JP4578098B2 - 多重鎖真核ディスプレイベクターとその使用 - Google Patents
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関連出願
本出願は、２００１年１０月１日提出の米国仮特許出願第６０／３２６，３２０号の利益を主張する。
上記出願の全教示は明細書に援用される。
本出願は、２００１年１０月１日提出の米国仮特許出願第６０／３２６，３２０号の利益を主張する。
上記出願の全教示は明細書に援用される。
発明の背景
非天然（異種）ポリペプチド若しくはタンパク質をバクテリオファージの表面に発現させて固着させる（表示する）、ファージディスプレイ技術の開発は、目的の生物活性を保有する分子、例えば、ある一定の標的分子へ高い特異性及び／又はアフィニティーで結合するペプチドリガンドを同定するための強力なツールとなる。合成オリゴヌクレオチドのライブラリーは、ファージ表面タンパク質をコードする遺伝子、例えばファージＭ１３のＩＩＩ遺伝子又はＶＩＩＩ遺伝子のコード配列へインフレームでクローニングすることができる。これらのクローンは、発現されるとき、使用されるオリゴヌクレオチドの配列における多様性により、複数のペプチド−キャプシド融合タンパク質としてファージ表面に「表示」される。次いで、これらのペプチドディスプレイライブラリーについて、通常はアフィニティー選択又は「バイオパニング（biopanning）」により、標的分子への結合をスクリーニングする（Ladner, R. et al., 1993; Kay et al., 1996; Hoogenboom, H. et al., 1997）。
非天然（異種）ポリペプチド若しくはタンパク質をバクテリオファージの表面に発現させて固着させる（表示する）、ファージディスプレイ技術の開発は、目的の生物活性を保有する分子、例えば、ある一定の標的分子へ高い特異性及び／又はアフィニティーで結合するペプチドリガンドを同定するための強力なツールとなる。合成オリゴヌクレオチドのライブラリーは、ファージ表面タンパク質をコードする遺伝子、例えばファージＭ１３のＩＩＩ遺伝子又はＶＩＩＩ遺伝子のコード配列へインフレームでクローニングすることができる。これらのクローンは、発現されるとき、使用されるオリゴヌクレオチドの配列における多様性により、複数のペプチド−キャプシド融合タンパク質としてファージ表面に「表示」される。次いで、これらのペプチドディスプレイライブラリーについて、通常はアフィニティー選択又は「バイオパニング（biopanning）」により、標的分子への結合をスクリーニングする（Ladner, R. et al., 1993; Kay et al., 1996; Hoogenboom, H. et al., 1997）。
ファージディスプレイライブラリースクリーニングは、膨大な数の異なるポリペプチド（典型的には、１×１０９を超える）が単一のファージディスプレイライブラリーに含有され得るために、他のスクリーニング方法よりもきわめて有利である。これは、単一のスクリーニング工程においてきわめて多様なライブラリーのスクリーニングを可能にする。小さなペプチド又は単鎖タンパク質のファージ上でのディスプレイが有利であるのは、（ファージや原核宿主がなし得ない）細胞内プロセシング又は翻訳後修飾が必要でないか又は所望されない限りにおいてである。例えば、異種ポリペプチドの有効なディスプレイには、様々な翻訳後修飾、細胞内構造、及びそのディスプレイポリペプチドを輸送し、グリコシル化し、整形し（conform）、組立て、そして宿主細胞の表面に適切に固着させるために必要である特殊酵素とシャペロンタンパク質の一揃い（complement）が必要とされ得るが、バクテリオファージや原核細胞のプロセスではこれらの方法はいずれも達成することができない。
より複雑な真核タンパク質、例えば免疫グロブリンとその機能的断片（例えばＦａｂ）、又はＭＨＣ分子若しくはＴ細胞受容体分子の細胞外ドメインを含む多重鎖ポリペプチドのディスプレイでは、克服すべき追加の問題が存在する：多重鎖産物を産生するのに十分な発現のレベルで成分鎖を同調的に発現すること、機能的多重鎖ポリペプチドへの会合を達成したまま各鎖を輸送及び分泌すること、及び、多重鎖ポリペプチドの少なくとも１本の鎖を宿主細胞表面に（即ち、ディスプレイのために）固定化する（固着させる）と同時に、多重鎖ポリペプチド産物の宿主細胞の外側で適切なアセンブリー及び機能性を保持することである。
単鎖ポリペプチドを発現して表示するための、酵母のような真核細胞を利用するディスプレイ系が報告されてきた（Boder, E. and Wittrup, K., 1998；Horwitz, A. et al., 1988；Kieke, M. et al., 1997；Kieke, M. et al., 1999；ＷＯ９４／１８３３０；ＷＯ９９／３６５６９）。しかしながら、多重鎖ポリペプチド、特に免疫グロブリンとその断片の発現と機能的なディスプレイのための改善された真核系へのニーズが存在する。さらに、ポリペプチドディスプレイの技術分野には、ファージディスプレイの能力と真核宿主細胞のプロセシング利点を利用する系においてニーズが存在する。例えば、ファージディスプレイライブラリーとは対照的に、真核宿主細胞の表面に発現されて表示され得るライブラリーの現実のサイズ、又は「多様性」は、最大でも約１０６〜１０７なのである。
上記や他の技術課題は、目的の生物活性を保有する新規分子を同定するのに有用な生物学的ツール及び技術の進歩を妨げてきた。これらの技術課題のために、多重鎖真核ディスプレイベクターの成功した構築のための材料又は方法、多重鎖ポリペプチド（抗体又はＦａｂ断片のような）の真核宿主細胞（酵母のような）の表面での成功したディスプレイ、多重鎖ポリペプチドディスプレイライブラリーの真核宿主細胞における創出、あるいは、目的の特定の多重鎖ポリペプチドを検出して単離する（例えば標的分子への結合特異性若しくはアフィニティーに基づいて）ためのこうしたライブラリーの成功した使用について、今日まで１つも報告されていない。
発明の概要
当該技術分野における上記及び他の課題（deficiencies）は、改善されたディスプレイベクター、ディスプレイライブラリーを含有する細胞、並びにこうしたライブラリー及びベクターの使用方法を提供する、本明細書に記載の本発明により克服される。特に、本発明は、多重鎖ポリペプチドの生物活性が宿主細胞の表面で現れるように、多重鎖ポリペプチドを宿主細胞の表面に表示することが可能な真核発現ベクターを提供する。こうしたベクターは、従来のファージディスプレイ技術により入手可能なものより複雑な、生物学的に活性なポリペプチド、例えば生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドのディスプレイを可能にする。
当該技術分野における上記及び他の課題（deficiencies）は、改善されたディスプレイベクター、ディスプレイライブラリーを含有する細胞、並びにこうしたライブラリー及びベクターの使用方法を提供する、本明細書に記載の本発明により克服される。特に、本発明は、多重鎖ポリペプチドの生物活性が宿主細胞の表面で現れるように、多重鎖ポリペプチドを宿主細胞の表面に表示することが可能な真核発現ベクターを提供する。こうしたベクターは、従来のファージディスプレイ技術により入手可能なものより複雑な、生物学的に活性なポリペプチド、例えば生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドのディスプレイを可能にする。
本発明は、生物学的に活性なポリペプチドのディスプレイ及び単離に関する。特に、本発明は、新規の多重鎖ディスプレイベクターの設計及び使用へ向けられる。
本発明は、多重鎖ポリペプチドの真核宿主細胞の表面での成功したディスプレイについて記載し、それを可能にする。多重鎖ポリペプチド鎖を宿主細胞において別個に、そして独立して発現する（例えば、別個のベクター制御配列の下で、及び／又は別個の発現ベクターにより、適合ベクターセットを生じる）のに好ましいベクターについて記載する。こうした適合ベクターセットの使用は、ディスプレイライブラリーの産生において、あるレベルの融通性及び汎用性、例えば多重鎖ポリペプチドの多様な個別の鎖を発現するベクターを組み合わせて組み換えることによって多重鎖ポリペプチドを産生して表示する能力を提供する。こうしたベクターセットを使用して、新規な鎖の組合せの全体レパートリーを設計することができる。
本発明は、多重鎖ポリペプチドの真核宿主細胞の表面での成功したディスプレイについて記載し、それを可能にする。多重鎖ポリペプチド鎖を宿主細胞において別個に、そして独立して発現する（例えば、別個のベクター制御配列の下で、及び／又は別個の発現ベクターにより、適合ベクターセットを生じる）のに好ましいベクターについて記載する。こうした適合ベクターセットの使用は、ディスプレイライブラリーの産生において、あるレベルの融通性及び汎用性、例えば多重鎖ポリペプチドの多様な個別の鎖を発現するベクターを組み合わせて組み換えることによって多重鎖ポリペプチドを産生して表示する能力を提供する。こうしたベクターセットを使用して、新規な鎖の組合せの全体レパートリーを設計することができる。
さらに本発明は、ファージディスプレイ技術の能力（その操作容易性と多様性の大きさがある）を、多重鎖真核ディスプレイベクター（又はベクターセット）の潜在的な複雑性及び汎用性と組み合わせる能力を提供する。本明細書に記載される特別な方法は、実施者が、ファージディスプレイ系と真核ディスプレイ系との間でペプチドライブラリー（又はライブラリーの選択されたメンバー）の配列情報を効率的に移行させることを可能にし、これは一方のディスプレイベクターから他方への配列情報の物理的な移行による（慣用の遺伝子工学技術を使用する）か、又は真核ディスプレイ系とファージディスプレイ系の両方において作動可能である新規な二元ディスプレイベクターの使用（必然的に原核性の発現を伴う）により達成される。
本発明は、真核宿主細胞において、多重鎖ポリペプチドの生物活性、例えば多重鎖ポリペプチドの結合活性が宿主細胞の表面で現れるように、多重鎖ポリペプチドを宿主細胞の表面に表示するのに有用な新規ベクターへ向けられる。本発明のベクターの１つの好ましい態様は、単一の複製可能な遺伝子パッケージのそれであるが、多重鎖真核ディスプレイベクターは、単一ベクターとして、又はベクターセット中の多数の独立したベクターとして存在してよい。本明細書に使用される「ベクター」は、単一のベクター分子、又はベクターセットのいずれかを意味する。１つの態様において、ディスプレイベクターは、シャトルベクターであるか、又はより正確には二元ディスプレイベクターであり、ここでこのベクターは、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドを、そのベクターで形質転換された真核宿主細胞の表面に、又は原核性の発現の結果として産生されるバクテリオファージの表面に表示することができる。本発明の別の態様において、ベクターは、ベクターセットして存在してよく、ここで多重鎖ポリペプチドの各鎖はベクターの適合対の１つでコードされるので、このベクター対が単一の真核細胞中に存在する場合、多重鎖ポリペプチド鎖が会合し、多重鎖ポリペプチドの生物活性が真核細胞の表面で現れる。
本発明の真核多重鎖ディスプレイベクターは、多重鎖ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。第一のポリヌクレオチドは、アンカータンパク質へ連結する多重鎖ポリペプチドの第一鎖をコードする。このベクター（又はベクターセット）の他のポリヌクレオチドは、多重鎖ポリペプチドの他の鎖をコードする。ディスプレイベクターのポリヌクレオチドはすべてディスプレイベクターにおいて作動可能に位置しているので、そのベクター（又はベクターセット）で形質転換された宿主真核細胞は、多重鎖ポリペプチドの生物活性がその細胞の表面で現れるように、多重鎖ポリペプチドを宿主細胞の表面に表示する。
好ましくは、本発明の多重鎖ディスプレイベクターによりコードされる多重鎖ポリペプチドは、二本、三本、四本、又は多重鎖のポリペプチドのいずれかとして存在する。より好ましくは、多重鎖ポリペプチドは、２本の異なる鎖からなる二本鎖若しくは四本鎖ポリペプチドである。より好ましくは、多重鎖ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、及び免疫グロブリンＦａｂ断片からなる多重鎖ポリペプチドの群より選択される。より好ましくは、多重鎖ポリペプチドは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はそれらの生物学的に活性な断片である。最も好ましくは、多重鎖ポリペプチドはＦａｂ断片であり、ここで多重鎖ディスプレイベクターの第一のポリヌクレオチドは、Ｉｇ重鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインをコードするセグメントを含み、第二のポリヌクレオチドは、Ｉｇ軽鎖（ＶＬドメイン及びＣＬドメイン）をコードするセグメントを含む。
本発明によれば、多重鎖ポリペプチドの第一鎖をコードする第一のポリヌクレオチドをアンカータンパク質へ連結する。好ましくは、アンカータンパク質は、真核細胞の細胞表面タンパク質、又はその機能的断片である。より好ましくは、アンカータンパク質は、α−アグルチニン、ａ−アグルチニン、Ａｇａ１ｐ、Ａｇａ２ｐ、又はＦＬＯ１である。本明細書に開示されるように、第一鎖ポリペプチドのアンカータンパク質への連結は、多様な分子生物学技術によって達成することができる。好ましくは、多重鎖ポリペプチドの第一鎖をコードする第一のポリヌクレオチドは、真核宿主細胞において、第一鎖−アンカー融合タンパク質として、最も好ましくは、第一鎖：Ａｇａ２ｐ融合タンパク質として発現される。
１つの態様において、宿主細胞においてベクターにより発現される多重鎖ポリペプチドの１以上の鎖は、レポーター遺伝子又はタグへ連結される。好ましくは、タグは、６×Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、及びｍｙｃタグから成る群より選択されるエピトープタグである。最も好ましくは、多重鎖ポリペプチドの各鎖は、異なるタグへ連結される。
好ましくは、本発明の多重鎖ディスプレイベクターは、多重鎖ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列の移行を促進するクローニング部位を提供する。そうしたクローニング部位は、多重鎖ポリペプチドの１以上の鎖をコードするポリヌクレオチドの切断及び挿入を促進するように位置する制限エンドヌクレアーゼ認識部位（即ち、制限部位）を含む。例えば、制限部位は、好ましくは、多重鎖ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドの５’端及び３’端に位置する。本発明のベクターは、多重鎖ポリペプチド鎖をコードするすべてのセグメントを含むポリヌクレオチドセグメントの末端にわずか２つの制限部位を含有することができ、又は、好ましくは、制限部位は、多重鎖ポリペプチドの１本の鎖をコードするそれぞれのポリヌクレオチドセグメントの末端に存在する（図１及び２）。それぞれの制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、ベクターにおけるユニーク認識部位であることが好ましい。
本発明のベクター（又はベクターセット）は、様々な真核宿主細胞において作動可能であることができ、場合により、原核細胞（例えば細菌）において作動可能であることができる。好ましくは、本発明の多重鎖ディスプレイベクターは、動物細胞ディスプレイベクター、植物細胞ディスプレイベクター、真菌細胞ディスプレイベクター、又は原生生物細胞ディスプレイベクターである。より好ましくは、ディスプレイベクターは、酵母ディスプレイベクターである。最も好ましくは、酵母ディスプレイベクターは、サッカロミセス・セレビシエにおいて作動可能である。
別の態様において、本発明は、多重鎖ポリペプチドを真核宿主細胞の表面に表示するために本明細書に記載し教示するベクター（又はベクターセット）を使用する方法へ向けられる。ここで該ベクター（又はベクターセット）は真核細胞へ導入され、宿主細胞は、多重鎖ポリペプチドの生物活性が宿主細胞の表面で現れるように、多重鎖ポリペプチド鎖の発現、輸送、及び会合に適した条件下で培養される。本明細書に記載されるように、多重鎖ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドは、１以上のベクターにより宿主細胞へ導入することができる。ベクターを宿主細胞へ導入する方式には、当該技術分野で公知の、遺伝材料を細胞へ導入するあらゆる方法が含まれる。好ましい方式には、当該技術分野で公知の形質転換技術が含まれ、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルス移行、弾丸挿入、等が含まれる。
真核多重鎖ディスプレイベクターを宿主細胞へ導入する別の好ましい方式には、それぞれが多重鎖ポリペプチド鎖のうちの少なくとも１つを発現する２つの一倍体真核細胞を融合し、両方の（すべての）鎖を発現する二倍体宿主細胞を産生することが含まれる。多重鎖ポリペプチドの生物活性は、この得られる二倍体宿主細胞の表面で現れる。例えば、２つの一倍体細胞のそれぞれがベクターセットのベクター（本明細書に記載のような）の１つ（又はそれ以上）を含有し得るので、多重鎖ポリペプチドの生物活性は、一倍体／一倍体融合より生じる二倍体宿主細胞の表面で現れる。好ましくは、一倍体宿主細胞対は反対の接合型のものであり、それによりこの２つの真核一倍体細胞の融合（接合）が促進される。
本発明の別の目的は、多重鎖ポリペプチドの生物活性を細胞の表面に現す真核宿主細胞へ向けられる。本明細書に記載されるように、真核宿主細胞は、好ましくは、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、又は原生生物細胞である。より好ましくは、真核宿主細胞は、酵母細胞である。好ましくは、酵母宿主細胞は、サッカロミセス属、ピキア属、ハンゼヌラ属、シゾサッカロミセス属、クライベロミセス（Kluyveromyces）属、ヤローウィア（Yarrowia）属、及びカンジダ属より選択される。最も好ましくは、真核宿主細胞は、Ｓ．セレビシエである。本発明の真核宿主細胞は、どんな遺伝子構築体のものでもよいが、好ましくは、一倍体又は二倍体である。
本発明の１つの態様は、真核一倍体細胞対（好ましくは、反対の接合型の）へ向けられる。ここで第一の一倍体細胞は、アンカータンパク質へ連結する生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドの第一鎖をコードする少なくとも第一のポリヌクレオチドを発現し、第二の一倍体細胞は、多重鎖ポリペプチドの第二鎖をコードする少なくとも第二のポリヌクレオチドを発現する。上記に論じたように、この一倍体細胞対の融合が、多重鎖ポリペプチドの生物活性を該細胞の表面に現す二倍体細胞をもたらす。
さらに本発明は、本明細書に記載の様々な態様の集合へ向けられる。これは、多重鎖ポリペプチド又はそれらをコードするポリヌクレオチドの新規ライブラリーを形成する。本発明のライブラリーは、多重鎖ポリペプチドをコードする複数のベクターを含み、該ベクターは、真核宿主細胞において、多重鎖ポリペプチド鎖の発現及び分泌、多重鎖ポリペプチドの生物活性が構成されるような鎖の会合、及び多重鎖ポリペプチドの生物活性が真核宿主細胞の表面で現れるような多重鎖ポリペプチドの少なくとも１本の鎖の固着を指令するように作動可能である。好ましくは、本発明のライブラリーは、多数の異なる多重鎖ポリペプチドをコードするライブラリーメンバーからなる。最も好ましくは、ライブラリーは、多数の変異体多重鎖ポリペプチド（多重鎖ポリペプチド鋳型の変形化により設計されて産生される）をコードするライブラリーメンバーからなる。本発明の新規な多重鎖ライブラリー集合には、本明細書に記載され教示される、ベクターライブラリー、ベクターセットライブラリー、宿主細胞ライブラリー、及び宿主細胞対ライブラリーが含まれる。
本発明の関連した態様は、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドをコードする核酸配列情報をファージディスプレイベクターと真核ディスプレイベクターとの間で移行させる方法へ向けられる。１つの移行方法は、ファージディスプレイベクターより得られる多重鎖ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を、本明細書に記載され教示される真核多重鎖ディスプレイベクターへ挿入することを含む。多重鎖ポリペプチド鎖をコードする核酸配列情報の移行は、単一の移行事象として起きても、また、多重鎖ポリペプチド鎖のそれぞれをコードする核酸配列情報の別個の独立した移行事象として起きてもよい。同様に、多重鎖ポリペプチド鎖のそれぞれをコードする配列情報は、１つのディスプレイベクターからか、又は多数の異なるディスプレイベクターから移行させてよい。
生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドをコードする核酸配列情報をファージディスプレイベクターと真核ディスプレイベクターとの間で（及び、この記載とは逆に）移行させる別の方法は、本明細書に記載され教示される真核多重鎖ディスプレイベクターより得られる多重鎖ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列をファージディスプレイベクターへ挿入することを含む。本発明のファージディスプレイ−真核ディスプレイ移行方法は二方向性である。即ち、ファージディスプレイベクターから真核ディスプレイベクターへ、又は真核ディスプレイベクターからファージディスプレイベクターへ起こり得る。
本発明のファージディスプレイベクターと真核ベクターとの間の核酸配列情報の移行は、当該技術分野で公知の多様な遺伝子移行法（例えば組換えＤＮＡ技術のような遺伝子工学技術）により達成することができる。好ましい移行の方式には、制限消化、ＰＣＲ増幅、又は相同組換えの技術が含まれる（例えば、Liu, Q. et al., 2000; Walhout, A. et al., 2000 を参照のこと）。
本発明はまた、実施者にとって目的の生物活性を現す多重鎖ポリペプチドを検出し単離する方法へ向けられる。本発明の方法は、多重鎖ポリペプチドと別の分子種との間の望ましい相互作用、好ましくはタンパク質−タンパク質相互作用、より好ましくは多重鎖ポリペプチドとそのリガンド／基質（即ち、標的分子）との相互作用の検出を可能にする。好ましくは、この相互作用の性質は、分子種間の非共有結合的会合（即ち、結合）を含むが、この結合の性質は、一過性（例えば酵素−基質結合）であっても、高アフィニティー／アビディティー（例えば、分離法、診断薬、及び／又は治療薬に有用なアフィニティーリガンドに対するような）のものであってもよい。
１つの態様において、本発明の方法は、（真核宿主細胞の表面に表示される）多重鎖ポリペプチドのライブラリーを、実施者にとって目的の生物活性を現すライブラリーのメンバーを検出することによってスクリーニングするのに有用である。特に好ましい態様において、目的の生物活性を現す多重鎖ポリペプチドを表示する宿主細胞を単離する。次いで、単離された宿主細胞は、場合により、反復ラウンドのスクリーニングを受けるか、あるいは、表示される多重鎖ポリペプチドのポリペプチド配列を特性決定するか又は利用するために操作してよい。さらに、本発明のスクリーニング法は、（予備的）ファージディスプレイスクリーニングや、本明細書に記載の真核ディスプレイスクリーニング用真核ディスプレイ系への選択されたファージディスプレイ単離物の移行と組み合わせることができる。
本発明のさらなる態様において、二倍体真核宿主細胞の表面に表示される多重鎖ポリペプチドのライブラリー（ここで、この二倍体細胞は、本明細書に記載され教示される多重鎖ベクターセットを含有する）は、実施者にとって目的の生物活性を現す多重鎖ポリペプチドを検出するために（そして、場合により、単離するために）スクリーニングすることができる。好ましくは、二倍体真核宿主細胞は、本明細書に記載され教示される一倍体真核宿主細胞対の融合の産物である。１つの特に好ましい態様において、目的の生物活性を現す多重鎖ポリペプチドを表示する、スクリーニングされた二倍体細胞は、単離されてから、場合により、減数分裂を受けてよく、それにより娘（一倍体）細胞は、選択された多重鎖ポリペプチドの別個の鎖を発現する。次いで、娘細胞は、場合により、多重鎖ポリペプチド鎖を発現する他の一倍体細胞（例えば、単離二倍体細胞の同一亜集団由来の他の娘細胞）と融合させてよく、多重鎖ポリペプチドをその表面に表示する二倍体真核宿主細胞の組換え集団を産生する。選択された多重鎖ポリペプチドの個別の鎖の追加ラウンドのスクリーニングと反復組換えを実施してよく、最終的に、表示された多重鎖ポリペプチドのポリペプチド配列は、上記に論じたように特性決定するか又は利用することができる。選択された一倍体娘細胞の組換えはまた、他の偏性又は非偏性の真核ディスプレイベクターと（細胞融合により）組換えて、新規な多重鎖ディスプレイ宿主細胞ライブラリーを産生することができる。
真核ディスプレイベクターは、複数のそうした真核ディスプレイベクターを含む、酵母ディスプレイライブラリーのような真核ディスプレイライブラリーを創出するために使用することができる。好ましくは、複数の真核ディスプレイベクターは、多重鎖ポリペプチドの異種集団をコードし、多重鎖ポリペプチドの表示されるレパートリー、例えば、少なくとも１０４、好ましくは少なくとも１０５、より好ましくは少なくとも１０６、より好ましくは少なくとも１０７、より好ましくは少なくとも１０８、最も好ましくは少なくとも１０９の異なるポリペプチドを生じる。
本発明の特定の態様において、アンカーは、真核細胞の表面上にアンカーとして作動可能で、ファージの表面上にアンカーとして作動可能なポリペプチドである。他の態様において、アンカーは、真核宿主細胞の細胞表面とファージの表面へ固着する表面タンパク質の一部である。
本発明の好ましい態様において、アンカーと多重鎖ポリペプチドの１本の鎖は、融合タンパク質として発現される。他の態様において、アンカーと多重鎖ポリペプチドの１本の鎖は、発現時に、好ましくは、Ｊｕｎ／Ｆｏｓ連結のような間接的な連結により連結される。
別の態様において、本発明は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドを真核宿主細胞の表面に表示する方法へ向けられる。該方法は、細胞表面アンカーへ連結する生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドの第一のポリペプチド鎖をコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一の真核ベクター（ここで前記ベクターは、真核宿主細胞において前記第一鎖の発現及び分泌を指令するように作動可能である）；及び前記多重鎖ポリペプチドの第二のポリペプチド鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二の真核ベクター（ここで前記ベクターは、真核宿主細胞において前記第二鎖の発現及び分泌を指令するように作動可能である）を真核宿主細胞へ導入する工程（ここで前記第一の真核ベクターと前記第二の真核ベクターで形質転換された真核宿主細胞は、前記第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドの発現時に、真核宿主細胞の表面に前記多重鎖ポリペプチドの生物活性を現す）；及び、前記宿主細胞を前記第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドの発現に適した条件下で培養する工程を含む。
さらなる態様において、本発明は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドを真核宿主細胞の表面に表示する方法へ向けられる。該方法は、上記に記載のような真核ディスプレイベクター、真核ディスプレイベクターセット、又は二元ディスプレイベクターを真核宿主細胞へ導入する工程、及び前記宿主細胞を前記ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で培養する工程を含む。
さらに本発明は、本明細書に記載のような真核ディスプレイベクター、真核ディスプレイベクターセット、又は二元ディスプレイベクターを含む真核宿主細胞を提供する。好適な真核宿主細胞は、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞であり得る。好ましくは、真核宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、及び酵母細胞であろう。最も好ましくは、真核宿主細胞は酵母細胞であり、例えば、サッカロミセス属、ピキア属、ハンゼヌラ属、シゾサッカロミセス属、クライベロミセス属、ヤローウィア属、デバリオミセス属、又はカンジダ属より選択される酵母細胞であろう。好ましい酵母宿主には、サッカロミセス・セレビシエ、ハンゼヌラ・ポリモルファ（polymorpha）、クライベロミセス・ラクチス、ピキア・パストリス、シゾサッカロミセス・ポンベ及びヤローウィア・リポリチカが含まれる。最も好ましい酵母宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエである。
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様の記載が以下に続く。
本出願において開示される発明は、機能的な異種多重鎖ポリペプチド（例えばＦａｂ抗体断片）の真核宿主細胞（例えば酵母）の表面での成功した発現、輸送、組立て、及び固定化（又は「ディスプレイ」）をはじめて例証したことを記載する。本発明は、ベクターライブラリー及び真核宿主細胞ライブラリーの構築を可能にし、ここで該細胞はきわめて可変な多重鎖ポリペプチドのレパートリーを表示し、この多重鎖ポリペプチドは、そのレパートリー内で高度の配列多様性と、標的（例えば抗体）特異性のような、必然的にきわめて可変な範囲の生物活性を現す。当業者は、本発明の教示に従うことによって、おびただしい数の多重鎖分子を酵母のような真核宿主細胞の表面に安定的に発現させることができることを理解するであろう。
本発明の好ましい態様の記載が以下に続く。
本出願において開示される発明は、機能的な異種多重鎖ポリペプチド（例えばＦａｂ抗体断片）の真核宿主細胞（例えば酵母）の表面での成功した発現、輸送、組立て、及び固定化（又は「ディスプレイ」）をはじめて例証したことを記載する。本発明は、ベクターライブラリー及び真核宿主細胞ライブラリーの構築を可能にし、ここで該細胞はきわめて可変な多重鎖ポリペプチドのレパートリーを表示し、この多重鎖ポリペプチドは、そのレパートリー内で高度の配列多様性と、標的（例えば抗体）特異性のような、必然的にきわめて可変な範囲の生物活性を現す。当業者は、本発明の教示に従うことによって、おびただしい数の多重鎖分子を酵母のような真核宿主細胞の表面に安定的に発現させることができることを理解するであろう。
定義
本明細書において他に定義されなければ、本発明の記載に使用する術語及び用語は、当業者が一般に理解して受け容れているような術語及び用語の平明な意味に従って使用される。潜在的な混同若しくは曖昧さを避けるために、本発明に関連する特別な原理（elements）又は特徴を以下に説明する。
本明細書において他に定義されなければ、本発明の記載に使用する術語及び用語は、当業者が一般に理解して受け容れているような術語及び用語の平明な意味に従って使用される。潜在的な混同若しくは曖昧さを避けるために、本発明に関連する特別な原理（elements）又は特徴を以下に説明する。
