CN102740840A - 长效g-csf缀合物的液体制剂 - Google Patents

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Abstract

公开了一种液体制剂，其使得具有改进的体内持续时间和稳定性的长效G-CSF缀合物能在长时间储存时稳定。所述液体制剂包含以缓冲剂和甘露醇为特征的稳定剂组合物。由于不含人血清白蛋白和其他对身体有害的潜在因子，所以所述液体制剂没有病毒感染的问题并且其确保长效G-CSF缀合物的优异的储存稳定性。

Description

长效G-CSF缀合物的液体制剂
技术领域
本发明涉及用于确保长效G-CSF缀合物的长期储存稳定性的液体制剂，在所述缀合物中G-CSF、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段是共价连接的并且显示出相比于野生型延长的作用持续时间。
背景技术
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是刺激骨髓干细胞和白细胞以使其分化和增殖的细胞因子。它是分子量范围为18,000至19,000 Da、pI为6.1(5.5-6.1，取决于糖基化程度)的糖蛋白(Nomura等，EMBO J.5(5)：871-876，1986)。
重组DNA技术发现了G-CSF的分子和遗传特性(Clark和Kaman，Science，236：1229-1237，1987)。自从用分离自CHU-2和人膀胱癌5637细胞系的mRNA所构建的cDNA文库克隆人G-CSF基因以来(Nagata等，Nature，319：415-418，1986；Nagata等，EMBO J.，5(3)：575-581，1986；Souza等，Science，232：61-65，1986)，重组DNA技术就已允许从哺乳动物细胞和原核生物中生产G-CSF。此外，本发明人发现修饰的hG-CSF可以以在其N端不含甲硫氨酸残基的形式大量分泌到周质中，其中所述修饰的hG-CSF与野生型的不同之处在于其中至少一个氨基酸残基(特别是17位的半胱氨酸残基)被替换为不同的氨基酸残基(韩国专利No.10-356140)。
由于多肽易于因其稳定性低而变性、被血液中的蛋白水解酶降解并且易于通过肾脏或肝脏，因此需要频繁地向患者施用蛋白质药物(包括作为药物有效成分的多肽)以维持期望的血液水平浓度和效价。但是，这种蛋白质药物的频繁施用引起患者疼痛，特别是在通过注射施用的情况下。
为了解决这些问题，进行了很多努力来改善蛋白质药物的血清稳定性并使血液中的药物在更长的时间内维持在高水平，从而使药物的药效最大化。为了在长效制剂中使用，必须将蛋白质药物配制成高稳定性的且其效价维持在足够高的水平而不引起患者免疫应答。
为了稳定蛋白质并防止酶促降解和被肾脏清除，通常使用具有高溶解度的聚合物(如聚乙二醇(PEG))来对蛋白质药物表面进行化学修饰。通过与靶蛋白的特定区域或多个区域结合，PEG使蛋白质稳定并防止水解，而不引起严重的副作用(Sada等，J.Fermentation Bioengineering71：137-139，1991)。然而，尽管聚乙二醇化能够增强蛋白质稳定性，但其也存在问题，例如大大降低生理活性蛋白质的效价。另外，产量随着PEG分子量的增加而降低，这是由于蛋白质反应性的降低所致。
用于改善生理活性蛋白质的体内稳定性的一种替代性方法是通过基因重组技术将生理活性蛋白质的基因与编码具有高血清稳定性之蛋白质的基因连接，并且培养用该重组基因转染的细胞以生产融合蛋白。例如，融合蛋白可以这样制备：通过基因重组将白蛋白(已知的在增强蛋白质稳定性方面最有效的蛋白质)或其片段与目的生理活性蛋白质缀合(PCT公开No.WO 93/15199和WO 93/15200，欧洲专利公开No.413,622)。
另一种方法是使用免疫球蛋白。如美国专利No.5,045,312中所描述的，通过使用交联剂将人生长激素与牛血清白蛋白或小鼠免疫球蛋白缀合。该缀合物与未修饰的生长激素相比具有增强的活性。采用碳二亚胺或戊二醛作为交联剂。但是，与肽非特异性结合的这种低分子量交联剂不允许形成均一的缀合物，并且甚至在体内是有毒的。此外，该专利表明活性增加仅仅是由于与生长激素的化学偶联。该专利的方法不能保证不同种类的多肽药物的活性增强，因此该专利甚至没有认识到与蛋白质稳定性相关的因素，如持续时间、血液半衰期等。
最近提出的一种药物制剂是体内持续时间和稳定性均改善的长效蛋白质药物制剂。为了在长效药物制剂中使用，通过将生理活性多肽、非多肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段共价连接来制备蛋白质缀合物(韩国专利No.10-0567902和10-0725315)。
