa(55分钟)；CMP-SA-PEG-10kDa(63分钟)；CMP和CMP-SA-Gly(GSC，110分钟)；以及对硝基苯酚(180分钟)。
图5是在CMP-SA-PEG-10kDa的纯化过程中获得的阴离子交换色谱图，所述纯化使用实施例7中所描述的Q Sepharose Big Beads色谱柱和碳酸氢钠梯度洗脱(0-30mM，经过3CV；30mM，2CV；30mM-280mM，经过5CV；和1M，10CV)。
图6是在CMP-SA-PEG-20kDa的纯化过程中获得的阴离子交换色谱图，所述纯化使用实施例2.3中所描述的Q Sepharose Big Beads色谱柱和碳酸氢钠分阶洗脱方案(2mM NaHCO3，1CV；30mM，3CV；和1M，7CV)。保留时间为：SA-PEG-20kDa(55分钟)；CMP-SA-PEG-20kDa(75分钟)；CMP和CMP-SA-Gly(120分钟)；以及对硝基苯酚(200分钟)。
图7是在CMP-SA-PEG-40kDa的纯化过程中获得的阴离子交换色谱图，所述纯化使用实施例2.4中所描述的Q Sepharose Big Beads色谱柱和碳酸氢钠分阶洗脱方案(2mM，1CV；和30mM，3CV)。
图8是在CMP-SA-PEG-40kDa的纯化过程中获得的阴离子交换色谱图，所述纯化使用实施例7中所描述的Q Sepharose Big Beads色谱柱和碳酸氢钠洗脱(2mM NaHCO3，4CV)。
发明详述
I.缩写
PEG，聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；Ara，阿拉伯糖基；Fru，果糖基；Fuc，岩藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺基；Glc，葡萄糖基；GlcNAc，N-乙酰葡糖胺基；Man，甘露糖基；ManAc，甘露糖胺基乙酸酯；Xyl，木糖基；和NeuAc，唾液酸基(N-乙酰神经胺基(N-acetylneuraminyl))；M6P，甘露糖-6-磷酸；BEVS，杆状病毒表达载体系统；CV，柱体积；NTU(nominal turbidity units)，公称浊度单位；vvm，体积/体积/分钟；ACN，乙腈；mcL，微升；RO，反渗透。
II.定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语一般具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。通常，在细胞培养、分子遗传学、有机化学以及核酸化学和杂交方面的本文所使用的命名以及实验室操作程序是本领域熟知并通常采用的那些。标准技术用于核酸和肽合成。所述技术和操作程序通常根据本领域的常规方法和本文件中各处所提供的各种一般参考文献(一般可参见Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，其通过提及而合并入本文)来进行。下面所描述的在分析化学和有机合成方面的本文所使用的命名以及实验室操作程序是本领域熟知并通常采用的那些。标准技术或其修改形式用于化学合成和化学分析。
术语“核苷酸糖”和术语“糖核苷酸”可互换使用，并且是指与附加的糖部分例如唾液酸共价连接的核苷酸。核苷酸糖任选地用聚合物修饰基团例如线性或支化的PEG部分进行共价修饰。
本发明的核苷酸糖的“糖部分”选自天然和非天然的呋喃糖和己糖。非天然糖类任选地在环上包含烷基化或酰化的羟基和/或胺部分，例如醚、酯和酰胺取代基。其他非天然糖类在环上在这样的位置处包含H、羟基、醚、酯或酰胺取代基，此类取代基在天然糖类中不存在于所述位置处。备选地，所述碳水化合物失去了在其名称所源自的碳水化合物中发现的取代基，例如脱氧糖。更进一步的示例性的非天然糖包括氧化型碳水化合物(例如，-糖酸和-糖醛酸)和还原型碳水化合物(糖醇)。所述糖部分可以是单糖、寡糖或多糖。
在本发明中使用的示例性天然糖包括葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、核糖、N-乙酰葡萄糖(GlcNAc)、唾液酸和N-乙酰半乳糖(GalNAc)。
类似地，核苷可以选自天然和非天然的核苷。在本发明中使用的示例性天然核苷包括胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶。各种非天然核苷以及制备它们的方法是本领域已知的。
术语“唾液酸”是指九碳羧基化糖家族中的任何成员。唾液酸家族中的最常见的成员是N-乙酰神经氨酸(2-酮-5-乙酰氨基-3，5-二脱氧-D-甘油基-D-galactononulo吡喃糖-1-酮酸(通常简写为Neu5Ac、NeuAc、NAN或NANA)。该家族的第二个成员是N-羟乙酰-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基被羟基化。第三个唾液酸家族成员是2-酮-3-脱氧-nonulosonic酸(KDN)(Nadano等人(1986)J.Biol.Chem.261：11550-11557；Kanamori等人，J.Biol.Chem.265：21811-21819(1990))。还包括9-取代的唾液酸，例如9-O-C1-C6酰基-Neu5Ac，如9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。关于唾液酸家族的综述，参见例如，Varki，Glycobiology 2：25-40(1992)；Sialic Acids：Chemistry，Metabolism and Function，R.Schauer，Ed.(Springer-Verlag，New York(1992))。唾液酸化操作程序中唾液酸化合物的合成和使用公开在1992年10月1日公布的国际申请WO 92/16640中。
术语“阴离子交换色谱法”包括牵涉填充柱的操作程序以及牵涉阴离子交换膜的操作程序。术语“阴离子交换色谱法”包括使用具有阴离子交换能力的任何混合式介质来进行的色谱法。
术语“水性溶剂”描述了掺入有至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％水(v/v)的溶剂。水性溶剂可以任选地包括水混溶性有机溶剂，例如醇(例如，甲醇、乙醇或丁醇)、THF和其他脂族醚或环醚。
术语“聚合物修饰基团”指附着至本发明的核苷酸糖的任何聚合物。聚合物修饰基团可以是水溶性的或者是基本上水不溶性的。在本发明中使用的示例性的水溶性聚合物包括PEG、m-PEG和其他官能化的PEG部分、m-PPG、PPG、聚唾液酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺和生物可降解聚合物(例如，聚交酯、聚甘油酯)。
术语“水溶性(的)”是指在水中具有一定的可检测程度的溶解度的部分。用于检测和/或定量水溶性的方法是本领域公知的。示例性的水溶性聚合物包括肽、糖、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等等。肽可以具有由单一氨基酸组成的混合序列，例如聚(赖氨酸)。示例性的多糖是聚(唾液酸)。示例性的聚(醚)是聚(乙二醇)，例如m-PEG。聚(乙烯亚胺)是示例性的聚胺，聚(丙烯酸)是代表性的聚(羧酸)。
水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇)(即，PEG)。然而，应该理解，其他相关的聚合物也适合用于实施本发明，并且术语PEG或聚(乙二醇)的使用在该方面意在是包括性的而不是排他性的。术语“PEG”包括以其任何形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、双官能PEG、多臂PEG、叉状PEG、支化PEG、悬挂型PEG(即具有一个或多个悬挂在聚合物主链上的官能团的PEG或相关聚合物)或者其中具有可降解的键的PEG。
聚合物主链可以是线性或支化的。支化的聚合物主链是本领域普遍已知的。通常，支化的聚合物具有中央分枝核心部分和多个连接至该中央分枝核心的线性聚合物链。PEG通常以支化形式使用，其可以通过向各种多元醇例如甘油、季戊四醇和山梨糖醇中添加环氧乙烷来制备。中央分枝部分也可以衍生自几种氨基酸，例如赖氨酸。支化的聚(乙二醇)可以表示为诸如R(-PEG-OH)m的通式，其中R代表核心部分，例如甘油或季戊四醇，和m代表臂的数目。多臂PEG分子，例如美国专利号5,932,462(该专利通过提及而以其整体合并入本文)中描述的那些，也可以用作聚合物主链。
许多其他聚合物也适合于本发明。非肽且水溶性的、具有2至约300个末端的聚合物主链尤其可用于本发明。合适的聚合物的实例包括，但不限于，其他聚(亚烷基二醇)例如聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)，如美国专利号5,629,384(该专利通过提及而以其整体合并入本文)中所描述的，以及其共聚物、三元共聚物和混合物。尽管聚合物主链的每条链的分子量可以变化，但是它通常在约100Da至约100,000Da，常常约6,000Da至约80,000Da的范围内。
“进料溶液”是指包含待纯化的化合物的任何溶液。例如，反应混合物可以用作进料溶液，通过使用本发明的方法从所述进料溶液中纯化出所需反应产物。
当取代基由其从左至右书写的常规化学式来指定时，它们同等地包括由将该结构从右到左书写而产生的化学上相同的取代基，例如，-CH2O-意在也叙述了-OCH2-。
除非另有说明，术语“烷基”自身或作为另一取代基的一部分，是指具有指定碳原子数(即，C1-C10是指1至10个碳)的直链或支链的或环状的(即环烷基)烃基或者其组合，其可以是完全饱和的、单或多不饱和的并且可以包括二价(例如，亚烷基)和多价基团。饱和烃基的实例包括但不限于诸如下列的基团：甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，异丁基，仲丁基，环己基，(环己基)甲基，环丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体，等等。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限于，乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。除非另有说明，术语“烷基”还意味着包括下面更详细定义的那些烷基衍生物，例如“杂烷基”。局限于碳氢化合物基团的烷基被称作“同烷基(homoalkyl)”。
术语“亚烷基”自身或作为另一取代基的一部分，是指衍生自烷烃的二价基团，例如但不限于-CH2CH2CH2CH2-，并且进一步包括下面描述为“杂亚烷基”的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)将具有1至24个碳原子，在本发明中优选的是具有10个或更少碳原子的那些基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基，其通常具有8个或更少碳原子。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以它们的常规含义使用，并且是指各自通过氧原子、氨基或硫原子附着至该分子的其余部分的那些烷基。
除非另有说明，术语“杂烷基”自身或与另一术语相组合地指稳定的直链或支链的或者环状的烃基或其组合，其由指定数目的碳原子和至少一个选自O、N、Si和S的杂原子组成，并且其中氮和硫原子可以任选地被氧化以及氮杂原子可以任选地被季铵化。可以将杂原子O、N和S及Si置于所述杂烷基的任何内部位置处或者置于该烷基附着至该分子的其余部分的位置处。实例包括但不限于，-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”自身或作为另一取代基的一部分，是指衍生自杂烷基的二价基团，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基，杂原子也可以占据链末端之一或两端(例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基，等等)。另外，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团式的书写方向并不意味着连接基团的取向。例如，式-CO2R’-表示-C(O)OR’-和-OC(O)R’-两者。
除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”自身或与其他术语相组合地分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据该杂环附着至该分子的其余部分的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另有说明，术语“卤代”或“卤素”自身或作为另一取代基的一部分，是指氟、氯、溴或碘原子。另外，诸如“卤代烷基”的术语意味着包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”意味着包括但不限于，三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另有说明，术语“芳基”是指多不饱和的芳香族取代基，其可以是单环或者稠合在一起或共价连接的多个环(优选1-3个环)。术语“杂芳基”是指包含1-4个选自N、O、S、Si和B的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选地被氧化以及氮原子任选地被季铵化。杂芳基可以通过杂原子附着至该分子的其余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述各芳基和杂芳基环体系的取代基选自下述可接受的取代基。
简言之，术语“芳基”，当与其他术语组合使用时(例如芳氧基、芳硫氧基(arylthioxy)、芳基烷基)，包括如上定义的芳基和杂芳基环两者。因此，术语“芳基烷基”意味着包括其中芳基附着至烷基的那些基团(例如苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，包括其中碳原子(例如亚甲基)被例如氧原子代替的那些烷基(例如苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
除非另外指明，上述术语(例如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)各自意味着包括所述基团的取代的和未取代的形式两者。下面提供了每种类型的基团的优选取代基。
烷基和杂烷基(包括通常被称为亚烷基、链烯基、亚杂烷基、杂链烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基通称为“烷基取代基”，而且它们可以是选自但不限于以下的多种基团中的一个或多个：取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，数目从0至(2m’+1)，其中m’为此类基团中碳原子的总数。R’、R”、R”’和R””各自优选独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基(例如被1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或者芳基烷基。例如当本发明的化合物包含超过一个R基团时，独立地选择各个R基团，当存在超过一个R’、R”、R”’和R””基团时，这些基团也一样选择。当R’和R”附着至同一个氮原子时，它们可以与该氮原子相组合以形成5-、6-或7-元环。例如，-NR’R”意味着包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从取代基的上述论述中，本领域技术人员将会理解，术语“烷基”意味着包括这样的基团，所述基团含有与除氢基团之外的其他基团例如卤代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)结合的碳原子。
类似于对于烷基所描述的取代基，将芳基和杂芳基的取代基通称为“芳基取代基”。所述取代基选自例如：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烷基，数目从0至该芳环体系上开放价的总数；并且其中R’、R”、R”’和R””优选独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。例如当本发明的化合物包含超过一个R基团时，独立地选择各个R基团，当存在超过一个R’、R”、R”’和R””基团时，这些基团也一样选择。
在芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被式-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基代替，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR’-或单键，以及q是0-3的整数。备选地，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被式-A-(CH2)r-B-的取代基代替，其中A和B独立地是-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，以及r是1-4的整数。如此形成的新环的单键之一可以任选地被双键代替。备选地，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被式-(CRR’)s-X-(CR”R”’)d-的取代基代替，其中s和d独立地是0-3的整数，以及X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。取代基R、R’、R”和R”’优选独立地选自氢或者取代或未取代的(C1-C6)烷基。
如本文所使用的，术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)和硼(B)。
符号“R”是一般性缩写，其代表取代基。示例性的取代基包括取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基和取代或未取代的杂环烷基。
本文所描述的所有寡糖以下列方式进行描述：非还原糖的名称或缩写(即Gal)，接着是糖苷键的构型(α或β)、环键(1或2)、参与该键的还原糖的环位置(2、3、4、6或8)，然后是还原糖的名称或缩写(即GlcNAc)。每种糖优选是吡喃糖。标准糖生物学命名法的综述参见Essentials of Glycobiology Varki等人(编辑)，CSHL Press(1999)。
寡糖被认为具有还原端和非还原端，不论在还原端处的糖是否实际上为还原糖。根据公认的命名，在本文中用在左侧的非还原端和在右侧的还原端来描述寡糖。
如本文所使用的，术语“经修饰的糖”是指天然或非天然存在的碳水化合物，其在本发明的工艺过程中被酶促添加到肽的氨基酸或者糖基残基上。经修饰的糖选自许多酶底物，包括但不限于糖核苷酸(单、二和三磷酸)、活化的糖(例如，糖基卤化物、糖基甲磺酸酯)和既未活化也非核苷酸的糖。“经修饰的糖”用“修饰基团”来共价官能化。可用的修饰基团包括，但不限于，PEG部分、治疗性部分、诊断性部分、生物分子等等。修饰基团优选地不是天然存在的或未修饰的碳水化合物。选择用修饰基团进行官能化的位置，从而使得它不妨碍“经修饰的糖”被酶促添加至肽。
如本文所使用的，术语“糖缀合”是指经修饰的糖种类与多肽(例如，通过本发明的方法制备的促红细胞生成素肽)的氨基酸或糖基残基的由酶介导的缀合。“糖缀合”的亚类别是“糖-PEG化(glyco-PEGylation)”，其中经修饰的糖的修饰基团是聚(乙二醇)、其烷基衍生物(例如，m-PEG)或反应性衍生物(例如，H2N-PEG、HOOC-PEG)。
