JP5696300B1 - Automatic electroimmuno-staining system - Google Patents
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Abstract
【課題】免疫組織染色を迅速化且つ自動化し、術中迅速病理診断に利用可能とする。【解決手段】自動電界免疫組織染色装置１を、試料載置ユニット２、溶液供給ユニット３、電界撹拌ユニット４及び洗浄ユニット５を備えて構成し、組織標本Ｔが固定されているガラス基板Ｇを載置する試料載置ユニット２と、上部電極４１を備える電界撹拌ユニット４とを連動させて組織標本Ｔ中の抗原を賦活化し、試料載置ユニット２と、各種の溶液を収容している溶液供給ユニット３とを連動させて組織標本Ｔに対して一次抗体を含む溶液Ｓを供給し、試料載置ユニット２と電界撹拌ユニット４とを連動させて組織標本Ｔ中の抗原と一次抗体との抗原抗体反応を進め、電界撹拌ユニット４と洗浄ユニット５とを連動させて、一次抗体を含む溶液Ｓを排出したり、洗浄液を供給したりすることにより、組織標本Ｔを洗浄し、免疫組織染色の迅速化及び自動化を図る。【選択図】図１The immunohistological staining is accelerated and automated, and can be used for intraoperative pathological diagnosis. An automatic electric field immunohistochemical staining apparatus (1) comprises a sample placement unit (2), a solution supply unit (3), an electric field stirring unit (4), and a washing unit (5), and a glass substrate (G) on which a tissue specimen (T) is fixed. The sample placement unit 2 and the electric field agitation unit 4 including the upper electrode 41 are interlocked to activate the antigen in the tissue specimen T, and the sample placement unit 2 and a solution containing various solutions The solution S containing the primary antibody is supplied to the tissue specimen T in conjunction with the supply unit 3, and the antigen in the tissue specimen T and the primary antibody are linked in conjunction with the sample mounting unit 2 and the electric field stirring unit 4. By proceeding with the antigen-antibody reaction, the electric field agitation unit 4 and the washing unit 5 are linked to discharge the solution S containing the primary antibody or supply the washing solution, thereby washing the tissue specimen T and immunohistochemical staining. Speeded up and automated. [Selection] Figure 1
Description
本発明は、例えば、外科手術や内視鏡手術時の限られた時間内に、被験対象となる組織標本（病変部）の性質を特定する術中迅速病理診断に利用することが可能な自動電界免疫組織染色装置及び、自動電界免疫組織染色方法に関する。 The present invention provides, for example, an automatic electric field that can be used for intraoperative rapid pathological diagnosis that specifies the characteristics of a tissue specimen (lesion) to be tested within a limited time during surgery or endoscopic surgery. The present invention relates to an immune tissue staining apparatus and an automatic electric field immune tissue staining method.
物理的な現象として、高電圧交流電界によってクーロン力が発生し、このクーロン力で液滴が一方向に吸引されることが知られる。与える高電圧の極性変化によって液滴が振動することも知られる。液滴が吸引され、振動すれば、液滴内に存在する微細物は撹拌されることになる。本発明者らは、これらの物理的な現象に着目し、高電圧交流電界を与えることで、１ｍＬ以下、特に５０から数１００μＬオーダーの微少量の液滴を非接触に撹拌する技術をこれまでに開発してきた。特に、この技術を、抗体を含んだ液滴に適用すれば、抗体が液滴内で撹拌され積極的に分散されることになると考えられる。本発明者らは、下記特許文献１において、例えば、ＥＬＩＳＡにおける抗原定着工程、ブロッキング工程、抗原抗体反応工程、発色反応工程の各工程の所要時間を著しく短縮した非接触撹拌技術（以下、「電界撹拌技術」とも称する。）を提案している。 As a physical phenomenon, it is known that a Coulomb force is generated by a high-voltage AC electric field, and a droplet is attracted in one direction by this Coulomb force. It is also known that the droplet vibrates due to the applied high voltage polarity change. When the droplet is sucked and vibrates, the fine objects present in the droplet are agitated. The present inventors have focused on these physical phenomena and have so far developed a technique for stirring a small amount of droplets of 1 mL or less, particularly 50 to several 100 μL in a non-contact manner by applying a high-voltage AC electric field. Has been developed. In particular, if this technique is applied to a droplet containing an antibody, it is considered that the antibody is stirred and actively dispersed in the droplet. In the following Patent Document 1, for example, the present inventors have disclosed a non-contact stirring technique (hereinafter referred to as “electric field”) that significantly shortens the time required for each step of an antigen fixing step, blocking step, antigen-antibody reaction step, and color development reaction step in ELISA. It is also called “stirring technique”.
ここで、外科手術や内視鏡手術時の限られた時間内に病変部の性質を特定する術中迅速病理診断には、その時間の制約から、５分以内に染色可能なＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオジン染色）が用いられているのが現状である。しかし、ＨＥ染色は、単に細胞や組織構造の全体像を把握しやすくするための染色法であるので、小さながん遺残やリンパ節微小転移が見逃されることも多いという問題がある。一方、がん遺残やリンパ節転移を可能な限り見逃さないようにするには、病原となるタンパク質（抗原）の有無により判断可能な抗原抗体反応を利用した免疫組織染色を術中迅速病理診断として採用することが有効である。しかし、従来の免疫組織染色の所要時間は２時間以上とされ、４０分以内に診断を完了することが求められる術中迅速病理診断に適さないという問題があった。 Here, in the intraoperative rapid pathological diagnosis that identifies the nature of the lesion within a limited time during surgery or endoscopic surgery, HE staining (hematoxylin, At present, eosin staining is used. However, since HE staining is simply a staining method for facilitating the understanding of the whole picture of cells and tissue structures, there is a problem that small cancer residues and lymph node micrometastasis are often overlooked. On the other hand, in order to avoid missing cancer remnants and lymph node metastasis as much as possible, immunohistochemical staining using antigen-antibody reaction that can be determined by the presence or absence of pathogenic proteins (antigens) as an intraoperative rapid pathological diagnosis It is effective to adopt. However, the time required for conventional immunohistochemical staining is 2 hours or more, and there is a problem that it is not suitable for intraoperative rapid pathological diagnosis that requires completion of diagnosis within 40 minutes.