在该方法中，G-CSF可以用作生理活性多肽以提供长效G-CSF缀合物。为了将长效G-CSF缀合物应用到药物产品中，必须维持其在体内的药效，同时抑制在储存和运输期间的物理化学变化，如光、热或添加剂引起的变性、聚集、吸附或水解。与G-CSF多肽自身相比，长效G-CSF缀合物由于其体积和分子量增加因而更难以稳定化。
通常，蛋白质具有非常短的半衰期，并且当暴露于不合适的温度、水-空气界面、高压、物理/机械应力、有机溶剂、微生物污染等时，其发生变性，如单体聚集、聚集沉淀以及吸附到容器表面上。在变性后，蛋白质失去其物理化学特性和生理活性。一旦变性，蛋白质几乎不能恢复其原有特性，因为变性是不可逆的。特别在所施用的蛋白质(如G-CSF)是每次注射几百微克的微量的情况下，当它们丧失稳定性并因此吸附到容器表面上时，产生的损失相对较大。此外，在变性过程中吸附的蛋白质容易聚集，并且变性蛋白质的聚集体在施用到体内时，其充当抗原(不像体内合成蛋白质那样)。因此，蛋白质必须以稳定形式施用。已经进行了许多研究以防止蛋白质在溶液中变性(John Geigert，J.Parenteral Sci.Tech.，43(5)：220-224，1989；David Wong，Pharm.Tech.，34-48，1997；Wei Wang.，Int.J.Pharm.，185：129-188，1999；Willem Norde，Adv.Colloid Interface Sci.，25：267-340，1986；Michelle等，Int.J.Pharm.120：179-188，1995)。
将冻干法应用于一些蛋白质药物以实现稳定性目标。但是，冻干产品的不便之处在于它们必须重新溶解于注射用水中使用。此外，因为其生产过程包括冻干过程，所以需要在大容量冻干机上进行巨大投资。有人提出通过使用喷雾干燥器使蛋白质破碎。但是，该方法由于产量低而不经济。此外，喷雾干燥过程将蛋白质暴露于高温，因此对蛋白质稳定性有负面影响。
作为克服该限制的替代方案，出现了稳定剂，当将其添加到蛋白质的溶液中时，可以抑制蛋白质药物的物理化学变化并维持体内药效，甚至在长时间储存之后也是如此。稳定剂有糖类、氨基酸、蛋白质、表面活性剂、聚合物和盐。尤其是人血清白蛋白已被广泛用作多种蛋白质药物的稳定剂并且其性能已得到证明(Edward Tarelli等，Biologicals，26：331-346，1998)。
人血清白蛋白的典型纯化过程包括使生物污染物(如支原体、朊病毒、细菌和病毒)失活，或者筛选或检查一种或更多种生物污染物或病原体。但是，总存在因生物污染物未完全去除或失活而使患者处于与其接触的风险。例如，筛选来自供体的人血以检查其是否包含某些病毒。但是，该过程不总是可靠的。特别地，以非常小的数目存在的某些病毒不能被检测到。
最近提出了人血清白蛋白的替代物，包括重组白蛋白(韩国专利公开No.10-2004-0111351)和不含白蛋白的G-CSF(韩国专利No.10-0560697和10-0596610)。
即便采用不含白蛋白的稳定剂，不同蛋白质由于其化学差异可逐渐失活，因为它们在储存期间有不同的比率和条件。稳定剂对蛋白质储存期的影响因蛋白质而异。即，根据目的蛋白质的物理化学特性，不同稳定剂可以以不同的比例使用。
此外，同时使用不同稳定剂时，由于其竞争和误操作可引起相反作用。不同稳定剂的组合也引起不同的作用，因为它们使得蛋白质的特性或浓度在储存期间发生改变。因为每种稳定剂在特定浓度范围中才适宜地发挥其稳定作用，所以必须做许多努力来谨慎地将不同稳定剂的种类和浓度进行组合。
特别地，对于体内持续时间和稳定性改进的长效G-CSF缀合物来说，因为它们由生理活性肽G-CSF和免疫球蛋白片段Fc构成，所以其分子量和体积与普通G-CSF复合物的相当不同。此外，免疫球蛋白Fc片段的稳定性因pH而大不相同。因此，不能将用于G-CSF的常规稳定剂原样使用。因此，需要不同于G-CSF稳定剂之组成的特定稳定剂来用于长效G-CSF缀合物。
开发长效G-CSF缀合物的稳定液体制剂(其能够长期保持药效而没有病毒感染)的大量而充分的研究得到了本发明，导致了这一发现，即包含特定pH范围的缓冲剂和高浓度甘露醇的稳定剂赋予长效G-CSF缀合物增强的稳定性并且允许形成经济而稳定的长效G-CSF缀合物液体制剂。
发明内容
技术问题
因此本发明的一个目的是提供一种包含长效G-CSF缀合物和不含白蛋白的稳定剂的液体制剂，其中所述长效G-CSF缀合物中G-CSF、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段共价连接，并且所述稳定剂包含缓冲剂和甘露醇。
问题的解决方案
根据其中的一个实施方案，本发明提供了一种包含长效G-CSF缀合物和不含白蛋白的稳定剂的液体制剂，其中所述长效G-CSF缀合物中G-CSF、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段共价连接，并且所述稳定剂包含缓冲剂和甘露醇。
本文所用术语“长效G-CSF缀合物”意指蛋白质构建体，其中生理活性的G-CSF、一种或更多种非肽聚合物和一种或更多种免疫球蛋白Fc片段共价连接，并且所述蛋白质构建体相比于天然形式的G-CSF具有延长的作用持续时间。