术语“大规模”和“工业规模”可互换使用，并且是指这样的反应周期或工艺过程，所述反应周期或工艺过程在单个周期完成时产生至少约250mg，至少约500mg，至少约1克，至少约2克，至少约5g，至少约10g，至少约20g，至少约30g，至少约50或至少约100g的核苷酸糖。在一个实施方案中，本发明提供了大规模工艺过程，其适合于以千克规模(例如，每次合成/纯化运行产生至少约1kg，至少约1.5kg，至少约2kg或至少约3kg的经纯化的糖核苷酸)制备高纯度的核苷酸糖。
当涉及本发明的核苷酸糖或经修饰的核苷酸糖时，术语“分离的”或“纯化的”意指，此类材料基本上不含用于产生该材料的组分。“分离的”、“纯的”或“纯化的”可互换使用。可以通过任何本领域公认的分析方法(例如，经银染的凝胶上的条带强度、聚丙烯酰胺凝胶电泳、NMR、HPLC、ELISA或类似方法)来测定纯度。在一个实例中，将纯度测定为样品中存在的所需核苷酸糖的量和全部其他组分的量之间的比率(w/w)。例如，样品中核苷酸糖的浓度可以通过使用分析型色谱法(例如，HPLC、RP-HPLC)并结合核苷酸糖标准来测定。
通常，使用本发明的方法分离的核苷酸糖具有表示为一定范围的纯度水平。所述糖核苷酸的纯度范围的下端为约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约75％或约80％，而纯度范围的上端为约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或大于约95％。
当核苷酸糖大于约90％纯时，它的纯度也优选表示为范围。纯度范围的下端为约90％、约92％、约94％、约96％或约98％。纯度范围的上端为约92％、约94％、约96％、约98％或约100％的纯度(w/w)。
“核苷酸糖回收率”、“产率”或“反应产率”通常表示为在特定工艺过程步骤(或系列步骤)后回收的核苷酸糖的量和进入该工艺过程步骤的核苷酸糖的量之间的范围。例如，对于本发明的方法来说核苷酸糖的回收率为约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。在另一个实例中，对于本发明的方法来说核苷酸糖的回收率为约92％、约94％、约96％、约98％或大于约98％。
术语“加载缓冲液”是指这样的缓冲液，在所述缓冲液中将待纯化的肽施加至纯化装置，例如色谱柱或过滤器芯子。通常，如此来选择加载缓冲液，即使得可以完成将目的肽与不想要的杂质相分开。例如，当在羟基磷灰石(HA)或氟磷灰石柱上纯化肽时，可以如此来选择加载缓冲液的pH和加载缓冲液中的盐浓度，即使得该肽最初保留在柱上，而某些杂质在流出物中被发现。
术语“洗脱缓冲液”(也称为“限制缓冲液(limit buffer)”)是指这样的缓冲液，其通常用于从它早先所施加至的纯化装置(例如，色谱柱或过滤器芯子)中移除(洗脱)肽。通常，如此来选择加载缓冲液，即使得可以完成将目的肽与不想要的杂质相分开。常常地，在洗脱操作过程中改变洗脱缓冲液中特定盐(例如，NaCl)的浓度(梯度)。梯度可以是连续的或分阶的。
术语“室温”或“环境温度”是指至少约10℃、至少约15℃、至少约20℃或至少约25℃的温度。通常，室温为约20℃至约25℃。
III.方法
本发明提供了用于生产核苷酸糖的方法(例如，大规模工艺过程)。在一个实施方案中，所述核苷酸糖用聚合物修饰基团进行修饰(经修饰的核苷酸糖)。示例性的聚合物修饰基团在本文中公开。在一个实例中，聚合物修饰基团包含至少一个选自聚(环氧烷)部分的聚合物部分。示例性的聚(环氧烷)包括聚(乙二醇)(PEG)和聚(丙二醇)(PPG)部分。
在一个实例中，本发明提供了制备组合物的方法，所述组合物包含经修饰的核苷酸糖。在所述经修饰的核苷酸糖中，糖部分与聚合物修饰基团共价连接，其中所述聚合物修饰基团包含至少一个线性或支化的聚(环氧烷)部分。示例性的方法包括：(i)使包含所述经修饰的核苷酸糖的反应混合物与阴离子交换介质相接触；(ii)从所述阴离子交换介质中洗脱出所述经修饰的核苷酸糖，从而形成包含所述经修饰的核苷酸糖的洗出液级分；和(iii)使所述洗出液级分脱盐。出乎意料地，本发明人已发现，本发明的工艺过程导致以高纯度和高总产率获得经修饰的核苷酸糖，即使当该工艺过程在阴离子交换色谱法之前不包括超滤，并且反应混合物首先通过阴离子交换色谱法进行加工(例如，在通过去除溶剂和颗粒来对反应混合物进行调整后)时。因此，在一个实例中，该方法在阴离子交换色谱法即步骤(i)之前不包括超滤(例如，TFF)。
在一个示例性的实施方案中，上述方法可以进一步包括：(iv)减少反应混合物的体积。在一个实例中，通过使至少部分的溶剂蒸发(例如，在减压下)(例如，经由旋转蒸发)来减少反应混合物的体积。在一个实例中，反应混合物包含有机溶剂(例如，THF)，其通过在减压下蒸发而被基本上去除或部分去除。上述方法可以进一步包括(例如，在减少反应混合物的体积之后)：(v)使反应混合物过滤(例如，以便去除颗粒)。在一个典型实例中，反应混合物通过0.22μm滤器来进行过滤。在这个情况下，术语“过滤”不包括“超滤”。可用于为了阴离子交换色谱法而对反应混合物进行预处理的其他合适的过滤器描述在本文中。在一个具体的实例中，首先减少反应混合物的体积，并且对所得到的混合物实施过滤，随后使滤液与阴离子交换介质相接触。
在一个实例中，根据上述实施方案中的任一个，该方法可以进一步包括，例如在步骤(iii)之后：(v)从洗出液级分中去除水。在一个实例中，通过对洗出液级分实施冷冻干燥或喷雾干燥来去除水。通常，这些操作程序导致基本上干燥的产物，其中残留水含量为例如小于约10％(w/w)、小于约5％(w/w)、小于约4％(w/w)、小于约3％(w/w)、小于约2％(w/w)或小于约1％(w/w)。
在一个具体的实例中，本发明提供了制备组合物的方法，所述组合物包含经修饰的核苷酸糖，其中将聚合物修饰基团共价连接至所述核苷酸糖。在一个实例中，所述聚合物修饰基团包含至少一个线性或支化的聚(环氧烷)部分。所述方法包括：(i)使包含伯氨基的核苷酸糖衍生物与掺入了对硝基苯基碳酸酯部分的经活化的聚(环氧烷)部分在对于在所述核苷酸糖衍生物的氨基和所述聚(环氧烷)部分之间形成共价键来说足够的条件下相接触。所述接触在具有约8.0至约8.8的pH的水性溶剂存在下发生。因此，形成反应混合物，其包含经修饰的核苷酸糖。所述方法可以进一步包括：(ii)使所述反应混合物与阴离子交换介质接触，和(iii)从所述阴离子交换介质中洗脱出所述经修饰的核苷酸糖，从而形成包含所述经修饰的核苷酸糖的洗出液级分。所述方法可以进一步包括：(iv)使用膜过滤来使所述洗出液级分脱盐；和(v)从所述洗出液级分中去除水(例如，经由任选地在添加剂存在下进行冷冻干燥或喷雾干燥)。所述方法优选地在步骤(i)之前不包括超滤。
在任一个上述实施方案中有用的示例性的聚合物修饰基团在下文中公开。在一个实例中，所述聚合物修饰基团包含至少一个选自聚(环氧烷)部分的聚合物部分。示例性的聚(环氧烷)包括聚(乙二醇)(PEG)和聚(丙二醇)(PPG)。在一个实例中，PEG修饰基团具有约5kDa-约600kDa、约5kDa-约500kDa、约5kDa-约400kDa、约10kDa-约400kDa、约10kDa-约300kDa、约10kDa-约200kDa或约10kDa-约100kDa的分子量。在一个具体的实例中，PEG部分具有约10kDa-约80kDa、约10kDa-约60kDa或约10kDa-约40kDa的分子量。在一个实例中，所述聚合物修饰基团是支化的，并且包含与至少两个聚合物部分(例如，两个PEG部分)共价连接的甘油主链。
核苷酸糖
根据任一个上述实施方案的核苷酸糖或经修饰的核苷酸糖包含与磷酸部分(选自单磷酸、二磷酸、三磷酸和多磷酸部分)共价连接的核苷部分以及与磷酸部分共价连接的附加的糖部分。核苷酸糖的核苷部分可以是任何核苷或脱氧核苷，包括腺苷、鸟苷、5-甲基尿苷、尿苷、胞苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷和脱氧胞苷。另外的核苷部分描述在本文中。本发明的方法可用于生产核苷酸糖，其中核苷酸处于各种磷酸化状态中。因此，所述核苷酸糖的示例性核苷酸包括CMP、CDP、CTP、AMP、cAMP、ADP、ATP、UMP、UDP、UTP、GMP、cGMP、GDP、GTP、TMP、TDP和TTP以及这些和其他核苷酸(包括经修饰的核苷酸)的脱氧形式。
所述核苷酸糖的糖部分可以是任何糖基部分，包括单糖和寡糖。示例性的糖部分包括唾液酸、葡萄糖、GlcNAc、甘露糖、岩藻糖、半乳糖、GalNAc及其组合。术语“糖基部分”或“糖部分”包括“糖基模拟部分”。
示例性的核苷酸糖包括CMP-SA、CDP-SA、CTP-SA、AMP-SA、cAMP-SA、ADP-SA、ATP-SA、UMP-SA、UDP-SA、UTP-SA、GMP-SA、cGMP-SA、GDP-SA、GTP-SA、TMP-SA、TDP-SA和TTP-SA、CMP-GlcNAc、CDP-GlcNAc、CTP-GlcNAc、AMP-GlcNAc、cAMP-GlcNAc、ADP-GlcNAc、ATP-GlcNAc、UMP-GlcNAc、UDP-GlcNAc、UTP-GlcNAc、GMP-GlcNAc、cGMP-GlcNAc、GDP-GlcNAc、GTP-GlcNAc、TMP-GlcNAc、TDP-GlcNAc和TTP-GlcNAc、CMP-Gal、CDP-Gal、CTP-Gal、AMP-Gal、cAMP-Gal、ADP-Gal、ATP-Gal、UMP-Gal、UDP-Gal、UTP-Gal、GMP-Gal、cGMP-Gal、GDP-Gal、GTP-Gal、TMP-Gal、TDP-Gal和TTP-Gal、CMP-GalNAc、CDP-GalNAc、CTP-GalNAc、AMP-GalNAc、cAMP-GalNAc、ADP-GalNAc、ATP-GalNAc、UMP-GalNAc、UDP-GalNAc、UTP-GalNAc、GMP-GalNAc、cGMP-GalNAc、GDP-GalNAc、GTP-GalNAc、TMP-GalNAc、TDP-GalNAc和TTP-GalNAc、CMP-Glc、CDP-Glc、CTP-Glc、AMP-Glc、cAMP-Glc、ADP-Glc、ATP-Glc、UMP-Glc、UDP-Glc、UTP-Glc、GMP-Glc、cGMP-Glc、GDP-Glc、GTP-Glc、TMP-Glc、TDP-Glc和TTP-Glc、CMP-岩藻糖、CDP-岩藻糖、CTP-岩藻糖、AMP-岩藻糖、cAMP-岩藻糖、ADP-岩藻糖、ATP-岩藻糖、UMP-岩藻糖、UDP-岩藻糖、UTP-岩藻糖、GMP-岩藻糖、cGMP-岩藻糖、GDP-岩藻糖、GTP-岩藻糖、TMP-岩藻糖、TDP-岩藻糖和TTP-岩藻糖、CMP-Man、CDP-Man、CTP-Man、AMP-Man、cAMP-Man、ADP-Man、ATP-Man、UMP-Man、UDP-Man、UTP-Man、GMP-Man、cGMP-Man、GDP-Man、GTP-Man、TMP-Man、TDP-Man和TTP-Man及其脱氧变体。上述核苷酸糖中的任何一种可以是通过本发明方法生产的经修饰的核苷酸糖的一部分。在优选的实施方案中，这些经修饰的核苷酸糖中的聚合物修饰基团(例如，线性或支化的PEG部分)共价附着至核苷酸糖的糖部分，任选地经由接头部分。
可以使用本发明的方法来生产的示例性的经修饰的核苷酸糖包括：CMP-SA-PEG、CDP-SA-PEG、CTP-SA-PEG、AMP-SA-PEG、cAMP-SA-PEG、ADP-SA-PEG、ATP-SA-PEG、UMP-SA-PEG、UDP-SA-PEG、UTP-SA-PEG、GMP-SA-PEG、cGMP-SA-PEG、GDP-SA-PEG、GTP-SA-PEG、TMP-SA-PEG、TDP-SA-PEG和TTP-SA-PEG、CMP-GlcNAc-PEG、CDP-GlcNAc-PEG、CTP-GlcNAc-PEG、AMP-GlcNAc-PEG、cAMP-GlcNAc-PEG、ADP-GlcNAc-PEG、ATP-GlcNAc-PEG、UMP-GlcNAc-PEG、UDP-GlcNAc-PEG、UTP-GlcNAc-PEG、GMP-GlcNAc-PEG、cGMP-GlcNAc-PEG、GDP-GlcNAc-PEG、GTP-GlcNAc-PEG、TMP-GlcNAc-PEG、TDP-GlcNAc-PEG  和TTP-GlcNAc-PEG、CMP-Gal-PEG、CDP-Gal-PEG、CTP-Gal-PEG、AMP-Gal-PEG、cAMP-Gal-PEG、ADP-Gal-PEG、ATP-Gal-PEG、UMP-Gal-PEG、UDP-Gal-PEG、UTP-Gal-PEG、GMP-Gal-PEG、cGMP-Gal-PEG、GDP-Gal-PEG、GTP-Gal-PEG、TMP-Gal-PEG、TDP-Gal-PEG和TTP-Gal-PEG、CMP-GalNAc-PEG、CDP-GalNAc-PEG、CTP-GalNAc-PEG、AMP-GalNAc-PEG、cAMP-GalNAc-PEG、ADP-GalNAc-PEG、ATP-GalNAc-PEG、UMP-GalNAc-PEG、UDP-GalNAc-PEG、UTP-GalNAc-PEG、GMP-GalNAc-PEG、cGMP-GalNAc-PEG、GDP-GalNAc-PEG、GTP-GalNAc-PEG、TMP-GalNAc-PEG、TDP-GalNAc-PEG  和TTP-GalNAc-PEG、CMP-Glc-PEG、CDP-Glc-PEG、CTP-Glc-PEG、AMP-Glc-PEG、cAMP-Glc-PEG、ADP-Glc-PEG、ATP-Glc-PEG、UMP-Glc-PEG、UDP-Glc-PEG、UTP-Glc-PEG、GMP-Glc-PEG、cGMP-Glc-PEG、GDP-Glc-PEG、GTP-Glc-PEG、TMP-Glc-PEG、TDP-Glc-PEG  和TTP-Glc-PEG、CMP-岩藻糖-PEG、CDP-岩藻糖-PEG、CTP-岩藻糖-PEG、AMP-岩藻糖-PEG、cAMP-岩藻糖-PEG、ADP-岩藻糖-PEG、ATP-岩藻糖-PEG、UMP-岩藻糖-PEG、UDP-岩藻糖-PEG、UTP-岩藻糖-PEG、GMP-岩藻糖-PEG、cGMP-岩藻糖-PEG、GDP-岩藻糖-PEG、GTP-岩藻糖-PEG、TMP-岩藻糖-PEG、TDP-岩藻糖-PEG和TTP-岩藻糖-PEG、CMP-Man-PEG、CDP-Man-PEG、CTP-Man-PEG、AMP-Man-PEG、cAMP-Man-PEG、ADP-Man-PEG、ATP-Man-PEG、UMP-Man-PEG、UDP-Man-PEG、UTP-Man-PEG、GMP-Man-PEG、cGMP-Man-PEG、GDP-Man-PEG、GTP-Man-PEG、TMP-Man-PEG、TDP-Man-PEG和TTP-Man-PEG及其脱氧变体。上述PEG部分中的任何一种可以用另一种聚合物部分例如PPG部分替代。
在一个实例中，本发明的糖核苷酸或经修饰的糖核苷酸包含胞苷作为核苷和包含唾液酸作为糖部分。在一个具体的实例中，所述糖核苷酸或经修饰的核苷酸糖包括胞苷一磷酸-唾液酸(CMP-SA)。在另一个实例中，所述核苷酸糖是CMP-SA。在一个进一步的实例中，所述经修饰的核苷酸糖是与线性或支化的PEG部分共价连接的CMP-SA(CMP-SA-PEG)。
在一个实例中，根据任一个上述实施方案的核苷酸糖是选自下述的成员：
Figure G2008800255677D00201
其中每个n是独立地选自1-2500的整数。在一个实例中，n选自约100-约1000，约100-约800，约100-约600，约100-约500。每个Q是独立地选自H、负电荷和盐抗衡离子(例如，Na、K)的成员。每个Q1是独立地选自下列的成员：H，和C1-C6烷基，例如甲基、乙基、丙基(例如，正丙基、异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基)、戊基和己基。
在示例性的实施方案中，根据上述方法中的任一种，阴离子交换介质选自季铵树脂和二乙基氨基乙基(DEAE)树脂。在另一个实例中，阴离子交换介质是sepharose树脂(例如，Q-sepharose)。另外的阴离子交换介质描述在本文中，它们中的每一种同样地可用于本发明的方法。在一个实例中，阴离子交换介质是季铵树脂，其包含碳酸氢根离子作为抗衡离子。例如，在使用之前用碳酸氢盐缓冲液(例如，NaHCO3)处理季铵树脂。
在另一个实例中，使用碳酸氢盐缓冲液从阴离子交换介质中洗脱出核苷酸糖。例如，使用分阶洗脱方案或梯度(其中洗脱缓冲液中的碳酸氢盐浓度从约0mM增至约1M碳酸氢盐(例如，NaHCO3))来洗脱出核苷酸糖。通常，经PEG修饰的核苷酸糖(例如，CMP-SA-PEG)紧接着相应的经修饰的糖(例如，SA-PEG)被洗脱出来，所述相应的经修饰的糖是用于形成经修饰的核苷酸糖的偶联反应的常见副产物。出乎意料地，本发明人已发现，可以通过使用低碳酸氢盐浓度或缓慢梯度(牵涉约0.01mM至约30mM碳酸氢盐)来将核苷酸糖与相应的经修饰的糖相分开。因此，在一个实例中，使用碳酸氢盐缓冲液从阴离子交换介质中洗脱出核苷酸糖，所述碳酸氢盐缓冲液包含约0.01mM-约50mM、约0.01mM-约30mM、约0.01mM-约20mM或约0.01mM-约10mM的碳酸氢盐浓度。反应混合物的其他污染物(例如，核苷、未修饰的核苷酸糖)通常在高于约30或50mM的碳酸氢盐浓度下被洗脱出来。
在另一个示例性的实施方案中，被加载到阴离子交换柱上(即，与阴离子交换介质相接触)的反应混合物(阴离子交换进料溶液)具有小于约10mS/cm、小于约8mS/cm、小于约6mS/cm、小于约5mS/cm、小于约4mS/cm、小于约3mS/cm或小于约2mS/cm的盐电导率。在一个实例中，被加载到阴离子交换柱上的反应混合物具有小于约1mS/cm，小于约0.8、0.6、0.4或0.2mS/cm的盐电导率。可以在阴离子交换色谱法之前调整反应混合物的盐电导率，例如通过用水稀释反应混合物。
在根据任一个上述实施方案的一个实例中，步骤(iii)的脱盐使用膜过滤例如超滤来完成。例如，使用切向流过滤(TFF)来完成所述脱盐。可用于脱盐的超滤膜是本领域已知的。示例性的膜描述在本文中。在一个实例中，超滤膜具有比核苷酸糖的分子量小的MWCO。因此，核苷酸糖被该膜保留，而盐离子可以通过该膜过滤器。例如，用于使核苷酸糖溶液脱盐的超滤膜具有小于约100kDa、小于约80kDa、小于约60kDa、小于约40kDa或小于约20kDa的分子量截止值。在一个具体的实例中，超滤膜具有小于约10kDa的分子量截止值。用于使具有约10kDa-60kDa的PEG部分的CMP-SA-PEGs脱盐的超滤膜通常具有约1kDa-约5kDa的分子量截止值。
在一个实例中，上述脱盐步骤(例如，牵涉膜过滤，例如超滤)导致核苷酸糖溶液(例如，洗出液级分)具有相比于膜过滤之前的盐电导率而言降低的盐电导率。例如，在膜过滤之后洗出液级分的降低的盐电导率为约1μS/cm-约1000μS/cm。在一个具体的实例中，在膜过滤之后洗出液级分的盐电导率为约1μS/cm-约600μS/cm、约1μS/cm-约400μS/cm、约1μS/cm-约200μS/cm、约10μS/cm-约100μS/cm、约10μS/cm-约80μS/cm、约10μS/cm-约60μS/cm、约10μS/cm-约40μS/cm、约10μS/cm-约20μS/cm或约1μS/cm-约10μS/cm。在一个优选的实例中，在膜过滤期间盐电导率降低至小于约400μS/cm、小于约300μS/cm、小于约200μS/cm、小于约100μS/cm、小于约80μS/cm、小于约60μS/cm、小于约50μS/cm、小于约40μS/cm、小于约30μS/cm、小于约20μS/cm、小于约10μS/cm、小于约8μS/cm、小于约6μS/cm、小于约4μS/cm、小于约2μS/cm或小于约1μS/cm。