なお、約３０分で遺伝子増幅するＯＳＮＡ法を利用したリンパ節転移診断機器が市販されているが、同法による転移診断は形態学的な情報が欠如するため、信頼性に欠ける。自動免疫組織染色装置も市販されているが、これらは大量の免疫組織染色を一度に処理する目的で開発され、最短でも９０分を要するために術中迅速病理診断に不適である。 Although a lymph node metastasis diagnostic device using the OSNA method that amplifies a gene in about 30 minutes is commercially available, the metastasis diagnosis by this method lacks morphological information and thus lacks reliability. Although automatic immunohistochemical staining apparatuses are also commercially available, they have been developed for the purpose of processing a large amount of immunohistological staining at one time, and require 90 minutes at the shortest, so that they are not suitable for intraoperative rapid pathological diagnosis.
また、仮に、免疫組織染色による術中迅速病理診断が可能となれば、これをより広く普及させる必要がある。普及を進めていくには、診断に関わる試料を簡便に作成できるようにすること、処理工程を高精度化すること、市販のスライドガラス上ですべてを処理することができ、取扱いを容易化すること等が望まれる。すなわち、迅速化とともに、人手をかけないで免疫組織染色を進めるための自動化が求められることになる。したがって、一次抗体と抗原との抗原抗体反応や、二次抗体と一次抗体との抗原抗体反応等の反応工程をはじめ、反応工程の前後に行われる洗浄工程を含めて迅速化及び自動化していく必要がある。洗浄工程は従来、手作業でされるために人手を要していた。 In addition, if rapid pathological diagnosis during surgery by immunohistochemical staining becomes possible, it is necessary to disseminate this more widely. In order to promote the spread, it is possible to easily create a sample related to diagnosis, to improve the processing process, to process everything on a commercially available slide glass, and to facilitate the handling. That is desired. That is, in addition to speeding up, automation for proceeding with immunohistochemical staining without human intervention is required. Therefore, we will speed up and automate the reaction process including the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the antigen and the reaction process such as the antigen-antibody reaction between the secondary antibody and the primary antibody. There is a need. Conventionally, the cleaning process is manual and requires manual labor.
本発明は、上記実情に鑑み提案され、上記特許文献１で提案したような高電圧交流電界を被験対象に与え、被験対象を非接触な撹拌技術で自動化を進めて構築した自動電界免疫組織染色装置及び、自動電界免疫組織染色方法を提供することを目的とする。特に、本発明は、免疫組織染色に費やす所要時間を著しく短縮し、反応時（撹拌時）に試料温度を上昇させず、かつ、抗体と抗原との抗原抗体反応や、その前後に必要とされる洗浄に係る工程の完全自動化を目的とした。 The present invention has been proposed in view of the above circumstances, and an automatic electric field immunohistochemical staining constructed by applying a high-voltage alternating electric field as proposed in Patent Document 1 to a subject and automating the subject with automation using a non-contact stirring technique. An object is to provide an apparatus and an automatic electroimmunohistological staining method. In particular, the present invention significantly reduces the time required for immunohistochemical staining, does not increase the sample temperature during the reaction (during stirring), and is required before and after the antigen-antibody reaction between the antibody and the antigen. The purpose was to fully automate the process related to cleaning.
上記目的を達成するため、本発明は、所定の抗体を用い、被験対象となる組織標本中の抗原を検出する免疫組織染色を構成する一連の反応が、電界付与に基づく撹拌現象によって迅速化され、かつ自動化される自動電界免疫組織染色装置であって、前記組織標本が固定された基板が載置されるステージを有する試料載置ユニットと、前記抗体を含んだ溶液が収容される収容部及び、前記収容部から前記溶液を前記基板上の前記組織標本へ向けて滴下する滴下部材を備える溶液供給ユニットと、板状又は環状の一方の電極を備えた電界撹拌ユニットと、前記基板上の前記組織標本へ向けて滴下された前記溶液を排出する排出管を備えた洗浄ユニットとを有することを特徴とする。 In order to achieve the above-mentioned object, the present invention is a method in which a series of reactions constituting immunohistochemical staining for detecting an antigen in a tissue specimen to be tested is accelerated by a stirring phenomenon based on electric field application using a predetermined antibody. And an automated electric field immunohistochemical staining apparatus, a sample mounting unit having a stage on which a substrate on which the tissue specimen is fixed is mounted, a storage unit for storing a solution containing the antibody, and , A solution supply unit including a dropping member that drops the solution from the container toward the tissue specimen on the substrate, an electric field stirring unit including one plate-like or annular electrode, and the above-mentioned on the substrate And a washing unit having a discharge pipe for discharging the solution dripped toward the tissue specimen.
前記自動電界免疫組織染色装置において、前記試料載置ユニットが、前後又は左右に搬送可能であることが好ましい。
前記試料載置ユニットに、他方の電極が配設されていることが好ましい。
前記他方の電極が、前後又は左右に搬送可能であることが好ましい。
前記他方の電極が、前記ステージの内部に配設されていることが好ましい。
前記収容部が、カセット体に備えられていることが好ましい。
前記一方の電極が、貫通穴を有していることが好ましい。
前記排出管が、前記一方の電極の前記貫通穴に出し入れ可能であることが好ましい。
前記試料載置ユニットが搬送され、前記溶液供給ユニットの前記収容部の直下に前記組織標本が固定された基板が位置したときに、前記組織標本に対して前記溶液が滴下されることが好ましい。
前記試料載置ユニットが搬送され、前記電界撹拌ユニットの前記一方の電極の直下に前記組織標本が固定された基板が、前記溶液が滴下された上で位置したときに、前記組織標本に滴下された前記溶液に対して電界が与えられ、前記溶液が撹拌されて前記反応が進められることが好ましい。
前記反応が進められた前記組織標本に対し、前記洗浄ユニットの前記排出管により前記溶液が排出されることが好ましい。
前記洗浄ユニットが、前記基板上の前記組織標本へ向けて前記組織標本を洗浄する洗浄液を供給する供給管を備え、前記反応が進められた前記組織標本に対し、前記供給管により前記洗浄液が供給されることが好ましい。
前記供給管が、前記一方の電極の前記貫通穴に出し入れ可能であることが好ましい。
前記基板に、区分される複数の領域が形成され、この領域毎に前記組織標本が載置可能であり、前記一方の電極及び前記他方の電極が、前記領域に対応させて複数設けられていることが好ましい。
前記基板に、前記抗原と前記抗体との抗原抗体反応が進行したかどうかの指標となる陽性コントロール又は陰性コントロールが固定されていることが好ましい。
In the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus, it is preferable that the sample placement unit can be conveyed forward and backward or left and right.