本文所用术语“长效”意指相比于天然形式延长的作用持续时间。术语“缀合物”意指其中G-CSF、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段共价连接的构建体。
为了在本发明中使用，G-CSF具有人G-CSF或密切相关类似物的氨基酸序列。可用于本发明的G-CSF可以是天然蛋白质或重组蛋白质。而且，G-CSF可以是经插入、缺失或插入氨基酸的突变体，前提是所述突变对其原有生物活性没有显著影响。
可用于本发明的人G-CSF或其类似物可以分离自脊椎动物或可以化学合成。或者，G-CSF或其类似物可以得自使用基因重组技术用编码G-CSF或其类似物的基因转化的原核生物或真核生物。对此，可以将肠细菌(如大肠杆菌(E.coli))、酵母细胞(如啤酒酵母(S.cerevisiae))或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞、猴细胞)用作宿主细胞。根据宿主细胞，重组G-CSF或其类似物可以用哺乳动物或真核生物的糖进行糖基化，或者是非糖基化的。在表达时，重组G-CSF或其类似物可包含初始的甲硫氨酸残基(1位)。优选地，使用CHO细胞作为宿主制备重组人G-CSF(HuG-CSF)。使用大肠杆菌作为宿主细胞制备的重组人G-CSF(HuG-CSF)适用于本发明。在本发明的一个优选实施方案中，重组人G-CSF是突变体(17Ser-G-CSF)，其中17位是丝氨酸残基，而不是野生型的半胱氨酸，并且所述重组人G-CSF可以如韩国专利No.10-356140中公开的进行表达。
为了在本发明中使用，免疫球蛋白Fc片段具有人免疫球蛋白Fc片段或其密切相关类似物的氨基酸序列。Fc片段可以从分离自动物(包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠)的天然形式中得到。此外，免疫球蛋白Fc片段可以是来自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc片段，或者由其组合或杂合体制得。优选地，它来自在人血中最丰富的蛋白质IgG或IgM，并且最优选地来自已知增强配体结合蛋白的半衰期的IgG。本文中，免疫球蛋白Fc可以通过分离人或动物有机体的完整免疫球蛋白并用蛋白水解酶处理它们而得自天然免疫球蛋白，或者，它可以是得自经转化的动物细胞或微生物的其重组体或衍生物。优选的是由大肠杆菌转化体生产的重组人免疫球蛋白Fc。
另一方面，IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型，并且本发明包括其组合和杂合体。优选的是IgG2和IgG4亚型，最优选的是很少具有效应功能(如CDC(补体依赖性细胞毒性))的IgG4的Fc片段。也就是说，作为本发明的药物载体，最优选的免疫球蛋白Fc片段是人IgG4的非糖基化Fc片段。人源Fc片段比非人源Fc片段更优选，后者可在人体中充当抗原并引起不期望的免疫应答，如产生针对抗原的新抗体。
通过将G-CSF与免疫球蛋白Fc片段连接在一起来制备可用于本发明的长效G-CSF缀合物。对此，G-CSF和免疫球蛋白Fc片段可通过非肽聚合物交联，或者可以使用重组技术形成融合蛋白。
用于交联的非肽聚合物可选自可生物降解聚合物、脂质聚合物、甲壳素、透明质酸及其组合。可生物降解聚合物可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚(polyvinyl ethyl ether)、PLA(聚乳酸)、PLGA(聚乳酸-乙醇酸)及其组合。最优选聚(乙二醇)(PEG)，优选聚乙二醇。本领域熟知的并且能够易于由本技术领域技术人员制备的其衍生物也包含于本发明的范围中。
可以使用基因工程技术制备用于本发明的长效G-CSF缀合物，如韩国专利No.10-0725315中所公开的。
本发明的液体制剂包含治疗有效量的长效G-CSF缀合物。通常，G-CSF的治疗有效量为每个一次性瓶约300mcg。用于本发明的长效G-CSF缀合物的浓度为约7mg/ml至22mg/ml，优选约11mg/ml至22mg/ml。
本文所用术语“稳定剂”意指允许长效G-CSF缀合物安全储存的物质。术语“稳定”意指在储存条件下某时间段内活性成分的损失不多于预定的比例(通常最高10％)。当在10℃下储存2年、在25℃下6个月或在40℃下一至两周之后，G-CSF保留其原有活性的90％或更高(优选其原有活性的95％或更高)时，应理解为是稳定的。对于诸如G-CSF的蛋白质而言，其储存稳定性对于抑制G-CSF样抗原性物质的可能生成以及保证准确施用量是重要的。在储存期间，除非制剂中的G-CSF聚集或破裂形成抗原性物质，否则可将约10％的G-CSF活性损失理解为是施用所允许的。
用于本发明的稳定剂包含配制成赋予长效G-CSF缀合物以稳定性的缓冲溶液和甘露醇。