在一个实例中，将超滤(例如，TFF)用于减少洗出液级分或纯化的经修饰的核苷酸糖溶液的终体积。
在一个具体的实例中，本发明提供了用于生产经修饰的胞苷一磷酸-唾液酸(CMP-SA)核苷酸的工艺过程。可以使用本发明的方法来生产的示例性的经修饰的核苷酸糖包括CMP-SA-PEG-10kDa、CMP-SA-PEG-20kDa和CMP-SA-甘油-PEG-40kDa。示例性的经修饰的核苷酸糖(CMP-SA-PEGs)显示在图2中。
在根据任一个上述实施方案的一个实例中，通过本发明的方法生产的核苷酸糖(例如，CMP-SA-PEG)具有至少约50％(w/w)、至少约60％(w/w)、至少约70％(w/w)、至少约80％(w/w)、至少约85％(w/w)、至少约90％(w/w)或至少约95％(w/w)的纯度。在一个具体的实例中，通过本发明的方法生产的核苷酸糖具有约50％-约100％(w/w)、约60％-约100％(w/w)、约80％-约100％(w/w)或约90％-约100％(w/w)的纯度。在另一个实例中，通过本发明的方法生产的核苷酸糖具有约96％-约100％(w/w)、约97％-约100％(w/w)、约98％-约100％(w/w)或约99％-约100％(w/w)的纯度。
在一个实施方案中，本发明的工艺过程用于从其他反应组分中纯化出核苷酸糖。在CMP-SA-PEGs的情况下，反应混合物可以包含例如mPEG-OH和对硝基苯酚(PNP)，其例如在mPEG-对硝基苯基碳酸酯的水解过程中形成。反应混合物可以进一步包含CMP，其例如经由CMP-SA甘氨酸和/或CMP-SA-PEG的水解而形成。反应混合物可以进一步包含SA-PEG(其例如通过CMP-SA-PEG的水解而形成)以及盐(图3)。
在一个实施方案中，本发明的方法提供了这样的CMP-SA-PEG产物，其包含相比于CMP-SA-PEG而言小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％的CMP(w/w)。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了这样的CMP-SA-PEG，其包含相比于CMP-SA-PEG而言小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％、小于约0.5％、小于约0.4％、小于约0.3％或小于约0.2％CMP(w/w)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了这样的CMP-SA-PEG产物，其包含相比于CMP-SA-PEG而言小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％的SA-PEG(w/w)。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了这样的CMP-SA-PEG，其包含相比于CMP-SA-PEG而言小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％、小于约0.5％、小于约0.4％、小于约0.3％或小于约0.2％SA-PEG(w/w)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了这样的CMP-SA-PEG产物，其包含相比于CMP-SA-PEG而言小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％的mPEG-OH(w/w)。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了CMP-SA-PEG，其包含相比于CMP-SA-PEG而言小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％、小于约0.5％、小于约0.4％、小于约0.3％或小于约0.2％mPEG-OH(w/w)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了这样的CMP-SA-PEG产物，其包含相比于CMP-SA-PEG而言小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％的对硝基苯酚(w/w)。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了这样的CMP-SA-PEG，其包含相比于CMP-SA-PEG而言小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％、小于约0.5％、小于约0.4％、小于约0.3％或小于约0.2％的对硝基苯酚(w/w)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了这样的CMP-SA-PEG产物，其包含相比于CMP-SA-PEG而言小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％的对硝基苯酚(w/w)。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了这样的CMP-SA-PEG，其包含相比于CMP-SA-PEG而言小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％、小于约0.5％、小于约0.4％、小于约0.3％或小于约0.2％的对硝基苯酚(w/w)。
在根据任一个上述实施方案的另一个实例中，以至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的总产率获得通过本发明的方法生产的核苷酸糖。在一个具体的实例中，以约50％-约100％、约60％-约95％、约80％-约95％或约90％-约95％的总产率获得通过本发明的方法生产的核苷酸糖。在另一个实例中，以约40％-约90％、约50％-约90％、约60％-约90％、约70％-约90％、约80％-约90％、约85％-约90％(w/w)或约85％-约95％的总产率获得通过本发明的方法生产的核苷酸糖。
在示例性的实施方案中，通过本发明的方法纯化的经修饰的核苷酸糖包含与一个或多个聚合物(例如支化的聚合物)相缀合的糖、活化的糖或核苷酸糖。示例性的聚合物包括水溶性和水不溶性的种类。
示例性的经修饰的核苷酸糖在核苷酸糖的糖部分内的任何位置处用聚合物修饰基团进行取代。在示例性的实施方案中，所述糖在C-1、C-2、C-3、C-4或C-5中的一个或多个处用接头或通过接头附着的聚合物修饰基团进行取代。在另一个实施方案中，本发明提供了这样的吡喃糖，所述吡喃糖在C-1、C-2、C-3、C-4、C-5或C-6中的一个或多个处用接头或通过接头附着至所述糖的修饰基团进行取代。优选地，所述接头和/或修饰基团直接附着至从所述糖的碳上悬挂出的氧、氮或硫。
在一个目前优选的实施方案中，所述聚合物接头或修饰基团被附加至经如此选择的位置，即使得所得到的缀合物充当用于将经修饰的糖部分连接至另一种类(例如肽、糖肽、脂质、糖脂等)的酶的底物。示例性的酶是本领域已知的，并且包括糖基转移酶(唾液酸转移酶、葡糖基转移酶、半乳糖基转移酶、N-乙酰葡糖基转移酶、N-乙酰半乳糖基转移酶、甘露糖基转移酶、岩藻糖基转移酶等)。本发明的示例性的糖核苷酸和活化的糖缀合物还包括突变型糖苷酶和突变型糖神经酰胺酶(其经修饰从而具有合成活性而不是水解活性)的底物。
在示例性的实施方案中，通过本发明的方法纯化的核苷酸糖具有选自下列的式：
Figure G2008800255677D00261
在式I和II中，R1是H、CH2OR7、COOR7或OR7，其中R7表示H、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的杂烷基。R2是H、OH、NH或包含核苷酸的部分。根据这个实施方案的示例性的R2种类具有下式：
Figure G2008800255677D00262
其中X1表示O或NH，并且R8是核苷。
符号R3、R4、R5、R6和R6’独立地表示H、取代或未取代的烷基、OR9、NHC(O)R10。指数d是0或1。R9和R10独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基或者唾液酸。R3、R4、R5、R6和R6’中的至少一个包含接头或接头-修饰基团，例如PEG。在示例性的实施方案中，R6和R6’连同它们所附着的碳一起是唾液酸的侧链的组分。在更进一步的示例性的实施方案中，这个侧链在C-6、C-7或C-9中的一个或多个处用接头或接头-修饰部分进行修饰。
在示例性的实施方案中，当w是0时，接头臂具有下面的结构，并且当w大于0时，修饰基团通过接头连接至糖核心：
Figure G2008800255677D00263
其中R11是聚合物部分，且L选自键和连接基团，并且w是1-6，优选地1-3，和更优选地1-2的整数。
当L是键时，它在R11的前体上的反应性官能团和L的前体上的具有互补反应性的反应性官能团之间形成。如本文所示的，具有合适的反应性官能团的前体的选择和制备在本领域技术人员的能力之内。此外，通过本领域众所周知的化学来使前体相合并。
在示例性的实施方案中，L是从提供经修饰的糖的氨基酸、氨基酸模拟物或小肽(例如，1-4个氨基酸残基)形成的连接基团。在另一个实施方案中，修饰基团通过接头进行附着，例如聚合物修饰部分通过取代的烷基接头进行附着。接头通过氨基酸的胺部分和羧酸(或反应性衍生物，例如活性酯、酰基卤等)与L和R11的前体上的具有互补反应性的基团的反应而形成。缀合物的元件可以以基本上任何方便的顺序进行缀合。例如，在缀合R11和L的前体之前，L的前体可以在适当的位置处位于糖核心上。备选地，可以制备在L上携带反应官能度的R11-L盒，并随后通过该种类上的具有互补反应性的反应性官能团而连接至糖。
在示例性的实施方案中，接头和/或修饰部分是R3和/或R6。在另一个示例性的实施方案中，R3和/或R6包含聚合物修饰部分和使聚合物部分与该分子的其余部分相连接的接头L。在另一个示例性的实施方案中，修饰部分是R3。在进一步的示例性的实施方案中，R3包含修饰基团和使修饰基团与该分子的其余部分相连接的接头L。在其中糖是唾液酸的另外一个示例性的实施方案中，接头和/或修饰基团在R5处或者附着在唾液酸侧链的位置例如C-9处。
在示例性的实施方案中，本发明提供了用于纯化在线性聚合物(例如水溶性或水不溶性的聚合物)之间形成的糖或活化的糖缀合物或核苷酸糖缀合物的方法。在这些缀合物中，聚合物附着至糖、活化的糖或糖核苷酸。如本文所讨论的，聚合物直接地或通过接头连接至糖部分。
根据这个实施方案的示例性的化合物具有根据式(I)或(II)的结构，其中R1、R3、R4、R5或R6中的至少一个具有下式：
R11存在或不存在。在这个实施方案中，示例性的接头衍生自天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物或氨基酸模拟物，或者由一个或多个此类种类形成的小肽。例如，在通过本发明的方法纯化的化合物中发现的某些支化的聚合物具有下式：
Figure G2008800255677D00281
Xa是连接部分，其通过支化的聚合物修饰部分的前体上的反应性官能团与糖部分，或接头的前体上的反应性官能团的反应而形成。例如，当X3’是羧酸时，它可以被活化，并且直接结合至从氨基糖(例如，GalNH2、GlcNH2、ManNH2等)上悬挂出的胺基团，从而形成作为酰胺的Xa。另外的示例性的反应性官能团和活化的前体描述在下文中。指数c表示1-10的整数。其他符号具有与上文所讨论的那些相同的身份。
在另一个示例性的实施方案中，Xa是与另一个接头形成的连接部分：
其中Xb是连接部分并且独立地选自对于Xa所示的那些基团，并且L1是键、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的杂烷基。
关于Xa和Xb的示例性种类包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、和OC(O)NH。
根据这个实施方案的另一个实例具有下式：
Figure G2008800255677D00283
其中s是0-20的整数，并且C(O)R11存在或不存在，并且当存在时，R11是修饰基团。
当修饰基团是PEG部分时，所述PEG部分可以具有任何分子量，例如，2kDa、5kDa、10kDa、20kDa、30kDa和40kDa可在本发明中使用。
示例性的核苷包括AMP、UMP、GMP、CMP、TMP、ADP、UDP、GDP、CDP、TDP、ATP、UTP、GTP、CTP、TTP、cAMP和cGMP。
在优选的实施方案中，通过本发明的方法纯化的糖包含用接头基团进行修饰的唾液酸。用于此类修饰的优选位点是R5、R6或R6’。因此，在优选的实施方案中，R1和R2中的至少一个包含接头。示例性的接头是甘氨酰基接头。
在另一个优选的实施方案中，通过本文所示的方法纯化的核苷酸糖具有下式：
Figure G2008800255677D00291
其中所述基团如上文所讨论，并且R11是存在或不存在的修饰基团。
在一个实施方案中，经修饰的唾液酸(核苷酸糖衍生物)具有下述结构：
Figure G2008800255677D00292
在另外一个实施方案中，修饰基团通过接头而附着至唾液酸。根据该描述的示例性的种类包括通过接头的伯氨基进行附着的修饰基团。示例性的修饰基团是水溶性聚合物，例如聚(乙二醇)和聚(丙二醇)。
在另一个实施方案中，通过本发明的方法生产的核苷酸糖具有下式：
Figure G2008800255677D00293
其中
Figure G2008800255677D00294
是接头-修饰基团。指数s是选自1-20的整数。指数f是选自1-2500的整数。Q是选自H和取代或未取代的C1-C6烷基的成员。
作为修饰基团而被包含在本发明的经修饰的核苷酸糖中的示例性PEG部分包括但不限于：
Figure G2008800255677D00301
其中La是选自键、取代或未取代的烷基和取代或未取代的杂烷基的接头。符号X5、R16和R17独立地表示聚合物部分和非反应性基团。X2和X4表示独立地选择的连接片段(linkage fragment)，其将聚合物部分R16和R17连接至C。指数m和n是独立地选自0-5000的整数。
符号A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11独立地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、-NA12A13、-OA12或-SiA12A13。A12和A13是独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基的成员。
关于X2和X4的示例性的连接片段包括CH2、S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、和OC(O)NH、CH2S、CH2O、CH2CH2O、CH2CH2S、(CH2)aO、(CH2)aS或(CH2)aY’-PEG或(CH2)aY’-PEG，其中Y’是S或O，并且a是1-50的整数。
在示例性的实施方案中，聚合物修饰基团具有根据下式的结构：
Figure G2008800255677D00311
在根据上式的另一个示例性的实施方案中，聚合物修饰基团具有根据下式的结构：
Figure G2008800255677D00312
在示例性的实施方案中，A1和A2各自是选自-OH和-OCH3的成员。
根据这个实施方案的示例性的接头-聚合物修饰基团包括：
Figure G2008800255677D00313
可在本发明中使用的线性和支化的聚合物(例如PEGs)的进一步的特别实施方案包括：
Figure G2008800255677D00314
Figure G2008800255677D00321
以及这些种类的碳酸酯类和活性酯类，例如：
Figure G2008800255677D00322
可以用于形成线性和支化的聚合物种类、这些种类的接头臂缀合物以及在这些化合物与糖和核苷酸糖之间的缀合物。
适合于活化可在制备本文所示化合物中使用的线性PEGs的其他示例性的活化或离去基团包括，但不限于，下述种类：
对于在聚合物修饰部分的前体上的所选部分来选择合适的活化基团完全在本领域技术人员的能力之内。
用这些和其他种类活化的PEG分子以及制备活化的PEGs的方法在WO 04/083259中给出。
在示例性的实施方案中，支化的聚合物是基于半胱氨酸、丝氨酸、赖氨酸、二赖氨酸或三赖氨酸核心的PEG。因此，进一步的示例性的支化PEGs包括：
Figure G2008800255677D00331
在另外一个实施方案中，支化的PEG部分基于三赖氨酸肽。三赖氨酸可以是单-、二-、三-或四-PEG化的。根据这个实施方案的示例性的种类具有下式：
Figure G2008800255677D00341
其中e、f和f’是独立地选自1-2500的整数；并且q、q’和q”是独立地选自1-20的整数。
在本发明的示例性实施方案中，PEG是m-PEG(5kD、10kD或20kD)。示例性的支化PEG种类是丝氨酸-或半胱氨酸-(m-PEG)2，其中m-PEG是20kD m-PEG。
如对于本领域技术人员来说显而易见的，可在本发明中使用的支化的聚合物包含在上文所示主题上的变化。例如，上文所显示的二赖氨酸-PEG缀合物可以包含三个聚合物亚单位，其中与α-胺键合的第三个聚合物亚单位在上文结构中显示为未修饰的。类似地，用三或四个聚合物亚单位进行官能化的三赖氨酸的使用在本发明的范围内。
本领域技术人员将会意识到，支化的聚合物的一个或多个m-PEG臂可以用具有不同末端(例如，OH、COOH、NH2、C2-C10-烷基等等)的PEG部分来代替。此外，上面的结构容易地通过在α-碳原子和侧链的官能团之间插入烷基接头(或者除去碳原子)来进行修饰。因此，“同型(homo)”衍生物和高级同系物，以及低级同系物在可用于本发明的支化PEGs的核心的范围内。
在示例性的实施方案中，La通过胺、酰胺或氨基甲酸乙酯键而附着至接头臂(例如甘氨酰基接头)的游离胺部分。
在另一个示例性的实施方案中，PEG是线性PEG。类似于支化PEG种类，线性PEG可以通过胺、酰胺或氨基甲酸乙酯键而附着至接头臂的胺部分。
在目前优选的实施方案中，将上文描述的糖类转变成其核苷类似物、包含接头臂的衍生物、其中修饰基团直接地或通过接头与所述糖类的糖残基附着的类似物、和这些基序中每一种的核苷酸加合物。
经修饰的核苷酸糖的形成
在根据任一个上述实施方案的另一个实例中，所述方法进一步包括：(vi)形成经修饰的核苷酸糖。在一个实例中，通过使包含反应性官能团(例如，伯氨基)的核苷酸糖衍生物与经活化的聚合物试剂(例如，经活化的聚(环氧烷)试剂)相接触来形成经修饰的核苷酸糖。可以通过掺入经活化的酯部分(例如，NHS-酯)、酰基氯基团或经活化的碳酸酯(例如，对硝基苯基碳酸酯)部分来活化所述聚合物试剂。示例性的经活化的聚合物试剂包括对硝基苯基部分。本领域技术人员将会意识到，适合于将两个反应伙伴相缀合的任何偶联反应可以用于将核苷酸糖共价连接至修饰基团。术语“核苷酸糖衍生物”是掺入了反应性官能团的任何核苷酸糖，所述反应性官能团可用于与聚合物修饰基团上的另一个反应性官能团形成共价键。示例性的反应性官能团包括亲核基团，例如氨基、羟基和巯基。示例性的亲电反应性官能团包括活化的酯、对硝基苯基碳酸酯、酰基氯等。