本明細書に使用される「多重鎖ポリペプチド」は、ペプチド結合以外の分子会合により共有結合的又は非共有結合的に一緒に連結した、２つ以上の別個のポリペプチド要素（即ち、「鎖」）からなる機能的なポリペプチドを意味する。多重鎖ポリペプチド鎖は、同一でも異なっていてもよい。多重鎖ポリペプチドの著名な例は、典型的には４つの鎖、２つの重鎖と２つの軽鎖からなり、その鎖がいくつかのジスルフィド（共有）結合により連結している多重鎖ポリペプチドへ組み立てられる、免疫グロブリン（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）である。軽鎖（ＬＣ）ドメインと重鎖（ＨＣ）ドメインの組合せを含む、活性のある免疫グロブリンＦａｂ断片は、特に重要な種類の多重鎖ポリペプチドを生じる。ジスルフィド結合を形成するだけでなく、ＦａｂのＬＣ及びＨＣはまた、ジスルフィド架橋の非存在時に有効に（非共有結合的に）会合することが知られている。多重鎖ポリペプチドの他の例には、限定されるものではないが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）分子（α及びβ鎖、又はγ及びδ鎖を含む）の細胞外ドメイン、ＭＨＣクラスＩ分子（β２ミクログロブリンへ非共有結合的に会合するα１、α２、α３ドメインを含む）、及びＭＨＣクラスＩＩ分子（α及びβ鎖を含む）が含まれる。本明細書において特に考慮するのは、少なくとも１本の鎖が非天然に存在する（異種）アンカーと宿主細胞表面で固着している、真核宿主細胞におけるＴＣＲ及びＭＨＣ結合ドメインの発現である。
用語「生物学的に活性な」は、例えば、多重鎖ポリペプチドに関連する場合、該ポリペプチドが何らかの生物学的プロセス、経路、又は反応に関して有用である機能性若しくは特性を現すことを意味する。生物学的な活性は、例えば、別のポリペプチド若しくは分子と相互作用するか又は会合する（例えば結合する）能力を意味する場合があるか、又はそれは、他のタンパク質又は分子の相互作用（例えば酵素反応）を触媒するか又は調節する能力を意味する場合がある。生物活性は、天然に存在する免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）分子の四本鎖コンホメーション、Ｔ細胞受容体分子のα及びβ鎖、又は主要組織適合性複合体（例えばＭＨＣペプチド溝）の抗原提示構造のコンホメーションといった、天然に存在する構造に特徴的な物理コンホメーションをもたらす能力を意味する場合もある。
本明細書に使用される「ベクター」は、遺伝子移行、遺伝子発現、又は異種ポリヌクレオチドの宿主細胞における複製若しくは組込みの運搬体として役立つことが可能な要素を意味する。ベクターは、人工的な染色体若しくはプラスミドであってよく、宿主細胞ゲノムへ組み込まれても独立した遺伝要素（例えばエピソーム、プラスミド）として存在してもよい。ベクターは、単一ポリヌクレオチドとして存在しても、２以上の別々のポリヌクレオチドとして存在してもよい。本発明の「多重鎖ディスプレイベクター」は、適切な宿主において、多重鎖ポリペプチドの少なくとも１本の鎖の発現を指令して、それを前記宿主の表面でのディスプレイのために処理することが可能である。本発明に記載のベクターは、単一コピーベクターでもマルチコピーベクターでもよい（典型的には、宿主細胞において維持されるベクターのコピー数を示す）。本発明の好ましいベクターには、酵母発現ベクター、特に２μベクターと動原体ベクターが含まれる。「シャトルベクター」（又は二機能性ベクター）は、当該技術分野において、１以上の種の生物において複製することができるベクターとして知られている。例えば、Escherichia coli（Ｅ．ｃｏｌｉ）とサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．セレビシエ）の両方で複製することができるシャトルベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドからの配列を酵母２μプラスミドからの配列と連結させることによって構築することができる。本発明の特に好ましい態様は「二元ディスプレイベクター」であり、これは、２つの異なる種において複製することが可能であるだけでなく、２以上の宿主種において異種ポリヌクレオチドを発現して表示することが可能であるシャトルベクターである。
本明細書に使用される「分泌」は、分泌シグナルを有し、小胞体において処理されるペプチドに関連する。分泌されるペプチドがアンカー配列を含有するか、又は細胞表面の外側と会合すれば、このペプチドは「表示」されると言われる。本明細書に使用される「表示（ディスプレイ）」及び「表面ディスプレイ」（本明細書において交換可能的に使用される）は、異種ポリペプチドがファージ又は宿主細胞の外面へ付着又は「固着」し、それにより固着したポリペプチドが細胞外環境へ曝露される現象を意味する。本発明は、多重鎖ポリペプチドの各鎖の宿主細胞における発現とその多重鎖ポリペプチドの少なくとも１本の鎖の宿主細胞の表面への固着による、多重鎖ポリペプチドの真核宿主細胞の表面でのディスプレイへ特に向けられる。「ディスプレイベクター」は、ポリペプチドを宿主細胞又はファージにおいて発現することが可能であるベクターを意味し、発現されたポリペプチドは前記宿主細胞又はファージの表面に表示される。本発明のディスプレイベクターは、表示されるポリペプチドの生物活性が宿主細胞又はファージの表面で現れるように、多重鎖ポリペプチドの宿主細胞又はファージにおける発現を指令する。本発明の二元ディスプレイベクターは、ポリペプチドの生物活性がそれぞれの宿主の表面で現れるように、少なくとも２つの異なる宿主（好ましくは、例えば、原核宿主細胞と真核宿主細胞）における多重鎖ポリペプチドの発現を指令する。
用語「レパートリー」は、多様な分子、例えば、ヌクレオチド配列が異なる核酸分子、又はアミノ酸配列が異なるポリペプチドの集団を意味する。本発明によれば、ポリペプチドのレパートリーは、好ましくは、標的分子へのその結合部位が異なる多様な分子の集団を保有するように設計される。このレパートリーのポリペプチドは、共通の構造要素を有するように設計され、例えば、Ｆａｂのレパートリーでは、十分に認知された二本鎖構造（Ｉｇ軽鎖と、それに会合するＩｇ重鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン）を有するが、この成分鎖のそれぞれの可変領域における変異により、様々な結合特異性を現す。
用語「ライブラリー」は、異種のポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの混合物を意味する。ライブラリーは、類似のポリペプチド若しくはポリヌクレオチド配列を有するメンバーからなる。ライブラリーがポリヌクレオチドライブラリーである場合、それは、ポリペプチドのレパートリー（特に、例えば本発明に関しては、多重鎖ポリペプチドのレパートリー）をコードする。ライブラリーメンバー間の配列の違いは、ライブラリーに存在する多様性の原因となる。ライブラリーは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの単純な混合物の形態をとる場合があるか、又はポリヌクレオチドのライブラリーで形質転換された生物若しくは細胞、例えば、細菌、ウイルス、動物若しくは植物細胞、等の形態であってもよい。ライブラリーを形成する細胞若しくは生物の表面に異種ポリペプチドが発現されて明示される場合、このライブラリーは「ディスプレイライブラリー」である。有利には、ポリヌクレオチドを発現ベクターへ組み込み、このポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現を可能にする。故に、好ましい側面において、ライブラリーは、宿主生物の集団の形態をとる場合があり、各生物は、発現されて対応のポリペプチドメンバーを産生することができるポリヌクレオチドのライブラリーの単一メンバーを含有する発現ベクターの１以上のコピーを含有する。このように、宿主生物の集団には、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリーをコードする潜在能力がある。
本発明は、新規な多重鎖ディスプレイベクターへ向けられる。本発明の１つの態様において、多重鎖ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドは、別個の（即ち、２以上の）発現ベクターに存在し、その編集（compilation）により機能的なディスプレイ「ベクターセット」が生じる（一般用語「ベクター」にはベクターセットが含まれる）。例えば、多重鎖ポリペプチドが生物学的に活性なＦａｂの軽鎖及び重鎖からなる二本鎖ポリペプチドであれば、ＬＣをコードするポリヌクレオチドを１つの発現ベクターへ取り込み、ＨＣをコードするポリヌクレオチドを第二の、別個の発現ベクターへ取り込むことができる（最も好ましくは、ＨＣ−アンカー融合タンパク質として発現される）。各ベクターは、個別に、そのそれぞれのポリペプチド鎖を発現することが可能であり；この２つのベクターが適合ベクターセットを形成し、このセットは、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチド鎖をコードする。同様に、ベクターセットの異なるベクターでそれぞれ形質転換された別個の宿主細胞は、集合的に適合宿主細胞セット（又は、特に２−ベクターセットの場合は、適合「細胞対」）を形成する。ベクター及びベクターセットには、好ましくは、成功裡に形質転換された宿主の選択及び増殖を促進するための１以上の選択可能マーカー（例えばＴＲＰ、ａｍｐＲ等）も含まれる。
「宿主細胞」は、ベクターを含有するように形質転換されたあらゆる細胞（原核又は真核）を意味する。本発明によれば、好ましい宿主細胞は、細菌細胞と真核細胞であり、限定されないが、原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞、及び動物細胞が含まれる。本発明の宿主細胞はどのような遺伝子構築体でもよいが、好ましくは、一倍体、二倍体細胞、又は多倍体（例えば培養中の不死化細胞系が典型的である）である。好ましい宿主細胞には、昆虫細胞（例えばＳｆ９）、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２／０及びＮＳ／０骨髄腫細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞、乳児ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ヒトＢ細胞、ヒト細胞系ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ（Ｃｒｕｃｅｌｌ））、種子植物細胞、及び子嚢菌類細胞（例えばニューロスポラ属と酵母細胞；特に、サッカロミセス属、ピキア属、ハンゼヌラ属、シゾサッカロミセス属、クライベロミセス属、ヤローウィア属、及びカンジダ属の酵母）が含まれる。好ましい例示の酵母種には、Ｓ．セレビシエ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クライベロミセス・ラクチス、ピキア・パストリス、シゾサッカロミセス・ポンベ、及びヤローウィア・リポリチカが含まれる。特に好ましい酵母宿主細胞は、Ｓ．セレビシエである。
用語「ファージ」は、「バクテリオファージ」を意味し、これは、核酸コアとタンパク質性の保護殻を含有する細菌ウイルスである。用語「バクテリオファージ」及び「ファージ」は、本明細書において交換可能的に使用される。他に述べなければ、用語「バクテリオファージ」及び「ファージ」には、「ファージミド」（即ち、ヘルパーファージとの宿主の同時感染によりパーケージングされ得るプラスミドがそのゲノムに含まれる、バクテリオファージ）も含まれる。本発明の好ましい態様において、ファージは、Ｍ１３ファージである。
用語「アンカー」、「細胞表面アンカー」、及び「アンカーポリペプチド」は、宿主細胞中での発現時に、宿主細胞の外面、又はファージディスプレイ系の場合はファージ粒子の表面に（例えば、カプシドの一部として、又はフィラメントの一部として）付着するか又は他のやり方で会合するポリペプチド部分を意味する。アンカーポリペプチドは、コートタンパク質部分、膜貫通ポリペプチド部分であってよく、又は、細胞表面へ他のやり方で（例えば、ホスファチジルイノシトール又はジスルフィド架橋によるような、翻訳後修飾により）連結するポリペプチド部分であってもよい。この用語には、宿主細胞又はファージに対してネイティブなタンパク質、又は宿主細胞壁又はファージコートへ固着させる目的で導入した外来性タンパク質が含まれる。アンカーには、人工的に修飾又は末端切断されても、宿主細胞又はファージ粒子の表面へ付着する能力を保持する、天然に存在するアンカーが含まれる。好ましいアンカータンパク質部分は、例えば、真核細胞の細胞表面タンパク質に含まれる。有効なアンカーには、本発明に記載の多重鎖ポリペプチド鎖のように、別のポリペプチドへ融合したときに表面アンカーを提供するのに十分な細胞表面タンパク質の部分が含まれる。別個にコードされて発現されるが、共有（例えばジスルフィド）若しくは非共有結合により細胞の表面で会合するタンパク質対の使用も好適なアンカーとして考慮され、この点で特別な言及がなされるのは、酵母α−アグルチニン成分、Ａｇａ１ｐ及びＡｇａ２ｐであり、これは酵母細胞の表面にグリカン固定化、ジスルフィド連結複合体を生じる。アンカーとして利用することができる別のタンパク質対は、核タンパク質Ｊｕｎ及びＦｏｓ（「ｊｕｎ／ｆｏｓ連結」を生じる）のような、「ロイシンジッパー」相互作用、等を生じるタンパク質である。例えば、ディスプレイベクターは、本発明に従って、Ｊｕｎのロイシンジッパー部分へ融合する多重鎖ポリペプチドの第一鎖の宿主細胞における発現を指令するように設計することができ、第二ベクターは、宿主の表面タンパク質へ融合するＦｏｓのロイシンジッパー部分の独立した発現を指令するように設計することができる。このベクター構造遺伝子の発現時に、Ｊｕｎ及びＦｏｓのロイシンジッパーが第一鎖ポリペプチドとジッパーのＦｏｓ部分へ融合した宿主細胞表面タンパク質間の連結となるので、第一鎖のポリペプチドがｊｕｎ／ｆｏｓ連結を介して宿主細胞表面と会合（即ち、固着）する。この種の好適なタンパク質結合対をいずれも使用してよい。ポリペプチドアンカーの好ましい例には、ファージディスプレイ系では、線状ファージのｐｏｌＩＩＩコートタンパク質又はその断片（例えば、ｐＩＩＩアンカードメイン若しくは「断端（stump）」、米国特許第５，６５８，７２７号を参照のこと）、そして酵母ディスプレイ系では、ＦＬＯ１（Ｓ．セレビシエの綿状表現型に関連するタンパク質）、α−アグルチニン、及びａ−アグルチニン（例えば、Ａｇａ１ｐ及びＡｇａ２ｐサブユニット）とこれらの機能的断片が含まれる。
本明細書に使用される用語「融合タンパク質」は、１より多い供給源からのアミノ酸配列からなり、一緒に連結して非天然に存在する単体ポリペプチドを生じる、ハイブリッドポリペプチドを意味する。融合タンパク質は、例えば、成分アミノ酸配列のコード配列を、発現時に、それらが単一のポリペプチドとして産生されるようにインフレームで作動可能に連結することによって調製する。あるいは、融合タンパク質は、合成的に、例えば、２以上の別個ポリペプチド間にペプチド結合を創出することによって、組み立ててもよい。
本明細書に使用される「連結」は、２以上の要素間の機能的かつ構造上の結びつきを意味する。本明細書に使用されるように、連結要素は、典型的には、２以上のポリヌクレオチド要素若しくはポリペプチド要素間の作動可能な結びつきに関連する。例えば、上記に論じたように、ポリペプチドは、アンカータンパク質へ（ペプチド結合を介してか又はペプチドリンカーを介して）連結し、それにより融合タンパク質を生じ得る。同様に、このポリペプチド及びアンカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを、融合タンパク質が単体のＲＮＡメッセージとして転写及び翻訳されるように、連結してよい。ポリペプチドはまた、中間的な会合を介してアンカーへ間接的に連結してよく、その１例は、Ｊｕｎ及びＦｏｓロイシンジッパーの高アフィニティー相互作用（即ち、「ｊｕｎ／ｆｏｓ連結」）を使用して、ファージ又は宿主細胞の表面へポリペプチドを有効に連結させることである（Crameri, R. and Blaser, K., 1996）。どの好適なヘテロ二量体若しくはホモ二量体の分子対も使用してよい（Chang, H. et al., 1994; Moll, J. et al., 2001; Pu, W. and Struhl, K., 1993）。
当該技術分野の当業者により理解されるように、ファージディスプレイ若しくは宿主細胞ディスプレイ系において発現されて表示される多重鎖ポリペプチドの１以上の鎖をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターへ（転写を促進するために）作動可能に連結するか、又はシグナル配列若しくはリーダーペプチドへ（細胞プロセシングや表面への輸送を促進するために）作動可能に連結することができる。こうした遺伝子制御要素とそれへの機能的な連結は数多くあり、当該技術分野でよく知られていて、本発明はその使用により限定されない。しかしながら、好ましいプロモーターには、誘導プロモーターが含まれる。特に好ましいプロモーター（真核系用）には、ｐＧＡＬ１、ｐＧＡＬ１−１０、ｐＧＡｌ１０４、ｐＧａｌ１０、ｐＰＧＫ、ｐＣＹＣ１、及びｐＡＤＨ１のような、酵母ベクターにおいて有用なものが含まれる。他の好ましいプロモーターには、ＬａｃＺプロモーター（非真核系用）が含まれる。特に好ましいシグナル配列には、Ａｇａ２ｐシグナル配列（真核系用）とｐＩＩＩシグナル配列（非真核系用）が含まれる。
当該技術分野の実施者に知られている別の有用なツールは、分子標識又は「タグ」（例えば、エピトープタグ、レポーター遺伝子、放射性同位体、蛍光若しくは化学発光部分、等）であり、これらは、例えば、それへ連結するポリペプチドの存在を検出する実施者の能力を促進する。エピトープタグ（例えば、特別な抗体又は結合部分により認識されることが知られているペプチドセグメント）は、それらが本発明に記載の単数若しくは複数のベクターにおいて多重鎖ポリペプチドの１以上の鎖との融合パートナーとして同時発現されて、そのタグが同時発現される１以上の鎖の発現の検出を可能にするという点で、本明細書において特に有用である。当該技術分野で知られて使用されるように、タグは、典型的には、目的の遺伝子と同じ遺伝子制御下に（好ましくは、発現される融合タンパク質の成分として）置かれる。目的の遺伝子産物が容易には検出可能でない場合、タグは、容易に検出可能で、しばしば定量可能な、目的の遺伝子産物の存在を示すシグナルを提供する。目的のポリペプチド遺伝子産物へタグを連結することによって、実施者は、例えば、遺伝子発現、ポリペプチド転送、細胞外ディスプレイ、及びタンパク質−タンパク質相互作用のようなプロセスをモニターすることができる（Fields, S. and Sternglanz, R., 1994; Phizicky, E. and Fields, S., 1995）。
従って、多重鎖ポリペプチド鎖は、場合により、個別に、又は一緒に１以上のタグへ連結することができる。多様なタグが当該技術分野で知られて、市販されている（アマーシャム・ファルマシア・バイオテク、ピスカタウェイ、ニュージャージー州；アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州；プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州；ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、インディアナポリス、インディアナ州；ストラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア州）。好ましくは、この連結は、ペプチド結合を介して達成され（それにより融合タンパク質を創出する）、ここでは多重鎖ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドがタグ（例えばエピトープタグ）へ連結する。好ましいタグには、ポリＨｉｓタグ、ＨＡタグ、及びｍｙｃタグが含まれる。
本明細書に使用される用語「組換え」は、非天然的に改変又は操作された核酸、外来の核酸でトランスフェクトされた宿主細胞、又は、単離ＤＮＡの操作と宿主細胞の形質転換により非天然的に発現されたポリペプチドを記載するために使用される。「組換え」は、遺伝子工学技術を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されたＤＮＡ分子を特に包含する用語であり、分子、構築体、ベクター、細胞、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを記載するための形容詞としての用語「組換え」の使用では、天然に存在する分子が特に除外される。
同様に、用語「形質転換」は、一般に、挿入の方法に限定せずに遺伝物質を細胞又はファージへ導入する人工的な（即ち、実施者が制御する）方法を意味する。数多くの方法が当該技術分野で知られて、本明細書に引用されて組み込まれる参考文献に記載される。特に本明細書に適用される用語「形質転換体」は、形質転換された宿主細胞を意味し、例えば、（反対の接合型の一倍体酵母胞子の制御接合の場合のように）適合した一倍体細胞対の制御融合の産物である、二倍体細胞が含まれる。
核酸配列情報を１つのベクターから別のベクターへ「移行させる」方法は、本発明において限定されず、当該技術分野で知られている多様な遺伝子工学又は組換えＤＮＡ技術がいずれも含まれる。ここでも、膨大な数の方法が当該技術分野で知られて、本明細書に引用され援用される参考文献に記載される。特に好ましい移行技術には、限定されるものではないが、制限消化及びライゲーション技術（ユニークなクローニング部位を利用する）、ＰＣＲ増幅プロトコール（特定のプライマー配列を利用する）、及び相同組換え技術（相同性のあるポリヌクレオチド領域を利用する）が含まれる。
遺伝子工学技術を利用することは、必然的に、生物の必要条件や実施者により所望される特別な細胞状態により決定されるような多様な特殊条件下で組換え宿主細胞（形質転換体）を増殖させることを必要とする。例えば、生物は、（その遺伝素因により決定されるように）特定の栄養必要物、又は物理的（例えば温度）及び／又は化学的（例えば抗生物質）条件に対する特別な耐性若しくは感受性を保有する場合がある。さらに、所望の遺伝子の発現を誘導するか又は抑圧する（例えば誘導プロモーターの使用）、又は特別な細胞状態を始動させる（例えば酵母細胞の接合又は胞子形成）には、特定の培養条件が必要となる場合がある。これらの変動条件とこうした条件を満たすための必要条件は、当該技術分野の実施者により理解され、評価される。
従って、本発明の様々な側面の実施には、特別な細胞状態を達成するか又は誘導するのに「適した条件」又は「十分な条件」の下で宿主細胞を培養することが必要になる。こうした望ましい細胞状態には、限定されるものではないが、細胞の増殖及び生殖；多重鎖ポリペプチドの生物活性が宿主細胞（又はファージ粒子）の表面で現れるような、多重鎖ポリペプチドの発現、分泌又は輸送、及び会合；二倍体細胞を生じる一倍体細胞の融合（例えば受精、接合体形成、反対の接合型の細胞の接合）；及び、一倍体娘細胞を生じる二倍体細胞の減数分裂（例えば配偶子形成、胞子形成）が含まれる。本発明は、こうした「好適条件」の物理及び化学変数により限定されないが、こうした条件は、本発明を実施するために使用される生物及びベクターにより、そして実施者の選好性により決定される。
多重鎖ポリペプチド真核ディスプレイベクター
上記に概説したように、本発明は、真核細胞において、多重鎖ポリペプチドの生物活性が細胞の表面で現れるように細胞の表面に多重鎖ポリペプチドを表示するのに有用な新規の遺伝ベクターへ向けられる。本発明によれば、多重鎖ポリペプチドは、単一ベクターにコードすることができるか、又は多重鎖ポリペプチドの個別の鎖をベクターセットにコードすることができる。例えば、本発明の１つの側面において、ベクターは、ベクターセットとして存在してよく、ここで多重鎖ポリペプチドの各鎖は、ベクターの適合対の１つにコードされるので、ベクターセットが単一の真核細胞中に存在する場合、多重鎖ポリペプチド鎖は真核細胞の表面で会合する。本発明の別の側面において、ディスプレイベクターは二元ディスプレイベクターであってよく、ここで該ベクターは、（ｉ）生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドを真核細胞において発現して真核細胞の表面に表示すること、及び（ｉｉ）生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドを原核細胞において発現してバクテリオファージの表面に表示することが可能である。
上記に概説したように、本発明は、真核細胞において、多重鎖ポリペプチドの生物活性が細胞の表面で現れるように細胞の表面に多重鎖ポリペプチドを表示するのに有用な新規の遺伝ベクターへ向けられる。本発明によれば、多重鎖ポリペプチドは、単一ベクターにコードすることができるか、又は多重鎖ポリペプチドの個別の鎖をベクターセットにコードすることができる。例えば、本発明の１つの側面において、ベクターは、ベクターセットとして存在してよく、ここで多重鎖ポリペプチドの各鎖は、ベクターの適合対の１つにコードされるので、ベクターセットが単一の真核細胞中に存在する場合、多重鎖ポリペプチド鎖は真核細胞の表面で会合する。本発明の別の側面において、ディスプレイベクターは二元ディスプレイベクターであってよく、ここで該ベクターは、（ｉ）生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドを真核細胞において発現して真核細胞の表面に表示すること、及び（ｉｉ）生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドを原核細胞において発現してバクテリオファージの表面に表示することが可能である。
多重鎖ポリペプチドは、多重鎖ポリペプチド鎖と呼ばれる、２つ以上の別々のポリペプチド要素からなるいかなるポリペプチドでもよく、この鎖は、共有結合的又は非共有結合的に（ペプチド結合以外で）連結して生物学的に活性なポリペプチドを生じる。好ましくは、本発明の多重鎖ディスプレイベクターによりコードされる多重鎖ポリペプチドは、二、三、又は四本鎖ポリペプチドのいずれかとして存在する。ポリペプチド鎖は、同じであっても（例えばホモ二量体、三量体又は四量体）、異なっても（例えばヘテロ二量体、三量体又は四量体）よい。好ましくは、多重鎖ポリペプチドは、２つの異なる鎖からなる二本鎖若しくは四本鎖ポリペプチドである。より好ましくは、多重鎖ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、免疫グロブリン、及び生物学的に活性な免疫グロブリン断片（例えばＦａｂ）からなる多重鎖ポリペプチドの群より選択される。より好ましくは、多重鎖ポリペプチドは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はそれらの生物学的に活性な断片である。最も好ましくは、多重鎖ポリペプチドはＩｇのＦａｂ断片であり、ここで多重鎖ディスプレイベクターの第一のポリヌクレオチドは、Ｉｇ重鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインをコードするセグメントを含み、第二のポリヌクレオチドは、Ｉｇ軽鎖（即ち、ＶＬ及びＣＬドメイン）をコードするセグメントを含む。
多重鎖ポリペプチド鎖（例えば第一鎖、第二鎖、第三鎖等）は、発現ベクターにおいてポリヌクレオチド（例えば、それぞれ第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、第三のポリヌクレオチド、等）としてコードされる。当該技術分野の当業者により評価されて理解されるように、この鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、機能的な多重鎖ポリペプチドを産生するために、必ずしも同一のプラスミドへ挿入される必要はないし、同じ遺伝子発現制御下にある必要もない。例えば、Ｉｇ Ｆａｂの軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別個のプラスミド上に位置して、機能的な多重鎖ポリペプチドへの同時発現及び同時プロセシングのために、そのまま同一の宿主細胞を形質転換してよい。
また、当該技術分野の当業者により評価されるように、多重鎖ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドの配列は、同一の、又は同じ供給源に由来する必要はない。例えば、所望の特異性を有するモノクローナル抗体分子と同じ可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）と、所望の特性を有する異なるモノクローナル抗体由来の定常ドメイン（ＣＨ１及びＣＬ）を有するＩｇ分子を産生することができる（例えば、ヒト適合性を提供するか、又は特別な補体結合部位を提供するために）。
さらに、多重鎖ポリペプチド（例えばＩｇドメイン）の鎖をコードする異種ポリヌクレオチドは、互いにアミノ酸配列はやや異なるが同じ全体構造を有するポリペプチド鎖をコードする、ポリヌクレオチド相同体のファミリーを産生するように変化させることができる。このようにして、この相同体が異なる宿主細胞へ組み込まれて発現されると、多様な配列の多重鎖ポリペプチドのライブラリーが表示され、例えば、改変した生物活性を有する相同の多重鎖ポリペプチドを発見するためのスクリーニングに適したペプチドディスプレイライブラリーを提供する。アミノ酸配列におけるこうした改変は、対応するポリヌクレオチドコード配列の適切な領域の好適な突然変異、又は一部の合成及び置換、又はその一部若しくは全部の置換により達成することができる。代わりの定常ドメイン部分は、適合可能な組換えＤＮＡ配列より入手することができる。
発現ベクター成分と適合宿主細胞の適切な選択があれば、多重鎖ポリペプチド鎖が真核宿主細胞の表面に表示される。当業者は、このことがいくつかの可変発現ベクター構築体のいずれかを使用して達成し得ること、そして本発明がそれにより限定されないことを評価されよう。ディスプレイベクターそのものは、当該技術分野で公知であり市販されているいくつかの遺伝ベクター及び遺伝子制御配列（例えば、インビトロジェン（カールスバッド、カリフォルニア州）；ストラタジーン（ラホヤ、カリフォルニア州）；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（マナッサス、バージニア州））のいずれかより構築又は修飾してよい。本質的に、本発明のベクター構築体は、多重鎖ポリペプチドの生物活性が宿主細胞の表面で現れるように、そのベクターで形質転換された真核細胞の表面に完全に組み立てられた多重鎖ポリペプチドを有効に表示するためにポリペプチド鎖を発現する。
多重鎖ポリペプチドの有効な細胞発現を達成するために、多重鎖ポリペプチドのそれぞれの鎖をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、ポリペプチド鎖の発現を調節する転写プロモーターへ連結される。有効なプロモーターは、真核系において機能的で、場合により（特に、二元ディスプレイベクターの場合）原核プロモーターとしても有効でなければならない。特別な二元ディスプレイベクターにおいて、多重鎖ポリペプチドの異種ポリペプチド鎖の発現を調節するために選択される真核プロモーター及び原核プロモーターは、意図される宿主生物においてそれが適切に機能的である限りは、同じでも異なるプロモーターでもよい。あるいは、それらは、特別な宿主における各鎖の発現のために独立して選択してよい。真核プロモーターは構成プロモーターでもよいが、好ましくは誘導プロモーターである。均衡した発現を達成して発現の同時誘導を確実にするには、各鎖について同じプロモーターを利用するベクター構築体が好ましい。