此外，本发明的稳定剂优选不合白蛋白。因为从人血中制备，所以可作为蛋白质稳定剂的人血清白蛋白有被人源致病性病毒污染的可能性。明胶或牛血清白蛋白可在一些患者中引起疾病或引起过敏反应。由于不含来自人或动物的血清白蛋白或异源蛋白质(如纯化明胶)，因此本发明的稳定剂没有病毒感染的问题。
稳定剂中的缓冲溶液在维持液体制剂pH恒定以防止pH波动中起作用，从而使长效G-CSF缀合物稳定。可用于本发明的缓冲溶液可包含可药用pH缓冲剂(包括碱性盐(磷酸钠或磷酸钾、其氢盐或二氢盐)、柠檬酸钠/柠檬酸、乙酸钠/乙酸、及其组合。适用于本发明的是柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、碳酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂和乙酸盐缓冲剂，优选磷酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂，更优选磷酸盐缓冲剂。在磷酸盐缓冲剂中，磷酸盐的浓度范围优选为5至100mM，更优选10至50mM。缓冲剂优选pH为4.0至8.0，更优选pH为5.0至7.0，最优选pH为5.0至6.0。
在一个实施方案中，根据所用缓冲剂的pH值来评估长效G-CSF缀合物的稳定性。在pH 5.5时，发现pH 5.5的柠檬酸盐缓冲剂确保了比pH6.0更高的长效G-CSF的稳定性(见表2和4)。从这些结果，可理解本发明的长效G-CSF缀合物根据缓冲剂的pH值而被不同程度地稳定，并且在某一pH表现出峰值稳定性。特别地，发现在液体制剂包含低pH的缓冲剂时，其中Fc(在中性pH下稳定)与G-CSF连接的长效G-CSF缀合物储存稳定性降低。融合了PEG的市售G-CSF药物Neulasta采用pH 4的乙酸缓冲剂作为稳定剂。但是，不推荐在长效G-CSF缀合物中采用常规的稳定剂组合物及pH，这不仅是因为本发明的长效G-CSF缀合物的分子量和体积二者均比野生型G-CSF的大，而且还因为免疫球蛋白Fc在中性pH范围内是稳定的。
甘露醇(一种糖醇)用在本发明的稳定剂中，因为它起到增强长效G-CSF缀合物的稳定性的作用。甘露醇优选以基于液体制剂总体积的1至20％(w/v)、更优选为3至10％(w/v)，最优选为5至7％(w/v)的浓度使用。
根据本发明的一个实施方案，当在柠檬酸盐缓冲剂的存在下将甘露醇用作稳定剂时，长效G-CSF缀合物的储存稳定性显示比使用山梨醇时大大增加(见表6)。这些数据显示了甘露醇作为长效G-CSF缀合物稳定剂相比于其他稳定剂的特异性，表明根据待稳定的目标需要不同的稳定剂。
所述稳定剂还包含其他糖醇，前提是它们不降低甘露醇与缓冲剂的组合对长效G-CSF缀合物的稳定作用。
在本发明的另一个实施方案中，可用于本发明的稳定剂除所述缓冲溶液和甘露醇外，可还包含至少一种选自等张剂(isotonic agent)、多元醇、糖、非离子型表面活性剂和中性氨基酸的成分。
所述等张剂的作用不仅是使得当液体制剂中的长效G-CSF缀合物进入体内时起维持合适渗透压，还进一步使液体制剂中的长效G-CSF缀合物稳定。等张剂的实例包括水溶性无机盐。其中有氯化钠、硫酸钠、柠檬酸钠、氯化钙及其组合。最优选氯化钠。
优选地，等张剂的浓度为约5至200mM。在该范围内，可根据所包含组分的种类和量来调整等张剂的浓度，以使得液体制剂是等张的。
还可以包含的增加长效G-CSF缀合物的储存稳定性的糖的优选实例包括单糖(如甘露糖、葡萄糖、果糖和木糖)和多糖(如乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖和葡聚糖)。在液体制剂中，糖的使用量优选为1至20％(w/v)且更优选的使用量为5至20％(w/v)。可用于本发明的多元醇的实例包括丙二醇、低分子量的聚乙二醇、甘油和低分子量聚丙二醇。它们可以单独或组合使用。并且它们在液体制剂中的浓度优选为约1至15％(w/v)，更优选约5至15％(w/v)。
对于非离子型表面活性剂而言，其降低蛋白质溶液的表面张力以防止蛋白质被吸附到或聚集于疏水表面上。基于聚山梨酯(polysorbate)的非离子型表面活性剂和基于泊洛沙姆(poloxamer)的非离子型表面活性剂适合用在本发明中。它们可以单独或组合使用。优选基于聚山梨酯的非离子型表面活性剂。其中有聚山梨酯20、聚山梨酯40和聚山梨酯80，更优选聚山梨酯80。
不建议使用高浓度的非离子型表面活性剂，因为如果非离子型表面活性剂以高浓度存在，则会干扰UV光谱法或等电聚焦法，使得难以准确评估蛋白质的浓度或稳定性。因此，本发明的液体制剂可包含优选浓度为0.1％(w/v)或更少且更优选0.001至0.05％(w/v)的非离子型表面活性剂。