在一个实例中，通过使包含伯氨基的核苷酸糖衍生物与经活化的聚(环氧烷)部分在对于在核苷酸糖衍生物的氨基和聚(环氧烷)部分之间形成共价键来说足够的条件下相接触，来形成经修饰的核苷酸糖。在一个实例中，核苷酸糖衍生物是与甘氨酸部分共价连接的核苷酸糖。在另一个实例中，核苷酸糖衍生物选自CMP-SA-甘氨酸、AMP-SA-甘氨酸、UMP-SA-甘氨酸、GMP-SA-甘氨酸、CMP-SA-甘氨酸、TMP-SA-甘氨酸、ADP-SA-甘氨酸、UDP-SA-甘氨酸、GDP-SA-甘氨酸、CDP-SA-甘氨酸、TDP-SA-甘氨酸、ATP-SA-甘氨酸、UTP-SA-甘氨酸、GTP-SA-甘氨酸、CTP-SA-甘氨酸、TTP-SA-甘氨酸、cAMP-SA-甘氨酸和cGMP-SA-甘氨酸，其中唾液酸部分(SA)任选地被另一个糖部分(例如，Glc、GlcNAc、Gal、GalNAc、岩藻糖、甘露糖、木糖)替代，和/或甘氨酸部分任选地被另一个提供反应性官能团的接头部分替代。
在一个实例中，在酶例如糖基转移酶(例如，唾液酸转移酶)存在下，从核苷酸和糖酶促合成在本发明的方法中使用的核苷酸糖衍生物。用于合成和纯化核苷酸糖衍生物的示例性的方法以及示例性的酶公开在于11月3日提交的WO2007/056191中，所述文献的公开内容以其整体合并入本文。
在根据任一个上述实施方案的一个实例中，在具有约8.0至9.0、8.0至约8.9或约8.0至约8.8的pH的水性溶剂存在下，使包含伯氨基的核苷酸糖衍生物与包含对硝基苯基碳酸酯部分的经活化的聚合物部分(例如，聚(乙二醇)-对硝基苯基碳酸酯)相接触。
出乎意料地，本发明人已发现，在包含对硝基苯基(pNP)碳酸酯部分的经活化的聚合物修饰基团(例如PEG-对硝基苯基碳酸酯(例如，mPEG-对硝基苯基))和核苷酸糖衍生物(例如，CMP-SA-甘氨酸)之间的偶联反应过程中，在水性溶剂系统中约8.0至约8.8的pH范围是关键性的。经优化的pH范围(高于pH 7.0)在很大程度上减少了由于反应伙伴和产物的水解而引起的副产物形成，并因此显著增加终产物的产率和纯度。例如，在低于pH 7.0时，CMP-SA-甘氨酸和CMP-SA-PEG由于水解而分解，从而形成CMP、唾液酸-甘氨酸和唾液酸-PEG。示例性的分解产物显示在图3中。约8.0至约8.8(例如，约8.6至约8.7)的反应混合物的初始pH在达到最高转化产率方面是关键性的。在该工艺过程始终，最佳的pH范围是约8.0至约8.8。当pH降至低于8.0时，反应急剧减慢，从而导致差的转化产率。
例如，CMP-SA-PEGs(例如，CMP-SA-PEG-10kDa、CMP-SA-PEG-20kDa和CMP-SA-甘油-PEG-40kDa)可以通过使CMP-SA-甘氨酸(GSC)与掺入了对硝基苯基碳酸酯部分的PEG试剂(例如，线性或支化的具有10kDa、20kDa、40kDa、60kDa、80kDa、100kDa分子量的PEG试剂)进行反应来制备。根据这个实施方案的示例性合成途径概述在图2中。本发明提供了改良的方法，其中以比在已知的工艺过程中更大的纯度和更好的总产率获得CMP-SA-PEGs。
阴离子交换色谱法
在示例性的实施方案中，将包含目的核苷酸糖的样品加载到在加载缓冲液中的阴离子交换剂上，所述加载缓冲液所包含的盐浓度低于从柱上洗脱出核苷酸糖时所处的浓度。在一个实例中，如此选择缓冲液的pH，即使得核苷酸糖保留在阴离子交换介质上。改变缓冲液的pH将会改变核苷酸糖的电荷，并且降低pH值将会缩短与阴离子交换剂的保留时间。备选地，对阴离子交换条件进行选择以优先结合杂质，而纯化的肽在流出物中被发现。
柱可以用几个柱体积(CV)的缓冲液进行洗涤，以去除未结合的物质和/或与树脂弱结合的那些物质。然后，根据常规方法，使用例如碳酸氢盐梯度，从柱上洗脱出级分。溶液中的盐与核苷酸糖竞争与柱结合，并且释放出核苷酸糖。具有弱离子相互作用的组分在比具有强离子相互作用的组分更低的盐浓度下洗脱出来。从柱中收集样品级分。将包含高水平的所需核苷酸糖和低水平的杂质的级分汇集在一起，或者分开地进行加工。
阴离子交换介质是本领域技术人员已知的。示例性的阴离子交换介质例如描述在下列文献中：Protein Purification Methods，A PracticalApproach，Ed.Harris ELV，Angal S，IRL Press Oxford，England(1989)；Protein Purification，Ed.Janson JC，Ryden L，VCH-Verlag，Weinheim，Germany(1989)；Process Scale Bioseparations for the BiopharmaceuticalIndustry，Ed.Shukla AA，Etzel MR，Gadam S，CRC Press Taylor&Francis Group(2007)，第188-196页；Protein Purification Handbook，GE Healthcare 2007(18-1132-29)；和Protein Purification，Principles，High Resolution Methods and Applications(第2版1998)，Ed.Janson J-C和Ryden L，这些文献的公开内容通过提及而以其整体合并入本文。本发明的示例性阴离子交换剂选自季铵树脂和DEAE树脂。在一个实施方案中，阴离子交换剂是季铵树脂(例如，Mustang Q离子交换膜，PallCorporation)。其他有用的树脂包括QXL、Capto和BigBeads树脂。在一个实例中，阴离子交换剂是Sartobind Q。
示例性的阴离子交换介质和示例性的制造商概括在下面：
GE Healthcare：
Q-Sepharose FF
Q-Sepharose BB
Q-Sepharose XL
Q-Sepharose HP
Mini Q
Mono Q
Mono P
DEAE Sepharose FF
Source 15Q
Source 30Q
Capto Q
ANX Sepharose 4FF(高取代)
Streamline DEAE
Streamline QXL
Applied Biosystems：
Poros HQ 10和20um自包装
Poros HQ 20和50um散装介质
Poros PI 20和50um
Poros D 50um
Tosohaas：
Toyopearl DEAE 650S，M和C
Super Q 650
QAE 550C
Pall Corporation：
DEAE Hyper D
Q Ceramic Hyper D
Mustang Q膜吸收器
Merck KGgA：
Fractogel DMAE
FractoPrep DEAE
Fractoprep TMAE
Fractogel EMD DEAE
Fractogel EMD TMAE
Sartorious：Sartobind Q膜吸收器
在本发明的方法中使用的阴离子交换剂任选地是膜吸收器而不是色谱树脂或支持物。膜吸收器任选地是一次性的。
脱盐
在一个实施方案中，使包含目的核苷酸糖的混合物在阴离子交换色谱法之后进行脱盐。
核苷酸糖溶液的脱盐使用膜过滤器来达到，其中所述膜过滤器具有比目的核苷酸糖小的MWCO。核苷酸糖在截留物(retentate)中被发现，并且在所选择的缓冲液(例如，水)中进行重构。用于使核苷酸糖脱盐的膜的MWCO必须相对较小，以避免核苷酸糖渗漏过膜孔。例如，超滤膜的MWCO为约1kDa-10kDa(例如，约5kDa的孔径大小)。
在一个实施方案中，核苷酸糖的脱盐使用大小排阻色谱法(例如，凝胶过滤)来完成。该技术基于尺寸大小来分开分子。通常，高分子量组分可以比较小的分子更容易地经过柱，因为它们的大小阻止其进入珠孔中。因此，低分子量组分花费更长的时间通过柱。因此，可以将低分子量材料(例如不想要的盐)与目的核苷酸糖相分开。
在示例性的实施方案中，柱材料选自葡聚糖、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶，其中凝胶的特征在于不同的颗粒大小。在另一个示例性的实施方案中，所述材料选自刚性的、水相容性的大小排阻材料。本发明的示例性凝胶过滤树脂是Sepharose G-25树脂(GE Healthcare)。
在示例性的实施方案中，脱盐在阴离子交换色谱法之后(例如，在Q-sepharose色谱法之后)进行。
为了根据本发明的方法来纯化核苷酸糖，选择这样的膜，其适合于将所需碳水化合物与从中纯化出该碳水化合物的溶液的不希望的组分(污染物)相分开。选择膜的目的是就具体的应用来优化分子量截止值(MWCO)、膜组成、渗透性和截留特性，即膜保留特定分子并同时允许其他种类(例如，盐和其他的一般更小或带相反电荷的分子)通过的总能力。组分i的保留百分比(Ri)由式Ri＝(1-Cip/Cir)x 100％给出，其中Cip是组分i在渗透物(permeate)中的浓度，和Cir是组分i在截留物中的浓度，两者都以重量百分比表示。组分的保留百分比(percentretention)也称为保留特性(retention characteristic)或膜截留系数(membrane rejection coefficient)。
在示例性的实施方案中，选择这样的膜，其具有相对于关于希望与之分开的化合物的截留率(rejection ratio)而言高的关于目的核苷酸糖的截留率。如果膜具有相对于第二种化合物而言高的关于第一种化合物的截留率，那么相对于第二种化合物而言，第一种化合物在通过膜的渗透物溶液中的浓度降低。相反地，相对于第二种化合物在截留物中的浓度而言，第一种化合物的浓度增加。如果膜不截留化合物，那么该化合物在渗透物和截留部分中的浓度将保持与在进料溶液中的浓度基本上相同。如果化合物在渗透物中的浓度变得大于化合物在进料溶液中的浓度，那么对于该化合物具有负截留率的膜也是可能的。关于膜技术的全面综述可在″Membranes and Membrane Separation Processes″，Ullmann′sEncyclopedia of Industrial Chemistry(VCH，1990)中找到；还可参见，Noble和Stern，Membrane Separations Technology：Principles andApplications(Elsevier，1995)。
作为起始点，一般将会选择具有这样的分子量截止值(MWCO，其通常与膜孔径大小相关)的膜，所述分子量截止值预期保留所需化合物，并同时允许在给料流中存在的不希望的化合物通过膜。所希望的MWCO一般小于待纯化的化合物的分子量，并且通常大于待从包含待纯化的化合物的溶液中去除的不希望的污染物的分子量。例如，为了纯化具有200Da的分子量的化合物，可以选择具有小于约200Da的MWCO的膜。例如，具有100Da的MWCO的膜也将会是合适的候选物。部分地基于其MWCO，将可在本发明中使用的膜分类为超滤(UF)膜、纳米过滤(NF)膜或反渗透(RO)膜，这依赖于所希望的分离。为了本发明的目的，如Pure Water Handbook，Osmonics，Inc.(Minnetonka MN)中所定义的，对UF、NF和RO膜进行分类。RO膜通常具有小于约200Da的标称MWCO并且截留大多数离子，NF膜一般具有约150Da-约5kDa的标称MWCO，和UF膜一般具有约1kDa-约300kDa的标称MWCO(这些MWCO范围采取了糖类样分子)。在可用于纯化核苷酸糖PEG缀合物的目前优选的超滤膜具有19Kd的分子量截止值。
在对于具体的分离而选择合适的膜方面所考虑的第二种参数是膜的聚合物类型。可在本发明中使用的示例性的膜由常规的膜材料制成，无论是无机的、有机的还是混合式无机和有机的。典型的无机材料包括玻璃、陶瓷、陶瓷金属、金属等。可以例如如Asaeda等人的美国专利号4,692,354、Alary等人的美国专利号4,562,021及其他中所描述的，制备对于UF领域来说优选的陶瓷膜。对于NF和RO应用来说优选的有机材料通常是聚合物，无论其与纤维的孔程(bore side)或壳程(shell side)上的薄层或“皮(skin)”各向同性还是各向异性。关于纤维的优选材料是聚酰胺类，聚苯甲酰胺类，聚砜类(尤其包括磺化聚砜和磺化聚醚砜)，聚苯乙烯类(包括含苯乙烯的共聚物，例如丙烯腈-苯乙烯、丁二烯-苯乙烯和苯乙烯-乙烯基苄基卤共聚物)，聚碳酸酯类，纤维素聚合物类(包括乙酸纤维素)，聚丙烯，聚(氯乙烯)，聚(对苯二甲酸乙二酯)，聚乙烯醇，碳氟化合物等，例如在美国专利号4,230,463、4,806,244和4,259,183中所公开的那些。NF和RO膜常常由多孔支持物基材加上聚合物区分层(polymeric discrimination layer)组成。
在选择合适的膜组成中特别重要的是膜表面电荷。在所要求的MWCO范围内，选择具有适合于碳水化合物的离子电荷和污染物的离子电荷的表面电荷的膜。虽然关于具体膜的MWCO一般是不变的，但改变进料溶液的pH可以通过改变膜表面电荷而影响膜的分离特性。例如，仅仅通过降低溶液的pH，可以将在中性pH下具有净负表面电荷的膜调整为具有净中性电荷。调整溶液pH的另外的影响是调节污染物上的和目的碳水化合物上的离子电荷。因此，通过选择合适的膜聚合物类型和pH，可以获得这样的系统，在其中污染物和膜都是中性的，从而促进污染物的通过。如果例如污染物在中性pH下带负电荷，那么常常希望降低进料溶液的pH以使污染物质子化。例如，通过下列方式来促进磷酸的去除，即将溶液的pH降低至至少约3，优选地降低至至少约4，更优选地降低至至少约5，和更加优选地降低至至少约6，这使磷酸阴离子质子化，从而允许通过膜。对于阴离子碳水化合物的纯化来说，pH将会一般为约pH 1至约pH 7，优选地约3至约7，和更优选地约4至约6。相反地，如果污染物具有正表面电荷，那么可以将进料溶液的pH调整为约pH 7至约pH 14。例如，增加包含具有氨基(-NH3 +)的污染物的溶液的pH将使得氨基成为中性，从而促进它通过膜。因此，本发明的一个方面涉及通过调整与膜接触的溶液的pH来调节分离；这可以改变污染物的离子电荷并且还可以影响膜的表面电荷，从而促进所需碳水化合物的纯化。当然，关于具体膜的可接受的pH范围必须遵循制造商的说明书，以避免对膜的损害。
对于某些应用，首先在一个pH下对混合物实施纳米过滤或反渗透，在这之后将包含目的核苷酸糖的截留物调整至不同的pH，并且实施另外的膜纯化循环。例如，在pH 3，优选地至少约4，更优选地至少约5，和更加优选地至少约6下，通过Osmonics MX07膜(具有约500Da的MWCO的纳米过滤膜)对于用于合成唾液酸基乳糖的反应混合物所进行的过滤将会保留唾液酸基乳糖，并且从溶液中去除大多数磷酸、丙酮酸、盐和锰，同时还去除GlcNAc、乳糖和唾液酸中的一些。在将截留物的pH调整至约7(例如7.4)后通过MX07膜的进一步再循环，将会去除大多数的其余磷酸、所有的丙酮酸、所有的乳糖、一些唾液酸、和显著量的其余锰。
如果待从包含蛋白质(例如用于合成所需寡糖或核苷酸糖的酶)的混合物中纯化出核苷酸糖，那么作为纯化操作程序的第一步骤常常希望去除所述蛋白质。对于小于所述蛋白质的核苷酸糖，该分离通过选择具有这样的MWCO的膜来完成，所述MWCO小于待从溶液中去除的蛋白质或其他大分子的分子量，但大于待纯化的寡糖的分子量(即，在这种情况下，关于所述蛋白质的截留率高于关于所需糖类的截留率)。因此，具有大于该MWCO的分子量的蛋白质和其他大分子将会被该膜所截留，而核苷酸糖将会通过该膜。相反地，如果待从小于寡糖或核苷酸糖的蛋白质中纯化出寡糖或核苷酸糖，那么使用具有大于所述蛋白质的分子量但小于所述寡糖或核苷酸糖的分子量的MWCO的膜。一般地，蛋白质与碳水化合物的分开将会采用通常称为超滤(UF)膜的膜。适合于在本发明的方法中使用的UF膜可从几个商业制造商获得，包括Millipore Corp.(Bedford，MA)，Osmonics，Inc.(Minnetonka，MN)，Filmtec(Minneapolis，MN)，UOP，Desalination Systems，AdvancedMembrane Technologies，和Nitto。
本发明还提供了通过使用纳米过滤(NF)或反渗透(RO)膜从包含目的核苷酸糖的混合物中去除盐和其他低分子量组分的方法。纳米过滤膜是这样的一类膜，对于所述膜来说分离基于分子量和离子电荷。就将会通过膜的种类的大小而言，这些膜通常位于反渗透和超滤膜之间。纳米过滤膜通常具有在膨胀的聚合物网络中的链之间的微孔或开口。关于非离子化的分子的分子量截止值通常在100-20,000道尔顿的范围内。对于具有相同分子量的离子，由于渐增的电荷密度，关于具体的膜而言，对于0、1、2、3等的离子电荷来说膜截留(保留)将会逐渐增加(参见例如，Eriksson，P.，″Nanofiltration Extends the Range of MembraneFiltration，″Environmental Progress，7：58-59(1988))。纳米过滤还描述于-Chemical Engineering Progress，pp.68-74(March 1994)，Rautenbach等人，Desalination 77：73(1990)，以及USPN 4,806,244中。在典型的应用中，目的核苷酸糖将被纳米过滤膜保留，而污染性盐和其他不希望的组分将会通过。在本发明的方法中有用的纳米过滤膜对于目的核苷酸糖通常将会具有约40％-约100％，优选地约70％-约100％，更优选地约90％-约100％的保留特征。在本发明中使用的纳米过滤膜可以是任何一种常规的纳米过滤膜，其中聚酰胺膜是特别合适的。几个商业制造商(尤其包括Millipore Corp.(Bedford，MA)，Osmonics，Inc.(Minnetonka，MN)，Filmtec，UOP，Advanced Membrane Technologies，DesalinationSystems，和Nitto)供销适合于在本发明的方法中使用的纳米过滤膜。例如，合适的膜尤其包括Osmonics MX07，YK，GH(G-10)，GE(G-5)，和HL膜。
反渗透(RO)膜也允许各种水性溶质通过其并同时保留所选的分子。一般地，渗透是指这样的过程，通过该过程纯液体(通常是水)通过半透膜进入溶液(通常是糖或盐和水)，从而稀释该溶液且达到这两种液体之间的渗透平衡。相反地，反渗透是压力驱动的膜过程，其中对膜系统施加外部压力导致逆流(reverse flux)，在这之中水分子从膜系统的盐水或糖溶液区室流到纯水区室中。半渗透性且无孔的RO膜要求以超过溶解在水中的物质的渗透压的压力将水性进料泵至其。RO膜可以从水中有效地去除低分子量分子(＜200道尔顿)以及离子。优选地，反渗透膜对于目的核苷酸糖将会具有约40％-约100％，优选地约70％-约100％，和更优选地约90％-约100％的保留特性。合适的RO膜尤其包括，但不限于，Filmtec BW-30，Filmtec SW-30，Filmtec SW-30HR，UOP RO膜，Desal RO膜，Osmonics RO膜，Advanced Membrane Technologies RO膜，和Nitto RO膜。合适的RO膜的一个实例是Millipore目录号CDRN50060(Millipore Corp.，Bedford MA)。
在本发明中使用的膜可以以任何已知的膜构造(construction)进行使用。例如，膜可以是平的、板框式的、管状的、螺旋形的、中空纤维等。在优选的实施方案中，膜是螺旋形的。膜可以以任何合适的构型(configuration)进行使用，包括交叉流或深度构型(configuration)。在对于根据本发明的超滤、纳米过滤和反渗透纯化来说优选的“交叉流”过滤中，从中待纯化出目的碳水化合物的“进料”或溶液流过与膜表面平行或切向的膜通道，并且被分开成截留物(也称为再循环或浓缩物)物流(stream)和渗透物物流。为了维持有效的膜，进料物流应当以足够高的速度并且与膜表面平行地流动，以产生剪切力和/或湍流从而冲走积聚的被膜截留的颗粒。因此，交叉流过滤带来三种物流(即进料、渗透物和截留物)的流动。相反地，“死端(dead end)”或“深度(depth)”过滤器仅具有两种物流，即进料和滤液(或渗透物)。保留了被膜截留的所有颗粒和大分子的再循环或截留物物流可以全部再循环至在其中产生再循环物流的膜组件，或者可以从该系统中部分地去除。当本发明的方法用于从低分子量组分中纯化核苷酸糖时，例如，所需的核苷酸糖被包含在截留物物流(或进料物流，对于深度过滤器来说)中，而渗透物物流包含被去除的污染物。