本発明に有用ないくつかの真核プロモーターが当該技術分野で知られている。特に好ましいプロモーター（真核系用）には、ガラクトース誘導プロモーター、ｐＧＡＬ１、ｐＧＡＬ１−１０、ｐＧａｌ４、及びｐＧａｌ１０；ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ｐＰＧＫ；シトクロムｃプロモーター、ｐＣＹＣ１；及びアルコールデヒドロゲナーゼＩプロモーター、ｐＡＤＨ１のような、酵母発現ベクターにおいて有用なものが含まれる。
好ましくは、多重鎖ポリペプチド鎖をコードするそれぞれのポリヌクレオチドは、シグナル配列（又はリーダーペプチド配列）へも連結する。シグナル配列は、新生ポリヌクレオチドの細胞膜中への、又はそれを通過する輸送（分泌と呼ばれる場合もある）を指令するように作動する。真核細胞において本発明のベクターから発現される多重鎖ポリペプチド鎖は、組立てのために小胞体（ＥＲ）へ輸送されて、細胞外ディスプレイのために細胞表面へ輸送される。有効なシグナル配列は、真核系において機能的であるべきで、場合により（特に、二元ディスプレイベクターの場合）、シグナル配列は、原核系でも有効であるべきである。多重鎖ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドは、典型的には、シグナル配列へインフレームで（ポリヌクレオチドへすぐに隣接するか、場合により、リンカー若しくはスペーサー配列を介して連結する）直に連結され、それによりポリペプチド鎖−シグナル配列ペプチド融合タンパク質を産生する。好ましくは、多重鎖ポリペプチドの各鎖は別個のシグナルペプチドへ融合する。
シグナルペプチドをコードするシグナル配列は、多重鎖ポリペプチドの各鎖について同じでも異なってもよい。シグナル配列は、それが作動可能でその融合するポリペプチドの細胞外輸送をもたらす限りにおいて、宿主にとってネーティブでも異種でもよい。本発明において作動可能ないくつかのシグナル配列が当業者に知られている（例えば、酵母において作動可能なＭｆα１ ｐｒｅｐｒｏ、Ｍｆα１ ｐｒｅ、酸ホスファターゼ Ｐｈｏ５、インベルターゼＳＵＣ２シグナル配列；Ｅ．ｃｏｌｉにおいて作動可能なｐＩＩＩ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡシグナル配列；昆虫細胞において作動可能なｇｐ６４リーダー；ＩｇＫリーダー、哺乳動物細胞において作動可能な蜜蜂メリチン分泌シグナル配列）。シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞のネーティブ分泌タンパク質に由来する。特に好ましい真核シグナル配列には、酵母のα接合因子、酵母のα−アグルチニン、サッカロミセスのインベルターゼ、クライベロミセスのイヌリナーゼのそれと、最も好ましくは、ａ−アグルチニンのＡｇａ２ｐサブユニットのシグナルペプチド（特に、使用される固着ポリペプチドがＡｇａ２ｐポリペプチドである態様において）が含まれる。
多重鎖ポリペプチドがＦａｂである、特に好ましい態様において、第一のポリヌクレオチドは、Ｉｇ重鎖のＶＨ領域及びＣＨ１領域をコードするセグメントとインフレームでＡｇａ２ｐシグナル配列を含み、第二のポリヌクレオチドは、Ｉｇ軽鎖をコードするセグメントとインフレームでＡｇａ２ｐシグナル配列を含む。
本発明の多重鎖真核ディスプレイベクターは、該ベクターによりコードされる多重鎖ポリペプチドが宿主細胞の表面に表示されるように、真核宿主細胞において作動する。宿主細胞の表面での固着（「係留」又は「ディスプレイ」）は、多重鎖ポリペプチドの少なくとも１本の鎖を宿主細胞壁へ付着した分子部分へ連結することによって達成される。多重鎖ポリペプチドの１以上の鎖がアンカーへ連結してもよいが、完全に組み立てられた多重鎖ポリペプチドは、宿主細胞表面に対して付着点を１つしか必要としないので、細胞付着の点には、多重鎖ポリペプチド鎖が１つしか必要でない。その細胞の表面でのディスプレイは、ポリペプチド鎖の少なくとも１つをそのアンカータンパク質又は機能的断片（部分）へ連結することによって達成することができる。有効なアンカーは、真核系において機能的であるべきであり、場合により（特に、二元ディスプレイベクターの場合）、アンカーは、バクテリオファージの表面でのアンカーとしても有効であるべきである。好ましくは、アンカーは、宿主細胞にとってネーティブな表面発現タンパク質であり、例えば、膜貫通タンパク質、又はグリカン架橋を介して細胞表面へ連結したタンパク質である。本発明において作動可能ないくつかのアンカータンパク質が当業者に知られている（例えば、ｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩＩ、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ、Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ（ＦｌｉＣ）、又は原核生物／ファージにおいて作動可能な、少なくともその膜貫通部分；哺乳動物細胞において作動可能な、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）膜貫通ドメイン、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー；昆虫細胞中のｇｐ６４アンカー、等）。好ましくは、酵母が宿主である場合、アンカータンパク質は、α−アグルチニン、ａ−アグルチニン（サブ成分のＡｇａ１ｐ及びＡｇａ２ｐを有する）、又はＦＬＯ１であり、これらは本来的に酵母細胞表面への連結を形成する。
ポリペプチド鎖のアンカーへの連結は、多様な分子生物学技術により、直接的又は間接的に達成することができる。本発明は、鎖−アンカー連結の方法により限定されず、そうした連結の結果として、連結ポリペプチド鎖が宿主細胞（又は、場合により、バクテリオファージ）の表面に固定化されるという機能上の必要性にのみ限定される。
鎖−アンカー連結の好ましい方法は、鎖−アンカー融合タンパク質の構築による。鎖−シグナルペプチド融合タンパク質に類似して、そして好ましくはそれと協奏的に、多重鎖ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドは、アンカーへインフレームで（ポリヌクレオチドへすぐに隣接するか、又は場合により、リンカー若しくはスペーサー配列を介して連結する）直に連結され、それによりシグナルペプチド−ポリペプチド鎖−アンカー融合タンパク質を産生する。
代わりのペプチド−ペプチド連結の方式が当該技術分野で知られていて、本発明の有効な鎖―アンカー連結を達成するために利用可能である。例えば、そしてすでに引用したように、多重鎖ポリペプチド鎖は、Ｊｕｎ及びＦｏｓロイシンジッパー（ｊｕｎ／ｆｏｓ連結）の高アフィニティー相互作用のような中間的な会合を介してアンカーへ間接的に連結させて、ファージ又は宿主細胞のアンカーへポリペプチド鎖を共有的に連結させることができる（Crameri, R. and Suter, M., 1993; Crameri, R. and Blaser, K., 1996）。
多重鎖ポリペプチドがＩｇ Ｆａｂ断片である、特に好ましい態様において、第一のポリヌクレオチドは、Ａｇａ２ｐアンカーをコードするセグメントとインフレームで、並びに、Ｉｇ重鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインをコードするセグメントとインフレームでＡｇａ２ｐシグナル配列を含み；第二のポリヌクレオチドは、Ｉｇ軽鎖をコードするセグメントとインフレームでＡｇａ２ｐシグナルペプチドを含む。
好ましくは、本発明の多重鎖ディスプレイベクターは、多重鎖ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列の移行を促進するクローニング部位を提供する。こうしたベクタークローニング部位は、ポリヌクレオチドセグメントのリーディングフレームでの切断及び挿入を促進するように位置した少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。当該技術分野で知られているどの制限部位も、本発明のベクター構築体において利用してよい。ほとんどの市販ベクターは、すでに多重クローニング部位（ＭＣＳ）又はポリリンカー領域を含有する。さらに、新しいユニークな制限部位をベクターへ取り込むのに有用な遺伝子工学技術が知られていて、当業者により定常的に実践されている。クローニング部位は、単一のポリヌクレオチド断片の挿入又は切断を可能にする、わずかに１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む場合がある。より典型的には、２以上の制限部位を利用して、例えば、挿入（例えば挿入の方向）のより強い制御や、より柔軟な操作（例えば、１以上のポリヌクレオチド断片の方向づけられた移行）を提供する。多数の制限部位は同じであるか又は異なる認識部位であってよい。
本発明の多重鎖真核ディスプレイベクターは、好ましくは、多重鎖ポリペプチド鎖のコード配列の末端に位置する制限部位を含有する。制限部位は、最先端に、つまり多重鎖ポリペプチド鎖の（単一ベクター上の）コード配列のすべてを包含するポリヌクレオチドセグメントの５’端及び３’に位置してよい；又は、より好ましくは、制限部位は、多重鎖ポリペプチド鎖をコードするそれぞれのポリヌクレオチドセグメントの５’端及び３’端に位置してよい。より好ましくは、制限部位のそれぞれは、ベクターにおいてユニークであり、他の制限部位とは異なる。この特に有用なベクター構築体は、多重鎖ポリペプチド鎖をコードする個別のポリヌクレオチド配列のモジュラー移行に柔軟性と制御を提供する。
多重鎖ポリペプチドがＦａｂである、特に好ましいベクター構築体において、第一のポリヌクレオチドは、Ａｇａ２ｐアンカーをコードするセグメントとインフレームで、並びに、Ｉｇ重鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインをコードするセグメントとインフレームでＡｇａ２ｐシグナル配列を含み、ここでＩｇ重鎖領域はユニークな制限部位（例えばＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ）を境界とし；そして、第二のポリヌクレオチドは、Ｉｇ軽鎖をコードするセグメントとインフレームでＡｇａ２ｐシグナルペプチドを含み、ここでＩｇ軽鎖領域はユニークな制限部位（例えばＡｐａＬＩ及びＡｓｃＩ）を境界とする。
多重鎖真核ディスプレイベクターの好ましい態様において、該ベクターにより宿主細胞において発現される多重鎖ポリペプチドの１以上の鎖は、分子タグ又はレポーター遺伝子へ連結する。好ましくは、この連結は、多重鎖ポリペプチド鎖へポリペプチドタグを連結するペプチド結合である。多重鎖ポリペプチドの１以上の鎖は、同一、類似、又は異なるタグを使用してタグ付けてよい。好ましいタグには、エピトープタグが含まれる（Munro, S. and Pelham, H., 1987）。好ましいエピトープタグには、ポリＨｉｓタグ、ＨＡタグ、及びｍｙｃタグが含まれ、好ましくは、それぞれの鎖を異なるタグへ融合する。
多重鎖ポリペプチドが免疫グロブリンのＦａｂ断片である、本明細書に例示される特に好ましいベクター構築体に基づけば、第一のポリヌクレオチドは、Ａｇａ２ｐアンカーをコードするセグメントとインフレームで、Ｉｇ重鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインをコードするセグメントとインフレームで、並びにｍｙｃタグをコードするセグメントとインフレームでＡｇａ２ｐシグナル配列を含み、ここでＩｇ重鎖領域はユニークな制限部位（例えばＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ）を境界とし；そして、第二のポリヌクレオチドは、ＨＡタグをコードするセグメントとインフレームで、並びにＩｇ軽鎖をコードするセグメントとインフレームでＡｇａ２ｐシグナルペプチドを含み、ここでＩｇ軽鎖領域は、ユニークな制限部位（例えばＡｐａＬＩ及びＡｓｃＩ）を境界とする。
多重鎖ポリペプチドの真核細胞ディスプレイ
本明細書に記載されて教示されるベクターを利用して、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドを真核宿主細胞の表面に表示する方法を本明細書において初めて例証する。多重鎖ポリペプチドを真核宿主細胞の表面に表示する方法は、ベクター（おそらくは、ベクターセットとして）を真核宿主細胞（即ち、宿主細胞）へ導入すること、及び多重鎖ポリペプチドの生物活性が宿主細胞の表面で現れるように、宿主細胞表面での多重鎖ポリペプチド鎖の発現、輸送、及び会合に適した条件下で宿主細胞を培養することを含む。
本明細書に記載されて教示されるベクターを利用して、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドを真核宿主細胞の表面に表示する方法を本明細書において初めて例証する。多重鎖ポリペプチドを真核宿主細胞の表面に表示する方法は、ベクター（おそらくは、ベクターセットとして）を真核宿主細胞（即ち、宿主細胞）へ導入すること、及び多重鎖ポリペプチドの生物活性が宿主細胞の表面で現れるように、宿主細胞表面での多重鎖ポリペプチド鎖の発現、輸送、及び会合に適した条件下で宿主細胞を培養することを含む。
本発明のベクターの宿主細胞への導入の方式は、本発明には限定されず、当該技術分野で知られている、遺伝物質を細胞へ導入するあらゆる方法が含まれる。こうした方法には、限定されないが、トランスフェクション、形質転換、エレクトロポレーション、リポソーム仲介性移行、生物（biolistic）移行、コンジュゲーション、細胞融合、及び核マイクロインジェクションとして当該技術分野で知られて呼ばれる方法が含まれる。当該技術分野で知られている形質転換技術が遺伝子移行の好ましい方法である。
多重鎖ポリペプチドディスプレイ宿主細胞（及び宿主細胞対）
本発明のベクターは、真核宿主細胞において作動可能であり、真核宿主細胞の表面での発現をもたらして多重鎖ポリペプチドを表示する。場合により、特に二元ディスプレイベクターの場合、本発明のベクターは、原核宿主細胞においても作動可能であり、細菌宿主細胞においても発現をもたらし、多重鎖ポリペプチドをバクテリオファージの表面に表示する。真核宿主細胞は、実施者の特別な関心及び要求に応じて、どの遺伝子型の、分化又は未分化、単細胞又は多細胞の、どの真核細胞でもよい。特に有用な真核細胞には、哺乳動物細胞、植物細胞、真菌細胞、及び原生生物細胞が含まれる。好ましくは、宿主細胞は、未分化、単細胞、一倍体若しくは二倍体の細胞生物である。好ましい宿主細胞は真菌であり、特に、その培養条件の容易さと多様性、利用可能な生化学及び細胞性突然変異体の多様性、その短い世代時間、及びその生活環（以下参照）のために、子嚢菌門（子嚢菌）の種である。好ましい真菌宿主細胞には、サッカロミセス、ピキア、ハンゼヌラ、シゾサッカロミセス、クライベロミセス、ヤローウィア、デバリオミセス、及びカンジダのような、ニューロスポラ属と様々な酵母のものが含まれる。最も好ましい種は、分子生物学の研究においておそらく最もよく知られていて、特徴付けられ、利用される真核宿主細胞系である、サッカロミセス・セレビシエ（パン酵母）である。
本発明のベクターは、真核宿主細胞において作動可能であり、真核宿主細胞の表面での発現をもたらして多重鎖ポリペプチドを表示する。場合により、特に二元ディスプレイベクターの場合、本発明のベクターは、原核宿主細胞においても作動可能であり、細菌宿主細胞においても発現をもたらし、多重鎖ポリペプチドをバクテリオファージの表面に表示する。真核宿主細胞は、実施者の特別な関心及び要求に応じて、どの遺伝子型の、分化又は未分化、単細胞又は多細胞の、どの真核細胞でもよい。特に有用な真核細胞には、哺乳動物細胞、植物細胞、真菌細胞、及び原生生物細胞が含まれる。好ましくは、宿主細胞は、未分化、単細胞、一倍体若しくは二倍体の細胞生物である。好ましい宿主細胞は真菌であり、特に、その培養条件の容易さと多様性、利用可能な生化学及び細胞性突然変異体の多様性、その短い世代時間、及びその生活環（以下参照）のために、子嚢菌門（子嚢菌）の種である。好ましい真菌宿主細胞には、サッカロミセス、ピキア、ハンゼヌラ、シゾサッカロミセス、クライベロミセス、ヤローウィア、デバリオミセス、及びカンジダのような、ニューロスポラ属と様々な酵母のものが含まれる。最も好ましい種は、分子生物学の研究においておそらく最もよく知られていて、特徴付けられ、利用される真核宿主細胞系である、サッカロミセス・セレビシエ（パン酵母）である。
特別の態様において、真核宿主細胞は、細胞融合に適している（以下参照）。例えば、反対の接合型の酵母細胞は、「接合」して融合二倍体細胞を産生することができる。さらに、細胞融合に適した酵母プロトプラスト若しくはスフェロプラストも、本発明の目的に適した真核宿主細胞である。あるいは、培養で増殖する細胞（例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞等）も、当該技術分野で知られている（例えばセンダイウイルスや電流を使用する）方法により融合してよい。
ファージディスプレイ−真核ディスプレイ移行系
複雑な多重鎖ポリペプチドを真核宿主細胞の表面に表示する本発明の技術進歩は、ファージディスプレイ技術の力能とカップルさせることができる。例えば、本明細書に記載のファージディスプレイ−真核ディスプレイ移行系を利用することによって、実施者は、ファージディスプレイライブラリー及びファージディスプレイ技術により提供される膨大な多様性を、上記の多重鎖真核ディスプレイ技術により提供される細胞の発現、プロセシング、組立て、及びディスプレイと初めて組み合わせることができる。ファージディスプレイベクターと本発明の真核ベクターの間での核酸配列情報の移行は、当該技術分野で知られている多様な遺伝子移行法（例えば組換えＤＮＡ技術のような遺伝子工学技術）により達成することができる。好ましい移行の方式には、制限消化、ＰＣＲ増幅、又は相同組換えの技術が含まれる。
複雑な多重鎖ポリペプチドを真核宿主細胞の表面に表示する本発明の技術進歩は、ファージディスプレイ技術の力能とカップルさせることができる。例えば、本明細書に記載のファージディスプレイ−真核ディスプレイ移行系を利用することによって、実施者は、ファージディスプレイライブラリー及びファージディスプレイ技術により提供される膨大な多様性を、上記の多重鎖真核ディスプレイ技術により提供される細胞の発現、プロセシング、組立て、及びディスプレイと初めて組み合わせることができる。ファージディスプレイベクターと本発明の真核ベクターの間での核酸配列情報の移行は、当該技術分野で知られている多様な遺伝子移行法（例えば組換えＤＮＡ技術のような遺伝子工学技術）により達成することができる。好ましい移行の方式には、制限消化、ＰＣＲ増幅、又は相同組換えの技術が含まれる。
１つの態様において、本明細書に記載されて教示される真核／原核多重鎖ディスプレイシャトルベクターを利用する。本発明の二元ディスプレイベクターの遺伝子制御要素は、真核宿主細胞内で、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドの発現、プロセシング、組立て、及びディスプレイを二元ディスプレイベクターで形質転換された真核宿主細胞の表面に提供するだけでなく、原核宿主細胞内では、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドの発現、プロセシング、組立て、及びディスプレイを原核宿主細胞において感染したバクテリオファージの表面に提供する。
別の態様において、ファージディスプレイ−真核ディスプレイ移行系は、当該技術分野で知られている慣用のファージディスプレイベクター（即ち、ファージ粒子の表面に外来性ポリペプチドを表示するように工学処理されたバクテリオファージ）より切断した鎖コードポリヌクレオチドセグメントを、本発明の多重鎖真核ディスプレイベクターへ挿入し、それにより鎖コードセグメントの発現と、真核ディスプレイベクターで形質転換された真核宿主細胞の表面での生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドの真核プロセシング、組立て、及びディスプレイを可能にする。上記に記載のように、ファージディスプレイベクターから多重鎖真核ディスプレイベクターへのポリヌクレオチド配列の移行は、当該技術分野で知られているどの遺伝子工学技術でも達成してよい。２つの特に好ましい方法には、単一切断／挿入移行法と多重（又はモジュラー）切断／挿入移行法が含まれる。
単一切断／挿入移行法では、多重鎖ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドセグメントを（例えば制限消化により）ファージディスプレイベクターから単一の単体核酸として切断し、引き続き、多重鎖ディスプレイベクターへ挿入する。真核ディスプレイベクターへ挿入したならば、鎖コードポリヌクレオチドの間に位置する、望まれない原核性の遺伝子制御要素を、（もしあれば）真核性の遺伝子制御要素に置き換える。ファージディスプレイベクターから本発明の特に好ましい多重鎖酵母ディスプレイベクターへ移行させたＩｇ Ｆａｂ多重鎖ポリペプチドについて、この方法を図１に図解する。
あるいは、多重鎖ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドセグメントをファージディスプレイベクターから個別に切断し、そして引き続き、別個の独立したやり方で多重鎖ディスプレイベクターへ挿入する。このアプローチは、多重鎖ポリペプチドの個別の鎖を別々に、又はひとまとめに移行することに優るより強い制御と柔軟性を提供する。実際、実施者の関心とニーズに応じて、多重鎖ポリペプチドの選択された鎖だけを移行させるべきである。Ｉｇ Ｆａｂ多重鎖ポリペプチドについて、この方法を図２に図解する。
当該技術分野の実施者は、本明細書に記載されて教示されるファージディスプレイ−真核ディスプレイ移行系が、ファージディスプレイベクターから多重鎖真核ディスプレイベクターへ、又は多重鎖真核ディスプレイベクターからファージディスプレイベクターへ配列情報を移行しても同等に機能的である、即ち、本発明のこのファージディスプレイ−真核ディスプレイ移行系が有効にも二方向性であることを評価されよう。本発明に記載のファージディスプレイ−真核ディスプレイ移行系における使用に特に好ましいファージディスプレイライブラリーは、大量ヒトＦａｂ断片ライブラリー（de Haard, H. et al., 1999）である。
多重鎖真核ディスプレイライブラリーとそのスクリーニングプロトコール
本発明の多重鎖真核ディスプレイベクターと、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドが宿主細胞表面に表示されるように、これらのベクターで形質転換された宿主細胞は、ディスプレイライブラリーの産生に有用である。また、こうしたディスプレイライブラリーは、実施者の関心がある多様な生物活性をスクリーニングする、例えば、多様な標的分子のいずれかに対してスクリーニングして、その標的に特異的な結合ポリペプチドを同定するために、有用である。
本発明の多重鎖真核ディスプレイベクターと、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドが宿主細胞表面に表示されるように、これらのベクターで形質転換された宿主細胞は、ディスプレイライブラリーの産生に有用である。また、こうしたディスプレイライブラリーは、実施者の関心がある多様な生物活性をスクリーニングする、例えば、多様な標的分子のいずれかに対してスクリーニングして、その標的に特異的な結合ポリペプチドを同定するために、有用である。
数多くの多様な分子を宿主細胞又はファージの表面に発現させるいくつかの方法が存在する。ファージディスプレイライブラリーとそのスクリーニングは、強力な研究及び開発ツールの代表である。ファージディスプレイライブラリーを産生してスクリーニングする方法は、当該技術分野でよく知られ、使用されている（Hoogenboom, H. et al., 1997; Kay et al., 1996; Ladner, R. et al）。
本発明の多重鎖真核ディスプレイベクターを使用して、既知のファージディスプレイライブラリーに類似した、新規のペプチドライブラリーをｄｅ ｎｏｖｏ産生することができる。しかしながら、本明細書に記載のベクターは、真核系においてのみ達成することができる、適切にフォールドされ、組み立てられ、グリコシル化され、そして表示される多重鎖ポリペプチドのより効率的な発現を可能にする。次いで、これらの多重鎖真核ディスプレイライブラリーは、スクリーニングアッセイに使用することができる。当業者は、当該技術分野で知られているディスプレイライブラリースクリーニングプロトコール（例えばファージディスプレイスクリーニングアッセイ）を評価して、本発明の多重鎖真核ディスプレイライブラリーへ容易に適用するだろう。
新規の多重鎖真核ディスプレイライブラリーをｄｅ ｎｏｖｏ産生することに加え、さらに本発明は、実施者が既存のファージディスプレイライブラリーを本明細書に開示されて教示される多重鎖真核ディスプレイ系へ移行させることを可能にする。特に、ファージディスプレイ−真核ディスプレイ移行系は、ファージディスプレイライブラリーが多重鎖ポリペプチド（例えば軽鎖及び重鎖の成分を有するＦａｂ）のごく大量なレパートリーのディスプレイのために構築されることを可能にする。ファージディスプレイライブラリーは、ライブラリー中に＞１×１０８（好ましくは、＞１×１０９、より好ましくは＞１×１０１０）の異なる多重鎖ポリペプチドの多様性を有し得るが、初回スクリーニングを受けて、約１×１０７未満（好ましくは１×１０５〜１×１０６の間）のファージディスプレイ単離物のサブ集団を生じる場合がある。次いで、多重鎖ポリペプチド単離物の鎖をコードするポリヌクレオチドを、真核宿主への形質転換のために、本発明の多重鎖真核ディスプレイベクターへ「バッチ移行」させてよい。真核宿主細胞に表示される多重鎖ポリペプチドは、先に論じたような真核宿主系の培養条件及び発現特質（例えば、タンパク質フォールディング、多重鎖タンパク質における別個の鎖の適切な会合、グリコシル化、分泌、及び、細胞膜へのホスファチジルイノシトール連結のような翻訳後修飾）を利用して、さらにスクリーニングして操作することができる。さらに、多重鎖真核ディスプレイベクターへ挿入したならば、多重鎖ポリペプチドライブラリー（又はそれより予め選択した単離物）は、追加ラウンドのスクリーニングのためにさらに多様化（例えば、ポリペプチド鎖の組換え、再シャッフリング、又は再混合）してよい。
特に好ましい態様において：
ＡｐａＬＩ制限部位及びＡｓｃＩ制限部位により画定され、シグナル配列（例えばｐＩＩＩシグナル配列）に対して３’配向し、そしてＬａｃＺプロモーターの転写制御下にある、Ｉｇ軽鎖クローニング部位；及び
ＳｆｉＩ制限部位及びＮｏｔＩ制限部位により画定され、シグナル配列（例えばｐＩＩＩシグナル配列）に対して３’配向し、ＬａｃＺプロモーターの転写制御下にあり、そして成熟ｐＩＩＩをコードする配列又はｐＩＩＩの固着部分（断端）に対して５’配向する、Ｉｇ重鎖断片クローニング部位
を有するＭ１３ファージ発現ベクターが提供される。
ＡｐａＬＩ制限部位及びＡｓｃＩ制限部位により画定され、シグナル配列（例えばｐＩＩＩシグナル配列）に対して３’配向し、そしてＬａｃＺプロモーターの転写制御下にある、Ｉｇ軽鎖クローニング部位；及び
ＳｆｉＩ制限部位及びＮｏｔＩ制限部位により画定され、シグナル配列（例えばｐＩＩＩシグナル配列）に対して３’配向し、ＬａｃＺプロモーターの転写制御下にあり、そして成熟ｐＩＩＩをコードする配列又はｐＩＩＩの固着部分（断端）に対して５’配向する、Ｉｇ重鎖断片クローニング部位
を有するＭ１３ファージ発現ベクターが提供される。
この好ましい態様における多重鎖真核ディスプレイベクターは：
ＡｐａＬＩ制限部位及びＡｓｃＩ制限部位により画定され、Ａｇａ２ｐ分泌シグナルに対して３’配向し、そしてＧＡＬプロモーター（好ましくはＧＡＬ１又はＧＡＬ１−１０）の転写制御下にある、Ｉｇ軽鎖クローニング部位；及び
ＳｆｉＩ制限部位及びＮｏｔＩ制限部位により画定され、Ａｇａ２ｐ分泌シグナルに対して３’配向し、ＧＡＬプロモーター（好ましくはＧＡＬ１又はＧＡＬ１−１０）の転写制御下にあり、そして成熟Ａｇａ２ｐをコードする配列に対して３’配向する、Ｉｇ重鎖断片クローニング部位
を有する酵母ベクターである。
ＡｐａＬＩ制限部位及びＡｓｃＩ制限部位により画定され、Ａｇａ２ｐ分泌シグナルに対して３’配向し、そしてＧＡＬプロモーター（好ましくはＧＡＬ１又はＧＡＬ１−１０）の転写制御下にある、Ｉｇ軽鎖クローニング部位；及び
ＳｆｉＩ制限部位及びＮｏｔＩ制限部位により画定され、Ａｇａ２ｐ分泌シグナルに対して３’配向し、ＧＡＬプロモーター（好ましくはＧＡＬ１又はＧＡＬ１−１０）の転写制御下にあり、そして成熟Ａｇａ２ｐをコードする配列に対して３’配向する、Ｉｇ重鎖断片クローニング部位
を有する酵母ベクターである。
この酵母発現ベクターを使用して、酵母細胞表面に表示される抗体又はＦａｂ断片の発現のために酵母宿主細胞を形質転換する。軽鎖及び重鎖のコード配列は、ファージディスプレイベクターより個別に（それぞれ、ＡｐａＬＩ／ＡｓｃＩ消化及びＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ消化により）、又は一緒に（ＡｐａＬＩ／ＮｏｔＩ消化により）切断し、バッチ移行により多重鎖酵母ディスプレイベクターへ挿入し、酵母における発現及びディスプレイのために多数のＬＣ／ＨＣ鎖対合を得る。Ｆａｂの酵母ディスプレイに特に好ましい酵母ディスプレイベクターは、ｐＴＱ３（以下に記載）である。特に好ましいファージディスプレイは、大量ヒトＦａｂ断片ライブラリーである（de Haard, H. et al., 1999）。
当業者は、上記の方法が、様々な検出可能特性（例えば、触媒活性、ペプチド相互作用、熱安定性、望ましい発現レベル）又は、表示される多重鎖ポリペプチドの表面発現を介して選択可能である他の改善を保有する多重鎖ポリペプチドを同定して単離するのに有用であることを評価されよう。
さらに、本発明が、免疫精製、イムノアッセイ、細胞化学標識化、及びターゲッティング法に有用な抗体若しくは抗体断片の産生、そして診断若しくは療法の方法に使用可能であることを評価されよう。例えば、この抗体若しくは断片は、インターフェロンや、例えば、ＶＩＩＩ因子のような血液凝固因子のような治療上有効なタンパク質へ結合する場合があり、故に、タンパク質の免疫精製若しくはアッセイに使用のアフィニティークロマトグラフィー媒体を産生するのに使用することができる。
細胞融合の産物としての多重鎖ポリペプチドディスプレイ
真核細胞の基本的な生活環は、二倍体（生物の染色体若しくはゲノムが細胞に２コピーあること）と一倍体（生物の染色体若しくはゲノムが細胞に１コピーあること）状態との間の改変を伴う。この２つの状態間の改変は、単一の二倍体細胞を生ずる２つの一倍体細胞の融合（典型的には、必ずしも必然的ではないが、反対の接合型の受精）と、多数の一倍体（娘）細胞を生じる二倍体細胞の減数分裂により達成される。生物学者は、この基本的な生活環（即ち、一倍体世代と二倍体世代の改変）が遺伝情報の生物学的な組換え（即ち、有性生殖）の重要な天然の機序をもたらすと理解している。
真核細胞の基本的な生活環は、二倍体（生物の染色体若しくはゲノムが細胞に２コピーあること）と一倍体（生物の染色体若しくはゲノムが細胞に１コピーあること）状態との間の改変を伴う。この２つの状態間の改変は、単一の二倍体細胞を生ずる２つの一倍体細胞の融合（典型的には、必ずしも必然的ではないが、反対の接合型の受精）と、多数の一倍体（娘）細胞を生じる二倍体細胞の減数分裂により達成される。生物学者は、この基本的な生活環（即ち、一倍体世代と二倍体世代の改変）が遺伝情報の生物学的な組換え（即ち、有性生殖）の重要な天然の機序をもたらすと理解している。