It is preferable that the other electrode is disposed on the sample mounting unit.
It is preferable that the other electrode can be conveyed forward and backward or left and right.
It is preferable that the other electrode is disposed inside the stage.
It is preferable that the accommodating portion is provided in the cassette body.
It is preferable that the one electrode has a through hole.
It is preferable that the discharge pipe can be taken in and out of the through hole of the one electrode.
It is preferable that the solution is dropped onto the tissue specimen when the sample mounting unit is transported and a substrate on which the tissue specimen is fixed is positioned directly below the storage portion of the solution supply unit.
When the sample mounting unit is transported and the substrate on which the tissue specimen is fixed immediately below the one electrode of the electric field stirring unit is positioned on the solution specimen, the substrate is dropped on the tissue specimen. In addition, it is preferable that an electric field is applied to the solution, the solution is stirred, and the reaction proceeds.
It is preferable that the solution is discharged by the discharge pipe of the cleaning unit with respect to the tissue specimen in which the reaction has proceeded.
The cleaning unit includes a supply pipe that supplies a cleaning liquid for cleaning the tissue specimen toward the tissue specimen on the substrate, and the cleaning liquid is supplied from the supply pipe to the tissue specimen that has undergone the reaction. It is preferred that
It is preferable that the supply pipe can be inserted into and removed from the through hole of the one electrode.
A plurality of divided areas are formed on the substrate, the tissue specimen can be placed in each of the areas, and a plurality of the one electrode and the other electrode are provided corresponding to the areas. It is preferable.
It is preferable that a positive control or a negative control serving as an index as to whether the antigen-antibody reaction between the antigen and the antibody has progressed is fixed to the substrate.
このほか、前記一方の電極に、前記貫通穴を中心点として対称に突部が形成されていることが好ましい。なお、前記自動電界免疫組織染色装置は、前記試料載置ユニットが搬送され、前記電界撹拌ユニットの前記一方の電極の直下に前記組織標本が固定された基板が位置したときに、前記組織標本に対して電界が与えられて前記抗原が賦活化される作用を備えることが好ましい。 In addition, it is preferable that the one electrode is formed with a protrusion symmetrically with the through hole as a center point. The automatic electric field immunohistochemical staining apparatus is configured such that when the sample mounting unit is transported and a substrate on which the tissue specimen is fixed is positioned directly below the one electrode of the electric field stirring unit, the tissue specimen is placed on the tissue specimen. On the other hand, it is preferable that an electric field is applied to activate the antigen.
また、本発明は、前記自動電界免疫組織染色装置を用いて行われる自動電界免疫組織染色方法であって、前記組織標本へ向けて、前記抗原と反応する一次抗体を含む第一の溶液を滴下し、この第一の溶液に対して電界を与えて前記第一の溶液を撹拌し、前記抗原と前記一次抗体との抗原抗体反応を進める工程を含むことを特徴とする。
特に、前記自動電界免疫組織染色方法において、前記抗原と前記一次抗体との抗原抗体反応の後に、前記第一の溶液を吸引して排出する工程を含むことが好ましい。
前記第一の溶液を吸引して排出した後に、前記組織標本へ向けて、前記一次抗体と反応する二次抗体を含む第二の溶液を滴下し、この第二の溶液に対して電界を与えて前記第二の溶液を撹拌し、前記一次抗体と前記二次抗体との抗原抗体反応を進める工程を含むことが好ましい。
前記一次抗体と前記二次抗体との抗原抗体反応の後に、前記第二の溶液を吸引して排出する工程を含むことが好ましい。
前記抗原と前記一次抗体との抗原抗体反応を進めることから前記第二の溶液を吸引して排出することまでを自動化することが好ましい。
Further, the present invention is an automatic electroimmunohistological staining method performed using the automatic electroimmunohistological staining apparatus, wherein a first solution containing a primary antibody that reacts with the antigen is dropped onto the tissue specimen. The method further comprises a step of applying an electric field to the first solution to stir the first solution to advance an antigen-antibody reaction between the antigen and the primary antibody.
In particular, the automatic electric field immunohistochemical staining method preferably includes a step of sucking and discharging the first solution after the antigen-antibody reaction between the antigen and the primary antibody.
After the first solution is aspirated and discharged, a second solution containing a secondary antibody that reacts with the primary antibody is dropped toward the tissue specimen, and an electric field is applied to the second solution. It is preferable to include a step of stirring the second solution and advancing the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the secondary antibody.
It is preferable to include a step of aspirating and discharging the second solution after the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the secondary antibody.
It is preferable to automate the process from advancing the antigen-antibody reaction between the antigen and the primary antibody to aspirating and discharging the second solution.
前記自動電界免疫組織染色方法は、前記洗浄ユニットが、前記基板上の前記組織標本へ向けて前記組織標本を洗浄する洗浄液を供給する供給管を備え、前記第一の溶液を吸引して排出した後であって、前記一次抗体と前記二次抗体との抗原抗体反応を進める前に、前記組織標本へ向けて前記供給管により前記洗浄液を供給し、この洗浄液に対して電界を与えて前記洗浄液を撹拌し、前記組織標本を洗浄し、前記第二の溶液を吸引して排出した後に、前記組織標本へ向けて前記供給管により前記洗浄液を供給し、この洗浄液に対して電界を与えて前記洗浄液を撹拌し、前記組織標本を洗浄することが好ましい。
また、前記一方の電極が、貫通穴を有し、前記供給管が、前記一方の電極の前記貫通穴に出し入れ可能であることが好ましい。
前記基板に、区分される複数の領域が形成され、この領域毎に前記組織標本が載置可能であり、前記一方の電極及び前記他方の電極が、前記領域に対応させて複数設けられていることが好ましい。
前記基板に、前記抗原と前記抗体との抗原抗体反応が進行したかどうかの指標となる陽性コントロール又は陰性コントロールが固定されていることが好ましい。
なお、前記自動電界免疫組織染色方法は、前記一方の電極及び前記他方の電極の間に、前記組織標本が固定された基板を載置し、前記組織標本に対して電界を与え、前記抗原を賦活化する工程を備えるが好ましい。この場合、本発明において、抗原を賦活化することから第二の溶液を吸引して排出することまでを自動化することができる。
In the automatic electric field immunohistochemical staining method, the cleaning unit includes a supply pipe for supplying a cleaning liquid for cleaning the tissue specimen toward the tissue specimen on the substrate, and the first solution is sucked and discharged. After that, before proceeding with the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the secondary antibody, the cleaning liquid is supplied to the tissue specimen through the supply pipe, and an electric field is applied to the cleaning liquid to thereby supply the cleaning liquid. After the tissue sample is washed and the second solution is sucked and discharged, the washing liquid is supplied to the tissue specimen through the supply pipe, and an electric field is applied to the washing liquid to supply the washing liquid. It is preferable to wash the tissue specimen by stirring the washing liquid.