就长效G-CSF缀合物的储存稳定性而言，比较了聚山梨酯20和聚山梨酯80。发现相比于聚山梨酯20，长效G-CSF缀合物在存在聚山梨酯80的情况下稳定性增加(见表8)。融合了PEG的G-CSF药物制剂Neulasta采用聚山梨酯20。但是，与包含聚山梨酯20时相比，本发明的液体制剂在包含聚山梨酯80时对长效G-CSF缀合物确保更高的储存稳定性。从这些数据应理解，根据待稳定的目标需要不同的表面活性剂。
在本发明的一个实施方案中，在40℃下储存4周的时间中，长效G-CSF缀合物在含有作为非离子型表面活性剂的0.005％(w/v)聚山梨酯80的液体制剂中比0.01％(w/v)聚山梨酯80保持更稳定(见表10)。
氨基酸也可作为液体制剂的稳定剂，其在溶液中起将更多水分子吸引到G-CSF周围的作用，使得G-CSF最外面的亲水氨基酸分子被进一步稳定(Wang，Int.J.Pharm.185：129-188，1999)。对此，带电氨基酸可引起与G-CSF的静电吸引而促进G-CSF聚集。因此，添加中性氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)作为稳定成分。在液体制剂中，中性氨基酸的使用浓度优选为0.1至10％(w/v)。
在本发明的一个实施方案中，包含浓度为基于液体制剂总体积的3至12％(w/v)的甘露醇的稳定剂使得具有大分子量Fc的长效G-CSF缀合物在即使不添加中性氨基酸的情况下也能稳定储存4周(见表12)。因此，即使在不添加中性氨基酸时也可以使用高浓度的甘露醇来制备用于向长效G-CSF缀合物提供高稳定性的液体制剂。但是，超过20％(w/v)的甘露醇浓度超出了等张上限。因此，甘露醇的使用浓度为液体制剂的1至20％(w/v)，优选浓度为3至10％(w/v)，更优选浓度为5至7％(w/v)。
除了包括缓冲剂、等张剂、糖醇、中性氨基酸和非离子型表面活性剂在内的上述组分外，本发明的液体制剂还可任选地包含本领域已知的其他组分，只要它们不降低本发明的作用。
根据本发明的一个优选实施方案，所述液体制剂不包含白蛋白并且可包含缓冲溶液、甘露醇、等张剂和非离子型表面活性剂。
更详细地，本发明提供了包含长效G-CSF缀合物和稳定剂的液体制剂，所述稳定剂包含磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂、甘露醇、等张剂和聚山梨酯80，所述等张剂选自氯化钠、硫酸钠、柠檬酸钠及其组合。
优选地，所述液体制剂包含浓度范围为5至100mM和pH为5至7的磷酸盐或柠檬酸盐缓冲溶液、浓度为1至20％(w/v)的甘露醇、浓度为5至200mM的等张剂以及浓度为0.001至0.05％(w/v)的聚山梨酯80，其中所述等张剂选自氯化钠、硫酸钠和柠檬酸钠。更优选地，所述液体制剂包含浓度范围为5至100mM和pH为5至6的柠檬酸盐缓冲溶液、浓度为1至10％(w/v)的甘露醇、浓度为100至200mM的氯化钠以及浓度为0.001至0.05％(w/v)的聚山梨酯80。最优选地，所述液体制剂包含浓度为20mM的柠檬酸盐缓冲剂(pH 5.2-5.8)、浓度为3至7％(w/v)的甘露醇、浓度为100至200mM的氯化钠以及浓度为0.001至0.05％(w/v)的聚山梨酯80，并且其中不使用中性氨基酸。
在本发明的一个实施方案中，比较了长效G-CSF缀合物液体制剂与已知的G-CSF制剂Neulasta(Amgen)的G-CSF储存稳定性，所述长效G-CSF缀合物液体制剂包含柠檬酸钠缓冲溶液(pH 5.5)、5％(w/v)甘露醇、150mM氯化钠和0.005％(w/v)聚山梨酯80。发现G-CSF在本发明的液体制剂中比在包含pH 4的柠檬酸钠的市售制剂中更稳定(见表14)。
在另一个实施方案中，测定了本发明的长效G-CSF缀合物液体制剂的长期储存稳定性，发现其使长效G-CSF缀合物稳定保存6个月并且即使在加速条件下储存6个月之后仍确保至少96.6％的活性(见表16)，其中所述长效G-CSF缀合物液体制剂包含pH 5.5的柠檬酸缓冲剂、甘露醇、氯化钠和聚山梨酯80。
从数据中应理解，包含pH范围为5至6的缓冲剂和浓度为1至20％(w/v)的甘露醇的液体制剂可以在其中稳定储存长效G-CSF缀合物12个月或更久。
发明的有利效果
如前所述，本发明的包含缓冲剂和甘露醇的稳定剂是专门用于长效G-CSF缀合物的。由于不含人血清白蛋白和其他对身体有害的潜在因子，因此本发明的长效G-CSF缀合物液体制剂不存在病毒感染的问题并且确保长效G-CSF缀合物的优异的储存稳定性，所述G-CSF和免疫球蛋白Fc片段连接并且比天然形式的G-CSF有更大的分子量和更长的作用持续时间。
附图说明
图1是表明当在40℃下储存两周的时间中每周使用SE-HPLC进行分析时，G-CSF在长效G-CSF缀合物液体制剂中和在PEG融合物G-CSF制剂Neulasta中的稳定性的图，其中在所述长效G-CSF缀合物液体制剂中使用不同pH值的缓冲剂。
发明实施方式
通过以下实施例可更好地理解本发明，列出所述实施例以举例说明本发明，但不应理解为限制本发明。
实施例1：构建长效G-CSF缀合物
<1-1>使用免疫球蛋白制备免疫球蛋白Fc片段