ほとんどの動物では、二倍体状態が生活環の優勢な段階であり、これは反対の接合型の２つの一倍体細胞（通常、配偶子と呼ばれる）；精子及び卵子の融合により産生される。二倍体細胞の減数細胞分裂（配偶子形成）により、有性生殖のための一倍体細胞状態が産生される。
植物界の生活環様式は、より一般的な世代の改変を提供し、ここでは特別な植物種に応じて、一倍体及び二倍体の状態がより明瞭な世代として存在し得る。「低級」（即ち、より原始的な）植物では一倍体細胞の世代（「配偶体」）が優勢である（例えば、蘚類、苔類、及びツノゴケ類）のに対し、「高等」（即ち、より進化した）植物では、二倍体細胞の世代（「胞子体」）が優勢である（例えば、シダ、針葉樹、及び顕花植物）が優勢である。
多くの真菌及び原生生物では、一倍体段階の生活環が優勢である。受精によって二倍体段階になるが、これはしばしばほとんどすぐに（環境条件に依存して）減数分裂を行なって一倍体細胞を生じる。重要にも、そしてどの属の生物について論じているか、又はどの段階がその生物の生活環に優勢であるかに関わらず、一倍体細胞を産生する二倍体細胞の減数分裂と、（新たな遺伝的混合物の）二倍体細胞を産生する個々の一倍体細胞の細胞融合より生じる遺伝物質の天然の組換え及び再混合は、生物学的研究に利用可能である強力な方法である。本明細書において初めて記載されて教示される、この強力な機序を、ユニークな多重鎖ペプチドディスプレイライブラリーを産生するためのコンビナトリアルタンパク質研究に利用する。
本発明のさらなる側面において、真核多重鎖ディスプレイベクターを宿主細胞へ導入する方式には、２つの真核細胞、好ましくは一倍体の融合が含まれ、このそれぞれは、多重鎖ポリペプチドの生物活性が生じる宿主細胞、好ましくは二倍体の表面で現れるように、多重鎖ポリペプチド鎖の少なくとも１つを発現する。例えば、２つの一倍体細胞のそれぞれは、ベクターセット（上記に記載）のベクターの１つを含有し得るので、ひとたび結合して（例えば宿主細胞の細胞融合を介して）、生じる二倍体宿主細胞において同時発現されると、多重鎖ポリペプチドの生物活性がその宿主細胞の表面で現れる。こうした方法を使用して、上記のような新規の多重鎖ポリペプチドライブラリー（例えば、供給源のレパートリーより大きな多様性を有する多重鎖ポリペプチドを表示する二倍体細胞を含む、抗体若しくはＦａｂディスプレイライブラリー）を調製することができる。
あるいは、１つの真核発現ベクター集団が多数（例えば、レパートリー又はライブラリー）の形態のＩｇ Ｆａｂ軽鎖（ＶＬ及びＣＬドメインを含む）を発現し、第二の真核発現ベクター集団が、酵母アンカータンパク質（例えばＡｇａ２ｐ）へ融合した、多数の形態のＩｇ Ｆａｂ重鎖（ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む）を発現するように、適合ベクターセットの集団を構築してよい。このベクター集団のそれぞれを使用して、あるベクター構築体が一方の接合型であり、第二のベクター構築体が反対の接合型である、反対の接合型の一倍体酵母細胞を形質転換する。この２つの一倍体酵母集団を、２つの接合型の酵母接合（即ち、細胞融合）を誘導するのに十分な条件下で共存培養する。生じる二倍体酵母宿主細胞の集団は、両方のベクター構築体を保有し、完全に形成されて組み立てられたＩｇ Ｆａｂを発現して表示する。
しかしながら、上記に論じたように、本発明においては細胞融合の可能などの真核細胞も使用可能である。細胞融合は、接合により有性的に、又は人工的に、例えば組織培養や他の人工条件において起こり得る。有性細胞融合の場合、どの真核細胞も、それが一倍体状態と二倍体状態の両方で（どんなに短い間でも）存在することが可能である限りにおいて、好適である。人工的な細胞融合では、細胞は、有性融合の場合のように、倍数性により限定されない。例えば、組織培養において維持される二倍体哺乳動物細胞を、融合するように誘導してよく、それにより四倍体宿主細胞を生じる。本発明では、融合される宿主細胞の実際の倍数性は、それが融合し得る限りにおいて、限定をもたらさない。細胞の重要な特徴は、ある細胞パートナーが多重鎖ポリペプチドの特別な鎖と特定の選択可能マーカーを含むベクター若しくはベクターセットを含有し、そのパートナー宿主細胞が多重鎖ポリペプチドの第二鎖と選択可能マーカーを含むベクター若しくはベクターセットを含有することである。故に、細胞が融合するとき、生じる融合細胞は、選択可能マーカーにより容易に同定される細胞において、多重鎖ポリペプチドの２以上の鎖をコードするベクターを含有する。
真菌、特に子嚢菌（子嚢菌類；例えば、ニューロスポラと酵母）は、特に好ましい真核宿主細胞である。子嚢菌がそのように命名されるのは、それらが減数分裂の一倍体胞子産物を微視的な嚢中に産生し、それにより容易に採取、分離、解析、及び操作されるからである（ニューロスポラは、その子嚢の大きさ及び形状が減数分裂の一倍体細胞産物の状態（order）を維持するので、特に注目される）。また、上記の真菌、特にＳ．セレビシエは、一倍体と二倍体の両方の状態で安定的に存在し、そのいずれも容易に誘導されて維持される（例えば、酵母の一倍体状態は、典型的に、ある形式の栄養ストレス、即ち、飢餓の下で誘導されて維持される）。最後に、多くの真菌（やはり、特に好ましい酵母）において、一倍体細胞は２つの性（α及びａの接合型）として存在し、それから反対の接合型だけが融合（接合）して二倍体状態を生じる。当業者により作動可能な実験室の条件下では、α細胞がａ細胞へ融合して、それにより融合二倍体細胞を創出する。
上記に述べたように、細胞を融合する人工的な方法が当該技術分野で知られている。故に、本発明は、例えば、培養において増殖される哺乳動物、昆虫、又は植物細胞のような真核細胞に適している。さらに、酵母のプロトプラスト若しくはスフェロプラストを操作して、たとえそれらが同じ接合型であっても、細胞融合を起すことができる。こうした人工的な細胞融合の方法は、当該技術分野で知られていて、本発明の目的に好適であろう。
最後に、当該技術分野の実施者は、本明細書に記載されて例証される産物及び方法がある特別な倍数性の真核宿主細胞に限定されないことを認識されよう。実際、他の多倍数性生物（例えばより稀な三倍性及び四倍性の形態）を、より高次の多重鎖ポリペプチド（例えば、それぞれ、三本鎖及び四本鎖ポリペプチド）を発現する適合ベクターセットの宿主として特別に使用してよい。
真核細胞融合を使用する多重鎖ポリペプチドスクリーニング
真核宿主細胞上に表示される多重鎖ポリペプチドライブラリーは、当該技術分野で知られている手順及び技術、例えばファージディスプレイライブラリースクリーニングと同様にスクリーニングして操作することができるが、真核宿主系の培養条件及び発現特質を利用することも実施者に可能にする。上記に論じたように、真核ディスプレイスクリーニングは、初回ラウンドのファージディスプレイスクリーニングで始めた後で、ディスプレイライブラリーをファージディスプレイベクターから多重鎖真核ディスプレイベクターへ移行させることができる。多重鎖真核ディスプレイベクターへ挿入したならば、この多重鎖ポリペプチドライブラリー（又は予め選択した単離物）は、真核ディスプレイ系での１以上の追加ラウンドのスクリーニングへかけることができる。
真核宿主細胞上に表示される多重鎖ポリペプチドライブラリーは、当該技術分野で知られている手順及び技術、例えばファージディスプレイライブラリースクリーニングと同様にスクリーニングして操作することができるが、真核宿主系の培養条件及び発現特質を利用することも実施者に可能にする。上記に論じたように、真核ディスプレイスクリーニングは、初回ラウンドのファージディスプレイスクリーニングで始めた後で、ディスプレイライブラリーをファージディスプレイベクターから多重鎖真核ディスプレイベクターへ移行させることができる。多重鎖真核ディスプレイベクターへ挿入したならば、この多重鎖ポリペプチドライブラリー（又は予め選択した単離物）は、真核ディスプレイ系での１以上の追加ラウンドのスクリーニングへかけることができる。
本発明のスクリーニング方法のさらなる態様として、そして本発明の方法にユニークである、多重鎖真核ディスプレイライブラリーは、上記に論じたような真核系に特徴的な数世代の改変を利用するスクリーニングアッセイに引き続き、さらなる（偏性又は不偏性の）多様化を受ける場合がある。多重鎖の異なる鎖が異なるベクターから発現される（例えば、上記のように、二倍体宿主細胞が一倍体接合又は細胞融合の産物である）、多重鎖真核ディスプレイベクターを含有する二倍体真核宿主細胞の集団は、減数分裂（例えば酵母における胞子形成）を起すように誘導することができる。この一倍体酵母細胞（胞子）は、スクリーニング条件に依存して分離及び／又は選択することが可能であり、目的の好ましい特性をもった異なる真核発現ベクターを別個の一倍体娘細胞に単離することができる。次いで、娘細胞は、場合により：
ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば単離ＤＮＡ操作）又はｉｎ ｖｉｖｏ（例えばＵＶ光）で突然変異誘発（変形化）させ、予め選択された鎖の多数の相同体を提供する（これらの相同的な鎖が同時発現されて表示されると、同じ標的分子へのより大きなアフィニティーを有する相同の多重鎖ポリペプチドを選択することができる）；又は
他の娘宿主細胞とともに戻し融合させる（それにより、多重鎖ポリペプチド単離物の個別の予め選択された鎖をそれらの間で組換える）；又は
最初の多重鎖ライブラリー宿主細胞集団と融合させる（それにより、多重鎖ポリペプチド単離物の予め選択された鎖を多重鎖変異の元の供給源と組換える）；又は
新しい多重鎖ライブラリー宿主細胞集団と融合させる（それにより、多重鎖ポリペプチド単離物の予め選択された鎖を多重鎖変動性の新たな供給源と組み合わせる）；又は
上記工程のいずれかを適宜組み合わせることが可能である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば単離ＤＮＡ操作）又はｉｎ ｖｉｖｏ（例えばＵＶ光）で突然変異誘発（変形化）させ、予め選択された鎖の多数の相同体を提供する（これらの相同的な鎖が同時発現されて表示されると、同じ標的分子へのより大きなアフィニティーを有する相同の多重鎖ポリペプチドを選択することができる）；又は
他の娘宿主細胞とともに戻し融合させる（それにより、多重鎖ポリペプチド単離物の個別の予め選択された鎖をそれらの間で組換える）；又は
最初の多重鎖ライブラリー宿主細胞集団と融合させる（それにより、多重鎖ポリペプチド単離物の予め選択された鎖を多重鎖変異の元の供給源と組換える）；又は
新しい多重鎖ライブラリー宿主細胞集団と融合させる（それにより、多重鎖ポリペプチド単離物の予め選択された鎖を多重鎖変動性の新たな供給源と組み合わせる）；又は
上記工程のいずれかを適宜組み合わせることが可能である。
スクリーニングする多重鎖ポリペプチドの予め選択した鎖の、それらの間でか又は別の多重鎖多様性の供給源とのこの組換え、再シャッフリング、又は再混合が完了したならば、この新たな混合ライブラリー集団をさらなるラウンドの新規若しくは反復スクリーニングにかけることができる。
本発明は、分子生物学の分野でよく知られている技術をそのまま参照により組み込む。これらの技術には、限定されないが、以下の公表文献に記載の技術が含まれる：
Ausubel, F. et al. 監修、「分子生物学の簡略プロトコール（Short Protocols In Molecular Biology）」（第４版、１９９９年）、ジョンウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、ニューヨーク州（ＩＳＢＮ ０−４７１−３２９３８−Ｘ）。
Ausubel, F. et al. 監修、「分子生物学の簡略プロトコール（Short Protocols In Molecular Biology）」（第４版、１９９９年）、ジョンウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、ニューヨーク州（ＩＳＢＮ ０−４７１−３２９３８−Ｘ）。
Fink and Guthrie 監修、「酵母遺伝学及び分子生物学の手引き（Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology）（１９９１年）、アカデミックプレス、ボストン、マサチューセッツ州（ＩＳＢＮ ０−１２−１８２０９５−５）。
Kay et al.,「ペプチド及びタンパク質のファージディスプレイ：実験マニュアル（Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual）（１９９６年）、アカデミックプレス、サンディエゴ、カリフォルニア州。
Kabat, E. et al.,「免疫学的に興味深いタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」（第５版、１９９１年）、米国保健社会福祉省、ベテスダ、メリーランド州。
Lu and Weiner 監修、「遺伝子機能解析用のクローニング及び発現ベクター（Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis）」（２００１年）、バイオテクニックプレス、ウェストバラ、マサチューセッツ州（ＩＳＢＮ １−８８１２９９−２１−Ｘ）。
Old, R. and Primrose, S.,「遺伝子操作の原理：遺伝子工学入門（Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering）」（第３版、１９８５年）ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ、ボストン、マサチューセッツ州。「微生物学研究（Studies in Microbiology）」；第２巻：４０９（ＩＳＢＮ ０−６３２−０１３１８−４）。
Sambrook, J. et al. 監修、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」（第２版、１９８９年）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク、ニューヨーク州、１〜３巻（ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６）。
Winnacker, E.,「遺伝子からクローンまで：遺伝子技術入門（From Genes to Clones: Introduction to Gene Technology）（１９８７年）ＶＣＨパブリッシャーズ、ニューヨーク、ニューヨーク州（Horst Ibelgaufts による翻訳）（ＩＳＢＮ ０−８９５７３−６１４−４）。
参考文献
本発明を以下の実施例によりさらに例示する。これらは決して本発明を限定するものと解釈してはならない。
多重鎖真核ディスプレイベクター：ｐＴＱ３の構築
上記に記載されて参照により組み込まれる材料及び技術を使用して、多重鎖真核ディスプレイベクター；特に、該ベクターで形質転換される宿主酵母細胞中で有効な酵母ディスプレイベクターを構築した。該ベクターは、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチド（例えばＩｇ Ｆａｂ）を宿主酵母細胞の表面で発現、輸送、組立て、及び表示するのに有用である。
上記に記載されて参照により組み込まれる材料及び技術を使用して、多重鎖真核ディスプレイベクター；特に、該ベクターで形質転換される宿主酵母細胞中で有効な酵母ディスプレイベクターを構築した。該ベクターは、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチド（例えばＩｇ Ｆａｂ）を宿主酵母細胞の表面で発現、輸送、組立て、及び表示するのに有用である。
本実施例においては、市販のベクター、ｐＹＤ１（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）、単鎖タンパク質のＳ．セレビシエ細胞の表面での発現、分泌、及びディスプレイのために設計された５．０ｋｂの発現ベクターを出発の真核発現ベクター鋳型として使用した。ｐＹＤ１には：α−アグルチニン受容体のサブユニットの１つをコードするａｇａ２遺伝子；Ａｇａ２／ポリペプチド融合物の調節発現用のＧＡＬ１プロモーター；表示タンパク質の検出用のＨＡエピトープタグ；金属キレート樹脂での精製用のポリヒスチジン（６×Ｈｉｓ）タグ；酵母における安定したエピソーム複製用のＣＥＮ６／ＡＲＳ４；及びＳ．セレビシエ形質転換体選択用のＴｒｐＩ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）及びＥ．ｃｏｌｉ中での選択及び複製用のｐＭＢ１起点が含まれる。
ｐＹＤ１プラスミドを、２つのタンデムなガラクトース誘導プロモーターからのＩｇ軽鎖及び重鎖断片の発現、インタクトなＦａｂ抗体断片のディスプレイのために修飾した。一方のＧＡＬ１プロモーターが軽鎖の発現を指令し、他方のＧＡＬ１プロモーターは、Ａｇａ２ｐ酵母アンカータンパク質のＣ末端へ融合する重鎖断片の発現を指令する。
多重鎖ポリペプチド鎖をディスプレイベクターへ有効に移行させるために、このベクター構築体の一部としてユニークな制限部位を産生した。このベクター構築体のために選択した制限エンドヌクレアーゼ認識配列（即ち、制限部位）には、二本鎖ポリペプチド（この場合はＩｇ Ｆａｂ）の鎖にユニークなクローニング部位として、ＡｐａＬＩ、ＡｓｃＩ、ＳｆｉＩ、及びＮｏｔＩを含め、そして既存のファージディスプレイライブラリーとのファージディスプレイ−真核ディスプレイ移行を促進するためのＮｈｅＩを含めた。
いくつかのベクター配列修飾を作製して、ＡｐａＬＩをユニーク制限部位として有効に使用することを確実にした。１３９３、３０４７、及び４２９３位で始まる、ｐＹＤ１プラスミド（インビトロジェンにより供給される）上に位置するＡｐａＬＩ部位を位置指定突然変異誘発法（ＱＵＩＣＫＣＨＡＮＧＥ（ストラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア州）を使用する）により以下に示すように除去した：
３０４７位から始まるＡｐａＬＩ部位は、ａｍｐＲ内に存在し、この遺伝子のアミノ酸コード配列を変化させないようにするのにサイレント突然変異を必要とした。
多重鎖酵母ディスプレイベクター構築体を当該技術分野で知られている他のすでに存在しているファージディスプレイライブラリー（Ｄｙａｘ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）と適合させるために、当該技術分野で知られているＰＣＲ位置指定突然変異誘発技術を使用して、ｐＹＤ１ベクターのａｇａ２ｐシグナル配列へコード配列を改変せずにユニーク制限部位を導入した。特に、コドンＴＣＡをコドンＡＧＣで置き換えることによって、ａｇａ２ｐシグナル配列の末端セリンコドンの向こう側へＮｈｅＩ部位を創出した。
多重鎖酵母ディスプレイベクター構築体を当該技術分野で知られている他のすでに存在しているファージディスプレイライブラリー（Ｄｙａｘ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）と適合させるために、当該技術分野で知られているＰＣＲ位置指定突然変異誘発技術を使用して、ｐＹＤ１ベクターのａｇａ２ｐシグナル配列へコード配列を改変せずにユニーク制限部位を導入した。特に、コドンＴＣＡをコドンＡＧＣで置き換えることによって、ａｇａ２ｐシグナル配列の末端セリンコドンの向こう側へＮｈｅＩ部位を創出した。
このように修飾した、予め存在するＧＡＬ１プロモーター−ａｇａ２ｐシグナル配列−ＨＡタグセグメントの３’近傍にユニークＡｐａＬＩ部位を有し、それにＡｓｃＩ部位が続き、ａｇａ２ｐシグナル配列にＮｈｅＩ部位が取り込まれたベクターを、ｐＴＱ２と命名した。
当該技術分野で知られている組立てＰＣＲ技術を使用して、Ｆａｂの軽鎖成分の構造遺伝子を多重鎖酵母ディスプレイベクターへ切断する／挿入するための、既存のファージディスプレイライブラリーと適合するポリリンカーを構築した。設計されるポリリンカー部位を通ってａｐａ２ｐシグナル配列を網羅する、生じる中間的な多重鎖真核ディスプレイベクターセグメントは、以下の通りである（＊は、終止コドンを示す）：
ＭＡＴα転写ターミネーター配列をｐＹＤ１プラスミドからＰＣＲにより増幅し、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔ１制限部位を付けて上記のプラスミドｐＴＱ２へのクローニングを促進した。次いで、ＭＡＴαターミネーターをＢａｍＨＩ及びＰｓｔ１で消化して、プラスミドｐＴＱ２のＢａｍＨＩ／Ｐｓｔ１部位へ挿入した。
ＧＡＬ１プロモーター、ａｇａ２ｐシグナル配列、Ａｇａ２ｐタンパク質コード配列、及びグリシン／セリンリンカーを（５’−３’に）包含するＤＮＡ構築体をプラスミドｐＹＤ１から増幅した。ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限部位を含有するＤＮＡリンカーセグメントとｍｙｃタグをコードするセグメントを、増幅したｐＹＤ１セグメントの３’端で加えた。ｍｙｃタグを含めたのは、（多重鎖ポリペプチドの）固着鎖の酵母細胞表面での検出を可能にするためである。このリンカー−ｍｙｃセグメントの配列は以下の通りである：
このリンカー−ｍｙｃセグメントを、ＥｃｏＲＩ及びＰａｃＩ消化したｐＴＱ２へ挿入した。生じたプラスミドは、多重鎖ポリペプチド鎖（特に、Ｆａｂの軽鎖及び重鎖断片）の挿入／切断用のユニークなクローニング部位があり、ｐＴＱ３と命名した（図３）。プラスミドｐＴＱ３は５８１０ｂｐの多重鎖酵母ディスプレイプラスミドであり、関連部分において、以下のベクター配列を含む：
上記のベクターに対して、可溶性Ｆａｂ抗体精製用の６×Ｈｉｓタグを挿入し、終止コドン（ＴＡＡ）をｍｙｃタグの末端、ＰｓｔＩ部位の前に再配置することによって後の修飾を作製し、余分なアミノ酸を消失させた。他の修飾には、Ｔｒｐ選択マーカー内の内因性ＸｂａＩ制限部位の、位置指定突然変異誘発による除去が含まれた。これを行なったのは、Ｃｊライブラリーセット（Ｄｙａｘコーポレーション、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）由来のリード抗体のクローニング及び操作を促進するためである。
ファージディスプレイ−真核移行と、ストレプトアビジン、ムチン−１、及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４に特異的な多重鎖Ｆａｂポリペプチドの真核宿主細胞発現
異なるファージディスプレイＦａｂをファージディスプレイベクターから多重鎖真核ディスプレイベクターへ移行させ、ファージディスプレイ−真核ディスプレイ移行系の有用性と、本発明の多重鎖真核ベクターの多重鎖ポリペプチドを発現する能力を例証した。次いで、このベクターを真核宿主細胞へ挿入し、この形質転換した宿主細胞をＦａｂの発現に適した条件下で増殖させた。
異なるファージディスプレイＦａｂをファージディスプレイベクターから多重鎖真核ディスプレイベクターへ移行させ、ファージディスプレイ−真核ディスプレイ移行系の有用性と、本発明の多重鎖真核ベクターの多重鎖ポリペプチドを発現する能力を例証した。次いで、このベクターを真核宿主細胞へ挿入し、この形質転換した宿主細胞をＦａｂの発現に適した条件下で増殖させた。
抗ストレプトアビジンＦａｂ抗体、Ｆ２、Ａ１２、及び４Ｃ８を、大量のネーティブなヒトＦａｂライブラリー（de Haard, H. et al., 1999）から、対の軽鎖（ＶＬＣＬ）及び重鎖（ＶＨＣＨ１）として実施例１において構築した多重鎖酵母ディスプレイベクターｐＴＱ３へそれぞれクローニングした。さらに、抗ムチンＦａｂ抗体、ＰＨ１を、同じＦａｂライブラリーから、対の軽鎖（ＶＬＣＬ）及び重鎖（ＶＨＣＨ１）として、実施例１において構築した多重鎖酵母ディスプレイベクターｐＴＱ３へクローニングした。さらに、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）に特異的な４つの抗体、Ｅ７、Ｅ８、Ａ９、Ａ１１を、同じＦａｂライブラリーから、対の軽鎖（ＶＬＣＬ）及び重鎖（ＶＨＣＨ１）として、実施例１において構築した多重鎖酵母ディスプレイベクターｐＴＱ３へクローニングした。
Ｆａｂの鎖を、先に記載して図１に例示した単一切断／挿入移行法を使用して多重鎖酵母ディスプレイベクターへクローニングした。このＦａｂライブラリー由来のＬＣ−ＨＣポリヌクレオチドを単一のＡｐａＬＩ／ＮｏｔＩ断片として挿入した。このＬＣ及びＨＣ断片のコード領域に介在して、Ｆａｂライブラリー由来のＡｓｃＩ／ＳｆｉＩ制限断片により画定される望まれない原核遺伝子制御要素を、ｐＴＱ３より導かれるＡｓｃＩ／ＳｆｉＩ断片で置き換えた。
生じたプラスミドをｐＴＱ３−Ｆ２、ｐＴＱ３−Ａ１２、ｐＴＱ３−４Ｃ８、ｐＴＱ３−ＰＨ１、ｐＴＱ３−Ｅ７、ｐＴＱ３−Ｅ８、ｐＴＱ３−Ａ９、及びｐＴＱ３−Ａ１１と命名し、Gietz, D. et al., 1992 の方法に従って、Ｓ．セレビシエ菌株、ＥＢＹ１００（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）へ別々に形質転換した。ＥＢＹ１００は、対照として、多重鎖インサートを含有しない形質転換体、ｐＴＱ３でもあった。形質転換体の選択は、ベクターのトリプトファン栄養要求性マーカーを選択して実施した（トリプトファン（−）、２％（ｗ／ｖ）グルコース、２％アガー（ＳＤＣＡＡ＋ＧＡ）の合成規定培地）。
成功した形質転換体（対応して、「ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２」、「ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ａ１２」、「ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−４Ｃ８」、「ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−ＰＨ１」、「ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｅ７」、「ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｅ８」、「ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ａ９」、「ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ａ１１」、及び対照の「ＥＢＹ１００ｐＴＱ３」と命名した）を、１０ｍＬ ＳＤＣＡＡ＋Ｇにおいて振り混ぜながら３０℃で一晩増殖させた。ＯＤ６００が１．０に達したとき、２つの細胞の試料（例えば、ＯＤ６００が１．０である２ｍＬの培養物）を誘導時間が０に等しい点（Ｔ０）のタンパク質溶解液調製物として直ちに取り去った。翌日、培養物を遠心分離して、ペレットになった酵母細胞を１０ｍＬ ＳＤＣＡＡ，２％（ｗ／ｖ）ガラクトースに再懸濁してＯＤ６００を１とした。細胞を２０℃で増殖させ、４８時間の間、軽鎖及び重鎖のベクター発現を誘導した。次いで、培養した細胞を遠心分離して、１ｍＬ滅菌水で２回洗浄し、遠心分離用エッペンドルフ管へ移した。
細胞ペレットを２５０ｍＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液＋ジチオスレイトール（ＤＴＴ）に再懸濁した。４２５〜６００ミクロンのガラスビーズ（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）をメニスカスの真下に加え、この懸濁液を１分間、４回激しく撹拌した。激しく撹拌している間、懸濁液は氷上に保った。上清を新鮮な管へ移し、１００℃まで５分間加熱した。
タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ウェスタンブロットのためにニトロセルロース膜へ移した。抗ＨＡ抗体（１μｇ／ｍＬ）（Ｄａｋｏ，カーピンテリア、カリフォルニア州）を使用して軽鎖ポリペプチドの検出を実施した。重鎖−Ａｇａ２ｐ融合ポリペプチドの検出は、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（１μｇ／ｍＬ）を二次ウサギ抗マウスＨＲＰ抗体（Ｄａｋｏ，カーピンテリア、カリフォルニア州）と一緒に使用して実施した。免疫検出は、増強化学発光（アマーシャム−ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）により実施した。表示されたＦａｂの約３０ｋＤのＬＣ産物と約４５ｋＤのＨＣ−Ａｇａ２ｐ融合産物（Ｆ２及びＰＨ１；図４Ａ及び４Ｂ）を検出した。ガラクトースでの誘導前には、検出可能なＬＣやＨＣ−Ａｇａ２ｐ融合産物は検出されなかった（図４Ａ及び４Ｂを参照のこと）。
多重鎖ポリペプチドの真核宿主細胞での機能的な表面ディスプレイ
本発明の多重鎖真核ベクターの、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドを真核宿主細胞の表面に発現し、組み立て、そして適切に表示する能力の例証として、多重鎖真核ディスプレイベクターを真核宿主細胞へ挿入し、形質転換した宿主細胞を、Ｆａｂの宿主細胞の表面での発現及びディスプレイに適した条件下で増殖させた。
本発明の多重鎖真核ベクターの、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドを真核宿主細胞の表面に発現し、組み立て、そして適切に表示する能力の例証として、多重鎖真核ディスプレイベクターを真核宿主細胞へ挿入し、形質転換した宿主細胞を、Ｆａｂの宿主細胞の表面での発現及びディスプレイに適した条件下で増殖させた。
上記の実施例２に記載のように、酵母クローンのＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２、ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−ＰＨ１、ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｅ７、ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｅ８、ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ａ９、及びＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ａ１１を調製し、培養し、抗体発現を誘導した。ガラクトースでの誘導に先立って、ＯＤ６００が１．０である酵母細胞の３つの０．２ｍＬアリコートをＴ０点として取り去った。
ガラクトースで発現を誘導した（実施例２）後で、ＯＤ６００が１．０である細胞のさらに３つの０．２ｍＬアリコートを取り去った。酵母試料を遠心分離し、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含有するＰＢＳに細胞ペレットを再懸濁した。
２つの試料を再び遠心分離し、細胞ペレットを１００ｍＬの抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（試料につき２．５μｇ）又は１００ｍＬの抗ＨＡ抗体（試料につき２．０μｇの抗体）のいずれかに再懸濁した。次いで、この試料を室温で１時間インキュベートし、細胞をペレットにして、０．５ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡで１回洗浄した。次いで、この試料をＦＩＴＣ結合ウサギ抗マウス抗体（１：４０希釈）とともに暗所で１時間インキュベートした。