Moreover, it is preferable that said one electrode has a through-hole and the said supply pipe can be taken in and out of the said through-hole of said one electrode.
A plurality of divided areas are formed on the substrate, the tissue specimen can be placed in each of the areas, and a plurality of the one electrode and the other electrode are provided corresponding to the areas. It is preferable.
It is preferable that a positive control or a negative control serving as an index as to whether the antigen-antibody reaction between the antigen and the antibody has progressed is fixed to the substrate.
In the automatic electric field immunohistochemical staining method, a substrate on which the tissue specimen is fixed is placed between the one electrode and the other electrode, an electric field is applied to the tissue specimen, and the antigen is A step of activation is preferably provided. In this case, in the present invention, from the activation of the antigen to the suction and discharge of the second solution can be automated.
本発明は、組織標本が固定された基板が載置される試料載置ユニット、組織標本へ向けて抗体を含んだ溶液を滴下する溶液供給ユニット、一方の電極を有して、組織標本に滴下された溶液へ向けて電界を与える電界撹拌ユニットを有している。これらのユニットが連係して動作することで、抗体等の溶液を滴下し、抗原抗体反応を進めて免疫組織染色を構成する一連の反応を自動化することができる。さらに、組織標本へ向けて滴下された抗体等の溶液を排出する排出管を備えた洗浄ユニットを有し、抗体等の溶液の排出も自動的に進めることができる。本発明では、これらの構成により、免疫組織染色を構成する一連の反応の迅速化及び、自動化に成功している。したがって、時間の制約に厳しさのある術中迅速病理診断に適用可能な自動電界免疫組織染色装置及び、自動電界免疫組織染色方法を提供することができる。 The present invention includes a sample placement unit on which a substrate on which a tissue specimen is fixed is placed, a solution supply unit that drops a solution containing an antibody toward the tissue specimen, and one electrode that is dropped onto the tissue specimen. An electric field stirring unit for applying an electric field toward the solution. By operating these units in cooperation, it is possible to automate a series of reactions that constitute an immune tissue staining by dropping a solution such as an antibody and advancing an antigen-antibody reaction. Furthermore, it has a washing | cleaning unit provided with the discharge tube which discharges | emits the solution, such as an antibody dripped toward the tissue specimen, and discharge | emission of solutions, such as an antibody, can also advance automatically. In the present invention, with these configurations, a series of reactions constituting immunohistochemical staining have been accelerated and automated. Therefore, it is possible to provide an automatic electric field immunohistochemical staining apparatus and an automatic electric field immunohistochemical staining method applicable to intraoperative rapid pathological diagnosis with severe time constraints.
特に、電界撹拌ユニットに、組織標本を洗浄する洗浄液を供給する供給管を備えさせ、組織標本に対して供給管により洗浄液を供給する構成とすれば、抗原抗体反応の前後に必要な洗浄プロセスまでを迅速化し、自動化することができる。また、確実な免疫組織染色を進めることができる。そうすると、時間の制約に厳しさのある術中迅速病理診断に確実に適用することのできる自動電界免疫組織染色装置及び、自動電界免疫組織染色方法として提供することができる。 In particular, if the electric field agitating unit is provided with a supply pipe for supplying a cleaning liquid for cleaning the tissue specimen and the cleaning liquid is supplied to the tissue specimen through the supply pipe, the cleaning process required before and after the antigen-antibody reaction can be performed Can be speeded up and automated. In addition, reliable immunohistochemical staining can be performed. Then, it can be provided as an automatic electric field immunohistochemical staining apparatus and an automatic electric field immunohistochemical staining method that can be surely applied to intraoperative rapid pathological diagnosis with severe time constraints.
さらに、基板に区分される複数の領域を形成し、この領域毎に組織標本を載置可能とし、併せて一方の電極及び他方の電極が、上記領域に対応するように複数設けられている構成にとすれば、複数の組織標本を同時に免疫組織染色することができる。基板に、抗原と抗体との抗原抗体反応が進行したかどうかの指標となる陽性コントロール又は陰性コントロールが固定されている構成とすれば、免疫組織染色のロット毎の妥当性、確実性を保証することが可能になる。一方の電極及び他方の電極の間に、組織標本が固定された基板を載置し、組織標本に対して電界を与えて抗原を賦活化する構成によって、免疫組織染色で染色される抗原の割合が向上する。したがって、本発明に係る自動電界免疫組織染色装置の品質及び、自動電界免疫組織染色方法の質を向上させることができる。 Further, a plurality of regions divided into the substrate are formed, a tissue specimen can be placed in each region, and a plurality of one electrode and the other electrode are provided so as to correspond to the region. In this case, it is possible to simultaneously immunostain a plurality of tissue specimens. If the substrate is configured with a positive control or negative control that indicates whether the antigen-antibody reaction between the antigen and the antibody has progressed, the validity and certainty of each lot of immunohistochemical staining is guaranteed. It becomes possible. Ratio of antigens stained by immunohistochemical staining by placing a substrate with a tissue specimen fixed between one electrode and the other electrode and applying an electric field to the tissue specimen to activate the antigen Will improve. Therefore, the quality of the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus according to the present invention and the quality of the automatic electric field immunohistochemical staining method can be improved.
なお、一方の電極に、貫通孔を中心点として対称に突部が形成されている構成とすることで電界分布のバランスが崩れるので、組織標本上に滴下された溶液の局所へ向けて電界を集中させて与えることができる。これにより、滴下する溶液の液量を減らして液滴の高さを減じ、抗体と組織標本中の抗原との接触機会を増やすことができる。さらに、一の電極と他の電極との電極間距離を短くすること、電界強度を高めること等によっても抗体と組織標本中の抗原との接触機会を増やすことができる。 In addition, since the balance of the electric field distribution is lost by adopting a configuration in which the protrusion is formed symmetrically with the through hole as the center point on one electrode, the electric field is applied toward the local area of the solution dropped on the tissue specimen. Can be given in a concentrated manner. As a result, the amount of the solution to be dropped can be reduced to reduce the height of the droplet, and the chance of contact between the antibody and the antigen in the tissue specimen can be increased. Furthermore, the chance of contact between the antibody and the antigen in the tissue specimen can also be increased by shortening the distance between one electrode and the other electrode or increasing the electric field strength.