可用于本发明的免疫球蛋白Fc片段是人非糖基化的IgG4Fc片段，其可如韩国专利No.725314中描述的由大肠杆菌转化体表达。
<1-2>制备重组人粒细胞集落刺激因子
本实施例中使用的重组人G-CSF是突变株(17Ser-G-CSF)，其中17位是丝氨酸，而不是野生型的半胱氨酸，并且能够如韩国专利No.356140中描述的由大肠杆菌转化体表达。
<1-3>使用免疫球蛋白Fc片段制备长效G-CSF缀合物
本实施例中的长效G-CSF缀合物是人粒细胞集落刺激因子与免疫球蛋白Fc片段通过非肽聚合物共价连接的构建体。并且其如韩国专利No.725315和775343中所描述而得到。
实施例2：测定取决于缓冲剂pH的长效G-CSF缀合物稳定性
为了配制用于稳定实施例1中制备的G-CSF缀合物的液体制剂，进行了改变缓冲剂pH值对所述长效G-CSF缀合物稳定性影响的实验。
对于该测定，用稳定剂组合物制备了表1的长效G-CSF缀合物液体制剂，所述稳定剂组合物包含作为稳定剂的甘露醇，作为表面活性剂的聚山梨酯80，以及作为缓冲剂的pH为5.0、5.5或6.0的柠檬酸钠溶液。将其在40℃下储存两周后，用尺寸排阻色谱法进行了分析。结果归纳在下表2中。长效G-CSF缀合物相比于其初始值的保留率表示为SE-HPLC(％)。
表1
[表1]
[表格]
Figure BDA00001902669600121
表2
[表2]
[表格]
Figure BDA00001902669600122
从表2的数据中明显地看出，pH 5.0的柠檬酸钠缓冲剂在第一周引起蛋白质沉淀而在使用pH 5.5或6.0的柠檬酸钠缓冲剂时则未检测到沉淀。还可理解的是，长效G-CSF的稳定性在pH为5.5时比pH为6.0时的柠檬酸缓冲剂中进一步增加。
用具有细分pH值的缓冲剂进行了以下实验。用列于下表3中的稳定剂组合物制备了长效G-CSF缀合物液体制剂，并在40℃下储存两周，然后用反相色谱法和尺寸排阻色谱法(SE-HPLC)进行分析。结果归纳在下表4中。长效G-CSF缀合物相比于其初始值的保留率表示为SE-HPLC(％)。
表3
[表3]
[表格]
表4
[表4]
[表格]
Figure BDA00001902669600132
在pH为5.2至5.5的柠檬酸钠缓冲剂中储存两周后，如表4所示，发现长效G-CSF缀合物保留了约90％或更高的初始活性。
从结果可理解，本发明的长效G-CSF缀合物根据所用缓冲剂的pH值被不同程度地稳定，在一定pH范围内有峰值稳定性。特别地，发现Fc(在中性pH下稳定)与G-CSF连接的长效G-CSF缀合物的储存稳定性在含有低pH缓冲剂的液体制剂中降低。
实施例3：测定取决于糖醇的长效G-CSF缀合物稳定性
如下测定了糖醇(如山梨醇和甘露醇)稳定长效G-CSF缀合物的能力：
用稳定剂组合物制备了长效G-CSF缀合物液体制剂，并在40℃下储存4周后用尺寸排阻色谱法(SE-HPLC)分析，其中所述稳定剂组合物包含作为糖醇的甘露醇或山梨醇、作为等张剂的氯化钠以及作为表面活性剂的聚山梨酯，如下表5所列出的。结果归纳在下表6中。长效G-CSF缀合物相比于其初始值的保留率(面积％/初始面积％)表示为SE-HPLC(％)。
表5
[表5]
[表格]
Figure BDA00001902669600141
表6
[表6]
[表格]
Figure BDA00001902669600142
从表6数据可明显地看出，用甘露醇替代山梨醇作为稳定剂使长效G-CSF缀合物保持更稳定。
实施例4：测定取决于非离子型表面活性剂种类的长效G-CSF缀合物稳定性
在存在柠檬酸钠缓冲剂的情况下，如下测定多种不同非离子型表面活性剂稳定长效G-CSF缀合物的能力：
对于该测定，比较了两种非离子型表面活性剂即聚山梨酯80和聚山梨酯20，后者包含在Neulasta(一种市售的PEG融合G-CSF的液体制剂)中。在合适的组合使用了在实施例2和3中表现出向长效G-CSF缀合物提供稳定性的其它试剂，包括pH 5.5的柠檬酸钠缓冲剂和甘露醇。用包含不同种类聚山梨酯(如下表7中所列)的稳定剂组合物制备了长效G-CSF缀合物液体制剂，并在40℃下储存4周后用尺寸排阻色谱法(SE-HPLC)分析。结果归纳在下表8中。长效G-CSF缀合物相比于其初始值的保留率表示为SE-HPLC(％)。
表7
[表7]
[表格]
Figure BDA00001902669600151
表8
[表8]
[表格]
Figure BDA00001902669600152
在相同条件下，如表8所示，与聚山梨酯20相比，聚山梨酯80确保了长效G-CSF缀合物的更高的储存稳定性。直至在40℃下储存两周末，还没有检测出两种聚山梨酯之间在长效G-CSF储存稳定性上的显著差异。但是，在第四周，所述非离子型表面活性剂表现出储存稳定性的显著差异，尽管它们在结构上非常相似。
实施例5：测定与非离子型表面活性剂浓度相关的长效G-CSF缀合物稳定性