細胞試料をＰＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中のストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（１：２０希釈）で標識し、暗所において室温で一晩インキュベートした。すべての試料を遠心分離し、細胞ペレットを０．５ｍＬ ＰＢＳで１回洗浄してから、５００ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。
細胞表面に結合したＦａｂ−抗原結合の存在をフローサイトメトリーにより検出した。誘導前の細胞は、軽鎖、重鎖、機能的なストレプトアビジン結合Ｆａｂ抗体のディスプレイをいずれも示さなかった。Ｆａｂ発現の誘導後、免疫蛍光法（図４Ｃ）、ＦＡＣＳ（図５Ａ〜Ｃ）、及び酵母全細胞ＥＬＩＳＡ（図６、実施例７を参照のこと）により、酵母細胞がＬＣ、ＨＣ、さらに機能的なストレプトアビジン結合Ｆａｂ抗体も表示していることを検出することができた。抗ＣＴＬＡ−４ Ｆａｂ抗体の機能的なディスプレイも例証された（データ示さず）。
ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２及びＥＢＹ１００ｐＴＱ３−ＰＨ１の場合、ＦＡＣＳにより検出されるような抗原結合は、非標識の可溶性抗原を用いて完了することができた。競合結合により、酵母細胞表面に表示されるコンビナトリアルに組み立てられたＦａｂ抗体の完全な特異性が示された（図５Ｃ）。
Ｆａｂ表示酵母細胞の選択濃縮：磁気ビーズ選択による検出
抗原特異的Ｆａｂ抗体を表示する酵母細胞を過剰な非関連酵母細胞に対して濃縮することができることを例証するために、自動磁気ビーズ選択装置を使用してモデル選択実験を実施した。
抗原特異的Ｆａｂ抗体を表示する酵母細胞を過剰な非関連酵母細胞に対して濃縮することができることを例証するために、自動磁気ビーズ選択装置を使用してモデル選択実験を実施した。
Ｆａｂ表示酵母細胞、ＥＢＹ１００ｐＴ−Ｆ２（トリプトファン栄養要求性選択マーカーがある）を非特異的な酵母細胞と様々な比率で混合した。この非特異的酵母細胞はＥＢＹ１００ｐＵＲ３８６７（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＶＬａａｒｄｉｎｇｅｎ，オランダ）からなり、ムチン−１（ＰＨ１）に特異的なｓｃＦｖ抗体をコードし、ロイシン栄養要求性選択マーカーを担っていた。選択の前後でのＬｅｕ＋／Ｔｒｐ＋細胞の比率を使用して、１ラウンドの選択の後で濃縮率を算出した。
実施例２に記載のように、酵母クローンを増殖させ、抗体発現をガラクトースで誘導した。この２種の酵母クローンを上記に示した比率で混合し、最終容量１ｍＬの２％リン酸緩衝化生理食塩水（例えば、２％ ＭＡＲＶＥＬ−ＰＢＳ又は「ＭＰＢＳ」，Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｒａｎｄｓ社、イギリス）において１００μＬのストレプトアビジン常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｍ２８０，Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，オスロ、ノルウェー）とともに１時間インキュベートした。
酵母−ビーズ混合物のインキュベーションの後で、この細胞−ビーズ複合体を、自動磁気ビーズ選択装置において１つのウェルから次のウェルへこの複合体を移すことによって、２％ ＭＰＢＳ中で１１サイクルの間洗浄した。２％ ＭＰＢＳ洗浄の後で、ＰＢＳを用いてさらに２回の洗浄工程を実施した。自動磁気ビーズ選択装置の最終ウェル中で、この細胞−ビーズ複合体を１ｍＬ ＰＢＳにおいて再懸濁し、ＳＤＣＡＡ＋Ｇアガープレート上でプレート培養することによるか、又はロイシンドロップアウト含有２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有する合成規定培地＋２％アガー（ＳＤ−Ｌｅｕ＋Ｇアガープレート）を用いて力価を決定した。磁気活性化細胞分取法（ＭＡＣＳ）による選択のために、酵母細胞を６ｍＬ ＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ中の５００μＬストレプトアビジン・マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，ケルン、ドイツ）とともに室温で１時間インキュベートした。この細胞／ビーズ混合物を磁石の存在下に洗浄済みＬＣカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，ケルン、ドイツ）上にロードし、このカラムをＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡで２回洗浄した。磁石を外した後で、結合した酵母細胞を６ｍＬ ＰＢＳ緩衝液で溶出させた。
キャピラリー洗浄装置（ＣＷＤ）を使用する酵母選択では、酵母細胞混合物と１００μＬのストレプトアビジンコート常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｍ２８０）を１ｍＬの２％ ＰＢＳにおいて１時間ブロックした。常磁性ビーズを１ｍＬの酵母細胞懸濁液に再懸濁し、エッペンドルフ管において室温で１時間穏やかに回転させた。この酵母細胞のストレプトアビジンコート常磁性ビーズとのインキュベーションの後で、この混合物をＣＷＤのキャピラリーへ導入した（５回の２００μＬ工程で１つのキャピラリーにロードするのに１ｍＬを使用した）。自動洗浄と酵母−ビーズ混合物の再懸濁の後で、ＰＢＳで最終洗浄を実施し、磁石を調整することによって酵母／ビーズ複合体を採取した。
２つの選択可能マーカーの使用は、特異酵母（トリプトファン（−）選択アガープレートで増殖することができる）の非特異酵母（ロイシン（−）選択アガープレートで増殖することができる）からの識別を可能にした。各力価のコロニー形成単位（ＣＦＵ）数を記録した。
濃縮率は、選択の前後での特異酵母細胞の比率を選択の前後での非特異酵母の比率で割ったものとして算出した。
表１に示すように、ストレプトアビジンに対するＦａｂ抗体を表示する特異酵母細胞は、Ｋｉｇｆｉｓｈｅｒ，キャピラリー洗浄装置、又は磁気活性化細胞分取法（ＭＡＣＳ）のような自動磁気ビーズ選択装置における１ラウンドの選択により、非関連酵母細胞に対して２〜６次数の大きさで濃縮することができる。
Ｆａｂ表示酵母細胞の選択濃縮：フローサイトメトリーによる検出
上記実施例４の磁気ビーズ検出法に代わるものとして、過剰の非関連酵母細胞に対する抗原特異的Ｆａｂ抗体の濃縮を、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）技術を使用して例証した。
上記実施例４の磁気ビーズ検出法に代わるものとして、過剰の非関連酵母細胞に対する抗原特異的Ｆａｂ抗体の濃縮を、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）技術を使用して例証した。
Ｆａｂ表示酵母細胞、ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２（トリプトファン栄養要求性選択マーカーを有する）を、Ｌｅｕ栄養要求性マーカーを担う非特異酵母細胞、ＥＢＹ１００（ｐＵＲ３８６７−ＰＨ１）と１：１００、１：１０００、及び１：１０，０００の比率で混合した。この酵母細胞混合物を１μＭストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ，カーピンテリア、カリフォルニア州）とともにインキュベートし、室温で３０分間平衡化した。
３０００個の細胞をフリーサイトメトリーにより分取し、最高の蛍光シグナルを有する６．５％の細胞を採取した。選択の前及び後の酵母細胞を、ＳＤＣＡＡ＋ＧアガープレートとＳＤ−Ｌｅｕ＋Ｇアガープレートでプレート培養し、ＣＦＵの数を決定した。濃縮率は、ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２及びＥＢＹ１００ｐＵＲ３８６７−ＰＨ１のアウトプット比率をそのインプット比率で割った比率として算出した。
１ラウンドのＦＡＣＳの後で、ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２は、ＥＢＹ１００ｐＵＲ３８６７−ＰＨ１に対して１０倍濃縮した（データ示さず）。
ファージディスプレイ抗体ライブラリーの多重鎖真核ディスプレイベクターへのバッチ移行
ファージディスプレイペプチドライブラリーを本発明の多重鎖真核ディスプレイベクターへひとまとめに移行させるファージディスプレイ／真核ディスプレイ移行系の有用性の例証として、当該技術分野で知られている技術を使用して調製したファージディスプレイＦａｂライブラリーを、上記の実施例１に記載のように産生した多重鎖酵母ディスプレイベクターｐＴＱ３へ移行させた。
ファージディスプレイペプチドライブラリーを本発明の多重鎖真核ディスプレイベクターへひとまとめに移行させるファージディスプレイ／真核ディスプレイ移行系の有用性の例証として、当該技術分野で知られている技術を使用して調製したファージディスプレイＦａｂライブラリーを、上記の実施例１に記載のように産生した多重鎖酵母ディスプレイベクターｐＴＱ３へ移行させた。
ファージディスプレイレパートリーを多重鎖酵母ディスプレイベクターへ移行させるために、先に記載して図１に例示した単一切断／挿入移行法を使用した（実施例１も参照のこと）。
５０ｍＬのＴＹＡＧ培養物（ＴＹ，アンピシリン１００μｇ／ｍＬ，グルコース２％）に、ファージへクローニングしたネーティブＦａｂライブラリーの１ラウンドのストレプトアビジン選択に由来する、１０μＬのグリセロールストックを接種した（de Haard, H. et al., 1999）。この培養物を３７℃で一晩増殖させ、プラスミドＤＮＡを調製した（ＱＩＡＧＥＮ プラスミド精製システム、Ｑｉａｇｅｎ，バレンシア、カリフォルニア州）。
Ｆａｂ抗体レパートリーをＡｐａＬＩ及びＮｏｔＩで消化し、約１．５ｋｂのＦａｂ抗体断片を回収し、１．０％ ＴＢＥ 臭化エチジウムアガロースゲル（ＱＩＡＥＸゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ，バレンシア、カリフォルニア州）からの抽出により精製した。
同様に、多重鎖酵母ディスプレイベクター、ｐＴＱ３をＡｐａＬＩ及びＮｏｔＩで消化し、約４．６ｋｂの断片を、１．０％ ＴＢＥ 臭化エチジウムアガロースゲルからの抽出により精製した。
Ｆａｂライブラリーから回収したＦａｂ抗体インサートの、ＡｐａＬＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＴＱ３プラスミドへのライゲーションを、１μｇ Ｆａｂ断片と０．７μｇ ｐＴＱ３ベクターを使用して４：１（インサート−ベクター）の比率で、１００μＬの反応液において１６℃で一晩実施した。このライゲーション混合物をフェノール、クロロホルム、及びイソアミルアルコール（ＰＣＩ）抽出により精製し、引き続き、１００％エタノールで沈殿させた。
ＢｉｏＲａｄ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ，カリフォルニア州）を２．５ｋＶ，２５ｍＦ及び２００Ｗで使用するエレクトロポレーションにより、精製したライゲーション混合物でＥ．ｃｏｌｉ菌株、ＴＧ１（オランダ細菌培養コレクション、ＰＣ４０２８、ユトレヒト、オランダ）を形質転換した。このライブラリーを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと２％ ｗ／ｖ グルコースを含有する、２×ＴＹアガープレート（バクト−トリプトン １６ｇ／Ｌ，酵母エキス １０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，バクト−アガー １５ｇ／Ｌ）（ＴＹＡＧプレート）上に置いた。３７℃で一晩の増殖の後で、プレートに多量の水を注ぐことによって、このレパートリーを２×ＴＹ培地＋アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）に回収し、１５％（ｗ／ｖ）グリセロールにアリコートで凍結した。
このライブラリーは、５．６×１０６の独立クローンを含有した。５．４×１０１０細胞／ｍＬのライブラリー懸濁液の１５μＬを使用して１００ｍＬのＴＹＡＧに接種し、この培養物を３７℃で一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを上記に記載のように回収した。
次いで、中間のｐＴＱ３−ＦａｂレパートリーをＡｓｃＩとＳｆｉＩで消化した。約６．１ｋｂの断片を上記のように精製した。供給源ベクターのｐＴＱ３もＡｓｃＩとＳｆｉＩで同様に消化し、約１１５０ｂｐの断片を精製した。
上記の精製した１１５０ｂｐ断片を、ＡｓｃＩ及びＳｆｉで消化したｐＴＱ３−Ｆａｂレパートリーと、１．６μｇインサートと１μｇベクターを使用して６：１（インサート−ベクター）の比率で連結した。このライゲーション混合物を精製し、上記に記載のようにＥ．ｃｏｌｉ菌株、ＴＧ１を形質転換して、１×１０６の独立クローンからなる最終のｐＴＱ３−Ｆａｂライブラリーを得た。
このライブラリーを上記に記載のようにプレートから回収し、１０ｍＬを５０ｍＬ ＴＹＡＧに接種し、３７℃で一晩増殖させた。Gietz, D. et al., (1992) の方法によりプラスミドＤＮＡをｐＴＱ３−Ｆａｂライブラリーより調製し、酵母菌株、ＥＢＹ１００を形質転換させ、２×１０６の独立した酵母クローンの酵母の最終ライブラリーサイズを得た。
バッチ移行された真核ディスプレイＦａｂライブラリーの選択：磁気ビーズ選択による検出
Ｆａｂ抗体の多様なレパートリーを表示する酵母細胞の集団からの選択を酵母ディスプレイＦａｂライブラリーが行なうことができることを例証するために、自動磁気ビーズ選択装置を使用して、多重選択実験を実施した。
Ｆａｂ抗体の多様なレパートリーを表示する酵母細胞の集団からの選択を酵母ディスプレイＦａｂライブラリーが行なうことができることを例証するために、自動磁気ビーズ選択装置を使用して、多重選択実験を実施した。
実施例６において調製した酵母レパートリーをＳＤＣＡＡ＋Ｇにおいて３０℃で増殖させ、ガラクトースで（実施例４のように）抗体発現を誘導した。酵母細胞のプールを、１ｍＬ ２％ ＭＰＢＳの最終容量において１００μＬのストレプトアビジン常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｍ２８０，Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，オスロ、ノルウェー）とともに１時間インキュベートした。
酵母−ビーズ混合物のインキュベーションの後で、この細胞−ビーズ複合体を、自動磁気ビーズ選択装置において１つのウェルから次のウェルへこの複合体を移すことによって、２％ ＭＰＢＳ中で１１サイクルの間洗浄した。２％ ＭＰＢＳ洗浄の後で、ＰＢＳを用いてさらに２回の洗浄工程を実施した。自動磁気ビーズ選択装置の最終ウェル中で、この細胞−ビーズ複合体を１ｍＬ ＰＢＳにおいて再懸濁し、ＳＤＣＡＡ＋Ｇアガープレート上でプレート培養することにより、選択の前後で酵母コロニー力価を決定した。次いで、選択した酵母細胞を使用して１０ｍＬ ＳＤＣＡＡ＋Ｇの新鮮培養物に接種し、第二ラウンドの選択を上記のように実施した。
第一ラウンドの選択の後と第二ラウンドの選択の後で、酵母全細胞ＥＬＩＳＡにより陽性及び陰性クローンの比率を決定した。９６穴プレート（コーニング・コスター、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）において、１００ｍＬ ＳＤＣＡＡ＋２％（ｗ／ｖ）ガラクトース中で細胞を増殖させて誘導した。
誘導後、細胞をＰＢＳで１サイクル洗浄し、抗原結合及び重鎖ディスプレイの検出のために２つのプレートに等しく分割した。第一のプレートにおいては、抗原結合を検出するために、抗ストレプトアビジン−ＨＲＰ（０．８７μｇ／ｍＬ）を含有する１００μＬ ＰＢＳに細胞を再懸濁した。第二のプレートの細胞は、重鎖ディスプレイを検出するために、抗ｃ−Ｍｙｃ（１μｇ／ｍＬ）を含有する１００μＬ ２％ ＭＰＢＳに再懸濁した。
１時間のインキュベーションの後で、細胞をＰＢＳで２サイクル洗浄し、この細胞を１００μＬ ＴＭＢ溶液に再懸濁することにより、特異結合の定量を行なった。呈色の後で、５０μＬ ２Ｎ硫酸を加えることによって反応を止めた。遠心分離により細胞をペレットにし、１００μＬの上清を柔軟な９６穴プレート（ファルコン、ＢＤバイオサイエンス、ベッドフォード、マサチューセッツ州）へ移し、４５０ｎｍでの吸光度を記録した。重鎖検出では、ウサギ抗マウスＨＲＰ（１：１０００）を含有する１００μＬ ２％ ＭＰＢＳを各ウェルへ加えた。１時間のインキュベーションの後で、上記に記載のように、細胞を２サイクル洗浄して重鎖ディスプレイを検出した。この結果を表３に提示する。
１ラウンドの選択の後で、抗原結合をスクリーニングした酵母クローンの２０％が陽性であることを見出し、第二ラウンドの選択後、抗原反応性の酵母クローンの数は１００％であった。
抗ストレプトアビジン表示酵母細胞のアフィニティー選択：フローサイトメトリーによる検出
別のアフィニティー識別実験において、クローンのＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２及びＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ａ１２／ｐＥＳＣは、Ｌｅｕ栄養要求性マーカーを担う空きベクター、ｐＥＣＳ（ストラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア州）を含有する。抗ストレプトアビジン抗体のＦ２は、プラスモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）により定量されるように５４ｎＭのアフィニティーを有し、抗ストレプトアビジン抗体のＡ１２は、約５００ｎＭのアフィニティーを有する。これら２つのクローンを一晩増殖させ、ＳＤＣＡＡ＋２％（ｗ／ｖ）ガラクトースにおいて１．０のＯＤ６００まで希釈し、２０℃で４８時間増殖させた。高アフィニティー抗体含有クローン（ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２）と低アフィニティー抗体含有クローン（ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ａ１２／ｐＥＳＣ）のクローンを約１：１００の比率で混合した。各クローン中に存在する異なる選択可能マーカーを使用することにより、ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ａ１２／ｐＥＳＣ（トリプトファン（−）、ロイシン（−）選択アガープレートで増殖することができる）をＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２（トリプトファン（−）選択アガープレートでしか増殖し得ない）から識別することが可能になる。この細胞混合物を、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、及び１０ｎＭのストレプトアビジン−ＦＩＴＣの系列希釈液を用いる以外は、前と同じように標識した。ＬＣディスプレイと抗原結合の両方に基づいて、ＥＰＩＣ ＡＬＴＲＡ（ベックマン・コールター、フラートン、カリフォルニア州）においてフローサイトメトリーにより細胞を分取した。分取速度を２０００細胞／秒に設定し、ＦＩＴＣ／ＰＥの最高比率を有する細胞集団の１％を採取するように分取ゲートを設定した（典型的なＦＡＣＳヒストグラムを図７に示す）。異なる抗原濃度での選択後のインプット細胞とアウトプット細胞について選択プレートで力価検定し、コロニーの数を合計して濃縮率とより高いアフィニティークローンの回収率を算出した（表４）。上記の結果は、より高いアフィニティーのクローンがフローサイトメトリー分取法により選好的に回収され得ることと、Ｋｄ＝５４ｎＭと約５００ｎＭのＫｄである２つの抗体の混合物では最適抗原濃度が１００ｎＭと２５ｎＭの間にあることを例証する。
別のアフィニティー識別実験において、クローンのＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２及びＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ａ１２／ｐＥＳＣは、Ｌｅｕ栄養要求性マーカーを担う空きベクター、ｐＥＣＳ（ストラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア州）を含有する。抗ストレプトアビジン抗体のＦ２は、プラスモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）により定量されるように５４ｎＭのアフィニティーを有し、抗ストレプトアビジン抗体のＡ１２は、約５００ｎＭのアフィニティーを有する。これら２つのクローンを一晩増殖させ、ＳＤＣＡＡ＋２％（ｗ／ｖ）ガラクトースにおいて１．０のＯＤ６００まで希釈し、２０℃で４８時間増殖させた。高アフィニティー抗体含有クローン（ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２）と低アフィニティー抗体含有クローン（ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ａ１２／ｐＥＳＣ）のクローンを約１：１００の比率で混合した。各クローン中に存在する異なる選択可能マーカーを使用することにより、ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ａ１２／ｐＥＳＣ（トリプトファン（−）、ロイシン（−）選択アガープレートで増殖することができる）をＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２（トリプトファン（−）選択アガープレートでしか増殖し得ない）から識別することが可能になる。この細胞混合物を、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、及び１０ｎＭのストレプトアビジン−ＦＩＴＣの系列希釈液を用いる以外は、前と同じように標識した。ＬＣディスプレイと抗原結合の両方に基づいて、ＥＰＩＣ ＡＬＴＲＡ（ベックマン・コールター、フラートン、カリフォルニア州）においてフローサイトメトリーにより細胞を分取した。分取速度を２０００細胞／秒に設定し、ＦＩＴＣ／ＰＥの最高比率を有する細胞集団の１％を採取するように分取ゲートを設定した（典型的なＦＡＣＳヒストグラムを図７に示す）。異なる抗原濃度での選択後のインプット細胞とアウトプット細胞について選択プレートで力価検定し、コロニーの数を合計して濃縮率とより高いアフィニティークローンの回収率を算出した（表４）。上記の結果は、より高いアフィニティーのクローンがフローサイトメトリー分取法により選好的に回収され得ることと、Ｋｄ＝５４ｎＭと約５００ｎＭのＫｄである２つの抗体の混合物では最適抗原濃度が１００ｎＭと２５ｎＭの間にあることを例証する。
誤りがちのＰＣＲにより多様化される酵母表示ライブラリーの構築
新規の多重鎖ディスプレイベクターライブラリーを産生する能力を例証するために、ストレプトアビジンに特異的なＦａｂ抗体、Ｆ２を誤りがちの（error prone）ＰＣＲにかけた。別々のＬＣ、ＨＣと全Ｆａｂ抗体を酵母ディスプレイベクターへクローニングした。誤りがちのＰＣＲを、２．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２と０．３７５ｍＭ ＭｎＣｌ２の存在下に３０サイクルの間実施した。精製した産物を、実施例２のように、ＬＣ、ＨＣ、及び全Ｆａｂ断片に対応するＡｐａＬ１／ＡｓｃＩ断片、Ｓｆｉ１／Ｎｏｔ１断片、又はＡｐａＬ１／Ｎｏｔ１断片としてｐＴＱ３酵母ディスプレイベクターへクローニングした。このライゲーション混合物でＥ．ｃｏｌｉを形質転換して、アンピシリン １００μｇ／ｍＬを含有する選択アガープレートで増殖させ、５×１０６のＬＣレパートリー（ｐＴＱ３Ｆ２−ＬＣｅｐと命名）、５．６×１０８のＨＣレパートリー（ｐＴＱ３Ｆ２−ＨＣｅｐと命名）、及びｐＴＱ３Ｆ２−Ｆａｂｅｐの全Ｆａｂレパートリーを得た。これらのレパートリーを採取し、２００ｍＬの接種液（少なくとも１０倍のライブラリー多様性を含むのに十分である）を作製した。２００ｍＬ培養物よりプラスミドＤＮＡを単離し、実施例２に記載のように酵母菌株、ＥＢＹ１００へ形質転換した。生じたレパートリーを、ＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−ＬＣｅｐ（サイズ＝５×１０６）；ＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−ＨＣｅｐ（サイズ＝１．７×１０６）；ＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−Ｆａｂｅｐ（サイズ＝１０６）と命名した。ヌクレオチドレベルでの突然変異頻度は、ＬＣで１．５％、ＨＣで０．８％であった。アミノ酸レベルでの突然変異頻度は、ＬＣで３％、ＨＣで１．３％であった。
新規の多重鎖ディスプレイベクターライブラリーを産生する能力を例証するために、ストレプトアビジンに特異的なＦａｂ抗体、Ｆ２を誤りがちの（error prone）ＰＣＲにかけた。別々のＬＣ、ＨＣと全Ｆａｂ抗体を酵母ディスプレイベクターへクローニングした。誤りがちのＰＣＲを、２．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２と０．３７５ｍＭ ＭｎＣｌ２の存在下に３０サイクルの間実施した。精製した産物を、実施例２のように、ＬＣ、ＨＣ、及び全Ｆａｂ断片に対応するＡｐａＬ１／ＡｓｃＩ断片、Ｓｆｉ１／Ｎｏｔ１断片、又はＡｐａＬ１／Ｎｏｔ１断片としてｐＴＱ３酵母ディスプレイベクターへクローニングした。このライゲーション混合物でＥ．ｃｏｌｉを形質転換して、アンピシリン １００μｇ／ｍＬを含有する選択アガープレートで増殖させ、５×１０６のＬＣレパートリー（ｐＴＱ３Ｆ２−ＬＣｅｐと命名）、５．６×１０８のＨＣレパートリー（ｐＴＱ３Ｆ２−ＨＣｅｐと命名）、及びｐＴＱ３Ｆ２−Ｆａｂｅｐの全Ｆａｂレパートリーを得た。これらのレパートリーを採取し、２００ｍＬの接種液（少なくとも１０倍のライブラリー多様性を含むのに十分である）を作製した。２００ｍＬ培養物よりプラスミドＤＮＡを単離し、実施例２に記載のように酵母菌株、ＥＢＹ１００へ形質転換した。生じたレパートリーを、ＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−ＬＣｅｐ（サイズ＝５×１０６）；ＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−ＨＣｅｐ（サイズ＝１．７×１０６）；ＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−Ｆａｂｅｐ（サイズ＝１０６）と命名した。ヌクレオチドレベルでの突然変異頻度は、ＬＣで１．５％、ＨＣで０．８％であった。アミノ酸レベルでの突然変異頻度は、ＬＣで３％、ＨＣで１．３％であった。
抗ストレプトアビジン表示酵母細胞ライブラリーのアフィニティー選択：フローサイトメトリーによる検出
多重鎖酵母ディスプレイライブラリーのアフィニティー選択を例証するために、ライブラリーのＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−ＬＣｅｐ；ＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−ＨＣｅｐ、及びＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−Ｆａｂｅｐの一晩培養物を実施例２のように調製し、ＳＤＣＡＡ＋２％（ｗ／ｖ）ガラクトースを含有する選択培地で１．０のＯＤ６００まで希釈し、２０℃で４８時間増殖させた。このレパートリーを抗ＨＡ ｍＡｂ（２５μｇ／ｍＬ）を用いて室温で１時間標識した後で、ウサギ抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣ（１：４０希釈）と６ｎＭストレプトアビジンＰＥを室温で１時間用いる第二のインキュベーション工程を続けた。それぞれのインキュベーション工程に続いて細胞を０．５ｍＬ ＰＢＳで一回洗浄し、最終洗浄の後で細胞を氷上に保ち抗原解離を妨げた。ＥＰＩＣ ＡＬＴＲＡフローサイトメーターにおいて２０００細胞／秒の分取速度で試料を分取した。濃縮形式において第一の分取ラウンドを行い、ゲートに入る細胞の集団を、ＬＣディスプレイと抗原結合の両方に基づいて採取するように、分取ゲートを設定した。採取される細胞の比率は選択ラウンドの継続とともに減少し、レパートリーの多様性の低下を説明した（図８Ａ）。次いで、実施例２のように、採取した細胞をＳＤＣＡＡ＋（ｗ／ｖ）グルコースにおいて３０℃で１．０のＯＤ６００まで増殖させた後で、ガラクトースで誘導した。分取ゲートが減少する純粋方式（purity mode）で行なうラウンド２及び３で選択を繰り返した（表５）。異なる抗原濃度でもポリクローナルＦＡＣＳ分析を実施し、ＬＣディスプレイと抗原結合活性の両方のＦＡＣＳヒストグラムを図８Ｂに示す。
多重鎖酵母ディスプレイライブラリーのアフィニティー選択を例証するために、ライブラリーのＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−ＬＣｅｐ；ＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−ＨＣｅｐ、及びＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−Ｆａｂｅｐの一晩培養物を実施例２のように調製し、ＳＤＣＡＡ＋２％（ｗ／ｖ）ガラクトースを含有する選択培地で１．０のＯＤ６００まで希釈し、２０℃で４８時間増殖させた。このレパートリーを抗ＨＡ ｍＡｂ（２５μｇ／ｍＬ）を用いて室温で１時間標識した後で、ウサギ抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣ（１：４０希釈）と６ｎＭストレプトアビジンＰＥを室温で１時間用いる第二のインキュベーション工程を続けた。それぞれのインキュベーション工程に続いて細胞を０．５ｍＬ ＰＢＳで一回洗浄し、最終洗浄の後で細胞を氷上に保ち抗原解離を妨げた。ＥＰＩＣ ＡＬＴＲＡフローサイトメーターにおいて２０００細胞／秒の分取速度で試料を分取した。濃縮形式において第一の分取ラウンドを行い、ゲートに入る細胞の集団を、ＬＣディスプレイと抗原結合の両方に基づいて採取するように、分取ゲートを設定した。採取される細胞の比率は選択ラウンドの継続とともに減少し、レパートリーの多様性の低下を説明した（図８Ａ）。次いで、実施例２のように、採取した細胞をＳＤＣＡＡ＋（ｗ／ｖ）グルコースにおいて３０℃で１．０のＯＤ６００まで増殖させた後で、ガラクトースで誘導した。分取ゲートが減少する純粋方式（purity mode）で行なうラウンド２及び３で選択を繰り返した（表５）。異なる抗原濃度でもポリクローナルＦＡＣＳ分析を実施し、ＬＣディスプレイと抗原結合活性の両方のＦＡＣＳヒストグラムを図８Ｂに示す。
選択Ｆａｂ抗体の分析
レパートリー、ＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−ＬＣｅｐ；ＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−ＨＣｅｐ；ＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−Ｆａｂｅｐのアフィニティー選択により編集した酵母クローンをアフィニティースクリーニングして、出発の野生型抗体に対するアフィニティーの改善を定量した。選択抗体も配列決定して改善アフィニティーと相関する突然変異を決定した。