以下、本発明に係る自動電界免疫組織染色装置並びに、当該装置を用いて行う自動電界免疫組織染色方法についての一実施形態を、図面を参照しつつ詳述していく。この実施形態は、本発明の構成を具現化した例示に過ぎない。本発明は、特許請求の範囲に記載した事項を逸脱することがなければ、種々の設計変更を行うことができる。 Hereinafter, an embodiment of an automatic electroimmunohistological staining apparatus and an automatic electroimmunohistological staining method performed using the apparatus according to the present invention will be described in detail with reference to the drawings. This embodiment is merely an example embodying the configuration of the present invention. The present invention can be modified in various ways without departing from the matters described in the claims.
なお、本発明に係る自動電界免疫組織染色装置により、所定の抗体を用いて被験対象となる組織標本中の抗原を検出する免疫組織染色に関する一連の反応が、電界付与に基づく撹拌現象によって迅速化され、かつ、この一連の反応のほとんどが自動化される。したがって、本発明は、免疫組織染色を時間的な制約がある術中迅速病理診断に適用可能とする。また、抗体試薬を希釈、すなわち節約して免疫組織染色をすることが本発明に係る自動電界免疫組織染色装置を使えば可能となるので、免疫組織染色にかかる費用を抑えることができる。本発明は、凍結切片を用いた術中迅速診断、パラフィン切片を用いた免疫組織染色診断に適用可能であるほか、核酸のハイブリダイゼーション、その他の抗原抗体反応等の迅速化、自動化に貢献することもできる。 A series of reactions related to immunohistochemical staining for detecting an antigen in a tissue specimen to be tested using a predetermined antibody is accelerated by an agitation phenomenon based on electric field application by the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus according to the present invention. And most of this series of reactions is automated. Therefore, the present invention enables immunohistochemical staining to be applied to intraoperative rapid pathological diagnosis with time constraints. Moreover, since it is possible to dilute the antibody reagent, that is, to perform immunohistochemical staining while saving, using the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus according to the present invention, it is possible to reduce the cost for immunohistological staining. The present invention can be applied to rapid intraoperative diagnosis using frozen sections and immunohistochemical staining diagnosis using paraffin sections, and also contributes to speeding up and automation of nucleic acid hybridization and other antigen-antibody reactions. it can.
本発明に係る自動電界免疫組織染色装置１は、図１に示すように、その筐体に、試料載置ユニット２、溶液供給ユニット３、電界撹拌ユニット４及び洗浄ユニット５を有している。また、その筐体には、ステージ２１を各ユニット（溶液供給ユニット３、電界撹拌ユニット４及び洗浄ユニット５）に搬送するステージ搬送部２３、カセット搬送部３５、上部電極搬送部４２、洗浄管搬送部５３が備えられている。各搬送部の動力源として、モーター等の公知の動力源を採用することができる。 As shown in FIG. 1, the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus 1 according to the present invention has a sample placement unit 2, a solution supply unit 3, an electric field stirring unit 4, and a washing unit 5 in its casing. Moreover, the the housing, the stage 21 units (soluble liquid supply unit 3, electric field stirred unit 4 and the cleaning unit 5) to feed transportable in the stage conveyance unit 23, the cassette transport unit 35, the upper electrode conveyance unit 42, the cleaning A tube transfer unit 53 is provided. A known power source such as a motor can be employed as a power source for each transport unit.
自動電界免疫組織染色装置１は、試料載置ユニット２、溶液供給ユニット３、電界撹拌ユニット４及び洗浄ユニット５が相互に連係して動作することにより、各種の作用を及ぼすことができる。具体的には、試料載置ユニット２と電界撹拌ユニット４とが動作し、組織標本中の抗原が賦活化される。試料載置ユニット２と溶液供給ユニット３とが動作し、組織標本に対して所定の抗体を含む溶液等が供給される。試料載置ユニット２と電界撹拌ユニット４とが動作し、所定の抗体を含む溶液が供給された組織標本に対し、抗原抗体反応が進められる。試料載置ユニット２、電界撹拌ユニット４及び洗浄ユニット５が動作し、所定の抗体を含む溶液等を排出したり、洗浄液を供給したりすることにより、組織標本が洗浄される。なお、本発明において抗原が賦活化されるとは、抗原抗体反応が進められる前の組織標本に対して電界が与えられることで、組織標本中の抗原の抗体に対する反応性が高まることをいう。 The automatic electric field immunohistochemical staining apparatus 1 can exert various actions by operating the sample placement unit 2, the solution supply unit 3, the electric field stirring unit 4 and the washing unit 5 in cooperation with each other. Specifically, the sample mounting unit 2 and the electric field stirring unit 4 operate, and the antigen in the tissue specimen is activated. The sample placement unit 2 and the solution supply unit 3 operate, and a solution containing a predetermined antibody is supplied to the tissue specimen. The sample mounting unit 2 and the electric field stirring unit 4 operate, and an antigen-antibody reaction is advanced on the tissue specimen supplied with a solution containing a predetermined antibody. The sample mounting unit 2, the electric field stirring unit 4 and the washing unit 5 operate, and the tissue specimen is washed by discharging a solution containing a predetermined antibody or supplying a washing solution. In the present invention, the activation of the antigen means that the reactivity of the antigen in the tissue specimen to the antibody is increased by applying an electric field to the tissue specimen before the antigen-antibody reaction is advanced.
図１及び図２に示すように、試料載置ユニット２は、組織標本Ｔが固定された基板としてのガラス基板Ｇが載置される載置部２１Ａを有し、この載置部２１Ａを前後又は左右又は上下に搬送可能なステージ２１を備えている。このステージ２１の内部に、載置部２１Ａに近接させて、他方の電極である下部電極２２が配設されている。また、試料載置ユニット２は、ステージ２１が前後又は左右に搬送されるようにステージ搬送部２３に取り付けられて構成されている。組織標本Ｔが固定される基板として、ガラス製の基板ほか、プラスチック製の基板を採用することができる。 As shown in FIGS. 1 and 2, the sample placement unit 2 has a placement portion 21A on which a glass substrate G as a substrate on which a tissue specimen T is fixed is placed. Or the stage 21 which can be conveyed right and left or up and down is provided. Inside the stage 21, a lower electrode 22 which is the other electrode is disposed in the vicinity of the mounting portion 21A. Further, the sample mounting unit 2 is configured to be attached to the stage transport unit 23 so that the stage 21 is transported back and forth or left and right. As a substrate on which the tissue specimen T is fixed, a glass substrate or a plastic substrate can be employed.