在实施例4中，聚山梨酯80被评估为比聚山梨酯20在稳定长效G-CSF方面更有效。在本实施例中，对聚山梨酯80的浓度对长效G-CSF缀合物稳定性的影响进行了实验。为此目的，用下表9所列的稳定剂组合物制备了长效G-CSF缀合物液体制剂，并在40℃下储存4周后用尺寸排阻色谱法分析。结果归纳在下表10中。长效G-CSF缀合物相比于其初始值的保留率表示为SE-HPLC(％)。
表9
[表9]
[表格]
Figure BDA00001902669600161
表10
[表10]
[表格]
Figure BDA00001902669600162
在40℃下储存4周的时间中，如表10所示，发现长效G-CSF缀合物在包含0.005％聚山梨酯80的液体制剂中比在含有0.01％聚山梨酯80的液体制剂中更稳定。
实施例6：测定与氨基酸相关的长效G-CSF缀合物稳定性
测定了使用氨基酸作为稳定剂稳定长效G-CSF缀合物的能力。用包含柠檬酸钠缓冲剂(pH 6.0)、甘露醇和中性氨基酸甘氨酸的稳定剂进行了评估长效G-CSF储存稳定性的实验。
用下表11中所列的稳定剂组合物制备了长效G-CSF缀合物液体制剂，并将其在40℃下储存4周后用尺寸排阻色谱法分析。结果归纳在下表12中。长效G-CSF缀合物相比于其初始值的保留率(面积％/初始面积％)表示为SE-HPLC(％)。
表11
[表11]
[表格]
Figure BDA00001902669600171
表12
[表12]
[表格]
Figure BDA00001902669600172
Figure BDA00001902669600181
即使在不存在中性氨基酸甘氨酸的情况下，如表12所示，包含高浓度(5％(w/v))甘露醇的液体制剂也确保了与使用中性氨基酸时得到的液体制剂水平相似的长效G-CSF缀合物的储存稳定性。
实施例7：比较液体制剂之间的长效G-CSF缀合物的储存稳定性
在储存稳定性方面，将用稳定剂组合物制备的液体制剂与市售G-CSF液体制剂Neulasta(Amgen)进行了比较，其中所述稳定剂组合物包含柠檬酸缓冲剂(pH 5.5)、氯化钠、甘露醇和聚山梨酯80(其已在实施例2至6中证明了都具有稳定化能力)。本发明的液体制剂和Neulasta的组成如下表13所示。当在40℃下储存两周时，每周用反相色谱法和尺寸排阻色谱法分析长效G-CSF缀合物液体制剂。结果归纳在下表14中。长效G-CSF缀合物相比于其初始值的保留率表示为RP-HPLC(％)和SE-HPLC(％)。
表13
[表13]
[表格]
Figure BDA00001902669600182
表14
[表14]
[表格]
Figure BDA00001902669600191
在长期储存之后，从表14中的数据可明显地看出，本发明的长效G-CSF缀合物液体制剂确保了与Neulasta所提供的相当或更高的储存稳定性。从这些结果，应理解本发明的液体制剂能够专门确保长效G-CSF的优异的储存稳定性。
实施例8：测定长效G-CSF缀合物液体制剂的长期储存稳定性和加速稳定性
为了检测其长期储存稳定性和加速稳定性，将长效G-CSF缀合物液体制剂在4℃下储存12个月并随后在25℃下储存6个月，其间分析样品的储存稳定性，其中所述长效G-CSF缀合物液体制剂由包含柠檬酸缓冲剂(pH 5.5)、氯化钠、甘露醇和聚山梨酯80的稳定剂组合物制得，并在实施例2至6中证明了能确保最大储存稳定性。结果归纳在下表15和16中。在表15和16中，长效G-CSF缀合物相对于其初始值的保留率表示为RP-HPLC(％)、SE-HPLC(％)、蛋白质含量(％)和生物惰性活性(biological inert activity)(％)。
表15
[表15]
[表格]
Figure BDA00001902669600192
Figure BDA00001902669600201
表16
[表16]
[表格]
Figure BDA00001902669600202
从表15和16中的数据可明显地看出，长效G-CSF缀合物在包含本发明稳定剂组合物的液体制剂中在6个月中保持高度稳定并且发现甚至在液体制剂中在加速条件下储存6个月后仍具有92.5％的初始活性。因此，本发明的长效G-CSF缀合物液体制剂表现出有效的储存稳定性。
尽管为举例说明的目的已公开了本发明的优选实施方案，但本领域技术人员会理解，在不脱离如所附权利要求中描述的本发明的范围和精神的情况下，可进行多种修改、添加和替换。
工业适用性
由于不含人血清白蛋白，因此本发明用于专门确保长效G-CSF缀合物之储存稳定性的液体制剂不具有病毒感染的问题。其组成简单，因此比其他稳定剂或冻干制剂更具经济优势。此外，因为其包含具有比其他天然形式更长的作用持续时间并且长时间保持高蛋白质活性的长效G-CSF缀合物，所以所述液体制剂可以用作有效的药物系统。

Claims (28)

1.一种长效粒细胞集落刺激因子(G-CSF)缀合物的液体制剂，其包含治疗有效量的长效粒细胞集落刺激因子缀合物和不合白蛋白的稳定剂，其中所述缀合物中G-CSF、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段共价连接，并且所述稳定剂包含缓冲剂和甘露醇。