レパートリー、ＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−ＬＣｅｐ；ＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−ＨＣｅｐ；ＥＢＹ１００−ｐＴＱ３Ｆ２−Ｆａｂｅｐのアフィニティー選択により編集した酵母クローンをアフィニティースクリーニングして、出発の野生型抗体に対するアフィニティーの改善を定量した。選択抗体も配列決定して改善アフィニティーと相関する突然変異を決定した。
酵母コロニーを摘出し、２５μＬの溶解酵素（lyticase）溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ；シグマ、セントルイス，ミズーリ州）に３７℃で１時間再懸濁した後で、２μＬを取り、ＰＣＲ反応に使用した。別々のＬＣ及びＨＣを増幅し、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭシークエンサーを使用して配列決定した。配列アライメントを使用して野生型からの突然変異を決定し、表６に示す。
選択Ｆａｂのオフ速度（off rate）を、ＦＡＣＳにおける解離速度を測定することによって蛍光シグナルの経時的な減少として決定すると、クローン、Ｒ２Ｈ１０が最大のアフィニティー改善（１０．７倍、３．２ｎＭ）を与えた。この解離速度を指数関数型崩壊モデルへ適合し、ｋｄを算出した。酵母細胞を、ＬＣを検出するために抗ＨＡで標識し、さらに抗原検出のためにストレプトアビジンＰＥでも標識した。実施例２の記載のように酵母培養物を増殖させて誘導し、約２×１０７個の細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、この細胞を１００μＬ 抗ＨＡ Ｍａｂ（２０μｇ／ｍＬ）とともに１時間インキュベートしてから、０．５ｍＬのＰＢＳで洗浄した。次いで、この細胞をウサギ抗マウスＦＩＴＣ（１：４０）及びストレプトアビジンＰＥ（１μｇ／ｍＬストックの１：４０希釈液）とともに氷上で１時間インキュベートした。次いで、この細胞ペレットを過剰の非蛍光リガンドにおいて室温で再懸濁した。非蛍光標識の濃度は、酵母細胞あたり約１００，０００コピーのＦａｂ抗体が存在すると仮定して、酵母に表示されるＦａｂ抗体のモル濃度の１０〜１００倍過剰になるようにした。蛍光強度の減少をフローサイトメトリーにより１．５分〜３０分間モニターした。非標識酵母細胞を使用してバックグラウンド蛍光を設定した。次いで、ｋｄを算出する指数関数型崩壊のモデルへ解離速度を適合することによって、ｋｄを算出した。図１０ｃは、野生型Ｆ２と突然変異体Ｒ２Ｅ１０、Ｒ３Ｂ１、及びＲ３Ｈ３のクローンについてのＦＡＣＳによるオフ速度決定を示す。
実施例２のように、選択Ｆａｂ抗体をＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター、ｐＣＥＳ１へサブクローニングすることによって、可溶性Ｆａｂのアフィニティーを決定した。可溶性Ｆａｂを精製し、ＢＩＡｃｏｒｅ（de Haard, H. et al.）によりアフィニティーを試験した。選択されたＦａｂのアフィニティーを表７に示す。
Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ及びＦＡＣＳ選択の組合せを使用する、酵母表示Ｆａｂレパートリーの迅速選択
酵母表示レパートリーのアフィニティー選択を速めるために、そしてまた１０８を超えるより大きなレパートリーの選択を可能にする方法論を開発するために、第一ラウンドの選択としてのＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ（実施例４のような）とその後の選択ラウンドのためのＦＡＣＳ（実施例５のような）の両方の組合せを使用した。実施例９において構築したＬＣレパートリーを一晩増殖させ、実施例２のように抗体発現を誘導した。この酵母細胞集団をストレプトアビジンコート磁気粒子とともにインキュベートし、実施例４のようにＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒで選択した。並行して、同じレパートリーを実施例５のようにＦＡＣＳにより選択した。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ及びＦＡＣＳを使用するラウンド１選択キャンペーンからの酵母細胞のプールを一晩増殖させ、実施例５のように抗体発現を誘導した。実施例２のように酵母細胞を標識し、第二ラウンドとしてＦＡＣＳにより選択した。ポリクローナルＦＡＣＳを使用して、Ｆａｂを表示する酵母の選択プールの分析を実施した（実施例１０を参照のこと）。抗原結合細胞の比率は、第一ラウンドの選択としてＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒを使用するとき、ＦＡＣＳに優先してより速く増加することが見られる（図８ｄ）。
酵母表示レパートリーのアフィニティー選択を速めるために、そしてまた１０８を超えるより大きなレパートリーの選択を可能にする方法論を開発するために、第一ラウンドの選択としてのＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ（実施例４のような）とその後の選択ラウンドのためのＦＡＣＳ（実施例５のような）の両方の組合せを使用した。実施例９において構築したＬＣレパートリーを一晩増殖させ、実施例２のように抗体発現を誘導した。この酵母細胞集団をストレプトアビジンコート磁気粒子とともにインキュベートし、実施例４のようにＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒで選択した。並行して、同じレパートリーを実施例５のようにＦＡＣＳにより選択した。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ及びＦＡＣＳを使用するラウンド１選択キャンペーンからの酵母細胞のプールを一晩増殖させ、実施例５のように抗体発現を誘導した。実施例２のように酵母細胞を標識し、第二ラウンドとしてＦＡＣＳにより選択した。ポリクローナルＦＡＣＳを使用して、Ｆａｂを表示する酵母の選択プールの分析を実施した（実施例１０を参照のこと）。抗原結合細胞の比率は、第一ラウンドの選択としてＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒを使用するとき、ＦＡＣＳに優先してより速く増加することが見られる（図８ｄ）。
Ｉｇ重鎖真核ディスプレイベクター：ｐＴＱ５−ＨＣの構築
本発明の多重鎖真核ディスプレイベクターの代わりの態様（特に、多重鎖の鎖が別々のベクターにコードされ、それによりベクターセットの別個の成分を生じる、多重鎖真核ディスプレイベクター）の例証として、Ｉｇ重鎖断片を発現、輸送、及び表示するベクターで形質転換された宿主酵母細胞において有効な酵母ディスプレイベクターを適合ベクターセットの１つのベクターとして構築した。
本発明の多重鎖真核ディスプレイベクターの代わりの態様（特に、多重鎖の鎖が別々のベクターにコードされ、それによりベクターセットの別個の成分を生じる、多重鎖真核ディスプレイベクター）の例証として、Ｉｇ重鎖断片を発現、輸送、及び表示するベクターで形質転換された宿主酵母細胞において有効な酵母ディスプレイベクターを適合ベクターセットの１つのベクターとして構築した。
実施例１に従って産生したベクター、ｐＴＱ３をさらに改変することによって、ＨＣ断片ディスプレイベクターを構築した。ディスプレイベクター、ＴＱ３をＢｓｅＲＩで消化し、それにより２つのタンデムＧＡＬ１プロモーターのそれぞれの中に位置する、ベクターの設計制限部位を確定した（実施例１、配列番号５、指定塩基９９０〜９９５を参照のこと）。この多重鎖ディスプレイベクターのクローニング部位の１つにまたがる９２４ｂｐ断片（図３）を除去し、残る４，８６８ｂｐベクター骨格を当該技術分野で知られている技術を使用してゲル精製した（特に、ＧＦＲ ＰＣＲとゲルバンド精製キット（Gel Band Purification Kit）、アマーシャム−ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、により）。このベクター骨格を再連結し、Ｅ．ｃｏｌｉへ形質転換した。生じたベクター（「ｐＴＱ５」と命名）を、制限解析を使用して検証した。
抗ストレプトアビジンＦａｂ抗体、Ｆ２のＨＣを、ｐＴＱ３−Ｆ２から７０９ｂｐのＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ断片として制限消化し、精製し、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ消化したベクター、ｐＴＱ５へクローニングした。生じたＨＣディスプレイベクターを「ｐＴＱ５−ＨＣ」と命名した（図９）。
このベクターに対する後の修飾は、可溶性Ｆａｂ抗体の精製用の６×Ｈｉｓタグを挿入し、終止コドン（ＴＡＡ）をｍｙｃタグの末端、Ｐａｃ１部位の前に再配置することによって行い、余分なアミノ酸を消失させた。他の修飾には、位置指定突然変異誘発による、Ｔｒｐ選択マーカー内の内因性ＸｂａＩ制限部位の除去が含まれた。これを行なったのは、ＣＪライブラリーセット（Ｄｙａｘ コーポレーション、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）由来のリード抗体のクローニング及び操作を促進するためである。
Ｉｇ重鎖真核ディスプレイベクターの真核宿主細胞発現：一倍体酵母細胞におけるＨＣ発現
多重鎖真核ディスプレイベクターセットの独立したベクターの有用性を例証するために、Ｉｇ重鎖断片をコードする（ベクターセットの）酵母ディスプレイベクターを真核宿主細胞へ挿入し、形質転換した宿主細胞をＩｇ Ｆａｂの重鎖成分の発現に適した条件下で増殖させた。
多重鎖真核ディスプレイベクターセットの独立したベクターの有用性を例証するために、Ｉｇ重鎖断片をコードする（ベクターセットの）酵母ディスプレイベクターを真核宿主細胞へ挿入し、形質転換した宿主細胞をＩｇ Ｆａｂの重鎖成分の発現に適した条件下で増殖させた。
先に記載の形質転換手順に従って、酵母菌株、ＥＢＹ１００（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を（実施例１３の）ベクターｐＴＱ５−ＨＣで、そして別に対照としてｐＴＱ５で形質転換した。成功した形質転換体を、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ及びＥＢＹ１００ｐＴＱ５とそれぞれ命名し、１０ｍＬ ＳＤＣＡＡ＋Ｇにおいて３０℃で一晩増殖させた。
翌日、培養物を遠心分離して、ペレットになった酵母細胞を１０ｍＬ ＳＤＣＡＡ＋２％（ｗ／ｖ）ガラクトースに再懸濁してＯＤ６００を１とした。次いで、細胞培養物を２０℃で２４時間増殖させ、Ａｇａ２ｐ−重鎖融合産物の発現を誘導した。細胞を遠心分離して、１ｍＬ滅菌水で２回洗浄し、エッペンドルフ管へ移した。
細胞ペレットを２００ｍＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液＋ＤＴＴに再懸濁し、ガラスビーズ（４２５〜６００ミクロン）をメニスカスの真下に加えた。この細胞及びビーズの懸濁液を１分間、４回激しく撹拌し、激しく撹拌している間、懸濁液は氷上に保った。上清を新鮮な管へ移し、１００℃まで５分間加熱した。
タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ウェスタンブロットのためにニトロセルロース膜へ移した。ＨＲＰ結合抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（１μｇ／ｍＬ，ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、インディアナポリス、イリノイ州）を使用してＡｇａ２ｐ−ＨＣ融合ポリペプチドの検出を実施した。免疫検出は、増強化学発光（アマーシャム−ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）により実施した。約４５ｋＤのＡｇａ２ｐ−ＨＣ融合ポリペプチドを検出した。（空き）対照ベクタークローン、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５には、検出可能なＡｇａ２ｐ−ＨＣ融合産物を検出しなかった（図１０）。
Ｉｇ重鎖真核ディスプレイベクターの真核宿主細胞ディスプレイ：一倍体酵母細胞の表面でのＨＣディスプレイ
多重鎖真核ディスプレイベクターセット由来のベクターの、多重鎖ポリペプチドの固着鎖を一倍体真核細胞の表面に表示する能力を例証するために、Ｉｇ重鎖断片をコードする（ベクターセットの）酵母ディスプレイベクターを真核宿主細胞へ挿入し、形質転換した宿主細胞をＩｇ Ｆａｂの重鎖成分の発現及びディスプレイに適した条件下で増殖させた。
多重鎖真核ディスプレイベクターセット由来のベクターの、多重鎖ポリペプチドの固着鎖を一倍体真核細胞の表面に表示する能力を例証するために、Ｉｇ重鎖断片をコードする（ベクターセットの）酵母ディスプレイベクターを真核宿主細胞へ挿入し、形質転換した宿主細胞をＩｇ Ｆａｂの重鎖成分の発現及びディスプレイに適した条件下で増殖させた。
ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ（実施例１４より）を増殖させ、抗体発現を上記のように誘導した。ＨＣ発現は、２０℃で振り混ぜながら、４８時間の増殖により誘導した。酵母試料を遠心分離し、ＢＳＡ １ｍｇ／ｍＬを含有するＰＢＳにおいて細胞ペレットを再懸濁した。２つの試料を再び遠心分離し、細胞ペレットをいずれも１００μＬの抗ヒトＣＨ１（２５μｇ／ｍＬ；Ｚｙｍｅｄ，サンフランシスコ、カリフォルニア州）において別々に再懸濁してから、室温で１時間のインキュベーションを続けた。この細胞をペレットにし、０．５ｍＬのＰＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで１回洗浄した。次いで、細胞試料をウサギ抗マウスＦＩＴＣ（１：５０希釈；Ｄａｋｏ，カーピンテリア、カリフォルニア州）とともに暗所で１時間インキュベートした。
抗原結合を検出するために、ＰＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中のストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（１：２５希釈；Ｄａｋｏ，カーピンテリア、カリフォルニア州）で細胞を標識し、暗所において室温で一晩インキュベートした。すべての試料を遠心分離し、細胞ペレットを０．５ｍＬ ＰＢＳで１回洗浄してから、５００ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。
細胞表面に結合したＦａｂ−抗原結合の存在をフローサイトメトリーにより検出した。誘導前の細胞は、重鎖や機能的なストレプトアビジン結合のディスプレイを示さなかった。ＨＣ発現の誘導後は、酵母細胞が重鎖だけを表示していることを検出し得たが、機能的なストレプトアビジン結合は予測されるほど検出されなかった（図１１）。
Ｉｇ軽鎖真核ディスプレイベクター：ｐＴＱ６−ＬＣの構築
上記に記載の重鎖酵母ディスプレイベクターと一緒に使用されるときに、多重鎖真核ディスプレイベクターセットを提供する、軽鎖酵母ディスプレイベクターを構築した（上記、実施例１３を参照のこと）。
上記に記載の重鎖酵母ディスプレイベクターと一緒に使用されるときに、多重鎖真核ディスプレイベクターセットを提供する、軽鎖酵母ディスプレイベクターを構築した（上記、実施例１３を参照のこと）。
ＨＡエピトープタグ及びＡｇａ２ｐシグナル配列へ融合した抗ストレプトアビジンＬＣを含有する断片を増幅することによって、ＬＣ酵母発現ベクターを構築した。ＧＦＸ ＰＣＲとゲルバンド精製キット（アマーシャム−ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を使用して、増幅産物をゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｍｅＩで消化した。この７８３ｂｐのＬＣ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｍｅＩ消化ｐＹＣ６／ＣＴベクター（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）の４，３２３ｂｐベクター骨格と一緒に１．２％ ＴＡＥ−アガロースゲルで精製した。このＬＣ断片とｐＹＣ６／ＣＴベクターを一緒に連結し、このライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉ菌株、ＴＧ１へ形質転換した。生じたＬＣ発現ベクターを「ｐＴＱ６−ＬＣ」と命名した（図１２）。
Ｉｇ軽鎖真核ディスプレイベクターの真核宿主細胞発現：一倍体酵母細胞における可溶性ＬＣ発現
多重鎖真核ディスプレイベクターセットの独立したベクターの有用性を例証するために、Ｉｇ軽鎖断片をコードする（ベクターセットの）酵母ディスプレイベクターを真核宿主細胞へ挿入し、形質転換した宿主細胞をＩｇ Ｆａｂの可溶性軽鎖成分の発現に適した条件下で増殖させた。
多重鎖真核ディスプレイベクターセットの独立したベクターの有用性を例証するために、Ｉｇ軽鎖断片をコードする（ベクターセットの）酵母ディスプレイベクターを真核宿主細胞へ挿入し、形質転換した宿主細胞をＩｇ Ｆａｂの可溶性軽鎖成分の発現に適した条件下で増殖させた。
先に記載の形質転換手順に従って、P. Slonimski より入手した酵母菌株、Ｗ３０３−１Ｂ（ａ／ａｌｐｈａ ｕｒａ３−１／ｕｒａ３−１ ｌｅｕ２−３，１１２／ｌｅｕ２−３，１１２ ｔｒｐ１−１／ｔｒｐ１−１ ｈｉｓ３−１１，１５／ｈｉｓ３−１１，１５ ａｄｅ２−１／ａｄｅ２−１ ｃａｎ１−１００／ｃａｎ１−１００）を（実施例１６の）ｐＴＱ−ＬＣで、そして別に対照としてｐＹＣ６／ＣＴで形質転換した。成功した形質転換体を、Ｗ３０３ｐＴＱ６−ＬＣ及びＷ３０３ｐＹＣ６／ＣＴとそれぞれ命名し、１０ｍＬ ＳＤ−Ｇ＋３００μｇ／ｍＬ ブラスチシジン（登録商標）（ＳＤ−Ｇ＋Ｂｌｓ）において３０℃で一晩培養した。
翌日、培養物を遠心分離して、ペレットになった酵母細胞を１０ｍＬ ＳＤ＋Ｂｌｓ＋２％（ｗ／ｖ）ガラクトースに再懸濁してＯＤ６００を０．４とした。次いで、細胞培養物を２０℃で２４時間増殖させ、可溶性軽鎖ポリペプチドの発現を誘導した。細胞を遠心分離し、遠心分離フィルターユニット（ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ ＹＭ−１０；ミリポア、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を使用して１０倍濃縮した。
細胞ペレットを洗浄し、破壊（breaking）緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４，１ｍＭ ＥＤＴＡ，５％（ｗ／ｖ）グリセロール＋プロテアーゼ阻害剤カクテル；ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、インディアナポリス、イリノイ州）に再懸濁してＯＤ６００を５０とし、ガラスビーズ（４２５〜６００ミクロン）をメニスカスの真下に加えた。この細胞及びビーズの懸濁液を１分間、４回激しく撹拌し、激しく撹拌している間、懸濁液は氷上に保った。上清を新鮮な管へ移し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液＋ＤＴＴにおいて、アリコートを１００℃まで５分間加熱した。
タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ウェスタンブロットのためにニトロセルロース膜へ移した。ＨＲＰ（１／１０００）結合ウサギ抗マウスと組み合わせて抗ＨＡモノクローナル抗体（１μｇ／ｍＬ）を使用してＬＣポリペプチドの検出を実施した。免疫検出は、増強化学発光（アマーシャム−ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）により実施した。培養上清に３０ｋＤと６０ｋＤのポリペプチド産物を検出した。空きベクター対照のＷ３０３ｐＹＣ６／ＣＴには、検出可能なＬＣ産物を検出し得なかった（図１３）。
多重鎖ポリペプチドの真核宿主細胞での表面ディスプレイ：一倍体宿主細胞対の細胞融合の産物
適合多重鎖真核ディスプレイベクターセットからの異なるベクターをそれぞれ保有する、２つの一倍体真核細胞の細胞融合を介して、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドを二倍体真核細胞の表面に表示する新規な方法の作動可能性を例証するために、可溶性Ｉｇ軽鎖断片を発現するベクターを含有する一倍体酵母細胞を、Ｉｇ重鎖−アンカー融合ポリペプチドを発現して表示するベクターを含有する一倍体酵母細胞へ接合して、機能的なＦａｂポリペプチドを宿主細胞の表面に表示する二倍体酵母細胞を産生した。
適合多重鎖真核ディスプレイベクターセットからの異なるベクターをそれぞれ保有する、２つの一倍体真核細胞の細胞融合を介して、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドを二倍体真核細胞の表面に表示する新規な方法の作動可能性を例証するために、可溶性Ｉｇ軽鎖断片を発現するベクターを含有する一倍体酵母細胞を、Ｉｇ重鎖−アンカー融合ポリペプチドを発現して表示するベクターを含有する一倍体酵母細胞へ接合して、機能的なＦａｂポリペプチドを宿主細胞の表面に表示する二倍体酵母細胞を産生した。
酵母クローン、Ｗ３０３ｐＴＱ６−ＬＣ（実施例１７より）及びＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ（実施例１４より）を、ブラストサイジン（登録商標）（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州；３００μｇ／ｍＬ；ＳＤ＋Ｇ＋Ｂｌｓアガープレート）又はトリプトファンドロップアウト培地（ＳＤ−Ｔｒｐ＋Ｇアガープレート）のいずれかを補充したアガープレートで増殖させた。次いで、これらのプレートを、トリプトファンドロップアウト＋３００μｇ／ｍＬ ブラスチシジン（登録商標）（ＳＤ−Ｔｒｐ＋Ｇ＋Ｂｌｓ）の合成規定培地を含有する二重選択プレート上で複製プレート培養した。生じた細胞層の二倍体酵母細胞を画線培養して単一コロニーとした。７つのＴｒｐ＋／ＢｌｓＲコロニーを選択し、９６穴プレートにおいて１００ｍＬ ＳＤ＋Ｇ−Ｔｒｐ＋Ｂｌｓ中に３０℃で振り混ぜながら一晩増殖させた。
翌日、培養物を遠心分離して、ペレットになった酵母細胞を１０ｍＬ ＳＤ−Ｔｒｐ＋Ｂｌｓ＋２％（ｗ／ｖ）ガラクトースか又は１０ｍＬ ＹＰ培地＋Ｂｌｓ＋２％（ｗ／ｖ）ガラクトースのいずれかにおいて２０℃で２４時間再懸濁した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、３つの９６穴プレートに等しく分けた。第一プレートの細胞は１００μＬ ストレプトアビジン−ＨＲＰ（０．８７μｇ／ｍＬ）に再懸濁し、第二プレートの細胞は１００μＬ 抗ｃ−Ｍｙｃ−ＨＲＰ（１μｇ／ｍＬ）に再懸濁し、第三プレートの細胞は１００μＬ 抗ＨＡ（１μｇ／ｍＬ）に再懸濁して、ウサギ抗マウスＨＲＰ（１／１０００）でさらに標識した。
酵母全細胞ＥＬＩＳＡを（実施例７のように）実施し、ＦＡＣＳを（実施例１５のように）実施して抗原結合とＨＣディスプレイを検出した。試験したすべての二倍体細胞がストレプトアビジンへ結合し、全細胞ＥＬＩＳＡ（図１４）とＦＡＣＳ（図１５Ａ〜Ｃ）において軽鎖を表示した。特に、コンビナトリアルに組み立てられたＦａｂ抗体（二倍体ＬＣ／ＨＣ）をその表面に表示する二倍体酵母細胞上でストレプトアビジン結合活性を検出したが、これに対し、ＬＣのみ（Ｗ３０３ｐＴＱ６−ＬＣ）又はＨＣのみ（ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ）のいずれかを発現する一倍体の親細胞は、結合活性を示さなかった。Ｆａｂ抗体を表示する標準の一倍体酵母細胞（ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２）は、ストレプトアビジン結合活性を示した。また、（予測されるように）ＬＣのみを発現する一倍体親酵母細胞（Ｗ３０３ｐＴＱ６−ＬＣ）がＨＣディスプレイを示さなかったのに対し、Ｆａｂ抗体を表示する標準の一倍体酵母細胞（ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２）は、ＨＣディスプレイを示した。
５つの酵母クローンを選択して１０ｍＬ ＳＤ＋Ｇ−Ｔｒｐ＋Ｂｌｓにおいて振り混ぜながら３０℃で一晩培養した。翌日、細胞培養物を遠心分離して、ペレットになった酵母細胞を１０ｍＬ ＳＤ−Ｔｒｐ＋Ｂｌｓ＋２％（ｗ／ｖ）ガラクトースに０．４のＯＤ６００まで２４時間再懸濁してベクター発現を誘導した。代わりのプロトコールは、１０ｍＬ ＹＰ培地＋ブラストサイジン（登録商標）＋２％（ｗ／ｖ）ガラクトースにおける再懸濁を含む。
２４時間の誘導インキュベーションの後で、５つの二倍体酵母培養物のそれぞれから１つのアリコートをペレットにし、洗浄し、破壊緩衝液に再懸濁してＯＤ６００を５０とした。ガラスビーズ（４２５〜６００ミクロン）をメニスカスの真下に加え、この細胞−ビーズ懸濁液を１分間、４回激しく撹拌し、激しく撹拌している間、懸濁液は氷上に保った。上清を新鮮な管へ移し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液＋ＤＴＴにおいて、アリコートを１００℃まで５分間加熱した。
タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ウェスタンブロットのためにニトロセルロース膜へ移した。抗ＨＡ抗体（１μｇ／ｍＬ）をＨＲＰ結合ウサギ抗マウスと組み合わせて１つの膜に対して使用して、軽鎖ポリペプチドの検出を実施した。重鎖−Ａｇａ２ｐ融合ポリペプチドの検出は、ＨＲＰへ直接結合した抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（１μｇ／ｍＬ，ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、インディアナポリス、イリノイ州）を使用して実施した。免疫検出は、増強化学発光（アマーシャム−ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）により実施した。二倍体酵母溶解液において、約３０ｋＤのＬＣ産物と約４５ｋＤのＨＣ−Ａｇａ２ｐ融合産物をいずれも検出した（図１６及び１７）を検出した。２つの空きベクター、ｐＴＱ５及びｐＹＣ６／ＣＴを収容する対照二倍体クローンには、検出可能なＬＣもＨＣ−Ａｇａ２ｐ融合産物も検出されなかった。
また、２４時間の誘導インキュベーションの後で、５つの二倍体酵母培養物のそれぞれからの第二アリコートをフローサイトメトリーにより分析した。検出剤につき５×１０６の細胞をＰＢＳで１サイクル洗浄し、この細胞を、重鎖検出には抗ｃ−Ｍｙｃ（２５μｇ／ｍＬ）を含有する１００μＬ ＰＢＳに、抗原結合の検出には抗ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（１：４０）を含有する１００μＬ ＰＢＳに、そして軽鎖検出には抗ＨＡ（２５μｇ／ｍＬ）を含有する１００μＬ ＰＢＳに再懸濁した。細胞を暗所で１時間インキュベートしてから、ＰＢＳで再び１サイクル洗浄した。洗浄後、ウサギ抗マウス−ＦＩＴＣ（１：４０）を含有する１００μＬ ＰＢＳに再懸濁し、再び暗所で１時間インキュベートした。
第二のインキュベーション工程の間に１工程標識化のために細胞を抗ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで処理した。インキュベーション後、細胞をさらに１サイクルの間洗浄し、５００μＬ ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。５つの試料は、すべて抗原へ結合し、ＨＣ並びにＬＣを表示することを示した（図１５Ａ〜Ｃ）。
２４時間の（誘導）インキュベーションの後で、５つの二倍体酵母培養物からの第三アリコートも免疫蛍光法のために標識した。ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（３０μｇ／ｍＬ，Ｄａｋｏ）又はウサギ抗ヒトλ鎖（１：４０；Ｄａｋｏ，カーピンテリア、カリフォルニア州）及びモノクローナル抗ＣＨ１（２５μｇ／ｍＬ，Ｚｙｍｅｄ，サンフランシスコ、アメリカ）の混合物のいずれかの１００μＬに１０８個の細胞を再懸濁した。第一の試料は、ウサギ抗ＦＩＴＣ（１：４０；Ｄａｋｏ，カーピンテリア、カリフォルニア州）とともにさらにインキュベートし、最後はＦＩＴＣ結合ブタ抗ウサギ（１：２０；Ｄａｋｏ，カーピンテリア、カリフォルニア州）とともにインキュベートした。第二の試料は、軽鎖についてはＦＩＴＣ結合ブタ抗ウサギ（１：２０；Ｄａｋｏ，カーピンテリア、カリフォルニア州）で、そして重鎖についてはイソチオシアン酸テトラメチルローダミン結合ウサギ抗マウス（ＴＲＩＴＣ，１：３０，シグマ、セントルイス、ミズーリ州）で二重標識した（図１８Ａ〜Ｃ）。
この二倍体は、軽鎖及び重鎖を細胞表面に表示し、予測されるように、ストレプトアビジンへ結合することが示された。ＨＣのみを発現する一倍体の親は、重鎖のＴＲＩＴＣ標識でのみ染色された。一倍体の親のＬＣはどの場合も陰性であった。
一倍体宿主酵母細胞対の接合効率
適合多重鎖真核ディスプレイベクターセットからの異なるベクターをそれぞれ保有する、２つの一倍体酵母細胞の細胞融合の効率を例証するために、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドをその表面に表示する二倍体酵母細胞を産生するための生きた（viable）プロセスとして、本発明に記載の宿主酵母細胞対について接合効率を決定した。接合反応の効率の定量決定を以下のように評価した。
適合多重鎖真核ディスプレイベクターセットからの異なるベクターをそれぞれ保有する、２つの一倍体酵母細胞の細胞融合の効率を例証するために、生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドをその表面に表示する二倍体酵母細胞を産生するための生きた（viable）プロセスとして、本発明に記載の宿主酵母細胞対について接合効率を決定した。接合反応の効率の定量決定を以下のように評価した。
それぞれの一倍体親、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５（実施例１４より）及びＷ３０３ｐＹＣ６／ＣＴ（実施例１７より）を、それぞれの適切な選択培地、ＳＤ＋Ｇ＋Ｔｒｐ及びＳＤ＋Ｇ＋Ｂｌｓにおいて３０℃で一晩増殖させた。２つの新鮮な一倍体培養物からの３×１０７個の細胞を混合し、４５ｍｍのニトロセルロースフィルター（微小充填装置、ミリポア、ベッドフォード、マサチューセッツ州）で採取した。このフィルターを非選択濃縮培地プレート（ＹＰＤ）上において３０℃で４時間インキュベートした。次いで、細胞をＹＰＤ培地に再懸濁し、２つの親の選択培地と二重選択培地（二倍体の増殖のみを可能にする）ＳＤ＋Ｇ−Ｔｒｐ＋Ｂｌｓで力価検定した。それぞれの一倍体親を同じやり方で別々に処理して、二重選択培地上で希釈せずにそれらをプレート培養することによって自然復帰若しくは耐性を評価した。