ステージ２１を備える試料載置ユニット２は、ステージ搬送部２３により、溶液供給ユニット３、電界撹拌ユニット４及び洗浄ユニット５に向けてそれぞれに搬送される。ステージ２１は中央部がへこんで形成され、このへこんだ領域が載置部２１Ａとなる。ガラス基板Ｇは、ステージ２１の載置２１Ａがへこんでいるので、載置部２１Ａに確実に収容される。また、下部電極２２には、電導性の高い銅、アルミ合金、ステンレス、透明電極である酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）等をはじめとする公知の電極材料を採用することができる。下部電極２２の厚みは４〜１０ｍｍであることが、安定的な電界形成の観点から望ましい。その形状は、後述する一方の電極としての上部電極との間で電界を形成することができれば、板状、円盤状、棒状等、各種の形状を採用することができる。 The sample stage unit 2 comprises a stage 21, the stage transfer unit 23, the solution supply unit 3 is conveyed to respectively toward the field stirrer unit 4 and the cleaning unit 5. The stage 21 is formed with a recessed central portion, and the recessed region serves as a placement portion 21A. Since the placement 21A of the stage 21 is recessed, the glass substrate G is reliably accommodated in the placement portion 21A. Further, the lower portion electrode 22, can be employed copper high conductivity, aluminum alloy, stainless steel, a known electrode materials including indium tin oxide (ITO) or the like which is a transparent electrode. The thickness of the lower electrode 22 is desirably 4 to 10 mm from the viewpoint of stable electric field formation. As the shape, various shapes such as a plate shape, a disk shape, and a rod shape can be adopted as long as an electric field can be formed with an upper electrode as one electrode described later.
ガラス基板Ｇには、固定されている組織標本Ｔを囲むように、耐アセトン性を有し、電界分布に影響を与えない樹脂からその枠が形成されているリング状で撥水性のはっ水リング２４が配設されている（図１２も参照のこと）。はっ水リング２４の枠により、溶液供給ユニット３から滴下されてくる溶液が組織標本Ｔ上で、液滴としてドーム形状を形成することになる。はっ水リング２４の材質は、例えば、ポリビニル系、ポリ塩化ビニル系、シリコーン系又はフッ素系から１つ選ばれる。なお、図１には２つのリングが形成された枠からなる２穴タイプのはっ水リング２４Ａが現れている。 The glass substrate G has a ring-like water-repellent water-repellent water-resistant water-repellent structure that is made of a resin that has acetone resistance and does not affect the electric field distribution so as to surround the fixed tissue specimen T. A ring 24 is provided (see also FIG. 12). The solution dripped from the solution supply unit 3 forms a dome shape as a droplet on the tissue specimen T by the frame of the water repellent ring 24. The material of the water-repellent ring 24 is selected from, for example, polyvinyl, polyvinyl chloride, silicone, or fluorine. In FIG. 1, a two-hole type water-repellent ring 24 </ b> A composed of a frame in which two rings are formed appears.
ここで、はっ水リング２４に滴下された溶液は、その樹脂部分である枠によって組織標本Ｔ上で４５度以下の接触角となるドーム形状を形成する。これにより、その液滴底面の径寸法のばらつきが抑制されるととともに、滴下される液量に応じて最大高さ（頂点位置）が一定となる。このため、ドーム形状を形成している溶液の頂点位置と、電極（下部電極２２又は上部電極４１）との間の距離のばらつきが抑制され、その結果、電界を与えて溶液を撹拌する際の、撹拌の度合いのばらつきも抑制される。すなわち、再現性に優れた高い品位の撹拌を実現することができる。 Here, the solution dropped on the water-repellent ring 24 forms a dome shape having a contact angle of 45 degrees or less on the tissue specimen T by the frame which is the resin portion. Thereby, the variation in the diameter of the bottom surface of the droplet is suppressed, and the maximum height (vertex position) is constant according to the amount of liquid dropped. For this reason, the dispersion | variation in the distance between the vertex position of the solution which forms the dome shape, and an electrode (lower electrode 22 or the upper electrode 41) is suppressed, As a result, when applying an electric field and stirring a solution , Variation in the degree of stirring is also suppressed. That is, high-quality stirring with excellent reproducibility can be realized.
そして、自動電界免疫組織染色装置１では、溶液の頂点位置と、電極との間の距離をロット毎に調整する調整機構、与える電界強度をロット毎に調整する調整機構及び、滴下された溶液の高さをセンシングする機構を不要とし、その構成を簡略化することができる。 And in the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus 1, the adjustment mechanism which adjusts the vertex position of a solution and the distance between electrodes for every lot, the adjustment mechanism which adjusts the electric field strength to give for every lot, and the dropped solution A mechanism for sensing the height is not required, and the configuration can be simplified.
本発明では、上述したはっ水リング２４に限定されないで、固定されている組織標本Ｔを囲むように何らかの撥水性の枠を、ガラス基板Ｇに載置してもよい。また、撥水機能を備えたインクを使ってガラス基板Ｇに円や矩形を描画することも可能である。ガラス基板Ｇに固定されている組織標本Ｔを囲むように撥水処理剤を塗布し、ガラス基板Ｇ上に撥水性を有する部位を形成してもよい。 In the present invention, it is not limited to the water-repellent ring 24 described above, and some water-repellent frame may be placed on the glass substrate G so as to surround the fixed tissue specimen T. It is also possible to draw a circle or rectangle on the glass substrate G using ink having a water repellent function. A portion having water repellency may be formed on the glass substrate G by applying a water repellent treatment so as to surround the tissue specimen T fixed to the glass substrate G.