可以通过调整压力、流速和在进行过滤时所处的温度来进一步优化本发明的纯化方法。UF、NF和RO一般要求增加压力至超过环境，以克服待通过膜的溶液的渗透压。关于最大和推荐的操作压力可以遵循膜制造商的说明书，并且通过进行递增的调整可能进一步进行优化。例如，推荐的压力对于UF来说一般将会是约25-约100psi，对于NF来说是约50psi-约1500psi，和对于RO来说是约100-约1500psi。还可以调整浓缩物(进料溶液)和渗透物的流速以优化所希望的纯化。再次，制造商关于具体膜的建议充当起始点，从该起始点起通过进行递增的调整来开始优化过程。关于浓缩物的典型流速(Pc)将会是约1-约15加仑/分钟(GPM)，和更优选地约3-约7GPM。对于渗透物，约0.05GPM-约10GPM的流速(Pf)是典型的，而约0.2-约1GPM的流速是优选的。在进行纯化时所处的温度也可以影响纯化的效率和速度。约0-约100℃的温度是典型的，而约20-40℃的温度对于大多数应用来说是优选的。对于某些膜，更高的温度可以导致膜孔径大小的增加，从而提供了可以进行调整以对纯化进行优化的额外参数。
在优选的实施方案中，过滤在膜纯化机器中进行，所述膜纯化机器提供了用于使流速、压力、温度和可以影响纯化的其他参数的控制自动化的工具。例如，Osmonics 213T膜纯化机器适合于在本发明的方法中使用，与由其他上文所列出的公司制造的机器一样。
可以在使用后或者在膜渗透性降低后容易地对膜进行清洁。如果需要，可以通过用水或苛性碱溶液漂洗而在略微升高的温度下进行清洁。如果物流包含少量的酶，那么在少量的表面活性剂例如ULTRASIL存在下进行漂洗是有用的。此外，还可以使用预滤器(100-200μm)以保护更昂贵的纳米过滤膜。在需要时，可以使用其他清洁试剂。清洁方法的选择将依赖于待清洁的膜，并且应当参考膜制造商的说明书。可以用正向冲洗或反向冲洗来完成清洁。
本发明的纯化方法可以单独地或者与用于纯化碳水化合物的其他方法相组合地使用。例如，离子交换树脂可以用于在纳米过滤/反渗透之前或之后，或者在过滤之前和之后，从包含目的核苷酸糖的混合物中去除特定离子。如果需要去除在第一轮纳米过滤或反渗透后保留的离子例如磷酸和核苷酸，那么离子交换是特别希望的。在如上文所讨论的唾液酸基乳糖合成的情况下，这可以例如通过下列方式来完成：将离子交换树脂例如AG1X-8(乙酸盐形式，BioRad；关于其他离子交换树脂，参见例如，BioRad目录)添加至约pH 3或更低的截留物，直至磷酸浓度如所希望地减少。在该过程中，释放出乙酸，因此可以希望在离子交换后实施通过纳米过滤或反渗透系统来进行的额外纯化。例如，可以使pH 3或更低的溶液循环通过Osmonics MX07或类似的膜，直至渗透物的电导率是低的且稳定的。然后，可以用NaOH使溶液的pH升高至约7，例如7.4，并且使该溶液再循环通过相同的膜以去除其余的乙酸钠和盐。可以以类似的方式来去除阳离子；例如，为了去除Mn2+，可以使用酸性离子交换树脂，例如AG50WX8(H+)(BioRad)。
过滤
在一个实施方案中，在合成后，核苷酸糖溶液任选地通过过滤来进行澄清。核苷酸糖溶液通过膜过滤器(例如，袋过滤器)，在其中污染性盐和其他不希望的污染物被从核苷酸糖溶液中过滤出。澄清步骤可以在所述工艺过程的任何步骤处并入。在优选的实施方案中，核苷酸糖溶液在核苷酸糖的合成之后进行澄清。核苷酸糖溶液可以澄清一次或多次。
在一个实例中，使用中空纤维过滤来纯化核苷酸糖溶液。中空纤维过滤去除例如通过核苷酸糖的酶制备而引入的蛋白质。中空纤维膜保留来自酶制备的蛋白质，而允许核苷酸糖溶液通过膜。在示例性的实施方案中，所述中空纤维膜包括具有切向过滤滑行(tangential filtration skid)的中空纤维膜。中空纤维过滤步骤可以在该工艺过程的任何步骤处并入。在一个实施方案中，核苷酸糖溶液在澄清后经过中空纤维过滤。在另一个实施方案中，核苷酸糖溶液在核苷酸糖的合成之后经过中空纤维过滤。可以使用中空纤维过滤来使核苷酸糖溶液过滤一次或多次。
在另一个实施方案中，使用纳米过滤来纯化核苷酸糖溶液。纳米过滤从混合物中去除盐和其他低分子量组分。纳米过滤膜基于分子量和离子交换来分开分子。关于非离子化的分子的分子量截止值通常在100-20,000道尔顿的范围内。在示例性的应用中，目的糖类将被纳米过滤膜保留，而污染性盐和其他不希望的组分将通过。纳米过滤步骤可以在所述工艺过程的任何步骤处并入。在一个实施方案中，核苷酸糖溶液首先经过中空纤维过滤，随后经过纳米过滤。在另一个实施方案中，核苷酸糖溶液首先经过纳米过滤，随后经过中空纤维过滤。在备选方案中，可以使用中空纤维过滤或纳米过滤来纯化核苷酸糖溶液。在另一个实施方案中，核苷酸糖溶液在澄清后经过纳米过滤。在另外一个实施方案中，核苷酸糖溶液在核苷酸糖的合成之后经过纳米过滤。可以使用纳米过滤来使核苷酸糖溶液过滤一次或多次。在纳米过滤后，经纯化的核苷酸糖溶液一般可以进行贮存，或者可以经历进一步的纯化。
在另一个实施方案中，核苷酸糖溶液可以任选地进行脱色(例如，通过使该溶液经过活性炭)。在优选的实施方案中，脱色涉及使核苷酸糖溶液经过与色谱法系统相连的活性炭预填充柱。脱色可以在所述工艺过程的任何步骤处并入。在一个实施方案中，核苷酸糖溶液在纳米过滤后进行脱色。在另一个实施方案中，核苷酸糖溶液在中空纤维过滤后进行脱色。在另外一个实施方案中，核苷酸糖溶液在澄清后进行脱色。核苷酸糖溶液可以脱色一次或多次。
在另一个实施方案中，使用荷电深度介质过滤器(charged depthmedia filter)来纯化核苷酸糖溶液。荷电深度介质过滤器从核苷酸糖溶液中去除例如内毒素。内毒素是有毒的天然化合物，例如在细菌的外细胞壁上在病原体内发现的脂多糖。通过荷电深度介质过滤器的纯化可以在所述工艺过程的任何步骤处并入。在一个实施方案中，核苷酸糖溶液在脱色后进行过滤。在另一个实施方案中，核苷酸糖溶液在纳米过滤后通过荷电深度介质过滤器进行纯化。在另外一个实施方案中，核苷酸糖溶液在中空纤维过滤后通过荷电深度介质过滤器进行纯化。在另一个实施方案中，核苷酸糖溶液在澄清后通过荷电深度介质过滤器进行纯化。在另一个实施方案中，核苷酸糖溶液在核苷酸糖的合成之后通过荷电深度介质过滤器进行纯化。可以使用荷电深度介质过滤器使核苷酸糖溶液过滤一次或多次。
在另一个实施方案中，使用无菌过滤器来纯化核苷酸糖溶液。无菌过滤器从核苷酸糖溶液中去除污染性盐和其他不希望的污染物。在更优选的实施方案中，对无菌过滤器进行预填充并且与用于最终的过滤和贮存的袋歧管系统(bag manifold system)一起进行灭菌。通过无菌过滤器的过滤可以在所述工艺过程的任何步骤处并入。在一个实施方案中，在通过荷电深度介质过滤器进行纯化之后，核苷酸糖溶液通过无菌过滤器进行过滤。在另一个实施方案中，核苷酸糖溶液在脱色后通过无菌过滤器进行纯化。在另外一个实施方案中，核苷酸糖溶液在纳米过滤后通过无菌过滤器进行纯化。在另一个实施方案中，核苷酸糖溶液在中空纤维过滤后通过无菌过滤器进行纯化。在另一个实施方案中，核苷酸糖溶液在澄清后通过无菌过滤器进行纯化。在另一个实施方案中，核苷酸糖溶液在核苷酸糖的合成之后通过无菌过滤器进行纯化。可以使用无菌过滤器使核苷酸糖溶液过滤一次或多次。
下面的实施例仅为了举例说明目的而提供，而既不意欲限制也不意欲限定本发明。下面的实施例描述了用于生产CMP-SA-PEGs的工艺过程。这个焦点是为了清楚地举例说明，而不应当被解释为限制该工艺过程。本领域技术人员将会意识到，所描述的工艺过程同样地可应用于这样的经修饰的核苷酸糖，所述经修饰的核苷酸糖分别包含除CMP和唾液酸之外的其他核苷酸和糖部分。
实施例
概述：
先前的用于生产CMP-SA-PEGs(例如，CMP-SA-PEG-10kDa、CMP-SA-PEG-20kDa和CMP-SA-甘油-PEG-40kDa)的制造工艺过程利用反相色谱法(例如，C-4树脂)。示例性的已知工艺过程包括碱水解，随后为TFF，随后为pH中和，随后为反相色谱法，随后为脱盐，随后为溶剂的去除(例如，旋转蒸发)和冷冻干燥。发现该工艺过程不适合于大规模的应用(kg量的生产)，这很大程度上是由于与反相色谱法步骤相关的限制(例如，树脂的高成本，预填充的商业规模的C-4柱的可获得性，要求使用有机溶剂)以及这种方法不能完全分开所有反应污染物。因此，开发了备选的现代化的生产工艺过程以解决上述缺点，并且特别是减少单元操作的数目。
示例性的经改良的工艺过程描绘在图1中。在一个实施方案中，该经改良的工艺过程仅合并了5个单元操作。这些包括偶联(PEG化)反应以形成CMP-SA-PEG，旋转蒸发以基本上去除THF，阴离子交换色谱法(纯化步骤)，使用TFF的脱盐/浓缩/渗滤，和冷冻干燥以形成固体产物。除冷冻干燥外，对每个步骤进行优化以改善该工艺过程的性能，所述工艺过程以高纯度提供了CMP-SA-PEGs。
依赖于PEG的大小，偶联反应的转化产率为67-99％。AEX色谱法的步骤产率(step yield)为95-99％，和TFF步骤的产率为90-95％，并且基本上去除了源自偶联反应的所有污染物(包括SA-PEG)。关于联合反应(combined reaction)、旋转蒸发、离子交换、TFF和冷冻干燥单元操作的总体产物回收率为约65-77％。通过该新工艺过程生产的CMP-SA-PEGs具有约90-95％的纯度。终产物的1H-NMR分析未显示SA-PEG杂质的证据。ICP分析表明，产物为二钠盐的形式，并且不包含另外的钠盐。
方法和材料
Q Sepharose Big Beads获自GE Healthcare。CMP-SA-甘氨酸钠盐获自AMRI。10kDa mPEG-对硝基苯基碳酸酯获自Dow ChemicalCompany。40kDa mPEG-对硝基苯基碳酸酯获自NOF。
一般使用下列设备：蠕动泵(Cole-Palmer，Masterflex L/S数字标准驱动，易装载的II泵压头)；蠕动泵(Cole-Palmer，Masterflex控制台驱动，易装载的I泵压头)；FPLC(GE Healthcare，
Figure G2008800255677D00501
)；HPLC泵A和B(Dynamax，SD-1)；HPLC检测器(Dynamax，UV-C)；HPLC检测器(Varian，ProStar 340型)；ELS检测器(S.E.D.E.R.E.France，Sedex 55)；冷冻干燥器(VirTis，6K Benchtop)；离子交换柱(4L)(Sepracor SA，285530，180x300mm)；离子交换柱(12mL)(Biovalve，Inc.，Omnifit，006CC-10-50-AF，10x250mm)；离子交换柱(2L)(GE Healthcare，BPG 100/500柱，18-1103-01)；离子交换柱(100mL)(GE Healthcare，XK 26/40，18-8768-01)；电导计(Fisher ThermoElectron Corporation，Accumet Basic AB30，Orion 4星)；pH计(OrionModel 250A0；容积式泵(Teknoflow Inc.，Labtop(300/350))；Pellicon2标准1K膜，再生纤维素(Millipore，P2PLACV01；1kDa再生纤维素膜；0.1m2；V筛网)；Pellicon 2标准3K膜，再生纤维素(Millipore，P2PLBCV01；3kDa再生纤维素膜；0.1m2；V筛网)；Pellicon 2标准5K膜，再生纤维素(Millipore，P2C005C01；5kDa再生纤维素膜；0.1m2；C筛网)；Pellicon 2标准1K膜，再生纤维素(Millipore，P2PLACC01；1kDa再生纤维素膜；0.1m2；C筛网)；Pellicon 2标准1K膜，再生纤维素(Millipore，P2PLACV05；1kDa再生纤维素膜；0.5m2；V筛网)。
NWP＝标准化的透水性(normalized water permeability)；GSC＝CMP-SA-甘氨酸；PSC＝CMP-SA-PEG-20kDa
在D2O中记录1H-NMR(500MHz，800MHz)谱。以相对于水峰的百万分率来表示化学位移。
使用反相HPLC来分析包含CMP-SA-PEGs的混合物(例如纯度和回收率测定)。示例性的方法在下面描述：将Chromolith PerformanceRP18柱(VWR或Phenomonex)与Beckman HPLC系统相连。经由自动进样器(10℃)将样品注射到维持于35℃的柱上。在下述梯度条件下以5.0mL/分钟的流速对柱进行洗脱(洗脱剂A：20mM磷酸钾，1mMTABHS，pH＝6.2；洗脱剂B：100％乙腈)：0.5％B 2分钟，随后为经过2分钟至20％B和经过8分钟至40％B的一系列线性梯度，和7分钟的在40％B下的最后等度洗脱。柱在0.5％B下再平衡3分钟，从而提供22分钟的总分析时间。在271nm处检测洗脱峰。将GSC和CMP-SA-PEG-10kDa(AMRI)用作保留时间和校正标准。GSC标准物(AMRI)用于测定标准曲线，从而用于计算CMP-SA-PEG-10kDa的浓度。这些标准物的纯度通过定量NMR分析来测定。
通过电感耦合等离子体分析(ICP)来测定经纯化且脱盐的CMP-SA-PEG样品的钠含量。
实施例1：
CMP-SA-PEGs的制备
1.1.CMP-SA-PEGs-10kDa的制备
将胞苷-5’-一磷酸-N-甘氨酰基唾液酸(CMP-SA-甘氨酸)二钠盐(1.23g，73.5wt％纯，1.34mmol)溶解于在1L单颈圆底烧瓶中的MilliQ水(80mL)之中。该无色溶液的pH为10.48。添加无水THF(320mL)，并且通过逐滴添加5.5mL 500mM磷酸二氢钠溶液(pH 4.6)来将pH调整至8.6。然后，将10kDa mPEG-对硝基苯基碳酸酯(20g，2.0mmol，1.5当量)一次性地全部添加到该反应溶液中。在PEG试剂溶解后，溶液的pH为8.7。将该黄色溶液于20℃搅拌21小时。然后，通过添加0.1M NaOH(4.0mL)来将反应混合物的pH从7.8调整至8.5。将反应混合物再次搅拌3小时，并且使用旋转蒸发器通过于30℃在减压下蒸发来去除THF。当所收集的液体的体积超过320mL时，停止蒸发。所得到的黄色溶液用Milli Q水(400mL)进行稀释，并且使用真空使该溶液通过0.22微米1L Nalgene过滤器单元进行过滤，以去除任何不溶的材料。黄色滤液的终体积为684mL，并且具有0.97mS/cm的电导率。通过HPLC测定的转化产率为82％(表1，批次9)。
1.2.CMP-SA-PEG-20kDa的制备
将胞苷-5’-一磷酸-N-甘氨酰基唾液酸(CMP-SA-甘氨酸)二钠盐(0.61g，73.5wt％，0.656mmol)溶解于在500mL单颈圆底烧瓶中的Milli Q水(40mL)之中。该无色溶液的pH为10.5。向该搅拌的溶液中添加无水THF(160mL)，并且通过逐滴添加2.0mL 500mM磷酸二氢钠溶液(pH 4.6)来将pH调整至8.5(从11.2)。将20kDa mPEG-对硝基苯基碳酸酯(20.0g，1.0mmol，1.5当量)一次性地全部添加到该反应溶液中。在PEG溶解后，溶液的pH为8.6。将该黄色混合物于20℃搅拌21小时。用NaOH(1.0N，2.0mL)将反应混合物的pH调整至8.5，并且将反应混合物再次搅拌18小时。通过在旋转蒸发器中于35℃使用减压进行旋转蒸发来去除THF。当所收集的液体的体积超过160mL时，停止蒸发。所得到的黄色溶液用Milli Q水(300mL)进行稀释，并且使用真空使该溶液通过0.22微米1L Nalgene过滤器单元进行过滤，以去除任何不溶的材料。黄色滤液的终体积为476mL，并且在pH 7.21下具有0.725mS/cm的电导率。通过HPLC测定的转化产率为87％(表5，实施例2)。
1.3.CMP-SA-甘油-PEG-40kDa的制备
将胞苷-5’-一磷酸-N-甘氨酰基唾液酸(CMP-SA-甘氨酸)二钠盐(368mg，73.5wt％纯，0.40mmol)溶解于在500mL单颈圆底烧瓶中的40mLMilli Q水之中。向该搅拌的溶液中添加无水THF(160mL)。通过逐滴添加2.0mL 500mM磷酸二氢钠溶液(pH 4.6)来将该混合物的pH从11.5小心地调整至8.6。将40kDa mPEG-对硝基苯基碳酸酯(20.96g，90％活化，0.44mmol，1.1当量)一次性地全部添加到该反应混合物中。在20小时后，通过添加1.4mL 0.1N NaOH溶液来将反应混合物的pH从8.31调整至8.82。在额外的22小时后，添加约0.8mL 0.1N NaOH，以使混合物的pH从8.52达到8.89。在另外的24小时(66小时的总反应时间)，采用低于35℃的水浴温度在减压下使用旋转蒸发器来去除THF。当所收集的液体的体积超过160mL时，停止蒸发。所得到的黄色溶液用600mL Milli Q水进行稀释，并且使用真空泵使该溶液通过0.22微米1L Nalgene过滤器进行过滤。过滤器用约50mL Milli Q水进行漂洗。黄色滤液的终体积为678mL，并且在pH 7.25时具有0.40mS/cm的电导率。通过HPLC测定的转化产率为57％(表6，实施例5)。将反应混合物分成335mL的两个相等的部分。一个部分如下所述进行纯化。
实施例2：
CMP-SA-PEGs的阴离子交换色谱法
2.1.用于Q-sepharose Big Bead树脂的柱填充操作程序(2L规模)
根据制造商的说明书来制备柱。代表性操作程序描述在下文中：
就清洁度和结构完整性来检查空的GE BPG 100/500色谱柱。用水湿润底部玻璃料。将柱的出口塞紧，并且在柱底部中倾到1-2cm的水。使在20％乙醇中的Q-Sepharose Big Beads树脂浆料(约3.2L，65％)重悬浮以确保同质性。将树脂浆料缓慢地倾到入柱内部以防止滞留空气。在将树脂浆料转移至柱后，使用包含20％乙醇的喷射瓶(squirt bottle)来漂洗柱的内部。让树脂沉降约30分钟，其中确保树脂的高度比25cm的所需高度高约3-5cm。(需要时添加更多的树脂)。将液流转换器(flowadaptor)充满水并置于柱内。需小心，以确保在液流转换器和液体之间未残存空气。将柱出口打开，并且向下调整液流转换器以轻轻地停留在床上。将入口与Dynamax SD-1 HPLC泵相连接。启动该泵，并且缓慢地增至200mL/分钟的靶流速。(可以以几个递增的改变来增加流速，其中具有2分钟的停滞时间)。在床被充分压固后，将泵关闭。将液流转换器向下调整到床上直至达到这样的抵抗力，即该抵抗力使得适配器不再进一步前行。将柱出口关闭。标明树脂高度(25.4cm)。在准备使用时，柱首先用4L脱气的RO水进行洗涤以从树脂浆料中去除该20％乙醇。向柱中装载NaOH(2CV，以100mL/分钟，40分钟的停留时间)以对柱进行消毒并且产生树脂的氢氧化物形式，用RO水(2CV，以200mL/分钟)进行洗涤，然后装载1M碳酸氢钠(3CV，200mL/分钟)以产生如上所述的碳酸氢盐抗衡离子形式。
2.2.CMP-SA-PEG-10kDa的Q-Sepharose Big Beads纯化
在BPG 100/500柱中，如上所述填充2.0L Q-Sepharose Big Beads阴离子交换树脂(氯化物形式；10cmIDx26cm)，并且与装配有能够在214和271nm处进行读取的UV检测器的Dynamax SD-1HPLC系统相连接。柱用2CV(4L)脱气的水以100mL/分钟(76cm/小时)进行洗涤，以去除所述20％乙醇填充溶液。然后，通过用1M NaOH(2CV，4L，100mL/分钟，76cm/小时)洗涤来对柱进行消毒，并随后通过用下列物质进行洗涤而转化成碳酸氢盐形式：RO水(2CV，4L，200mL/分钟，130cm/小时)，随后为1M NaHCO3(3CV，6L，200mL/分钟，130cm/小时)，和最后为RO水(3CV，6L，200mL/分钟，130cm/小时)。当完成时，柱流出液的电导率为≤10microS/cm(pH 4.5-6)。