一倍体親ＥＢＹ１００ｐＴＱ５の接合効率を以下のように算出した：（ＳＤ＋Ｇ−Ｔｒｐ＋Ｂｌｓで増殖する二倍体の数−ＳＤ＋Ｇ−Ｔｒｐ＋Ｂｌｓで増殖する自然耐性のＥＢＹ１００ｐＴＱ５の数）を（ＳＤ＋Ｇ−Ｔｒｐでの増殖を示す、接合反応からの細胞の全数）で割る。
一倍体親Ｗ３０３（ｐＹＣ６）の接合効率を以下のように算出した：（ＳＤ＋Ｇ＋Ｔｒｐ＋Ｂｌｓで増殖する二倍体の数−ＳＤ＋Ｇ−Ｔｒｐ＋Ｂｌｓで増殖する一倍体細胞のＷ３０３ｐＹＣ６／ＣＴの数）を（ＳＤ＋Ｇ＋Ｂｌｓで増殖する細胞の全数）で割る。
それぞれの接合型の３×１０７個の一倍体細胞は、ｐＴＱ５及びｐＹＣ６酵母発現ベクターの両方を含有する１．５×１０７個の二倍体細胞を産生した。接合効率の結果は、ｐＴＱプラスミドを含有する一倍体親の５１％が二倍体を生じること、そしてｐＹＣプラスミドを含有する一倍体親の６４％が二倍体を生じることを明らかにした。
コンビナトリアルに組み立てられたＦａｂ抗体を表示する二倍体酵母細胞の選択濃縮：フローサイトメトリーによる検出
過剰の非関連酵母細胞に対して抗原特異的Ｆａｂ抗体を表示する酵母細胞を選択する能力を確かめるために、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）を使用した。ストレプトアビジンに特異的なコンビナトリアルに組み立てられたＦａｂ抗体を表示する陽性の二倍体酵母細胞を使用した。この二倍体酵母細胞は、Ｔｒｐ＋／Ｌｅｕ−／ＢｌｓＲの表現型マーカーを担い、トリプトファン（−）のブラストサイジン（登録商標）含有選択アガープレートで増殖することができた。この二倍体をＢｌｓＲ二倍体と命名した。Ｔｒｐ＋／Ｌｅｕ＋の表現型マーカーを担う非関連酵母二倍体細胞を使用し、これはロイシン（−）のトリプトファン含有選択アガープレートで増殖することができた。この二倍体をＬｅｕ＋二倍体と命名した。陽性（ＢｌｓＲ）と無関連（Ｌｅｕ＋）二倍体酵母細胞の両方を、それぞれ−Ｔｒｐ／＋Ｌｅｕ／＋Ｂｌｓ培地と−Ｔｒｐ／−Ｌｅｕ培地の選択条件下でＳＤ＋２％（ｗ／ｖ）グルコースの培地において一晩増殖させた。ガラクトースを２％（ｗ／ｖ）で含有するＹＰ培地において酵母培養物を誘導した。この酵母培養物のＯＤ６００を決定し、１のＯＤ６００が４×１０６細胞／ｍＬに等しいとする変換率を使用した後で、陽性細胞の無関連酵母細胞に対する混合物を１：１００００の近似率で調製した。ＦＡＣＳによる選択のためにこの酵母細胞混合物を５００ｎＭストレプトアビジンＰＥで標識し、実施例８のように選択した。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒでは、実施例４のように酵母細胞混合物をストレプトアビジンコートビーズとともにインキュベートして、選択した。ＭＡＣＳによる選択では、誘導した二倍体を、６ｍＬ ＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ中で５００μＬストレプトアビジン・マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，ケルン、ドイツ）とともに室温で１時間インキュベートした。この細胞／ビーズ混合物を磁石の存在下に洗浄済みＬＣカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，ケルン、ドイツ）上にロードし、このカラムをＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡで再び２回洗浄した。磁石を外した後で、カラムに保持された細胞を６ｍＬ ＰＢＳ緩衝液で溶出させた。
過剰の非関連酵母細胞に対して抗原特異的Ｆａｂ抗体を表示する酵母細胞を選択する能力を確かめるために、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）を使用した。ストレプトアビジンに特異的なコンビナトリアルに組み立てられたＦａｂ抗体を表示する陽性の二倍体酵母細胞を使用した。この二倍体酵母細胞は、Ｔｒｐ＋／Ｌｅｕ−／ＢｌｓＲの表現型マーカーを担い、トリプトファン（−）のブラストサイジン（登録商標）含有選択アガープレートで増殖することができた。この二倍体をＢｌｓＲ二倍体と命名した。Ｔｒｐ＋／Ｌｅｕ＋の表現型マーカーを担う非関連酵母二倍体細胞を使用し、これはロイシン（−）のトリプトファン含有選択アガープレートで増殖することができた。この二倍体をＬｅｕ＋二倍体と命名した。陽性（ＢｌｓＲ）と無関連（Ｌｅｕ＋）二倍体酵母細胞の両方を、それぞれ−Ｔｒｐ／＋Ｌｅｕ／＋Ｂｌｓ培地と−Ｔｒｐ／−Ｌｅｕ培地の選択条件下でＳＤ＋２％（ｗ／ｖ）グルコースの培地において一晩増殖させた。ガラクトースを２％（ｗ／ｖ）で含有するＹＰ培地において酵母培養物を誘導した。この酵母培養物のＯＤ６００を決定し、１のＯＤ６００が４×１０６細胞／ｍＬに等しいとする変換率を使用した後で、陽性細胞の無関連酵母細胞に対する混合物を１：１００００の近似率で調製した。ＦＡＣＳによる選択のためにこの酵母細胞混合物を５００ｎＭストレプトアビジンＰＥで標識し、実施例８のように選択した。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒでは、実施例４のように酵母細胞混合物をストレプトアビジンコートビーズとともにインキュベートして、選択した。ＭＡＣＳによる選択では、誘導した二倍体を、６ｍＬ ＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ中で５００μＬストレプトアビジン・マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，ケルン、ドイツ）とともに室温で１時間インキュベートした。この細胞／ビーズ混合物を磁石の存在下に洗浄済みＬＣカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，ケルン、ドイツ）上にロードし、このカラムをＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡで再び２回洗浄した。磁石を外した後で、カラムに保持された細胞を６ｍＬ ＰＢＳ緩衝液で溶出させた。
酵母細胞を回収し、ＢｌｓＲ表現型又はＬｅｕ＋表現型のいずれか一方の選択アガープレートで力価検定をした。選択の前後でのＢｌｓＲ／Ｌｅｕ＋コロニーの比率を使用して、濃縮率と陽性酵母細胞の回収率を算出した。
ストレプトアビジンに特異的な抗体の上記例では、ＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒのほうがＭＡＣＳよりも高い濃縮率を与えるように見えた。しかしながら、陽性酵母細胞の回収率は有意に低かった。ＦＡＣＳを使用すると、抗ストレプトアビジンＦａｂ抗体についての１ラウンドの選択から、１次数の大きさの濃縮率を観察した。
一倍体宿主細胞対の細胞融合によるＬＣ及びＨＣ組換えとアフィニティー選択：フローサイトメトリーによる検出
適合多重鎖真核ディスプレイベクターセットからの異なるベクターをそれぞれ保有する、２つの一倍体真核細胞の融合の有用性を例証するために、複数の可溶性Ｉｇ軽鎖断片変異体を発現するベクターを含有する一倍体酵母細胞集団（即ち、ＬＣ変異体のライブラリー）を、複数のＩｇ重鎖−アンカー融合ポリペプチド変異体を発現して表示するベクターを含有する、反対の接合型の一倍体酵母細胞集団（即ち、ＨＣ変異体のライブラリー）へ接合して、複数の機能的なＦａｂポリペプチドを宿主細胞の表面に表示する新規な二倍体酵母細胞集団（即ち、新規Ｆａｂライブラリー）を産生する。
適合多重鎖真核ディスプレイベクターセットからの異なるベクターをそれぞれ保有する、２つの一倍体真核細胞の融合の有用性を例証するために、複数の可溶性Ｉｇ軽鎖断片変異体を発現するベクターを含有する一倍体酵母細胞集団（即ち、ＬＣ変異体のライブラリー）を、複数のＩｇ重鎖−アンカー融合ポリペプチド変異体を発現して表示するベクターを含有する、反対の接合型の一倍体酵母細胞集団（即ち、ＨＣ変異体のライブラリー）へ接合して、複数の機能的なＦａｂポリペプチドを宿主細胞の表面に表示する新規な二倍体酵母細胞集団（即ち、新規Ｆａｂライブラリー）を産生する。
標的分子に対してＦａｂレパートリーより予め選択したＦａｂファージディスプレイ単離物を使用して、（実施例６に例証されるように）ファージディスプレイ単離物の遺伝情報を多重鎖酵母ディスプレイベクターセットへバッチ移行するための重鎖及び軽鎖成分の供給源を提供し、（実施例１４及び１７に記載のような）多重鎖酵母ディスプレイベクターセットを使用して、（実施例１８に例証されるように）適合多重鎖真核ディスプレイベクターセットからの異なるベクターをそれぞれ保有する、２つの一倍体真核細胞の宿主細胞融合を介した軽鎖及び重鎖単離物の新規な組換えを提供する。
ファージディスプレイ抗体ライブラリー（de Haard, H. et al., 1999）を、当業者に馴染みのプロトコールを使用して、ストレプトアビジンコート磁気粒子上での１ラウンドの選択にかけた。このレパートリーを酵母ディスプレイ系への移行の出発レパートリーとして使用した。このライブラリーのインプットは５×１０１２ファージ粒子であり、１ラウンドの選択後のアウトプットは３．７５×１０５ファージ粒子であった。
ラウンド１選択ファージディスプレイライブラリーよりＨＣ断片をＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ断片として単離し、Ｉｇ重鎖酵母ディスプレイベクターのｐＴＱ５中へクローニングし、これをＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで消化した（実施例１３）。このライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉへ形質転換して１×１０８のライブラリーを得た。次いで、このライブラリーを酵母菌株のＥＢＹ１００へ形質転換して４×１０７のライブラリーを得て、これをＥＢＹ１００−ｐＴＱ５−ＨＣｒｅｐと命名した。
ラウンド１選択ファージディスプレイライブラリーよりＬＣ断片をＡｐａＬ１／ＡｓｃＩ断片として単離し、ＡｐａＬ１及びＡｓｃＩで消化した、Ｉｇ軽鎖酵母ディスプレイベクターのｐＴＱ６（実施例１６）へクローニングした。このライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉへ形質転換して１×１０８のライブラリーを得た。次いで、このライブラリーを酵母菌株のＢＪ５４５７へ形質転換して８×１０７のライブラリーを得て、ＢＪ５４５７−ｐＴＱ６−ＬＣｒｅｐと命名した。酵母中のＨＣ及びＬＣレパートリーは、いずれもファージ中の３．７５×１０５の出発レパートリーをカバーするのに十分な多様性を含有した。個別クローンのＤＮＡフィンガープリント解析は多様な制限様式を示し、別々のＬＣ及びＨＣライブラリー中に異なる生殖系列セグメントが表れていることを示唆した。
第一の接合方式では、ＬＣレパートリー（ＢＪ５４５７−ｐＴＱ６−ＬＣｒｅｐ）の７．２５×１０８個の細胞を、ストレプトアビジンに特異的な単一ＨＣを含有してクローンＦ２より派生したＥＢＹ１００−ｐＴＱ５−Ｆ２ＨＣの３．４×１０８個の細胞と接合した。この接合条件は、ＬＣ及びＨＣ発現プラスミドの両方を維持する選択圧力（トリプトファン栄養要求性、及びブラストサイジン耐性）下にあった。５５％の接合効率で１．９×１０８個の二倍体ライブラリーを得た。このライブラリー由来の個別クローンの酵母全細胞ＥＬＩＳＡによる分析は、１００％のクローンがＨＣを表示して、１００％のクローンがＬＣを表示することを示した。
第二の接合方式では、ＨＣレパートリー（ＥＢＹ１００−ｐＴＱ５−ＨＣｒｅｐ）の３．６×１０８個の細胞を、ストレプトアビジンに特異的な単一ＬＣを含有してクローンＦ２より派生したＢＪ５４５７−ｐＴＱ６−Ｆ２ＬＣの３×１０８個の細胞と接合した。この接合条件は、ＬＣ及びＨＣ発現プラスミドの両方を維持する選択圧力（トリプトファン栄養要求性、及びブラストサイジン耐性）下にあった。２７％の接合効率で８×１０７個の二倍体ライブラリーを得た。このライブラリー由来の個別クローンの酵母全細胞ＥＬＩＳＡによる分析は、８９％のクローンがＨＣを表示して、これらクローンのすべてがＬＣを表示することを示した。
第三の接合方式では、ＨＣレパートリー（ＥＢＹ１００−ｐＴＱ５−ＨＣｒｅｐ）の２．０×１０１０個の細胞を、ＬＣレパートリー（ＢＪ５４５７−ｐＴＱ６−ＬＣｒｅｐ）の５．６×１０９個の細胞と接合した。この接合条件は、ＬＣ及びＨＣ発現プラスミドの両方を維持する選択圧力（トリプトファン栄養要求性、及びブラストサイジン（登録商標）耐性）下にあった。６８％の接合効率で４×１０９個の二倍体ライブラリーを得た。このライブラリー由来の個別クローンの酵母全細胞ＥＬＩＳＡによる分析は、９４％のクローンがＨＣを表示して、５３％のクローンがＬＣを表示することを示した。
この一連の接合実験は、ＬＣ及びＨＣの個別レパートリーの接合を使用して大きなライブラリーを作製することができることを示す。これらのレパートリーは多様なＶ遺伝子生殖系列セグメントを含み、酵母細胞表面に発現されて表示され得る。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒを使用して、これらのレパートリーを抗原ストレプトアビジンとともに選択した（実施例７を参照のこと）。２ラウンドの選択の後で、編集したクローンの９７％が酵母全細胞ＥＬＩＳＡにおいて抗原結合活性を示した（実施例７を参照のこと）。
誤りがちのＰＣＲにより多様化されるＬＣ及びＨＣレパートリーの構築
一倍体酵母細胞の２つのレパートリーの融合を例証するために、適合多重鎖ベクターセット由来の異なるベクターを保有するそれぞれのレパートリーをアフィニティー成熟化に使用する場合があり、ｐＴＱ５（実施例１３）における誤りがちのＰＣＲ（実施例９）により多様化したＨＣレパートリーと、ｐＴＱ６（実施例１６）における誤りがちのＰＣＲ（実施例９）により多様化した別のＬＣレパートリーを、反対の接合型の酵母一倍体細胞において構築した。
一倍体酵母細胞の２つのレパートリーの融合を例証するために、適合多重鎖ベクターセット由来の異なるベクターを保有するそれぞれのレパートリーをアフィニティー成熟化に使用する場合があり、ｐＴＱ５（実施例１３）における誤りがちのＰＣＲ（実施例９）により多様化したＨＣレパートリーと、ｐＴＱ６（実施例１６）における誤りがちのＰＣＲ（実施例９）により多様化した別のＬＣレパートリーを、反対の接合型の酵母一倍体細胞において構築した。
ＨＣレパートリーは、抗ストレプトアビジンＦ２抗体を誤りがちの条件（実施例９）の下で増幅することによって構築した。この増幅した断片をＳｆｉＩとＮｏｔＩで消化し、精製し、すでにＳｆｉＩとＮｏｔＩで消化しておいたＨＣのみの発現ベクター、ｐＴＱ５（実施例１３）へクローニングした。生じたライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉへ形質転換して７×１０７のライブラリーを得た。このライブラリーで酵母菌株のＥＢＹ１００を形質転換して９×１０６のライブラリーを得て、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊と命名した。
ＬＣレパートリーは、抗ストレプトアビジンＦ２抗体のＬＣを誤りがちの条件（実施例９）の下で増幅することによって構築した。この増幅した断片をＡｐａＬ１とＡｓｃＩで消化し、やはりすでにＡｐａＬ１とＡｓｃＩで消化しておいたＬＣのみの発現ベクター（実施例１６）へクローニングした。生じたライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉへ形質転換して４×１０７のライブラリーを得て、これを引き続き酵母菌株のＢＪ５４５７へ移行させて１．８×１０７のライブラリー（ＢＪ５４５７ｐＴＱ６−ＬＣ＊と命名した）を得た。
生じたヌクレオチドレベルでの突然変異頻度は、ＨＣレパートリーで０．８％、ＬＣレパートリーで１．５％であった。これらの頻度は、アミノ酸レベルでそれぞれ１．３％及び３％の突然変異頻度に相当する。この一倍体細胞レパートリー、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊とＢＪ５４５７ｐＴＱ６−ＬＣ＊を、それぞれの独立クローンの少なくとも１０コピーが代表されるように、それぞれ１０μＬと３０μＬのグリセロールストックに接種し、選択培地（実施例１８）において一晩増殖させた。ＢＪ５４５７ｐＴＱ６−ＬＣ＊に対応する約１．６×１０６の一倍体細胞とＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊に対応する３×１０１０の一倍体細胞を接合させ（実施例１９）、選択培地で増殖させたときに、５×１０９の二倍体レパートリーを得た（ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊／ＢＪ５４５７ｐＴＱ６−ＬＣ＊と命名した）。１０個のクローンを摘出し、酵母コロニーＰＣＲ（実施例１１）によりＬＣ及びＨＣ含有ベクターの存在を試験したところ、いずれも予測されるＬＣ及びＨＣ産物を生じた。ＨＣ産物を表示して抗原ストレプトアビジンへの結合も示す、二倍体レパートリー、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊／ＢＪ５４５７ｐＴＱ６−ＬＣ＊の分画を決定するために、酵母全細胞ＥＬＩＳＡを実施した（実施例７）。試験した二倍体の６８％（１５／２２）がＨＣを表示し、試験した二倍体クローンの１８％（４／２２）がストレプトアビジンへの結合を示した。
この手順の汎用性を強調するために、野生型ＨＣ又は野生型ＬＣのいずれか一方が定常に保たれ、対応する反対の鎖のみが変化する、類似の序列的な（hierarchical）接合実験を実施した。抗ストレプトアビジンＦ２ Ｆａｂをモデル抗体として使用して、ＥＢＹ１００−ｐＴＱ５−Ｆ２ＨＣとＢＪ５４５７ｐＴＱ６−ＬＣ＊の接合から二倍体レパートリーを作製した。この二倍体レパートリーは、定常ＨＣと可変ＬＣを有する。この接合は、酵母全細胞ＥＬＩＳＡにより、二倍体の１００％がＨＣを表示し、３０％が抗原結合を示すことをもたらした。同様に、ＢＪ５４５７ｐＴＱ６−Ｆ２ＬＣをＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊と接合させることによって二倍体レパートリーを作製した。この二倍体レパートリーは、定常ＬＣと可変ＨＣを有する。この接合は、酵母全細胞ＥＬＩＳＡにより、二倍体の７０％がＨＣを表示し、４５％が抗原結合活性を示すことをもたらした。
コンビナトリアルに組み立てられたＦａｂレパートリーのアフィニティー選択
誤りがちのＰＣＲにより多様化される複数のコンビナトリアトルに組み立てられたＦａｂ抗体を表示する酵母細胞のレパートリーをアフィニティー選択することができることを例証するために、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒによる選択とアフィニティーによるフローサイトメトリー分取法の組合せを使用して最適アフィニティークローンを回収した。
誤りがちのＰＣＲにより多様化される複数のコンビナトリアトルに組み立てられたＦａｂ抗体を表示する酵母細胞のレパートリーをアフィニティー選択することができることを例証するために、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒによる選択とアフィニティーによるフローサイトメトリー分取法の組合せを使用して最適アフィニティークローンを回収した。
二倍体レパートリー、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊／ＢＪ５４５７ｐＴＱ６−ＬＣ＊（実施例２２）の一晩培養物を調製した（実施例１８）。この培養物を実施例１８のように誘導し、全部で１０１０個の細胞を１ラウンドのＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ選択にかけた（実施例７）。抗原結合性の酵母二倍体細胞を編集し、ＦＡＣＳアフィニティーによる選択にかけた（実施例２０を参照のこと）。抗原結合クローンの比率は、酵母全細胞ＥＬＩＳＡ（実施例７）により決定されるように、選択の間に増加した。抗原結合クローンの比率も増加し、ＦＡＣＳにより決定されるように、抗原平均蛍光強度も選択の間に増加した（表９）。
この選択キャンペーンの進捗はポリクローナルＦＡＣＳ分析を使用してモニターしたが、ここでは各ラウンドの選択からの選択レパートリーの一晩培養物を調製して、抗体発現を実施例１８のように誘導した。酵母細胞を実施例２０のように標識し、ＬＣディスプレイ（ＦＩＴＣ標識）と抗原結合（ＰＥ標識）の両方についてＦＡＣＳにより分析した。
選択したクローンを配列決定し、可変ＬＣと可変ＨＣにおける突然変異を表１０に示す。オフ速度スクリーニングアッセイ（実施例１０）又は非線形最小二乗解析のいずれかによるＦＡＣＳを使用して、選択したＦａｂのアフィニティーを決定した（データ示さず）。
ＬＣ及びＨＣの選択プールの再シャッフリング
本手順の汎用性と反復サイクルの選択及び再シャッフリングを行うことが可能であることを例証するために、コンビナトリアルＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊／ＢＪ５４５７ｐＴＱ６−ＬＣ＊レパートリーの第三選択ラウンド（実施例２３）のアウトプットからの選択ＬＣ及びＨＣのプールを再シャッフルした。
本手順の汎用性と反復サイクルの選択及び再シャッフリングを行うことが可能であることを例証するために、コンビナトリアルＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊／ＢＪ５４５７ｐＴＱ６−ＬＣ＊レパートリーの第三選択ラウンド（実施例２３）のアウトプットからの選択ＬＣ及びＨＣのプールを再シャッフルした。
溶解酵素処理（実施例１１）を使用してプラスミドＤＮＡを調製し、選択されたＬＣ及びＨＣを含有するｐＴＱ５−ＨＣ＊ｓｅｌ及びｐＴＱ６−ＬＣ＊ｓｅｌ発現プラスミドの両方を含有するＤＮＡ抽出物を新鮮なＥＢＹ１００及びＢＪ５４５７細胞へそれぞれ直に形質転換した。この形質転換混合物を、ＢＪ５４５７−ｐＴＱ６−ＬＣ＊ｓｅｌコロニーのみが増殖することができる選択プレート（ブラストサイジンを含有する選択アガープレート）又はＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊ｓｅｌのみが増殖することができる選択プレート（トリプトファン（−）の選択アガープレート）で増殖させた。ＢＪ５４５７ｐＴＱ６−ＬＣ＊ｓｅｌ形質転換により２５０個のコロニーを得て、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊ｓｅｌ形質転換により２５個のコロニーを得た。これら２つのミニレパートリーを採取し、実施例１８のように一晩増殖させて接合させた。この接合反応により、６２５０の異なるＬＣ／ＨＣ組合せの理論上のコンビナトリアルな多様性をカバーする、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊ｓｅｌ／ＢＪ５４５７ｐＴＱ６−ＬＣ＊ｓｅｌの二倍体レパートリーを得た。この二倍体培養物においてＦａｂ抗体発現を誘導し、ＡｕｔｏＭＡＣＳを使用して選択した。これは第四ラウンドの選択を表した。この第四の選択ラウンド由来の二倍体培養物を編集した。抗体発現を誘導し、その後でストレプトアビジンＰＥを０．５ｎＭで標識し、ＦＡＣＳを使用して選択した（実施例２０）。
ネーティブＨＣレパートリー酵母ディスプレイベクターと一倍体宿主細胞の構築
多重鎖真核ベクターセットの１つの成分として有用な新規の重鎖真核ディスプレイベクターを産生するために、ＨＣのネーティブレパートリーをベクターのｐＴＱ５へクローニングする（実施例１３）。
多重鎖真核ベクターセットの１つの成分として有用な新規の重鎖真核ディスプレイベクターを産生するために、ＨＣのネーティブレパートリーをベクターのｐＴＱ５へクローニングする（実施例１３）。
Ｖ遺伝子の末梢血リンパ球供給源より抗体ＨＣ断片を単離し、当該技術分野で知られている抗体ＰＣＲ法により単離する。当該技術分野で知られている技術に従ってファージディスプレイベクターにおいてＨＣライブラリーを捕捉してから、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ断片としてｐＴＱ５へ移行し、Ｅ．ｃｏｌｉへ形質転換し、約１×１０８のライブラリーを産生する。次いで、このライブラリーで酵母菌株のＥＢＹ１００へ形質転換し、約１×１０７のライブラリー、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊ｒｅｐを産生する。
ネーティブＬＣレパートリー酵母ディスプレイベクターと一倍体宿主細胞の構築
多重鎖真核ベクターセットの１つの成分として有用な新規の軽鎖真核ディスプレイベクターを産生するために、ＬＣのネーティブレパートリーをベクターのｐＴＱ６へクローニングする（実施例１６）。
多重鎖真核ベクターセットの１つの成分として有用な新規の軽鎖真核ディスプレイベクターを産生するために、ＬＣのネーティブレパートリーをベクターのｐＴＱ６へクローニングする（実施例１６）。
Ｖ遺伝子の末梢血リンパ球供給源より抗体ＬＣ断片を単離し、当該技術分野で知られている抗体ＰＣＲ法により単離する。当該技術分野で知られている技術に従ってファージディスプレイベクターにおいてＬＣライブラリーを捕捉してから、ＡｐａＬＩ／ＡｓｃＩ断片としてｐＴＱ６へ移行し、Ｅ．ｃｏｌｉへ形質転換し、約１×１０８のライブラリーを産生する。次いで、このライブラリーで酵母菌株のＷ３０３へ形質転換し、約１×１０７のライブラリー、Ｗ３０３ｐＴＱ５−ＬＣ＊ｒｅｐを産生する。
一倍体宿主細胞対の細胞融合と後続のアフィニティー選択を介したＬＣ／ＨＣ組換えライブラリー：フローサイトメトリーによる検出
新規のＦａｂ（二倍体）酵母ディスプレイライブラリーを産生するために、２つの（一倍体）宿主細胞集団（軽鎖断片のレパートリーを含有する第一の集団と重鎖断片のレパートリーを含有する第二の集団）を、細胞融合を可能にするのに十分な条件下で共存培養し、生じた二倍体集団を組換えＦａｂ（ＬＣ／ＨＣ）ライブラリーの発現及びディスプレイを可能にするのに十分な条件下で増殖させた。
新規のＦａｂ（二倍体）酵母ディスプレイライブラリーを産生するために、２つの（一倍体）宿主細胞集団（軽鎖断片のレパートリーを含有する第一の集団と重鎖断片のレパートリーを含有する第二の集団）を、細胞融合を可能にするのに十分な条件下で共存培養し、生じた二倍体集団を組換えＦａｂ（ＬＣ／ＨＣ）ライブラリーの発現及びディスプレイを可能にするのに十分な条件下で増殖させた。
実施例１８に概説した手順に従って、約１０１０のＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊ｒｅｐ酵母細胞（実施例２６より）を約１０１０のＷ３０３ｐＴＱ６−ＬＣ＊ｒｅｐ酵母細胞（実施例２２より）と接合させる。１０％の接合効率により、約１０９の二倍体レパートリーが生じる（従って、一倍体の親に個別成分のＬＣ及びＨＣレパートリーの出発多様性があれば、可能な最大１０１４通りのコンビナトリアルＬＣ／ＨＣ多様性のうち約１０９のＬＣ／ＨＣ組合せを捕捉する）。この二倍体レパートリーを培養し、ＬＣ及びＨＣの発現を誘導する（実施例１５を参照のこと）。この二倍体培養物をストレプトアビジン−ＦＩＴＣとともにインキュベートし、フローサイトメトリー分取法（実施例８を参照のこと）を使用してアフィニティー選択する。フローサイトメトリー（実施例９を参照のこと）を使用するオフ速度決定と、さらに、可溶性Ｆａｂ抗体を使用する当該技術分野で知られた表面プラスモン共鳴技術により、アフィニティー変異体をスクリーニングする。
二倍体胞子形成を介した、多重鎖ディスプレイ宿主細胞対ライブラリー：ＬＣ及びＨＣ一倍体酵母細胞レパートリーの産生
１つの細胞集団がアンカータンパク質へ連結する生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドの１本の鎖の複数の変異体を発現し；第二の細胞が多重鎖ポリペプチドの可溶性第二鎖の複数のポリペプチドを発現する、新規な宿主細胞対ライブラリーの１例として、実施例２３に記載のようなストレプトアビジン選択スクリーニングより生じる二倍体Ｆａｂ表示酵母単離物を、窒素飢餓の条件（Guthrie and Fink, 1991 に記載のような）下でこの単離物を培養することによって、胞子形成するように誘導する。胞子形成した二倍体を採取し、ザイモレース（zymolase）で処理し、音波処理し、濃縮プレート上でプレート培養する。
１つの細胞集団がアンカータンパク質へ連結する生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドの１本の鎖の複数の変異体を発現し；第二の細胞が多重鎖ポリペプチドの可溶性第二鎖の複数のポリペプチドを発現する、新規な宿主細胞対ライブラリーの１例として、実施例２３に記載のようなストレプトアビジン選択スクリーニングより生じる二倍体Ｆａｂ表示酵母単離物を、窒素飢餓の条件（Guthrie and Fink, 1991 に記載のような）下でこの単離物を培養することによって、胞子形成するように誘導する。胞子形成した二倍体を採取し、ザイモレース（zymolase）で処理し、音波処理し、濃縮プレート上でプレート培養する。
一倍体コロニーを２つのサブ試料へ分離する；第一のサブ試料は、ＬＣ発現ベクターの損失を促進するが、ＨＣディスプレイベクターを選択する条件下で増殖させ、第二のサブ試料は、ＨＣディスプレイベクターの損失を促進するが、ＬＣ発現ベクターを選択する条件下で増殖させる（非選択条件下での２μ派生プラスミドでは、プラスミド損失は世代につき２〜６％である）。数世代の後で、それぞれの酵母継代培養物から非選択鎖発現ベクターを有効に排除し、選択された（ＬＣ又はＨＣ）発現ベクターのみを含有し、それにより２つの偏性（即ち、予選択）単鎖発現一倍体酵母細胞を産生し、「ＨＡＰＬＯＩＤｐＴＱ６−ＬＣ＊ｓｅｌ」及び「ＨＡＰＬＯＩＤｐＴＱ５−ＨＣ＊ｓｅｌ」と命名した。予選択Ｆａｂの軽鎖又は予選択Ｆａｂの重鎖のいずれかをそれぞれ含有する、これら２つの一倍体酵母集団より、３つの接合方式を以下のように確立する：
第一の接合方式では、１０９の酵母ＨＡＰＬＯＩＤｐＴＱ６−ＬＣ＊ｓｅｌを１０９の酵母ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊ｒｅｐ（実施例２１より）と戻し接合し、ＬＣ及びＨＣ酵母発現プラスミドの両方を維持する選択条件下で増殖させる。１０パーセントの接合効率により約１０８の二倍体を生じる。この二倍体レパートリーを培養し、ＬＣ及びＨＣの発現を誘導する（実施例１８）。生じる二倍体培養物は、予選択ＬＣレパートリーに対して元のＨＣレパートリーのユニークな組合せを含有する偏性レパートリーを表し、これはさらに、例えば、フローサイトメトリー分取法（実施例８及び１１）及び／又は、可溶性Ｆａｂ抗体を使用する、当該技術分野で知られている表面プラスモン共鳴技術によりスクリーニングすることができる。
第一の接合方式では、１０９の酵母ＨＡＰＬＯＩＤｐＴＱ６−ＬＣ＊ｓｅｌを１０９の酵母ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ＊ｒｅｐ（実施例２１より）と戻し接合し、ＬＣ及びＨＣ酵母発現プラスミドの両方を維持する選択条件下で増殖させる。１０パーセントの接合効率により約１０８の二倍体を生じる。この二倍体レパートリーを培養し、ＬＣ及びＨＣの発現を誘導する（実施例１８）。生じる二倍体培養物は、予選択ＬＣレパートリーに対して元のＨＣレパートリーのユニークな組合せを含有する偏性レパートリーを表し、これはさらに、例えば、フローサイトメトリー分取法（実施例８及び１１）及び／又は、可溶性Ｆａｂ抗体を使用する、当該技術分野で知られている表面プラスモン共鳴技術によりスクリーニングすることができる。