ガラス基板Ｇは、例えば、幅２６ｍｍ、長さ７６ｍｍ、厚み０．８ｍｍの大きさのスライドガラスを用いることができる。はっ水リング２４は、内径が１０ｍｍ〜２０ｍｍであり、枠を形成している樹脂部分の幅は、４５度以下の接触角のドーム形状を溶液に形成させるために、０．５ｍｍ〜３ｍｍ、好ましくは２ｍｍ〜３ｍｍとする。はっ水リング２４の厚みは０．１５ｍｍ〜０．３ｍｍであることが好ましい。また、例えば、長方形の撥水の枠を採用することが可能であり、その滴下する溶液の液量は、３０００μＬ以下の範囲で許容される。ただし、滴下する溶液の液量は撹拌の均一性の面から、８〜１０００μＬであることが好ましい。 For the glass substrate G, for example, a slide glass having a width of 26 mm, a length of 76 mm, and a thickness of 0.8 mm can be used. The water-repellent ring 24 has an inner diameter of 10 mm to 20 mm, and the width of the resin part forming the frame is 0.5 mm to 3 mm in order to form a dome shape with a contact angle of 45 degrees or less in the solution. Preferably it is 2 mm-3 mm. The thickness of the water repellent ring 24 is preferably 0.15 mm to 0.3 mm. In addition, for example, a rectangular water-repellent frame can be adopted, and the amount of the dropped solution is allowed in the range of 3000 μL or less. However, the amount of the solution to be dropped is preferably 8 to 1000 μL from the viewpoint of uniformity of stirring.
図１及び図３に示すように、溶液供給ユニット３は、組織標本Ｔ中の抗原と反応する抗体として一次抗体を含む溶液Ｓ等が収容される収容部としてのシリンダ３１を有するカセット体３２を備えている。また、シリンダ３１に出し入れ可能にして設けられ、シリンダ３１から一次抗体を含む溶液Ｓ等をガラス基板Ｇ上の組織標本Ｔへ向けて滴下する滴下部材としてのプランジャロッド３３を備えている。溶液供給ユニット３は、一次抗体を含む溶液Ｓ等の滴下時にプランジャロッド３３を押圧するピストン３４を備えている。カセット体３２は、前後又は左右又は上下に搬送するカセット搬送部３５に取り付けられている。 As shown in FIGS. 1 and 3, the solution supply unit 3 includes a cassette body 32 having a cylinder 31 as a storage portion in which a solution S containing a primary antibody as an antibody that reacts with an antigen in a tissue specimen T is stored. I have. In addition, a plunger rod 33 is provided as a dropping member that is provided so as to be able to be taken in and out of the cylinder 31 and drops the solution S containing the primary antibody from the cylinder 31 toward the tissue specimen T on the glass substrate G. The solution supply unit 3 includes a piston 34 that presses the plunger rod 33 when the solution S containing the primary antibody is dropped. The cassette body 32 is attached to a cassette carrying section 35 that carries the front and rear, left and right, or up and down.
シリンダ３１は、一次抗体を含む溶液Ｓ等が収容されやすくするために広口とされたフランジ部３１Ａと、溶液Ｓ等が収容される本体部３１Ｂと、ガラス基板Ｇ上の組織標本Ｔへ向けて滴下するための誘導路となる筒先部３１Ｃとからなる筒体である。カセット体３２には、上下方向に貫通させた貫通孔が形成されている。この貫通孔は、シリンダ３１に対応した形状で、シリンダ３１を収容するためのシリンダ収容部３２Ａとなる。プランジャロッド３３は、ピストン３４により押圧されることで溶液Ｓ等をガラス基板Ｇ上に滴下する。 The cylinder 31 has a flange portion 31A that has a wide opening so that the solution S and the like containing the primary antibody can be easily stored, a main body portion 31B that stores the solution S and the like, and a tissue specimen T on the glass substrate G. It is a cylinder body which consists of 31 C of cylinder tip parts used as the guide path for dripping. The cassette body 32 is formed with a through hole penetrating in the vertical direction. The through hole has a shape corresponding to the cylinder 31 and serves as a cylinder housing portion 32 </ b> A for housing the cylinder 31. The plunger rod 33 drops the solution S or the like onto the glass substrate G by being pressed by the piston 34.
本実施形態において、シリンダ３１毎に、例えば、組織標本Ｔ中の抗原と反応する一次抗体を含む溶液Ｓのほか、一次抗体と反応する二次抗体を含む二次抗体溶液、免疫組織染色に必要な内因性ペルオキシダーゼ除去のためのブロッキング溶液、その他の試薬が収容される。また、溶液供給ユニット３では、カセット搬送部３５によりカセット体３２が搬送される際に、どのシリンダ３１に備えられたプランジャロッド３３がピストン３４により押圧されるのかが決定される。すなわち、カセット搬送部３５によりカセット体３２が搬送される際に、どの種類の溶液がガラス基板Ｇ上の組織標本Ｔに向けて滴下されるのかが決定される。 In the present embodiment, for each cylinder 31, for example, in addition to the solution S containing a primary antibody that reacts with an antigen in the tissue specimen T, a secondary antibody solution containing a secondary antibody that reacts with the primary antibody, necessary for immunohistochemical staining It contains a blocking solution for removing endogenous peroxidase and other reagents. Further, in the solution supply unit 3, when the cassette body 32 is conveyed by the cassette conveyance unit 35, it is determined which plunger rod 33 provided in which cylinder 31 is pressed by the piston 34. That is, when the cassette body 32 is transported by the cassette transport unit 35, it is determined which type of solution is dropped toward the tissue specimen T on the glass substrate G.
図１及び図４に示すように、電界撹拌ユニット４は、本実施形態において貫通穴４１Ａ（図１２も参照のこと）を有する環状で、試料載置ユニット２の下部電極２２と対をなす一方の電極としての上部電極４１を備えている。また、電界撹拌ユニット４は、上部電極搬送部４２に取り付けられて、前後又は左右又は上下に搬送される。上部電極４１についても下部電極２２と同様、導電性の高い銅、アルミ合金、ステンレス、透明電極である酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）等をはじめとする公知の電極材料を採用することができる。その厚みは４〜１０ｍｍであることが、安定的な電界形成の観点から好ましい。その形状は貫通孔が形成されれば、板状であってもよい。 As shown in FIGS. 1 and 4, the electric field stirring unit 4 has an annular shape having a through hole 41 </ b> A (see also FIG. 12) in the present embodiment, and is paired with the lower electrode 22 of the sample mounting unit 2. The upper electrode 41 is provided as an electrode. Moreover, the electric field stirring unit 4 is attached to the upper electrode conveyance part 42, and is conveyed back and forth or right and left or up and down. Similarly to the lower electrode 22, a known electrode material such as copper, aluminum alloy, stainless steel, indium tin oxide (ITO) which is a transparent electrode, or the like can be used for the upper electrode 41. The thickness is preferably 4 to 10 mm from the viewpoint of stable electric field formation. The shape may be plate-like as long as a through-hole is formed.