将根据实施例1.1的水性CMP-SA-PEG-10kDa反应混合物(684mL，pH 7.27，0.97mS/cm的电导率)以65mL/分钟(50cm/小时)的流速加载到柱上。在加载完成后，柱用4L(2CV)RO水以130mL/分钟(100cm/小时)的流速进行洗涤，直至所有非结合性杂质被从柱中洗涤出去，并且UV信号(271和214nm)回到基线。采用分阶洗脱来获得产物。使用1.2L(0.6CV)5mM NaHCO3以130mL/分钟(100cm/小时)的流速首先从柱中洗脱出SA-PEG杂质(55分钟的保留时间)，如图4中所显示的。然后增加洗脱缓冲液浓度，并且用6L(3CV)30mMNaHCO3以100cm/小时的流速洗脱出产物(63分钟的保留时间)。然后，使用14L(7CV)1M NaHCO3从柱中洗脱出过量的CMP-SA-甘氨酸和其他反应副产物，在这之后进行柱再生。使用在214nm和271nm处的UV来监测柱洗脱，并且手工收集合适的级分(图4)。在洗脱出SA-PEG杂质峰后，当UV 271读数上升超过基线时，产物级分开始，并且在产物峰的拖尾侧在峰最大值的约5％处结束。将含产物的级分(级分1，2.0L)分成两个部分。约500mL用于优化切向流过滤(TFF)步骤，而其余的1.5L如下所述通过经优化的TFF操作程序进行加工。
2.3.CMP-SA-PEG-20kDa的Q-Sepharose Big Beads纯化
在BPG 100/500柱中，如上所述填充2.0L Q-Sepharose Big Beads阴离子交换树脂(氯化物形式；10cm IDx26em)，并且与装配有能够在214和271nm处进行读取的UV检测器的Dynamax SD-1HPLC系统相连接。柱用2CV(4L)脱气的水以100mL/分钟(76cm/小时)进行洗涤，以去除所述20％乙醇填充溶液。然后，通过用1M NaOH(2CV，4L，100mL/分钟，76cm/小时)洗涤来对柱进行消毒，并随后通过用下列物质进行洗涤而转化成碳酸氢盐形式：RO水(2CV，4L，200mL/分钟，153cm/小时)，随后为1M NaHCO3(3CV，6L，200mL/分钟，153cm/小时)和RO水(3CV，6L，200mL/分钟，153cm/小时)。当完成时，柱流出液的电导率为≤10microS/cm(pH 4.5-6)。
将根据实施例1.2的CMP-SA-PEG-20kDa反应混合物(476mL，pH 7.21，0.725mS/cm的电导率)以65mL/分钟(50cm/小时)的流速加载到准备好的柱上。在加载完成后，柱用4L(2CV)RO水以130mL/分钟(100cm/小时)的流速进行洗涤，直至所有非结合性杂质被从柱中洗涤出去，并且UV信号(217和271nm)回到基线。采用分阶洗脱来洗脱出产物。使用2.0L(1.0CV)2mM NaHCO3以130mL/分钟(100cm/小时)的流速首先从柱中洗脱出SA-PEG杂质(55分钟的保留时间)，如图6中所显示的。然后增加洗脱缓冲液浓度，并且用6L(3CV)30mMNaHCO3以130mL/分钟(100cm/小时)的流速洗脱出产物(75分钟的保留时间)。然后，使用14L(7CV)1M NaHCO3从柱中洗脱出过量的CMP-SA-甘氨酸和其他反应副产物，在这之后进行柱再生。通过在214nm和271nm处的UV吸收来监测柱洗脱，并且收集合适的级分(图6)。在洗脱出SA-PEG杂质峰后，当UV 271读数上升超过基线时，产物级分开始，并且在产物峰的拖尾侧在峰最大值的约5％处结束。将含产物的级分(级分1，2.0L)用于下一个步骤。
2.4.CMP-SA-甘油-PEG-40kDa的Q-Seph arose Big Beads纯化
在BPG 100/500柱中，如上所述填充2.0L Q-Sepharose Big Beads阴离子交换树脂(氯化物形式；10cm IDx25.5cm)，并且与装配有能够在214和271am处进行读取的UV检测器的Dynamax SD-1HPLC系统相连接。柱用2CV(4L)脱气的水以100mL/分钟(76cm/小时)进行洗涤，以去除所述20％乙醇填充溶液。然后，通过用1M NaOH(2CV，4L，100mL/分钟，76cm/小时)洗涤来对柱进行消毒，并随后通过用下列物质进行洗涤而转化成碳酸氢盐形式：RO水(2CV，4L，200mL/分钟，153cm/小时)，随后为1M NaHCO3(3CV，6L，200mL/分钟，153cm/小时)和RO水(3CV，6L，200mL/分钟，153cm/小时)。当完成时，柱流出液的电导率为≤10microS/cm(pH 4.5-6)。
将根据实施例1.3的反应混合物(335mL，pH 7.25，0.40mS/cm的电导率)以40mL/分钟(30.6cm/小时)的流速加载到准备好的柱上。在加载完成后，用约500mL的水漂洗该容器，并且将溶液加载到柱上。然后，柱用4L(2CV)RO水以200mL/分钟(153cm/小时)的流速进行洗涤，直至所有非结合性杂质被从柱中洗涤出去，并且UV信号回到基线(217和271nm)。采用分阶洗脱来洗脱出产物。使用2.0L(1.0CV)2mM NaHCO3以200mL/分钟(153cm/小时)的流速首先从柱中洗脱出SA-PEG杂质(44分钟的保留时间)，如图7中所显示的。然后增加洗脱缓冲液浓度，并且用6L(3CV)20mM NaHCO3以200mL/分钟(153cm/小时)的流速洗脱出产物(47分钟的保留时间)。通过在214nm和271nm处的UV吸收来监测柱洗脱，并且收集合适的级分(图7)。当UV 271读数上升至产物峰最大吸收的20％(允许去除SA-PEG杂质肩)时，产物级分开始，并且在最大产物峰的拖尾侧在峰最大值的约5％处结束。汇集含产物的级分(4.05L，pH＝7.4，1218microS/cm)，并用于下一个步骤。
实施例3：
使用超滤进行脱盐
3.1.CMP-SA-甘油-PEG-10kDa产物库的切向流过滤
使用下表1中所概括的工艺参数，通过切向流过滤(TFF)来使1.5L根据实施例2.2的Q Sepharose Big Beads产物库脱盐。用聚硅氧烷管(L/S 24)将Masterflex L/S蠕动泵与装配有3个Millipore 1 kDa Pellicon2“MINI”过滤器(PLAC-V 1kDa再生纤维素膜；筛网类型：v；0.1m2)的Millipore Pellicon-2 Mini Holder相连接。将约500mL产物水溶液转移至500mL PETG瓶，所述PETG瓶被浸在冰浴中。使用磁力搅拌棒来对该溶液进行搅拌，并且在该过程自始至终监测温度并使之维持于14-16℃。将进料管线和截留物管线放置在位于TFF系统上的PETG瓶内。使用第二个Masterflex蠕动泵，通过另一根聚硅氧烷管(L/S 25)将也使用冰浴进行冷却的其余的1L溶液供入PETG瓶中。将第二个泵的转移流速设置为与TFF过程的渗透物流速相等，以维持恒定的在PETG瓶中的体积。将渗透物溶液收集为在250mL量筒中的级分，并且将每250mL收集的溶液转移至贮存瓶。将蠕动泵的初始流速设置为1200mL/分钟，并且调整截留物阀以在该过程自始至终保持恒定的TMP(～22psi)。每250mL体积对渗透物溶液进行取样，并且记录pH和电导率。还手工记录渗透物流速。一旦原始的1.5L产物溶液浓缩至约500mL的总体积，就将经冷却的RO水添加到PETG截留物瓶中，以维持恒定的体积。连续地每500mL对渗透物溶液进行取样。一旦渗透物的体积达到～2000mL并且渗透物溶液的电导率降至47microS/cm，就使转移泵停止。然后，将截留物溶液转移至另一个PETG瓶(1L)。然后，将RO水(150mL)添加至该截留物PETG瓶，并且通过TFF系统再循环5分钟。这去除了该系统中的其余产物。然后，将原始截留物溶液和洗涤截留物溶液相合并。基于HPLC分析，CMP-SA-PEG-10kDa的总体TFF步骤回收率为90％(表2)。使该重新合并的截留物溶液(488mL，pH＝7.31，138microS/cm)冷冻干燥，这提供了7.15g(66％的总体工艺产率)白色固体，其通过目前的分析方法为87％纯的(表3)。该冻干的产物通过1H NMR来进行分析。
表1：
关于用于CMP-SA-PEG(10和20kDa)的切向流过滤(TFF)单元操作的经优化地工艺参数
  膜   3个0.1m2Millipore 1K Pellicon 2“MINI”过滤器(PLAC 1K再生纤维素膜，V型筛网)
  膜面积，m2   0.3
  TMP   22±1psig
  通量   3.7LMH
  截留物体积(L)   500mL(在浓缩后和在渗滤自始至终)
  平衡/渗滤缓冲液   RO水
  渗滤标准   4DF体积(总共2000mL)
  总工艺时间   大约3小时
  温度(℃)   ≤16℃(优选地4-8℃)
  膜贮存条件   0.1M NaOH或20％乙醇
表2：
关于用于CMP-SA-PEGs(10kDa和20kDa)的切向流过滤(TFF)单元操作的实验结果
  PEG   膜面积(m2)   NWP(L/小时/psig/m2)   截留物体积(L)   截留物温度初始/最终(℃)   截留物pH   电导率(mcS/cm)   回收率(％)
  10kDa   0.1   0.20   0.15   21/23   6.6   112   96％
  10kDa   0.3   0.17   0.5   16/15   7.3   138   90％
  20kDa   0.3   0.17   0.5   14/16   7.8   110   112％
在表2中，在初始进料溶液的浓缩和脱盐后测量截留物体积。截留物温度为在浓缩步骤开始时测量的初始截留物温度，和在渗滤步骤结束时测量的最终截留物温度。在将最初的截留物(在浓缩和渗滤后)与系统洗涤截留物相合并后测量截留物的pH。在将最初的截留物(在浓缩和渗滤后)与系统洗涤截留物相合并后测量截留物的电导率。基于相比于在最终的合并的截留物(在浓缩、渗滤和系统洗涤后)中产物的量而言在系统进料溶液中产物的总量，来测定总体产物回收率。
表3.
关于CMP-SA-PEG(10kDa和20kDa)的总体工艺回收率
  工艺过程批次   干重(g)   纯度(％)   总回收率
  CMP-SA-PEG-10kDa   2.53   85.9％   70％
  CMP-SA-PEG-10kDa   7.15   87.0％   64％
  CMP-SA-PEG-20kDa   10.52   95.7％   77％
在表3中，干重是在冷冻干燥后的固体重量。通过将通过RP-HPLC测定的在冷冻干燥产物中产物的量除以在冷冻干燥样品中固体的总量来测定纯度(假定CMP-SA-PEG-10kDa的产物质量为10,600道尔顿，或者CMP-SA-PEG-20kDa的产物质量为20,600道尔顿)。基于所获得的产物的摩尔数除以在偶联反应中使用的限制试剂(limiting reagent)(CMP-SA-Gly)的摩尔数而得的比率乘以经加工的产物库的份额×100％，来计算该生产过程(反应，溶剂蒸发，AEX纯化，浓缩/渗滤和冷冻干燥步骤)的总回收率。
3.2.CMP-SA-甘油-PEG-20kDa产物库的切向流过滤
使用上表1中所概括的工艺参数，通过切向流过滤来使根据实施例2.3的Q Sepharose Big Beads产物库(2.0L)脱盐。用聚硅氧烷管(L/S24)将Masterflex L/S蠕动泵与装配有3个Millipore 1kDa Pellicon 2“MINI”过滤器(PLAC-V 1kDa再生纤维素膜；筛网类型：V；0.1m2)的Millipore Pellicon-2Mini Holder相连接。将约500mL产物水溶液转移至500mL PETG瓶，所述PETG瓶被浸在冰浴中。使用磁力搅拌棒来对该溶液进行搅拌，并且在该过程自始至终监测温度并使之维持于4℃。将进料管线和截留物管线放置在位于TFF系统上的PETG瓶内。使用第二个Masterflex蠕动泵，通过另一根聚硅氧烷管(L/S 25)将也使用冰浴进行冷却的其余的1.5L溶液供入PETG瓶中。将第二个泵的转移流速设置为与TFF过程的渗透物流速相等，以维持恒定的在该进料PETG瓶中的体积。使用500mL量筒将渗透物溶液收集为500mL级分，并且转移至贮存瓶。将蠕动泵的初始流速设置为1200mL/分钟，然后调整截留物阀以在该过程自始至终保持恒定的TMP(～22psi)。在加工过程中，在每500mL收集后对渗透物溶液进行取样，并且记录pH和电导率。还手工记录渗透物流速。一旦将进料中产物溶液的原始体积(2.0L)浓缩至约500mL的总体积，那么就使截留物溶液进行渗滤。以用于在渗滤过程中维持恒定体积的比率，将经冷却的RO水(4℃)添加到与TFF系统相连接的PETG截留物瓶中。连续地每500mL对渗透物溶液进行取样，并且记录电导率和pH。一旦渗透物的体积达到～2000mL并且渗透物溶液的电导率降至56microS/cm，就使转移泵停止。然后，将截留物溶液转移至另一个PETG瓶(1L)。将RO水(150mL)添加至该进料PETG瓶，并且通过TFF系统再循环5分钟。然后，将原始截留物溶液和洗涤截留物溶液相合并。如通过HPLC分析所测定的，CMP-SA-PEG-20kDa的总体TFF步骤回收率为112％(表3)。使该合并的截留物溶液(530mL，pH＝7.81，110microS/cm)冷冻干燥，从而产生10.52g(77％的总体工艺产率)白色固体，其通过目前的分析方法为96％纯的(表3)。该冻干的产物通过1H NMR来进行分析。
3.3.CMP-SA-甘油-PEG-40kDa产物库的切向流过滤
使用下表4中所概括的工艺参数，通过切向流过滤(TFF)来使根据实施例2.4的Q Sepharose Big Beads产物库(4.05L)脱盐。通过聚硅氧烷管(L/S 35)将Masterflex L/S蠕动泵(TFF泵)与装配有2个Millipore 1kDa Pellicon 2再生纤维素膜(筛网类型：V；0.5m2)的Millipore Pellicon-2 Holder相连接。将约1L产物水溶液转移至1LPETG瓶，所述PETG瓶被浸在冰浴中。使用磁力搅拌棒来对该溶液进行搅拌，并且整个过程自始至终监测温度。使其余的产物溶液在冰浴上冷却，并且经由第二个Masterflex蠕动泵通过聚硅氧烷管(L/S 25)将该溶液供入PETG瓶中。将第二个泵的转移速度设置为与渗透物流速相等，以维持恒定的在PETG瓶中的体积。将进料管线和截留物管线放置在位于TFF系统上的PETG瓶内。将渗透物溶液收集为在1.0L量筒中的1.0L级分，并且转移至贮存瓶。将TFF蠕动泵的初始流速设置为2.4L/分钟，并且调整截留物阀以在该过程自始至终维持恒定的TMP(～20psi)。在每收集了1.0L的溶液后对渗透物溶液进行取样，并且记录pH和电导率。还手工记录渗透物流速。一旦原始的4.0L产物溶液浓缩至约1.0L的总体积，就使截留物进行渗滤。以用于在渗滤过程中维持恒定体积的比率，将经冷却的RO水(4℃)添加到该PETG截留物瓶中。连续地每1.0L对渗透物溶液进行取样。一但渗透物溶液的总体积达到～4.0L并且渗透物溶液的电导率降至56microS/cm，就使转移泵停止。然后，将截留物溶液转移至另一个PETG瓶(2L)。将RO水(350mL)添加至该PETG截留物瓶，并且在TFF系统中再循环5分钟。然后，将原始截留物溶液和洗涤截留物溶液相合并。基于最终截留物库和原始离子交换库的HPLC分析，CMP-SA-甘油-PEG-40kDa的总体TFF步骤回收率为93％(表5，工艺过程#1)。使最终TFF产物溶液(1060mL，pH 7.60，66microS/cm)冷冻干燥，从而提供5.82g(67％的总体工艺产率)白色固体，其通过HPLC测定具有92％的纯度(表6，工艺过程1)。该经冷冻干燥的产物通过1H NMR来进行分析。
表4：
关于用于CMP-SA-甘油-PEG-40kDa的切向流过滤(TFF)单元操作的工艺参数
膜   2个0.5m2 Millipore 1K Pellicon 2再生纤维素膜，V型筛网
  膜面积，m2   1.0
  TMP   20±1psig
  通量   3LMH
  截留物体积(L)   1L(在浓缩后和在渗滤自始至终)
  平衡/渗滤缓冲液   RO水
  渗滤标准   ≥3DF体积(总共3000mL)
  总工艺时间   大约3小时
  温度(℃)   ≤15℃(最佳温度为4-8℃)
  CIP条件   0.1M NaOH，保持30分钟
  膜贮存条件   0.01M NaOH或20％乙醇
表5：
用于CMP-SA-甘油-PEG-40kDa的切向流过滤单元操作的结果
  膜面积(m2)   NWPL/小时/psig/m2   截留物体积(L)   初始/最终温度(℃)   截留物pH   截留物电导率(mcS/cm)   回收率
 批次1   1.0   0.15   1   15-12   7.6   66   93％
 批次2   1.0   0.15   1   13-10   7.0   45   86％
在表5中，在初始进料溶液的浓缩和脱盐后测量截留物体积。在浓缩步骤开始时测量该系统中的初始截留物温度。在渗滤步骤结束时测量最终截留物温度。在将最初的截留物(在浓缩和渗滤后)与系统洗涤截留物相合并后测量截留物的pH。在将最初的截留物(在浓缩和渗滤后)与系统洗涤截留物相合并后测量截留物的电导率。从在最终TFF截留物库中的产物(RP-HPLC浓度×体积)与起始IEX库的那种(RP-HPLC浓度×体积)的比率，来计算产物回收率。
表6：
关于CMP-SA-甘油-PEG-40kDa的生产的工艺过程概括结果
  干重(g)   量(g)   纯度   总回收率
  批次1   5.82   5.14   92.0％   67％
  批次2   5.36   4.81   93.1％   62％
在表6中，从TFF截留物库的RP-HPLC浓度值和体积来计算产物质量。使用RP-HPLC来测定纯度，并且通过对于CMP-SA-甘油-PEG-40kDa的质量(43,347道尔顿)使用制造商(NOF)的分析mPEG分子量的证书来进行计算。基于所获得的产物的摩尔数(根据干重)除以该反应中的限制试剂的摩尔数而得的比率乘以经加工的产物库的级分×100％，来计算关于相组合的反应、色谱法和TFF工艺过程的总回收率。
实施例4：
使用超滤的另外的脱盐实验
4.1.使用5kDa膜来使CMP-SA-甘油-PEG-40kDa脱盐
通过聚硅氧烷管(L/S 15，#96400-15)将Masterflex L/S蠕动泵与装配有1个Millipore 5kDa Pellicon 2“MINI”过滤器(PLCC 5kDa再生纤维素膜；筛网类型：C，0.1m2)的Millipore Pellicon-2Mini Holder相连接。该系统用2L水以1000mL/分钟进行冲洗。然后，使水(2L)在该系统中以1000mL/分钟进行再循环，并且以20psi的TMP收集约500mL渗透物。测得截留物的电导率为3microS/cm。测得标准化的透水性(NWP)为～1.4L/小时/m2/psi。将CMP-SA-甘油-PEG-40kDa(4.0g)溶解于在500mL塑料瓶中的200mL经冷却的Milli Q水中，所述塑料瓶被浸在冰浴中。使用磁力搅拌棒来对该溶液进行搅拌。将进料管线和截留物管线放置在该瓶内。该溶液通过该系统以500mL/分钟再循环5分钟。然后，使泵速度增至1000mL/分钟，并且将截留物压力调整至13psi，这提供了25psi的进料压力和19psi的TMP。TMP在该工艺过程自始至终维持恒定。将渗透物收集成100mL级分，并且记录关于每个级分的相应时间和截留物的温度。使用第二个蠕动泵来转移经冷却的milliQ水，以维持恒定的在该截留物瓶中的体积。当收集了600mL的渗透物时，完成了透析步骤。最后的100mL级分的电导率为12microS/cm。截留物的温度在该工艺过程期间为15-16℃。平均渗透物流速为28.6mL/分钟，其中计算出的通量为17.2L/小时/m2。标准化的渗透物速率为0.90L/小时/m2/psi。将截留物转移到分开的瓶中，并且用100mL水使该系统再循环5分钟。然后，将原始截留物溶液和洗涤截留物溶液相合并。使最终的合并的截留物溶液(～350mL，pH 6.6，33microS/cm)冷冻干燥，从而提供3.92g白色固体，回收率为98％(表7)。