2.根据权利要求1的液体制剂，其中甘露醇的浓度范围为基于所述液体制剂总体积的1至20％(w/v)。
3.根据权利要求1的液体制剂，其中所述缓冲剂选自柠檬酸盐、磷酸盐、酒石酸盐、碳酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐和乙酸盐缓冲剂。
4.根据权利要求1的液体制剂，其中所述缓冲剂的浓度范围为5至100mM。
5.根据权利要求1的液体制剂，其中所述缓冲剂的pH范围为4至8。
6.根据权利要求1的液体制剂，其中所述不含白蛋白的稳定剂还包含选自等张剂、多元醇、糖、非离子型表面活性剂、中性氨基酸及其组合的成分。
7.根据权利要求6的液体制剂，其中所述等张剂是盐，其选自氯化钠、硫酸钠、柠檬酸钠及其组合。
8.根据权利要求6的液体制剂，其中所述等张剂的浓度范围为5至200mM。
9.根据权利要求6的液体制剂，其中所述非离子型表面活性剂是基于聚山梨酯或基于泊洛沙姆的非离子型表面活性剂。
10.根据权利要求9的液体制剂，其中所述基于聚山梨酯的非离子型表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60和聚山梨酯80。
11.根据权利要求6的液体制剂，其中所述非离子型表面活性剂的浓度范围为基于所述液体制剂总体积的0.001至0.05％(w/v)。
12.根据权利要求6的液体制剂，其中所述糖选自甘露糖、葡萄糖、岩藻糖、木糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、葡聚糖及其组合。
13.根据权利要求6的液体制剂，其中所述糖的浓度范围为基于所述液体制剂总体积的1至20％(w/v)。
14.根据权利要求6的液体制剂，其中所述多元醇选自丙二醇、低分子量的聚乙二醇、甘油、低分子量的聚丙烯及其组合。
15.根据权利要求6的液体制剂，其中所述多元醇在所述液体制剂中的浓度范围为1至15％(w/v)。
16.根据权利要求6的液体制剂，其中所述中性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及其组合。
17.根据权利要求6的液体制剂，其中所述中性氨基酸在所述液体制剂中的浓度范围为0.1至10％(w/v)。
18.根据权利要求1的液体制剂，其中所述不含白蛋白的稳定剂包含pH范围为5至8且浓度范围为5至100的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为1至20％(w/v)的甘露醇、浓度为5至200mM的氯化钠和浓度为0.001至0.05％(w/v)的聚山梨酯80。
19.根据权利要求1的液体制剂，其中所述G-CSF是由野生型G-CSF通过替换、缺失或插入一个或更多个氨基酸而修饰的突变体G-CSF蛋白质，或者是与所述野生型G-CSF具有相似活性的肽类似物。
20.根据权利要求19所述的液体制剂，其中所述G-CSF衍生物是突变体(17Ser-G-CSF)，其中17位为丝氨酸残基，而不是野生型G-CSF的半胱氨酸残基。
21.根据权利要求1的液体制剂，其中所述长效G-CSF缀合物的浓度范围为7至22μg/ml。
22.根据权利要求1的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc片段选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合。
23.根据权利要求22的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc片段是由选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的不同来源的结构域构成的杂合片段。
24.根据权利要求22的液体制剂，所述免疫球蛋白Fc片段是单链免疫球蛋白的二聚体或多聚体形式，所述单链免疫球蛋白由相同来源的结构域构成。
25.根据权利要求22的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc片段是IgG4Fc片段。
26.根据权利要求25的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc片段是人的非糖基化IgG4Fc片段。
27.根据权利要求1的液体制剂，其中所述非肽聚合物选自可生物降解聚合物、脂质聚合物、甲壳素、透明质酸及其组合。
28.根据权利要求27的液体制剂，其中所述可生物降解聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、PLA(聚乳酸)和PLGA(聚乳酸-乙醇酸)。
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