第二の接合方式では、１０９の酵母ＨＡＰＬＯＩＤｐＴＱ６−ＨＣ＊ｓｅｌを１０９の酵母Ｗ３０３ｐＴＱ６−ＬＣ＊ｒｅｐ（実施例２２）と戻し接合し、ＬＣ及びＨＣ酵母発現プラスミドの両方を維持する選択条件下で増殖させる。１０パーセントの接合効率により約１０８の二倍体を生じる。この二倍体レパートリーを培養し、ＬＣ及びＨＣの発現を誘導する（実施例１８）。生じる二倍体培養物は、予選択ＨＣレパートリーに対して元のＬＣレパートリーのユニークな組合せを含有する偏性レパートリーを表し、これはさらに、例えば、フローサイトメトリー分取法（実施例８及び１１）及び／又は、可溶性Ｆａｂ抗体を使用する、当該技術分野で知られている表面プラスモン共鳴技術によりスクリーニングすることができる。
最後に、第三の接合方式では、１０９の酵母ＨＡＰＬＯＩＤｐＴＱ６−ＬＣ＊ｓｅｌを１０９の酵母ＨＡＰＬＯＩＤｐＴＱ６−ＨＣ＊ｓｅｌと接合し、ＬＣ及びＨＣ酵母発現プラスミドの両方を維持する選択条件下で増殖させる。１０パーセントの接合効率により約１０８の二倍体を生じる。この二倍体レパートリーを培養し、ＬＣ及びＨＣの発現を誘導する（実施例１８を参照のこと）。生じる二倍体培養物は、予選択ＨＣレパートリーに対して予選択ＬＣレパートリーのユニークな組合せを含有する偏性の組換えレパートリーを表し、これはさらに、例えば、フローサイトメトリー分取法（実施例８及び１１）及び／又は、可溶性Ｆａｂ抗体を使用する、当該技術分野で知られている表面プラスモン共鳴技術によりスクリーニングすることができる。
Ｆａｂ抗体の制限ベース多様化によるアフィニティー成熟化
酵母ディスプレイ及び選択を使用する、アフィニティー成熟化のためのＦａｂ抗体の制限ベース多様化及びシャッフリングの有用性を例証するために、リード標的特異的なＦａｂよりＦａｂ抗体ライブラリーを調製し、制限ベースクローニングを使用して、全ＬＣ又はＨＣの断片のいずれかを多様化する。１つの好ましい方法において、抗体Ｖ遺伝子配列を一括するとともにＶ遺伝子配列に対して内部にある制限部位を伴って構築する抗体ライブラリーを使用して、クローニング用の複数の抗体遺伝子断片を調製し、それによりリード抗体の多様化をもたらす。
酵母ディスプレイ及び選択を使用する、アフィニティー成熟化のためのＦａｂ抗体の制限ベース多様化及びシャッフリングの有用性を例証するために、リード標的特異的なＦａｂよりＦａｂ抗体ライブラリーを調製し、制限ベースクローニングを使用して、全ＬＣ又はＨＣの断片のいずれかを多様化する。１つの好ましい方法において、抗体Ｖ遺伝子配列を一括するとともにＶ遺伝子配列に対して内部にある制限部位を伴って構築する抗体ライブラリーを使用して、クローニング用の複数の抗体遺伝子断片を調製し、それによりリード抗体の多様化をもたらす。
１つのそのような抗体ライブラリー（例えば、ＣＪライブラリーセット、Ｄｙａｘ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）より単離したリード抗体をこのアプローチによりアフィニティー成熟化させることができる。例えば、ＣＪファージミドライブラリーを含む抗体は、ユニークなＡｐａＬ１及びＡｃｓＩ制限部位により一括されるＬＣと、ユニークなＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限部位により一括されるＨＣを有する。このＨＣはまた、ＣＤＲ２配列とＣＤＲ３配列の間に、内部のユニークなＸｂａＩ制限部位を含有する。
単一抗原特異的なリード抗体又は抗原特異的リード抗体のプールのいずれかにおいてＬＣを多様化させるために、はじめにＦａｂ抗体遺伝子を実施例２のように酵母ディスプレイベクターのｐＴＱ３へクローニングし、ｐＴＱ３−Ｆａｂを生じる。ＣＪファージミドライブラリーのＤＮＡ調製物より、ＡｐａＬ１及びＡｓｃＩ制限酵素での制限消化によって、複数のＬＣを単離する。ｐＴＱ３−ＦａｂもＡｐａＬ１及びＡｓｃＩで消化し、内因性ＬＣを複数のＬＣに置き換えて、レパートリー、ｐＴＱ３−ＬＣｃｊ−ｒｅｐを生じる。次いで、このレパートリーを酵母菌株のＥＢＹ１００へ移行させ、ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−ＬＣｃｊ−ｒｅｐを得る。
抗原特異的なリード抗体又は抗原特異的リード抗体のプールのいずれかにおいてＶＨＣＤＲ１−２を多様化させるために、はじめにＦａｂ抗体遺伝子を実施例２のように酵母ディスプレイベクターのｐＴＱ３へクローニングし、ｐＴＱ３−Ｆａｂを得る。ＣＪファージミドライブラリーより、ＳｆｉＩ及びＸｂａＩでの制限消化によって、複数のＶＨＣＤＲ１−２断片を単離する。ｐＴＱ３−ＦａｂもＳｆｉＩ及びＸｂａＩで消化し、内因性ＶＨＣＤＲ１−２断片を複数のＶＨＣＤＲ１−２断片に置き換えて、レパートリー、ｐＴＱ３−ＶＨＣＤＲ１−２ｃｊ−ｒｅｐを生じる。次いで、このレパートリーを酵母菌株のＥＢＹ１００へ移行させ、ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−ＶＨＣＤＲ１−２ｃｊ−ｒｅｐを得る。
当業者には、このクローニング手順がいくつかの異なる方法において、例えば、はじめにＶＨＣＤＲ１−２のレパートリーを構築してから、抗原特異的ＶＨＣＤＲ３又はＶＨＣＤＲ３のプールにおいてクローニングすることによって実施することができることが明らかであろう。
ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−ＶＨＣＤＲ１−２ｃｊ−ｒｅｐ及びＥＢＹ１００ｐＴＱ３−ＬＣｃｊ−ｒｅｐの培養物を実施例２のように調製する。次いで、この酵母培養物を、実施例１０のようにＬＣディスプレイと抗原結合のために標識して、フローサイトメトリー分取法によりアフィニティー選択する。次いで、実施例１０のように、選択したクローンについてそのＤＮＡ配列とアフィニティーにおけるその改善を解析する。
酵母接合を使用する遺伝子断片のコンビナトリアルシャッフリングによるアフィニティー成熟化
酵母接合が抗原特異的リード抗体又は抗原特異的リード抗体群のコンビナトリアル遺伝子多様化とアフィニティー成熟のために使用することができることを例証するために、選択したＬＣ又はＬＣのプールを再多様化させるか、又は選択したＨＣ又はＨＣのプールのＶＨＣＤＲ１−２断片を再多様化させる。ＣＪファージミドライブラリーを含む抗体は、そのようなアプローチへ適用可能である。それらは、ユニークなＡｐａＬ１及びＡｓｃＩ制限部位により一括されるＬＣとユニークなＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限部位により一括されるＨＣを有する。このＨＣはまた、ＣＤＲ２配列とＣＤＲ３配列の間に、内部のユニークなＸｂａＩ制限部位を含有する。このＬＣとＨＣが反対の接合型の酵母細胞中に存在するので、酵母接合を使用して、抗原特異的ＬＣを複数のＶＨＣＤＲ１−２断片と、又は抗原特異的ＨＣを複数のＬＣと一緒にし、それによりＬＣをＨＣと対合させる制限ベースのクローニングが必要でなくなる。
酵母接合が抗原特異的リード抗体又は抗原特異的リード抗体群のコンビナトリアル遺伝子多様化とアフィニティー成熟のために使用することができることを例証するために、選択したＬＣ又はＬＣのプールを再多様化させるか、又は選択したＨＣ又はＨＣのプールのＶＨＣＤＲ１−２断片を再多様化させる。ＣＪファージミドライブラリーを含む抗体は、そのようなアプローチへ適用可能である。それらは、ユニークなＡｐａＬ１及びＡｓｃＩ制限部位により一括されるＬＣとユニークなＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限部位により一括されるＨＣを有する。このＨＣはまた、ＣＤＲ２配列とＣＤＲ３配列の間に、内部のユニークなＸｂａＩ制限部位を含有する。このＬＣとＨＣが反対の接合型の酵母細胞中に存在するので、酵母接合を使用して、抗原特異的ＬＣを複数のＶＨＣＤＲ１−２断片と、又は抗原特異的ＨＣを複数のＬＣと一緒にし、それによりＬＣをＨＣと対合させる制限ベースのクローニングが必要でなくなる。
抗原特異的リード抗体又は抗原特異的リード抗体のプールを多様化させる１つの好ましい方法において、成分のＨＣ抗体遺伝子を実施例１３のように酵母ディスプレイベクターのｐＴＱ５へクローニングし、ｐＴＱ−ＨＣＡｇを得る。ＣＪファージミドライブラリー由来のＨＣ断片の、ＳｆｉＩ及びＸｂａＩ制限酵素での制限消化により、複数のＶＨＣＤＲ１−２断片を調製する。次いで、この複数のＶＨＣＤＲ１−２断片を、ＳｆｉＩ及びＸｂａＩですでに消化して内因性ＶＨＣＤＲ１−２断片を除去し、複数のＶＨＣＤＲ１−２断片で置き換え、抗原特異的ＶＨＣＤＲ３は保持されている、ｐＴＱ５−ＨＣＡｇより調製したＤＮＡへクローニングする。これにより、ｐＴＱ５−ＶＨＣＤＲ１−２（ＣＤＲ３Ａｇ）と命名されるライブラリーを得て、これを酵母菌株のＥＢＹ１００へ導入し、レパートリー、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＶＨＣＤＲ１−２（ＣＤＲ３Ａｇ）を得る。ＣＪファージミドライブラリーのＤＮＡ調製物より、ＡｐａＬ１及びＡｓｃＩでの制限消化によって、複数のＬＣを単離する。この複数のＬＣをｐＴＱ６へクローニングしてレパートリー、ｐＴＱ６−ＬＣｒｅｐを得て、他の標的に特異的な他の抗体のアフィニティー成熟化のための１つのマスターレパートリーとして役立てる。次いで、このレパートリーを反対の接合型の酵母菌株、ＢＪ５４５７へ移行して、ＢＪ５４５７ｐＴＱ６−ＬＣｒｅｐを得る。
ＬＣとＶＨＣＤＲ１−２遺伝子断片の両方の同時多様化を可能にする、１つの接合方式において、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＶＨＣＤＲ１−２（ＣＤＲ３Ａｇ）及びＢＪ５４５７ｐＴＱ６−ＬＣｒｅｐの培養物を実施例２２のように調製する。この２つのレパートリーを互いに接合し（実施例１９を参照のこと）、二倍体レパートリーのＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＶＨＣＤＲ１−２（ＣＤＲ３Ａｇ）／ＢＪ５４５７ｐＴＱ６−ＬＣｒｅｐを得る。Ｆａｂ抗体発現を誘導し（実施例１８を参照のこと）、実施例２０のように二倍体レパートリーをアフィニティー選択する。選択したクローンについて、実施例２３のようにアフィニティー改善を解析する。
本発明をその好ましい態様を参照にして特別に示して記載してきたが、当業者は、付帯の特許請求項により含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細において様々な変更を本発明においてなし得ることを理解されよう。
本発明の前記及び他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面（ここでは、類似の参照記号が異なる図面を通して同じ部分を意味する）に例示されるように、以下の本発明の好ましい態様のより特定の記載より明らかとなろう。この図面は、必ずしも正しい尺度ではなく、むしろ本発明の原理を例示することに力点が置かれる。
図１は、ファージディスプレイ−真核ディスプレイ移行系を例示する概略図である。Ｆａｂポリペプチド鎖をコードする遺伝情報は、ファージディスプレイベクターから本発明の多重鎖真核ベクターへ単一の切断された核酸として移行する。次いで、望まれない介在遺伝子要素を（もしあれば）置き換える。
図２は、ファージディスプレイ／真核ディスプレイ移行系を例示する概略図であり、ここでは、Ｆａｂポリペプチド鎖をコードする遺伝情報がファージディスプレイベクターから本発明の多重鎖真核ベクターへ独立して、そして別個に移行される。
図３は、本発明に記載の多重鎖酵母ディスプレイベクター、ｐＴＱ３の概略図であり、多重鎖ポリペプチドの少なくとも２本の鎖（例えば、Ｆａｂの軽鎖及び重鎖成分）の挿入のためのユニークなクローニング部位を、この２本の鎖がタンデムＧＡＬ１プロモーターの誘導により独立して発現されるように配置された追加要素とともに有する。このベクターにおいて、第一鎖（例えば、Ｉｇ軽鎖）は、ＡｐａＬＩ／ＡｓｃＩ断片として挿入され、Ａｇａ２ｐシグナル配列（Ａｇａ２ｐ／ｓｓ）を使用して可溶性分泌タンパク質として発現され、ＨＡエピトープタグと融合する。第二鎖（例えばＩｇ重鎖断片）は、ＳｆｉＩ／ＮｏｆＩ断片として挿入され、Ａｇａ２ｐ／ｓｓと固着性タンパク質サブユニット（成熟Ａｇａ２ｐ）を使用して、細胞表面結合性融合タンパク質として発現される。同様に、第二鎖は、ｍｙｃエピトープタグと融合する。プラスミド複製に有用な他の要素（例えばｐＭＢ１−ｏｒｉ及びＣｅｎ６／ＡＲＳＨ４）と選択マーカーとして有用な他の要素（即ち、ａｍｐＲ及びＴＲＰ）も示す。
融合タンパク質の独立した発現を例証するデータの代表例である。図４Ａは、酵母宿主細胞ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２及びＥＢＹ１００ｐＴＱ３−ＰＨ１における４５ｋＤ Ａｇａ２ｐ−ＶＨ−ＣＨ１融合タンパク質の発現を示す。いずれか一方が空き（empty）のベクター対照においては、融合産物を検出しなかった。それぞれの宿主細胞について、酵母ディスプレイベクターにおいて作動可能なＧＡＬ１プロモーターのガラクトース誘導の前（−）と後（＋）の両方で試料を調製した。
融合タンパク質の独立した発現を例証するデータの代表例である。図４Ｂは、酵母宿主細胞ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２及びＥＢＹ１００ｐＴＱ３−ＰＨ１における３０ｋＤ ＶＬ−ＣＬ鎖の発現を示す。いずれか一方が空き（empty）のベクター対照においては、融合産物を検出しなかった。それぞれの宿主細胞について、酵母ディスプレイベクターにおいて作動可能なＧＡＬ１プロモーターのガラクトース誘導の前（−）と後（＋）の両方で試料を調製した。
融合タンパク質の独立した発現を例証するデータの代表例である。図４Ｃは、酵母細胞表面で組み立てられたＦａｂ抗体の免疫蛍光検出の代表例である。（ａ）位相差（ｂ）ＨＣの検出（ｃ）ＬＣの検出。
図５Ａ〜５Ｃは、サイトメトリープロットの系列を表す。図５Ａは、ｐＴＱ３−Ｆ２（左パネル）及びｐＴＱ３−ＰＨ１（右パネル）構築体で形質転換し、未処理のままである（点線）か、２０℃で４８時間誘導した（薄灰色の線）酵母細胞を図示する。フローサイトメトリーを使用して、重鎖（ａ）、軽鎖ディスプレイ（ｂ）、及び抗原結合（ｃ）を解析した。
図６は、酵母宿主細胞ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２、ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ａ１２、及びＥＢＹ１００ｐＴＱ３−４Ｃ８の表面に表示された３つの異なる抗ストレプトアビジンＦａｂの全細胞ＥＬＩＳＡを例示するヒストグラムプロットである。それぞれ、抗原結合、ＬＣディスプレイ、及びＨＣディスプレイを示す。
図７は、酵母細胞混合物のサイトメトリープロットである。ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２、ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ａ１２、及びＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ａ１２／ｐＥＳＣを、抗原結合とＬＣディスプレイの両方のために二重標識した。抗原結合に対するＬＣディスプレイのプロットと正規化した抗原結合のゲート（gating）を示す。
酵母レパートリーと個別に選択された酵母クローンへの異なる抗原濃度での結合を示すデータの代表例である。図８Ａは、非選択ライブラリー（ａ）と選択ラウンド１、２、及び３（ｂ，ｃ，ｄ）のポリクローナル産出物について、抗原結合及びＦａｂディスプレイのヒストグラム系列を示す。多様化した抗ストレプトアビジン酵母レパートリーを３ラウンドのＦＡＣＳへかけた。それぞれのライブラリー選択に使用した分取（sorting）ゲートを示す。
酵母レパートリーと個別に選択された酵母クローンへの異なる抗原濃度での結合を示すデータの代表例である。図８Ｂは、抗ストレプトアビジンレパートリーのＦＡＣＳアフィニティー選択キャンペーンの、様々な抗原濃度でのポリクローナルＦＡＣＳ解析を示す。抗原結合とＦａｂディスプレイの両方のために標識した二変系サイトメトリープロットの系列は、抗原結合のＦａｂディスプレイに対する比率の増加を示し、酵母細胞の集団が増加することを示す。
酵母レパートリーと個別に選択された酵母クローンへの異なる抗原濃度での結合を示すデータの代表例である。図８Ｃは、抗ＨＡ ｍＡｂとストレプトアビジン−ＰＥで標識した、野生型Ｆ２（「○」で表す）と突然変異体Ｒ２Ｅ１０（三角で表す）、Ｒ３Ｂ１（四角で表す）、及びＲ３Ｈ３（菱形で表す）を表示する酵母細胞より得られたデータを示す。ストレプトアビジン結合の平均蛍光を経時的にモニターした。直線の傾きより解離速度定数を算出する。
酵母レパートリーと個別に選択された酵母クローンへの異なる抗原濃度での結合を示すデータの代表例である。図８Ｄは、ＦＡＣＳと組み合わせたＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ（左カラム）かＦＡＣＳ単独（右カラム）のいずれかを使用する２つの選択キャンペーンのサイトメトリープロット系列を示す。このサイトメトリープロットは、非選択（ａ）、ラウンド１（ｂ）、及びラウンド２（ｃ）の選択を通して抗原結合細胞の比率が増加することを示す。
図９は、誘導ＧＡＬ１プロモーターの制御下に重鎖断片挿入を有する、本発明に記載の重鎖酵母ディスプレイベクター、ｐＴＱ５−ＨＣの概略図である。Ｉｇ重鎖断片は、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ挿入断片として位置し、Ａｇａ２ｐシグナル配列（Ａｇａ２ｐ／ｓｓ）と固着性タンパク質サブユニット（Ａｇａ２ｐタンパク質）を使用して、細胞表面結合性融合タンパク質として発現される。重鎖断片（ＨＣ）は、ｍｙｃエピトープタグへ融合する。プラスミド複製に必要な他の要素（即ち、ｐＭＢ１−ｏｒｉ及びＣｅｎ６／ＡＲＳＨ４）や酵母接合に必要な他の要素（即ち、Ｍａｔαターミネーター）、及び選択マーカーとして有用な他の要素（即ち、ａｍｐＲ及びＴＲＰ）も示す。
図１０は、（対照）空きベクター酵母宿主細胞ＥＢＹ１００ｐＴＱ５（レーン１）と（標準）Ｆａｂディスプレイベクター酵母宿主細胞ＥＢＹ１００ｐＴＱＦ２（レーン３）に比較した、一倍体の親酵母細胞ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ（レーン２）において抗ｃ−Ｍｙｃ抗体で検出される、４５ｋＤ Ａｇａ２ｐ−ＨＣ融合産物の発現を例証するウェスタンブロットの代表例である。
図１１は、０に等しい時間（即ち、バックグラウンド；黒の実線）と誘導後４８時間（点線）での軽鎖の存在がない、酵母細胞の表面でのＨＣディスプレイを示すサイトメトリープロットの系列である。酵母細胞ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣと対照酵母細胞ＥＢＹ１００ｐＴＱ５を抗ＣＨ１とウサギ抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣで標識してＨＣの存在を検出し、また、ストレプトアビジンＦＩＴＣ（ｓｔｒｅｐ−ＦＩＴＣ）で標識して抗原結合活性を酵母表面で検出した。酵母細胞表面にはＨＣだけが表示されるのが見られるが、対のＬＣの非存在時には、抗原結合活性を少しも有さない。
図１２は、誘導ＧＡＬ１プロモーターの制御下に軽鎖挿入を有する、本発明に記載の軽鎖酵母ディスプレイベクター、ｐＴＱ６−ＬＣの概略図である。Ｉｇ軽鎖は、ＡｐａＬＩ／ＡｓｃＩ挿入断片として位置し、Ａｇａ２ｐ／ｓｓを使用して可溶性タンパク質として発現される。軽鎖断片（ＬＣ）はまた、ＨＡエピトープタグと融合する。プラスミド複製に有用な他の要素（即ち、ｐＵＣ１−ｏｒｉ及びＣｅｎ６／ＡＲＳＨ４）や選択マーカーとして有用な他の要素（即ち、ａｍｐＲ及びブラストサイジン（登録商標））も示す。
図１３は、（対照）空きベクター酵母宿主細胞Ｗ３０３ｐＹＣ６（レーンＳ１）に比較した、一倍体の親酵母細胞Ｗ３０３ｐＴＱ６−ＬＣ（レーンＳ２）において抗ＨＡ抗体で培養上清中に検出される、６０ｋＤ軽鎖ポリペプチドの発現を例証するウェスタンブロットの代表例である。
図１４は、誘導した二倍体酵母細胞（ＤＩＰＬＯＩＤ ＬＣ／ＨＣ）と対照の空きベクター酵母宿主細胞Ｗ３０３ｐＹＣ６、及び標準Ｆａｂディスプレイベクター酵母宿主細胞ＥＢＹ１００ｐＴＱ３−Ｆ２に比較した、親の一倍体酵母細胞（Ｗ３０３ｐＴＱ６−ＬＣ及びＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ）の細胞表面でのストレプトアビジン結合活性の全細胞ＥＬＩＳＡ定量を例示するヒストグラムプロットである。
図１５Ａ〜１５Ｃは、抗ストレプトアビジン一倍体ＨＣ親（Ａ）、及び空きＬＣ及びＨＣ発現プラスミドを含有する二倍体対照（Ｂ）、及びストレプトアビジン特異的Ｆａｂをその表面上に発現する陽性二倍体（Ｃ）での抗原結合と軽鎖ディスプレイを示すＦＡＣＳヒストグラムの系列である。
図１６は、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５をＷ３０３ｐＹＣ６と接合させることによって生じる（対照）二倍体酵母細胞（レーン２）と、親のＬＣベクター酵母宿主細胞Ｗ３０３ｐＴＱ６−ＬＣ（レーン１）に比較した、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣをＷ３０３ｐＹＣ６−ＬＣと接合させることによって生じる二倍体酵母細胞（レーン３）において抗ＨＡ抗体で検出される、３０ｋＤ ＬＣポリペプチドの発現を例証するウェスタンブロットの代表例である。
図１７は、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５をＷ３０３ｐＹＣ６と接合させることによって生じる（対照）二倍体酵母細胞（レーン４）、親のＨＣベクター酵母宿主細胞ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣ（レーン３）、標準Ｆａｂディスプレイベクター酵母宿主細胞ＥＢＹ１００ｐＴＱ３Ｆ２（レーン２）、及び（対照）空きベクター酵母宿主細胞ＥＢＹ１００ｐＴＱ５（レーン１）に比較した、ＥＢＹ１００ｐＴＱ５−ＨＣをＷ３０３ｐＹＣ６−ＬＣと接合させることによって生じる二倍体酵母細胞（レーン５）において抗ｃ−Ｍｙｃ抗体で検出される、４５ｋＤ Ａｇａ２ｐ−ＨＣ融合産物の発現を例証するウェスタンブロットの例示である。
図１８Ａ〜１８Ｃは、酵母二倍体細胞の表面でコンビナトリアルに組み立てられたＦａｂ抗体の免疫蛍光検出の代表例である。（Ａ）ＬＣディスプレイ（Ｂ）ＨＣディスプレイ（Ｃ）抗原結合。上列は免疫蛍光を示し、下列は位相差を示す。
Claims (28)
- （a）細胞表面アンカーへ連結する生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドの第一鎖を含むポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一の一倍体真核細胞を提供する工程；
（b）多重鎖ポリペプチドの第二鎖を含むポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二の一倍体真核細胞を提供する工程；
（c）第一の一倍体真核細胞と第二の一倍体真核細胞を、これらの細胞が融合するのに十分な条件下で接触させて、二倍体真核細胞を産生する工程；及び
（d）前記二倍体真核細胞を、多重鎖ポリペプチドの両鎖の発現及び会合を可能にするのに十分な条件下で培養する工程であって、多重鎖ポリペプチドの第一鎖が細胞表面アンカーによって二倍体真核細胞の表面に結合し、そして多重鎖ポリペプチドの生物活性が、二倍体真核細胞の表面で現れる、前記工程；
を含む、少なくとも2つのポリペプチド鎖を含む生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドを二倍体真核細胞の表面に表示する方法。 - 第一の一倍体真核細胞と第二の一倍体真核細胞が反対の接合型である、請求項1に記載の方法。
- （a）細胞表面アンカーへ連結するIg重鎖のVH領域及びCH1領域を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一の一倍体酵母細胞を提供する工程；
（b）Ig軽鎖を含む第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含む、第二の一倍体酵母細胞を提供する工程；
（c）第一の一倍体酵母細胞と第二の一倍体酵母細胞を、これらの細胞が融合するのに十分な条件下で接触させて、二倍体酵母細胞を産生する工程；並びに
（d）前記二倍体酵母細胞を、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドの発現及び会合を可能にするのに十分な条件下で培養する工程であって、Fabの第一のポリペプチドが細胞表面アンカーによって二倍体酵母細胞の表面に結合し、そしてFabが、二倍体酵母細胞の表面に表示される、前記工程；
を含む、Fabを二倍体酵母細胞の表面に表示する方法。 - 第一の一倍体酵母細胞と第二の一倍体酵母細胞が反対の接合型である、請求項3に記載の方法。
- 第一の一倍体酵母細胞及び第二の一倍体酵母細胞がSaccharomyces cerevisiaeの細胞である、請求項4に記載の方法。
- （a)細胞表面アンカーへ連結する生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドの第一鎖変異体を含むポリペプチドをそれぞれコードする複数の第一のポリヌクレオチドを含む第一の一倍体真核細胞集団を提供する工程；
（b）多重鎖ポリペプチドの第二鎖変異体をそれぞれコードする複数の第二のポリヌクレオチドを含む、第一の一倍体真核細胞集団の接合型とは反対の接合型の第二の一倍体真核細胞集団を提供する工程；
（c）第一の一倍体真核細胞集団と第二の一倍体真核細胞集団を、異なる接合型の個別細胞が融合するのに十分な条件下で接触させて、二倍体真核細胞の集団を産生する工程；
（d）前記二倍体真核細胞を、多重鎖ポリペプチドの両鎖の発現及び会合を可能にするのに十分な条件下で培養する工程であって、多重鎖ポリペプチドの第一鎖変異体が細胞表面アンカーによって二倍体真核細胞の表面に結合し、そして多重鎖ポリペプチドの生物活性が、二倍体真核細胞の表面で現れる、前記工程；並びに
（e）目的とする具体的な生物活性を検出する工程；
を含む、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドを多重鎖ポリペプチドライブラリーより検出する方法。 - （f）生物活性を表示する二倍体真核細胞を単離する工程をさらに含む、請求項6に記載の方法。
- （g）工程（d）、（e）及び（f）を繰り返す工程をさらに含む、請求項7に記載の方法。
- （g）工程（f）の単離二倍体真核細胞を、単離二倍体真核細胞が減数分裂をするのに十分な条件下で培養して、一倍体真核細胞を産生する工程；
（h）工程（g）からの一倍体真核細胞を、異なる接合型の真核細胞が融合するのに十分な条件下で接触させて、二倍体真核細胞の集団を産生する工程；並びに
（i）工程（d）、（e）及び（f）を繰り返す工程、
をさらに含む請求項7に記載の方法。 - （g）工程（f）の単離二倍体真核細胞を、単離二倍体真核細胞が減数分裂をするのに十分な条件下で培養して、一倍体真核細胞を産生する工程；
（h）工程（g）からの一倍体真核細胞を、以下から成る群より選択される１以上の一倍体真核細胞集団と、異なる接合型の真核細胞が融合するのに十分な条件下で接触させて、二倍体真核細胞の集団を産生する工程：
（i）工程（a）の第一の一倍体真核細胞集団；
（ii）工程（b）の第二の一倍体真核細胞集団；
（iii）細胞表面アンカーへ連結する生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドの第一鎖変異体を含むポリペプチドをコードする複数の第一のポリヌクレオチドを含む、第二の一倍体真核細胞集団の接合型とは反対の接合型の第三の一倍体真核細胞集団；及び
（iv）多重鎖ポリペプチドの第二鎖変異体をそれぞれコードする複数の第二のポリヌクレオチドを含む、第一の一倍体真核細胞集団の接合型とは反対の接合型の第四の一倍体真核細胞集団；並びに
（i）工程（d）、（e）及び（f）を繰り返す工程；
をさらに含む請求項7に記載の方法。 - 細胞表面アンカーのアミノ酸配列が、該細胞表面アンカーと融合するポリペプチドのアミノ酸配列と共には天然には生じないものである、請求項1、3、または6に記載の方法。
- 多重鎖ポリペプチドの第二鎖が細胞表面アンカーに連結していない、請求項1、3、または6に記載の方法。
- （a）細胞表面アンカーへ連結する生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドの第一鎖を含むポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一の一倍体真核細胞であって、多重鎖ポリペプチドの第一鎖が細胞表面アンカーによって一倍体真核細胞の表面に結合する、前記第一の一倍体真核細胞；及び
（b）多重鎖ポリペプチドの第二鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二の一倍体真核細胞；
を含む一対の一倍体真核細胞。 - 第一の一倍体真核細胞と第二の一倍体真核細胞が反対の接合型である、請求項13に記載の一倍体真核細胞対。
- 多重鎖ポリペプチドが二本鎖ポリペプチドである、請求項13に記載の一倍体真核細胞対。
- 多重鎖ポリペプチドが2本の第一鎖と2本の第二鎖とからなる四本鎖ポリペプチドである、請求項13に記載の一倍体真核細胞対。
- 多重鎖ポリペプチドが、免疫グロブリンFab断片、T細胞受容体の細胞外ドメイン、MHCクラスI分子、及びMHCクラスII分子から成る群より選択される二本鎖ポリペプチドである、請求項13に記載の一倍体真核細胞対。
- アンカーが真核細胞の細胞表面タンパク質である、請求項13に記載の一倍体真核細胞対。
- 細胞表面アンカーのアミノ酸配列が、該細胞表面アンカーと融合するポリペプチドのアミノ酸配列と共には天然には生じないものである、請求項13に記載の一倍体真核細胞対。
- 多重鎖ポリペプチドの第二鎖が細胞表面アンカーに連結していない、請求項13に記載の一倍体真核細胞対。
- 請求項13に記載の複数の真核宿主細胞対の融合産物である、複数の二倍体細胞を含む、真核宿主細胞ライブラリー。
- 複数の二倍体細胞が多重鎖ポリペプチドの異種集団を表示する、請求項21に記載の真核宿主細胞ライブラリー。
- （a）細胞表面アンカーへ連結する生物学的に活性な多重鎖ポリペプチドの第一鎖を含むポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一の一倍体酵母細胞；及び
（b）多重鎖ポリペプチドの第二鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二の一倍体酵母細胞、
を含む一対の一倍体酵母細胞。 - 第一の一倍体酵母細胞と第二の一倍体酵母細胞が反対の接合型である、請求項23に記載の一倍体酵母細胞対。
- 細胞表面アンカーのアミノ酸配列が、該細胞表面アンカーと融合するポリペプチドのアミノ酸配列と共には天然には生じないものである、請求項23の一倍体酵母細胞対。
- 多重鎖ポリペプチドの第二鎖が細胞表面アンカーに連結していない、請求項23の一倍体酵母細胞対。
- 請求項23に記載の複数の酵母細胞対の融合産物である複数の二倍体細胞を含む酵母ディスプレイライブラリー。
- 複数の二倍体細胞がFabの異種集団を表示する、請求項27に記載の酵母ディスプレイライブラリー。
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