4.2.使用3kDa膜来使CMP-SA-甘油-PEG-40kDa脱盐
通过聚硅氧烷管(L/S 15，#96400-15)将Masterflex L/S蠕动泵与装配有1个Millipore 3kDa Pellicon 2“MINI”过滤器(PLCC 3kDa再生纤维素膜；筛网类型：C，0.1m2)的Millipore Pellicon-2Mini Holder相连接。该系统用2L水以1000mL/分钟进行冲洗。然后，用2L水以1000mL/分钟使它再循环，并且以处于20psi的TMP收集约500mL渗透物。测得截留物的电导率为5microS/cm。测得标准化的透水性(NWP)为～0.75L/小时/m2/psi。将CMP-SA-甘油-PEG-40kDa(4.0g)溶解于在500mL塑料瓶中的200mL经冷却的Milli Q水中，所述塑料瓶被浸在冰浴中。使用磁力搅拌棒来对该溶液进行搅拌。将进料管线和截留物管线放置在该瓶内。该溶液通过该系统以500mL/分钟再循环5分钟。然后，使泵速度增至1000mL/分钟，并且将截留物压力调整至20psi，从而提供了20psi的进料压力和20psi的TMP。TMP在该工艺过程自始至终维持恒定。将渗透物收集成100mL级分，并且记录关于每个级分的相应时间和截留物的温度。使用第二个蠕动泵来转移经冷却的milli Q水，以维持恒定的在该截留物瓶中的体积。当收集了600mL的渗透物时，完成了透析步骤。最后的100mL级分的电导率为34microS/cm。截留物的温度在该工艺过程期间为13-15℃。平均渗透物流速为16.7mL/分钟，且计算出的通量为10.0L/小时/m2，并且标准化的渗透物速率为0.50L/小时/m2/psi。将截留物转移到分开的瓶中，并且用100mL水使该系统再循环5分钟。然后，将原始截留物溶液和洗涤截留物溶液相合并。使该合并的截留物溶液(～300mL，pH 7.4，56microS/cm)冷冻干燥，从而提供3.86g白色固体，回收率为95％(表7)。
表7：
使用再生纤维素膜(3kDa和5kDa)来进行的CMP-SA-甘油-PEG-40kDa的切向流过滤
  膜类型   膜面积(m2)   截留物初始浓度(mg/mL)   TMP(psi)   温度(℃)   渗透物通量(L/小时/m2)   NWPL/小时/m2/psi   电导率(microS/cm)   回收率
  5kDa   0.1   20   19   15-16   10.0   0.90   33   98％
  3kDa   0.1   20   20   13-15   7.6   0.50   56   95％
在表7中，温度是在渗滤过程自始至终在该系统中的截留物温度范围。在将最初的截留物(在渗滤后)与系统洗涤截留物相合并后在截留物中测量电导率。从冻干的TFF产物的质量与用于制备用于TFF的原始溶液的CMP-SA-甘油-PEG的质量(4g)的比率，来计算产物回收率。
实施例5：
偶联(PEG化)反应的优化
对用于形成CMP-SA-PEG-10kDa的偶联反应进行优化，以改善转化产率和简化在该反应过程中的工艺操作(表8)。需要略微摩尔过量的mPEG-pNP试剂(1.2-1.5摩尔当量)以获得最高的转化产率。以3.4-3.7mM的CMP-SA-甘氨酸浓度和50-55mg/mL的mPEG-pNP浓度，在THF/水(4/1)中进行反应。
表8：
关于CMP-SA-PEG-10kDa的偶联反应结果
  反应编号   10-kDa-PEG-pNP(mmol)   GSC(mmol)   THF(mL)   水(mL)   缓冲液(mcL)   pH范围   反应时间(小时)   终体积(mL)   PSC/GSC之比   CMP-SA-PEG的浓度(mg/mL)   产率
  1   0.09   0.073   16   4   0.4   8.2-7.8   42   25   N/A   3.9   12％
  2   0.90   0.73   160   40   4.0   8.2-7.8   88   200   N/A   14   36％
  3   0.09   0.073   16   4   0.3   8.6-7.9   64   25   6.8/1   46.5   149％
  4   0.11   0.073   16   4   0.3   8.6-7.8   64   25   15.8/1   45.5   146％
  5   1.10   0.735   160   40   2.9   8.7-7.9   26   250   15.0/1   32.7   104％
  6   2.75   1.838   400   100   7.0   8.7-8.1   40   660   44.2/1   33.8   113％
  7   5.50   3.675   800   200   14.0   8.7-8.1   45   1285   77.9/1   32   105％
  8   2.75   1.838   400   100   7.0   8.6-8.1   46   675   2.5/1   22.4   77％
  9   2.00   1.342   320   80   5.5   8.6-7.8   19   684   7.1/1   17.1   81％
在表8中，PEG-pNP是10kDa-PEG-pNP(假定MW为10,000道尔顿，假定100％活化)，缓冲液是为了维持反应的pH而添加的磷酸盐缓冲液(0.5M)的量，并且pH是在偶联反应过程中观察到的pH范围。使用HPLC来测量在偶联反应完成后PSC的量与GSC的量的比率。所有计算对于作为二钠盐的GSC(CMP-SA-甘氨酸)(MW＝673)引入了73.5％纯度的干重纯度，并且对于10kDa-mPEG-pNP假定分子量为10,000道尔顿，和对于CMP-SA-PEG-10kDa假定分子量为10,700道尔顿。所有反应在约19-约20℃下进行。就实际的试剂纯度对向每个反应添加的GSC的质量和摩尔数进行校正。反应时间是总反应时间。在反应完成后通过HPLC来测定PSC的浓度。转化产率基于PSC的量(HPLC)与GSC的量(使用量)的比率。反应1至4通过RP-HPLC来进行分析，其中使用CMP-SA-PEG-10kDa作为校正标准。反应5至10使用CMP-SA-甘氨酸作为校正标准。
数据表明，反应混合物的8.6-8.7的初始pH在达到最高转化产率方面是关键性的(表8)。在该工艺过程自始至终最佳的pH范围是约8.0-8.8。当pH降至低于8.0时，反应急剧减慢，从而导致差的转化产率。需小心，以不要让pH降至低于7.0，因为在这些条件下CMP-SA-甘氨酸和CMP-SA-PEG由于水解而分解，从而形成CMP、唾液酸-甘氨酸和唾液酸-PEG(图3)。在超过8.8的pH下，10kDa-mPEG-pNP试剂快速水解，从而导致低的转化产率(图1，表8；反应1和2)。某些CMP-SA-甘氨酸试剂包含残留的NaOH(以确保该试剂的钠盐形式)，当溶解于水中时，所述残留的NaOH产生具有pH＞10的溶液。因此，在建立偶联反应(牵涉将CMP-SA-甘氨酸溶解在水中)方面的最初步骤要求添加缓冲液(磷酸钠，pH 4.6)，以使pH在添加mPEG-pNP之前降低至约8.6。在pH调整后，向反应混合物中添加mPEG-pNP，并且使反应混合物保持在环境温度(约19-20℃)下。随着反应进行，所添加的磷酸盐缓冲液阻止pH降至低于8.0，因为形成了酸性种类对硝基苯酚。然而，如果pH的确降至8.0，那么使用氢氧化钠(0.1N)来使pH升至8.6。
由于反应混合物的粘度，尤其是对于牵涉较大PEGs的反应，有时候难以达到稳定的pH读数。对于更大的PEGs(20kDa和甘油-40kDa)使用更高的mPEG-pNP浓度，以增加产率。对于3.3的CMP-SA-甘氨酸浓度，使用100mg mPEG-pNP/mL反应混合物的浓度(表9和10)。当使用更高的PEG浓度时，转化产率增加约10％(表10，反应1-4)。
偶联反应要求约24-约72小时来完成。使用RP-HPLC来监测反应。对于某些反应条件，尤其是牵涉较大PEG分子的那些，需要长至约48-约72小时的反应时间。
当使用不同比率的偶联试剂(GSC和40kDa-甘油-mPEG-对硝基苯基碳酸酯)时，未观察到转化产率的显著差异。表10显示，在其他方面相同的条件下，使用1.4mol当量的GSC/1mol当量的活化的PEG的反应给出与包含1.1mol当量的活化的PEG/mol当量的GSC的反应相同的结果(反应2和3)。尽管可以使用过量得多的40kDa-甘油-mPEG-对硝基苯基碳酸酯来增加转化产率，但该工艺过程的经济学将会变得不利得多。
用于产生CMP-SA-PEG-20kDa和CMP-SA-甘油-PEG-40kDa的PEG化反应也在100％水(无THF)中进行(表9)。最初假定，在不存在THF的情况下，反应过程可能更快速地进行，并且该工艺过程自身将不再需要旋转蒸发作为单元操作。结果表明，水性反应是可能的。然而，对于20kDa反应，需要广泛的pH监测和用0.1N NaOH来进行调整，尤其是在反应的最初数小时期间。因此，未观察到显著的时间节省。此外，当使用100％水来生产CMP-SA-甘油-PEG-40kDa时，甘油-mPEG-对硝基苯基碳酸酯不容易溶解。这影响反应的速率和转化产率。作为仅使用水作为溶剂的PEG化优化过程的一部分，还检查了不同的缓冲液。然而，碳酸氢钠缓冲液(10mM，pH 8.1)和硼酸钠缓冲液(10mM，pH 8.6)都导致较低的转化产率(表10)。
表9：
关于CMP-SA-PEG-20kDa的偶联反应结果1
  反应编号   10-kDa-PEG-pNP(mmol)   GSC(mmol)   THF(mL)   水(mL)   缓冲液(mcL)   pH范围   反应时间(小时)   终体积(mL)   PSC/GSC之比   CMP-SA-PEG的浓度(mg/mL)   产率
  1   0.50   0.327   80   20   1200   8.7-8.3   29   200   22.7   31.8   96％
  2   1.0   0.656   160   40   2000   8.6-8.2   39   476   21   25.1   87％
  3   0.11   0.073   0   30   120   8.7-7.8   25   45   20   29.4   84％
  4   0.55   0.365   0   100   800   8.4-8.0   24   220   20   29.4   84％
在表9中，GSC是CMP-SA-甘氨酸，并且PSC是CMP-SA-PEG-20kDa。所有计算对于作为二钠盐的GSC(673道尔顿)引入了73.5％纯度(HPLC)的干重纯度，并且对于20kDa mPEG-pNP假定分子量为20,000道尔顿和100％活化，和对于CMP-SA-PEG-20kDa假定分子量为20,700道尔顿。就实际的试剂纯度对向每个反应添加的GSC的质量和摩尔数进行校正。“缓冲液”指明为了维持反应的pH而添加的磷酸盐缓冲液(0.5M)的量。“pH范围”指明在偶联反应过程中观察到的pH范围。“反应时间”是总反应时间。在偶联反应完成后通过HPLC来测定PSC的量与GSC的量的比率。在反应完成后通过HPLC来测定PSC的浓度。转化产率基于通过HPLC测定的PSC的量与GSC的量的比率。
表10：
关于CMP-SA-甘油-PEG-40kDa的偶联反应结果
  反应编号   10-kDa-PEG-pNP(mmol)   GSC(mmol)   THF(mL)   水(mL)   缓冲液(mcL)   pH范围   反应时间(小时)   终体积(mL)   PSC/GSC之比   CMP-SA-PEG的浓度(mg/mL)   产率
  1   0.083   0.066   32   8   250   8.7-8.4   21   60   2.54   30.08   67％
  2   0.022   0.020   16   4   90   8.7-8.4   75   25   1.38   17.36   53％
  3   0.020   0.024   16   4   120   8.7-8.4   75   35   0.77   12.56   54％
  4   0.11   0.10   40   10   500   8.7-8.1   68   165   3.57   17.92   73％
  5   0.44   0.40   160   40   2000   8.9-8.3   66   678   2.73   13.72   57％
  6   0.010   0.012   0   10   50   ～8.2   20   10   0.68   15.5   38％
  7   0.015   0.010   0   10   40   ～8.2   22   10   1.23   19.16   47％
  8   0.010   0.012   0   010   0   ～8.6   20   10   0.46   17.18   42％
  9   0.015   0.010   0   010   0   ～8.6   22   10   0.95   17.09   42％
在表10中，GSC是CMP-SA-甘氨酸，并且PSC是CMP-SA-PEG-40kDa。所有计算对于作为二钠盐的GSC(673道尔顿)引入了73.5％纯度的干重纯度，并且对于40kDa mPEG-pNP(90％活化)假定分子量为42,843道尔顿，和对于CMP-SA-甘油-PEG-40kDa假定分子量为40,700道尔顿。就实际的试剂纯度对向每个反应添加的GSC的质量和摩尔数进行校正。“缓冲液”指明为了维持反应的pH而添加的磷酸盐缓冲液(0.5M)的量。“pH范围”指明在偶联反应过程中观察到的pH范围。“反应时间”是总反应时间。在偶联反应完成后通过HPLC来测定PSC的量与GSC的量的比率。在反应完成后通过HPLC来测定PSC的浓度。转化产率基于通过HPLC测定的PSC的量与GSC的量的比率。通过使用10mL 10mM硼酸钠缓冲液(pH 8.6)替代磷酸钠缓冲液，来进行反应8和9。
实施例6：
用于生产CMP-SA-PEGs的示例性工艺过程
6.1.用于生产CMP-SA-PEG-10kDa的示例性工艺过程
将CMP-SA-甘氨酸以3.4mM的浓度溶解在水和THF(1份比4份)中。用磷酸钠将溶液调整至pH 8.6，然后添加10kDa mPEG-pNP试剂(相对于CMP-SA-甘氨酸的实际摩尔数而言1.5摩尔当量)。将反应体系在室温下搅拌20-48小时，同时使pH维持在8.6。反应通过RP-HPLC来进行监测，并且当完成时，通过旋转蒸发来浓缩反应混合物以去除THF。将浓缩的水性反应混合物用水(400mL)稀释至为原始反应体积的1.7倍的终体积。测量电导率，并且其低于1mS/cm。将稀释的产物溶液以50cm/小时的流速加载到Q-sepharose Big Beads柱(10g PEG试剂/升树脂，其中具有至少10cm的树脂床高度)上。用2CV的水从柱中洗涤出非结合性材料。用5mM NaHCO3(0.6CV)以100cm/小时的流速从柱中洗脱出SA-PEG-10kDa杂质。也以100cm/小时的流速，用30mM NaHCO3(3CV)洗脱出纯的产物，CMP-SA-PEG-10kDa。在SA-PEG杂质峰之后，当UV 271读数上升超过基线时，产物级分开始，并且在产物峰的拖尾侧在峰最大值的约5％处结束，如图4中所显示的。使汇集的产物冷却至4℃，并且使用切向流过滤系统将其浓缩3倍(至大约14g/L的产物浓度)，所述切向流过滤系统使用1kDa再生纤维素膜。用4℃水(4倍截留物体积)对截留物进行渗滤以用于去除盐，并且持续直至渗透物电导率接近给水(feed water)的电导率。然后，将纯化的CMP-SA-PEG-10kDa溶液进行冷冻，并且冷冻干燥至干。
6.2.用于生产CMP-SA-PEG-20kDa的示例性工艺过程
将CMP-SA-甘氨酸以3.3mM的浓度溶解在水和THF(1份比4份)中。用磷酸钠将溶液调整至pH 8.6，并且添加20kDa mPEG-pNP试剂(相对于CMP-SA-甘氨酸的实际摩尔数而言1.5摩尔当量)。将反应体系在室温下搅拌20-48小时，同时使pH维持在8.6。反应通过RP-HPLC来进行监测，并且当反应完成时，通过旋转蒸发来浓缩反应混合物以去除THF。将浓缩的水性反应混合物用水(300mL)稀释至为原始总反应体积的2.4倍的终体积。测量电导率，并且证实其低于0.8mS/cm。将稀释的产物溶液以50cm/小时的流速加载到Q-sepharose Big Beads柱(10gPEG试剂/升树脂，其中具有至少10cm的树脂床高度)上。用2CV的水从柱中洗涤出非结合性材料。用2mM NaHCO3(1CV)以100cm/小时的流速从柱中洗脱出SA-PEG-10kDa杂质。也以100cm/小时，用30mM NaHCO3(3CV)洗脱出纯的产物(图6)。在SA-PEG杂质峰之后，当UV 271读数上升超过基线时，被收集的产物级分开始，并且在产物峰的拖尾侧在最大产物峰的约5％处结束。使汇集的产物冷却至4℃，并且使用切向流过滤系统将其浓缩4倍(至大约21g/L的产物浓度)，所述切向流过滤系统包含1kDa再生纤维素膜。用4℃水(4倍截留物体积)对截留物进行渗滤以用于去除盐，并且持续直至渗透物电导率接近给水的电导率。将纯化的CMP-SA-PEG-20kDa溶液进行冷冻，并且冷冻干燥至干。
6.3.用于生产CMP-SA-甘油PEG-40kDa的示例性工艺过程
将CMP-SA-甘氨酸以2mM的浓度溶解在水和THF(1份比4份)中。用磷酸钠将溶液调整至pH 8.6，并且添加40kDa mPEG-pNP试剂(相对于CMP-SA-甘氨酸的实际摩尔数而言1.1摩尔当量)。将反应体系在室温下搅拌60-66小时，同时使pH维持在8.6。反应通过RP-HPLC来进行监测，并且当反应完成时，通过旋转蒸发来浓缩反应混合物以去除THF。将浓缩的水性反应混合物用水(600mL)进行稀释，以将体积调整至原始总反应体积的3.4倍，并且将电导率调整至低于0.5mS/cm。将稀释的产物溶液以30cm/小时的流速加载到Q-sepharose Big Beads柱(5g PEG试剂/升树脂，其中具有至少10cm的树脂床高度)上。用2CV的水从柱中洗涤出非结合性材料。用2mM NaHCO3(1CV)以150cm/小时的流速从柱中洗脱出SA-PEG-10kDa杂质。也以150cm/小时，用30mM NaHCO3(3CV)洗脱出纯的CMP-SA-甘油-PEG-40kDa(图7)。当UV 271读数上升至产物峰最大吸收的20％(允许去除SA-PEG杂质肩)时，产物级分开始，并且在产物峰的拖尾侧在峰最大值的约5％处结束(图7)。使汇集的产物冷却至4℃，并且使用切向流过滤系统将其浓缩4倍(至大约6g/L的产物浓度)，所述切向流过滤系统包含1kDa再生纤维素膜。进一步的浓缩受到该系统所要求的大工作体积的限制。用4℃水(4倍截留物体积)对截留物进行渗滤以用于去除盐，并且持续直至渗透物电导率接近给水的电导率。将纯化的CMP-SA-甘油-PEG-40kDa溶液进行冷冻，并且冷冻干燥至干。
实施例7：
阴离子交换条件的优化
选择来自GE Healthcare的Q-Sepharose Big Beads树脂作为用于纯化CMP-SA-PEGs的所选树脂，因为所述树脂具有低成本、高结合能力、高线性流速和季胺离子结合官能度。就其与CMP-SA-PEGs结合的能力来检查所述树脂的不同抗衡离子形式，包括氯化物、氢氧化物、磷酸盐和碳酸氢盐离子。观察到，CMP-SA-PEGs对于这种树脂具有低的结合亲合力，这很可能是由于在所述试剂上的干扰试剂-树脂离子相互作用的大的PEG部分。因此，选择加载溶液的电导率低于1mS/cm。
CMP-SA-PEGs不与所述树脂的氯化物形式结合，但与氢氧化物、磷酸盐和碳酸氢盐形式结合(表11)。所述树脂的氢氧化物形式不能在加工中使用，因为当使用氯化钠来洗脱CMP-SA-PEG时，无法解析出SA-PEG，并且溶液的pH变得非常碱性。pH的增加引起CMP-SA-PEG的分解(表11)。使用磷酸钠(pH 7.5或pH 8.0)从所述树脂的磷酸盐形式中产物的洗脱提供了污染物的差的解析(表11)。
只有用碳酸氢钠作为洗脱缓冲液从Q-Sepharose Big Bead树脂的碳酸氢盐形式中洗脱出产物这种情况提供了在进料溶液中的许多相关污染物的分开，包括CMP、SA-PEG和CMP-SA-甘氨酸(图5)。浅NaHCO3梯度或小分阶洗脱方法对于从可能在反应或生产过程中形成的SA-PEG选择性地洗脱CMP-SA-PEGs来说是必需的。仅需要电导率的非常小的逐步增加来洗脱SA-PEG和CMP-SA-PEG(＜30mM NaHCO3，＜2.7mS/cm)。然而，只有当使用高得多的NaHCO3浓度时，其他结合性反应组分(CMP、CMP-SA-甘氨酸、对硝基苯酚)才全部被洗脱出。
表11：
使用各种洗脱条件，用Q-Sepharose Big Beads柱来进行的CMP-SA-PEG-10kDa的纯化
  树脂   洗脱盐   洗脱方法   解析
氢氧化物 NaCl   线性梯度(在1M氯化钠中无缓冲质)注：柱洗脱pH＞11，这导致CMP-SA-PEG的分解   CMP和GSC的差的解析；无SA-PEG的解析
磷酸盐   磷酸钠(pH 7.5)   线性梯度，0-15mM磷酸钠，pH 7.5，6CV；随后，15-140mM磷酸钠，pH 7.5，5CV；以及随后，0.5M磷酸钠，pH 7.5   CMP和GSC的差的解析；无SA-PEG的解析
磷酸盐   磷酸钠(pH 7.5)   线性梯度，0-30mM磷酸钠，6CV；30-280mM磷酸钠，5CV；0.5M磷酸钠。   CMP和GSC的差的解析；无SA-PEG的解析
碳酸氢盐 NaCl   线性梯度，0-0.5M NaCl(无缓冲质)，5CV   CMP和GSC的差的解析；无SA-PEG的解析
碳酸氢盐 NaCl   线性梯度，0-0.3M NaCl(无缓冲质)，经过6CV   CMP和GSC的部分解析；无SA-PEG的解析
碳酸氢盐 NaCl   分阶洗脱，从0至30mM NaCl(无缓冲质)；随后，线性梯度，30-250mM NaCl，经过5CV CMP和GSC的分开；无SA-PEG的解析
碳酸氢盐   磷酸钠(pH 8.0)   线性梯度，0-30mM磷酸钠，pH 8，经过6CV；随后，30-280mM磷酸钠，5CV   CMP和GSC的良好解析；无SA-PEG的分开
碳酸氢盐 碳酸氢钠   分阶，从0至0.01％NaHCO3，1.5CV；随后，分阶，至0.1％NaHCO3，1.5CV；随后，线性梯度，30mM-280mMNaHCO3，经过5CV CMP和GSC的良好解析；无SA-PEG的解析
碳酸氢盐 碳酸氢钠   线性梯度，0-30mM NaHCO3，3CV；随后，30mM NaHCO3，2CV；随后，线性梯度，30-280mM NaHCO3，经过5CV   CMP和GSC的极佳解析；SA-PEG的部分解析
碳酸氢盐 碳酸氢钠   分阶洗脱，0-5mM NaHCO3，经过0.6CV；随后，分阶，至30mM NaHCO3，并且保持3CV，随后，分阶，至1M NaHCO3或NaOH   所有污染物(包括SA-PEG)的极佳解析
  氯化物   --   CMP-SA-PEG不结合   --
在表11中，经浓缩和稀释的偶联反应混合物溶液的电导率为＜1.0mS/cm。解析(resolution)表示CMP-SA-PEG-10kDa产物与其他相关污染物(例如，CMP、GSC、SA-PEG、PEG和对硝基苯酚)相分开。通过所有方法容易地将PEG和对硝基苯酚与产物相分开，除了当树脂处于氯化物离子形式时。还通过相同的洗脱方法来检查pH 8.0的磷酸盐缓冲液。如对于pH 7.5的磷酸盐缓冲液所见的，观察到类似的结果。
分阶洗脱优化
使用Q Sepharose Big Beads树脂的HCO3 -形式，对于每种CMP-SA-PEG产物小心地对用NaHCO3缓冲液的分阶洗脱条件进行优化。在早期洗脱SA-PEG杂质峰和产物之间的解析是最大化的。对于CMP-SA-PEG-10kDa，研究了从水到低NaHCO3浓度(30mM，0mM，5mM)的小阶跃，如表12中所描述的。使用至5mM NaHCO3的初始阶跃，在SA-PEG-10kDa和产物之间达到基线解析。尽管产物也在5mMNaHCO3浓度下洗脱，但产物峰洗脱特性曲线图是非常宽的。因此，在5mM下0.6CV后，梯度立即阶跃至30mM NaHCO3。于pH 8.3-8.6在大约1.5CV中有效地收集了纯的CMP-SA-PEG-10kDa，如图3中所显示的。用至1M NaHCO3的分阶洗脱，洗脱出更紧密地结合的CMP、CMP-SA-Gly和对硝基苯酚杂质。还收集了SA-PEG-10kDa峰，脱盐(在G-25柱上，未描述)，并冷冻干燥。通过1H-NMR来进行的该固体的分析验证了其结构。
为了达到SA-PEG-20kDa和CMP-SA-PEG-20kDa产物之间的相同的基线分离，需要至2mM NaHCO3的初始阶跃(图6)。在2mM NaHCO3下产物也开始洗脱。为了避免非常宽的洗脱产物峰，在2mM碳酸氢钠下仅1CV后使梯度阶跃至30mM NaHCO3。于pH 7.8在大约1.5CV中收集了纯的产物(图5)。还收集了SA-PEG-20kDa峰，脱盐(在G-25柱上，未描述)，并冷冻干燥。通过1H-NMR来进行的该固体的分析验证了其结构。
表12：
对于CMP-SA-PEG-10kDa，Q-Sepharose Big Beads洗脱条件的优化
 PEG载荷＊(克PEG/L树脂)   体积流速加载/洗涤/洗脱(mL/分钟)   线性流速加载/洗脱(cm/小时) 梯度 注解
1 11g PEG/L树脂 1.7/3.4/3.4 19.2/38.4   水洗涤，3.2CV，10mM NaHCO3，2.5CV，10-30mM NaHCO3，经过1.5CV，30mM NaHCO3，1CV，30-280mM NaHCO3，5CV，1M NaHCO3，2CV。   SA-PEG和CMP-SA-PEG的一些解析，但产物洗脱在10mM NaHCO3下开始。
2 11g PEG/L树脂 1.7/3.4/3.4 19.2/38.4   水洗涤，3.2CV，5mM NaHCO3，2CV，10mM NaHCO3，2CV，20mM NaHCO3，2CV，30mM NaHCO3，2CV，30-280mM NaHCO3，经过1CV，280mM-1M NaHCO3，经过1CV，1M NaHCO3，2CV。   SA-PEG和CMP-SA-PE G的良好解析。产物洗脱在10mM NaHCO3下开始。
3 11g PEG/L树脂 1.7/3.4/8.9 19.2/100   水洗涤，2.2CV，30mM NaHCO3，3CV，30-280mM NaHCO3，经过1CV，280mM-1M NaHCO3，经过1CV，1M NaHCO3，2CV。   SA-PEG和CMP-SA-PEG的差的解析。
4 22g PEG/L树脂 1.7/3.4/3.4 19.2/38.4   水洗涤，2.2CV，30mM NaHCO3，3CV，30-280mM NaHCO3，经过1CV，280mM-1M NaHCO3，经过1CV，1M NaHCO3，2CV。   无SA-PEG和CMP-SA-PEG的解析。
5 11g PEG/L树脂 1.7/8.9/8.9 19.2/100   水洗涤，2.2CV，5mM NaHCO3，0.6CV，30mM NaHCO3，3CV，1M NaHCO3，7CV。   SA-PEG和CMP-SA-PEG的最佳分离。
6 8.2g PEG/L树脂 1.7/8.9/8.9 19.2/100   水洗涤，2.2CV，5mM NaHCO3，0.6CV，30mM NaHCO3，3CV，30-280mM NaHCO3，经过1CV，280mM-1M NaHCO3，经过1CV，1M NaHCO3，7CV。   SA-PEG和CMP-SA-PEG的最佳分离。柱的未留意的负载不足。通过RP-HPLC，收集所有峰并确认其身份。
7 10g PEG/L树脂 65/130 50/100   水洗涤，2.2CV，5mM NaHCO3，0.6CV，30mM NaHCO3，3CV，1M NaHCO3，7CV。   SA-PEG和CMP-SA-PEG的最佳分离。图3。
在表12中，Q Big Beads柱对于实验1-6是GE XK-26(2.6cm x 18.8cm，100mL)，碳酸氢盐离子形式，而对于实验7是GE BPG 100/500柱(10cmx26cm，2L)，碳酸氢盐形式。根据在源反应中使用的以克表示的10kDa-mPEG-pNP的质量乘以通过使加载到柱上的最终反应体积除以以升表示的柱体积而得的分数，来计算PEG载荷。
CMP-SA-甘油-PEG-40kDa与Q-Sepharose Big Beads树脂非常弱地结合。产物和SA-PEG副产物均使用至2mM NaHCO3的分阶洗脱而洗脱出来。SA-PEG-40kDa杂质部分地被解析为在产物峰的前沿上的非常小的肩(图8)。当使用2mM碳酸氢钠来收集CMP-SA-甘油-PEG-40kDa时，收集到宽的洗脱峰(3CV)。该洗脱峰的pH仅为6.5，这引起产物分解。
因此，采用使用2mM碳酸氢钠(1CV)的分阶洗脱，洗脱出SA-PEG-40kDa。然后，产物通过下列方式而洗脱出来：增加分阶洗脱至30mM NaHCO3以快速洗脱出产物，如图7中所显示的。使用这些条件，于7.4的pH以2CV从柱中收集CMP-SA-甘油-PEG-40kDa产物。进一步的pH调整不是必需的。在图5中观察到的不寻常的峰形状可以通过将2mM NaHCO3步骤从1个完全柱体积(CV)的洗脱缩短至0.5CV而得到防止，如关于10kDa产物所做的(图4)。按常规地发现这个单元操作的工艺步骤回收率为超过95，如通过RP-HPLC所测定的(图7)。还收集了SA-PEG-40kDa峰，并冷冻干燥。通过1H-NMR来进行的该固体的分析验证了其结构。
工艺参数。优选地，将CMP-SA-PEG-10kDa和20kDa产物的经旋转蒸发的反应混合物进行稀释，直至电导率分别减少至小于1和0.8mS/cm。此外，溶液的pH优选地为7.1-7.6，以确保产物的完全捕获。将经稀释的溶液以这样的浓度加载到AEX柱上，所述浓度相应于10g用于该反应的经活化的mPEG-pNP起始试剂/升AEX树脂。更高的产物柱载荷可以用于CMP-SA-PEG-10kDa产物(22g mPEG-pNP/L树脂)，但丧失了SA-PEG和CMP-SA-PEG-10kDa之间的解析(表11)。
优选地，通过水稀释将经旋转蒸发的CMP-SA-甘油-PEG-40kDa反应混合物的电导率减少至低于0.5mS/cm。此外，溶液的pH优选地为7.1-7.6，以确保产物的完全捕获。小规模的加载研究表明，对于每5克在该反应中使用的40kDa-mPEG-pNP起始试剂来说需要约1升Q-Sepharose Big Beads树脂。因此，4L的柱应当足以捕获以20g 40kDa-mPEG-pNP开始的CMP-SA-甘油-PEG-40kDa反应产物。这是在使用这些洗脱条件的情况下对于AEX树脂的最大加载能力的约70％。在使用15和28cm之间的柱床高度的色谱法的性能方面未观察到差异。
将经浓缩的、经稀释的反应混合物以15-50cm/小时(相应于在2L柱上的20-65mL/分钟)的线性流速加载到AEX柱上。在所有情况下，加载溶液在柱上的停留时间为大约15分钟。在使用2L AEX柱的情况下，对于所有三种CMP-SA-PEG产物采用100-150cm/小时(对于2L柱为130-200mL/分钟)的洗涤和洗脱流速。因此，总单元操作时间(包括反应混合物加载和产物洗脱)小于1.5小时(图3、5和7)。使用了直至200cm/小时的更高洗脱流速，其中未观察到SA-PEG-20kDa和CMP-SA-PEG-20kDa产物之间的解析的丧失。
实施例8：
超滤/渗滤脱盐步骤(TFF)的优化
使用超滤/渗滤(TFF)来对CMP-SA-PEG离子交换洗脱汇集物进行浓缩和洗脱。所述TFF系统使用Millipore Pellicon-2平片膜(1kDaMWCO；再生纤维素膜)来使进料溶液脱盐并保留产物。
示例性的切向流过滤过程
CMP-SA-PEG-10kDa离子交换产物库(1500mL，图4)和CMP-SA-PEG-20kDa离子交换产物库(图6)都使用具有3x0.1m2膜的Pellicon 2“MINI”系统来进行脱盐(表1)，其中使用蠕动泵。使用大约22psi的跨膜压，其产生大约3.7LMH的通量。
由于对于CMP-SA-甘油-PEG-40kDa来说来自AEX洗脱汇集物的大的洗脱体积(图7)，因而使用2x0.5m2膜来使所述洗脱汇集物脱盐(表4)。对于这个系统使用这样的蠕动泵，其以20psi的TMP产生3LMH的通量率。在加工过程中使Q-sepharose Big Beads洗脱产物库在冰浴中进行冷却，以防止CMP-SA-甘油-PEG-40kDa由于由泵产生的热而分解。
使在MINI系统上加工的截留物溶液浓缩至500mL(对于CMP-SA-PEG-10kDa来说为3倍，对于CMP-SA-PEG-20kDa来说为4倍)，分别相应于14.3g/L和21g/L的产物浓度。在任何渗透物样品中未观察到产物穿透(RP-HPLC)。由于0.5m2系统的大的系统滞留体积(对于2个膜筒来说大约400mL)，所以可以达到的最小截留物体积仅为1L(4-6倍浓缩)。所得到的产物浓度是相当稀释的，为大约5g/L，这比对于更小的20kDa产物所达到的20g/L低得多。
在浓缩后，使用4倍渗体积(diavolume)的冷却水(对于10和20kDa产物来说为2L；对于40kDa产物来说为4L)以恒定的体积使各个截留物进行渗滤。在浓缩和渗滤过程自始至终收集渗透物样品，并且记录pH和电导率。当渗透物溶液的电导率接近用于渗滤的水的电导率(＜50microS/cm)时，渗滤完成。
表8：
通过RP-HPLC来分析最终的经渗滤的截留物库，并且经过大约3天的时间段进行冷冻干燥从而提供了白色粉末。通过RP-HPLC和NMR来分析最终的经冷冻干燥的TFF产物，以测定产物回收率(90-95％)和纯度(＞90％，表2、3、5和6)。关于联合反应、旋转蒸发、离子交换、TFF单元操作和冷冻干燥的总体产物回收率为65-77％。1H-NMR验证了每种产物的结构，并且ICP测试表明，每种产物结构为二钠形式。ICP测试还表明，不存在另外的钠盐。
纯度和总产率计算基于用于产生每种CMP-SA-PEG产物的mPEG的据估计的平均质量(对于CMP-SA-PEG-10kDa来说为10,700；对于CMP-SA-PEG-20kDa来说为20,700；对于CMP-SA-甘油-PEG-40kDa来说为43,347)，其由制造商所报道。产物分子量的低估导致通过RP-HPLC少报了产物含量，并因此低估了产物纯度。

Claims (27)

1.制备组合物的方法，所述组合物包含与聚合物修饰基团共价连接的经修饰的核苷酸糖，所述聚合物修饰基团包含至少一个线性或支化的聚(环氧烷)部分，其中所述经修饰的核苷酸糖是与线性或支化的聚(乙二醇)部分共价连接的胞苷一磷酸-唾液酸(CMP-SA)；
所述方法包括：
(i)使包含所述经修饰的核苷酸糖的反应混合物与阴离子交换介质相接触；
(ii)从所述阴离子交换介质中洗脱出所述核苷酸糖，从而形成包含所述经修饰的核苷酸糖的洗出液级分；和
(iii)使所述洗出液级分脱盐，
其中所述方法在步骤(i)之前不包括超滤，
从而形成所述组合物；
其中使用碳酸氢盐缓冲液从所述阴离子交换介质中洗脱出所述经修饰的核苷酸糖，并且其中所述缓冲液包含0.01mM至30mM的所述碳酸氢盐。
2.权利要求1的方法，其中所述反应混合物具有小于5mS/cm的盐电导率。
3.权利要求1或2的方法，其中所述阴离子交换介质是选自季铵树脂和二乙基氨基乙基(DEAE)树脂的成员。
4.权利要求1的方法，其中所述阴离子交换介质是季铵树脂的碳酸氢盐形式。
5.权利要求1的方法，其中所述阴离子交换介质是Q-sepharose树脂。
6.权利要求1的方法，其中使用膜过滤来完成所述脱盐。
7.权利要求6的方法，其中所述膜过滤是切向流过滤(TFF)。
8.权利要求6的方法，其中所述膜过滤减少所述洗出液级分的体积。
9.权利要求6的方法，其中所述膜过滤导致所述洗出液级分具有相比于所述膜过滤之前的盐电导率而言降低的盐电导率。
10.权利要求9的方法，其中所述洗出液级分的所述降低的盐电导率为10μS/cm-200μS/cm。
11.权利要求9的方法，其中所述洗出液级分的所述降低的盐电导率小于50μS/cm。
12.权利要求1的方法，其在步骤(i)之前进一步包括：
(iv)减少所述混合物的体积。
13.权利要求12的方法，其中使用旋转蒸发来完成所述减少。
14.权利要求1的方法，其进一步包括：
(v)对包含所述经修饰的核苷酸糖的所述洗出液级分实施冷冻干燥或喷雾干燥。
15.权利要求1的方法，其中所述聚(乙二醇)部分具有5kDa-500kDa的分子量。
16.权利要求1的方法，其中所述聚(乙二醇)部分具有10kDa-100kDa的分子量。
17.权利要求1的方法，其中所述支化的聚(乙二醇)部分包含甘油主链。
18.权利要求1的方法，其中所述方法以80％-100％(w/w)的纯度提供所述经修饰的核苷酸糖。
19.权利要求1的方法，其中所述方法以50％-90％的总产率提供所述经修饰的核苷酸糖。
20.权利要求1的方法，其在步骤(i)之前进一步包括：
(vii)使包含伯氨基的核苷酸糖衍生物与经活化的聚(环氧烷)部分在对于在所述核苷酸糖衍生物的所述氨基和所述聚(环氧烷)部分之间形成共价键来说足够的条件下相接触。
21.权利要求20的方法，其中所述核苷酸糖衍生物是CMP-SA-甘氨酸。
22.权利要求20的方法，其中所述经活化的聚(环氧烷)部分包含对硝基苯基碳酸酯部分。
23.权利要求20-22中任一项的方法，其中在具有8.0至8.8的pH的水性溶剂存在下，使所述核苷酸糖衍生物与所述聚(环氧烷)部分相接触。
24.权利要求23的方法，其中所述聚(环氧烷)部分是聚(乙二醇)-对硝基苯基碳酸酯。
25.制备组合物的方法，所述组合物包含与聚合物修饰基团共价连接的经修饰的核苷酸糖，所述聚合物修饰基团包含至少一个线性或支化的聚(环氧烷)部分，其中所述经修饰的核苷酸糖是与线性或支化的聚(乙二醇)部分共价连接的CMP-SA；所述方法包括：
(i)使包含伯氨基的核苷酸糖衍生物与包含对硝基苯基碳酸酯部分的经活化的聚(环氧烷)部分在对于在所述核苷酸糖衍生物的所述氨基和所述聚(环氧烷)部分之间形成共价键来说足够的条件下相接触，其中所述接触在具有8.0至8.8的pH的水性溶剂存在下发生，从而形成包含所述经修饰的核苷酸糖的反应混合物；
(ii)使包含所述经修饰的核苷酸糖的所述反应混合物与阴离子交换介质相接触；
(iii)从所述阴离子交换介质中洗脱出所述经修饰的核苷酸糖，从而形成包含所述经修饰的核苷酸糖的洗出液级分；
(iv)使用膜过滤来使所述洗出液级分脱盐；和
(v)从所述洗出液级分中去除水，
其中所述方法在步骤(i)之前不包括超滤，
从而形成所述组合物；
其中使用碳酸氢盐缓冲液从所述阴离子交换介质中洗脱出所述经修饰的核苷酸糖，并且其中所述缓冲液包含0.01mM-30mM的所述碳酸氢盐。
26.权利要求25的方法，其中所述核苷酸糖衍生物是CMP-SA-甘氨酸。
27.权利要求25的方法，其中所述聚(乙二醇)部分具有10-100kDa的分子量。
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