図１及び図５に示すように、洗浄ユニット５は、ガラス基板Ｇ上の組織標本Ｔへ向けて滴下された一次抗体を含む溶液Ｓ等を排出する排出管５１及び、ガラス基板Ｇ上の組織標本Ｔへ向けて組織標本Ｔを洗浄する洗浄液を供給する供給管５２を備えている。排出管５１と供給管５２とは、洗浄管搬送部５３に取り付けられている。この洗浄管搬送部５３によって排出管５１と供給管５２とは前後又は左右又は上下に搬送され、上部電極４１の貫通穴４１Ａに出し入れ可能である。また、図示が省略されているが、排出管５１から外部へ溶液Ｓ等を排出する排出管接続チューブが排出管５１に接続され、外部から供給管５２へ洗浄液を供給する供給管接続チューブが供給管５２に接続される。 As shown in FIGS. 1 and 5, the cleaning unit 5 includes a discharge tube 51 that discharges the solution S containing the primary antibody dropped toward the tissue specimen T on the glass substrate G, and a tissue on the glass substrate G. A supply pipe 52 for supplying a cleaning liquid for cleaning the tissue specimen T toward the specimen T is provided. The discharge pipe 51 and the supply pipe 52 are attached to the cleaning pipe transport unit 53. The discharge pipe 51 and the supply pipe 52 are transported back and forth, left and right, or up and down by the cleaning pipe transport section 53 and can be taken in and out of the through hole 41 A of the upper electrode 41. Although not shown, a discharge pipe connection tube for discharging the solution S and the like from the discharge pipe 51 to the outside is connected to the discharge pipe 51, and a supply pipe connection tube for supplying the cleaning liquid from the outside to the supply pipe 52 is supplied. Connected to tube 52.
なお、洗浄液として、免疫組織染色に用いられるものとしてＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を例示することができる。本発明では、ＰＢＳに限定されないで、免疫組織染色を有効に進めるこが可能な各種の洗浄液を採用することができる。ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＨＰＯ4，ＫＨ2ＰＯ4が配合されたＰＢＳでもよい。カルシウムやマグネシウムを含む組成の洗浄液を採用し得る。また、界面活性剤を含んだ洗浄液であってもよい。 In addition, as a washing | cleaning liquid, PBS (phosphate buffered saline) can be illustrated as what is used for immunohistochemical staining. The present invention is not limited to PBS, and various washing solutions that can effectively advance immunohistochemical staining can be employed. PBS mixed with NaCl, KCl, NaHPO 4 , KH 2 PO 4 may be used. A cleaning liquid having a composition containing calcium or magnesium may be employed. Moreover, the washing | cleaning liquid containing surfactant may be sufficient.
本発明の自動電界免疫組織染色装置１では、図６に示すように、試料載置ユニット２が搬送され、溶液供給ユニット３の所定のシリンダ３１の直下に組織標本Ｔが固定されたガラス基板Ｇが位置したときに、組織標本Ｔに対しシリンダ３１に収容されている溶液が滴下される。例えば、組織標本Ｔに対し、一次抗体を含む溶液Ｓが滴下される。 In the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus 1 of the present invention, as shown in FIG. 6, the glass substrate G on which the sample mounting unit 2 is transported and the tissue specimen T is fixed immediately below a predetermined cylinder 31 of the solution supply unit 3. When is positioned, the solution stored in the cylinder 31 is dropped onto the tissue specimen T. For example, a solution S containing a primary antibody is dropped on the tissue specimen T.
まず、どの溶液（一次抗体を含む溶液Ｓ、一次抗体と反応する二次抗体を含む二次抗体溶液、内因性ペルオキシダーゼ除去のためのブロッキング溶液、その他の試薬）がガラス基板Ｇ上の組織標本Ｔに向けて滴下されるのかが決定される。その上で、決定された溶液（図６において、一次抗体を含む溶液Ｓ）が収容されているシリンダ３１に備わるプランジャロッド３３の直上にピストン３４が位置するように、カセット搬送部３５によりカセット体３２が搬送される。同時に、組織標本Ｔが固定されているガラス基板Ｇが載置されたステージ２１が、決定された溶液である一次抗体を含む溶液Ｓが収容されているシリンダ３１の直下の位置までステージ搬送部２３により搬送される。 First, which solution (the solution S containing the primary antibody, the secondary antibody solution containing the secondary antibody that reacts with the primary antibody, the blocking solution for removing the endogenous peroxidase, and other reagents) is the tissue specimen T on the glass substrate G. It is determined whether it is dripped toward In addition, the cassette body 35 causes the cassette body 35 to place the piston 34 directly above the plunger rod 33 provided in the cylinder 31 in which the determined solution (the solution S containing the primary antibody in FIG. 6) is accommodated. 32 is conveyed. At the same time, the stage 21 on which the stage 21 on which the glass substrate G on which the tissue specimen T is fixed is placed is placed directly below the cylinder 31 in which the solution S containing the primary antibody as the determined solution is accommodated. It is conveyed by.
次に、一次抗体を含む溶液Ｓを収容しているシリンダ３１に備えられたプランジャロッド３３がピストン３４により押圧される。これにより、シリンダ３１の筒先部３１Ｃを通じ、一次抗体を含む溶液Ｓが、組織標本Ｔが固定されているガラス基板Ｇ上に滴下される。ピストン３４により押圧され、滴下される一次抗体を含む溶液Ｓの１回の滴下液量は、５〜６００μＬである。 Next, the plunger rod 33 provided in the cylinder 31 containing the solution S containing the primary antibody is pressed by the piston 34. Thereby, the solution S containing the primary antibody is dropped onto the glass substrate G on which the tissue specimen T is fixed through the tube tip portion 31C of the cylinder 31. The amount of one drop of the solution S containing the primary antibody that is pressed and dropped by the piston 34 is 5 to 600 μL.
なお、組織標本Ｔが固定されているガラス基板Ｇ上に滴下されるのが、一次抗体を含む溶液Ｓのほかに、上述した二次抗体溶液、ブロッキング溶液又はその他の試薬のいずれかが滴下される場合がある。この場合にも、上述した試料載置ユニット２と溶液供給ユニット３とが連係した同様な動作により、その選択された溶液が、組織標本Ｔが固定されているガラス基板Ｇ上に滴下される。二次抗体溶液の１回の滴下液量は５〜６００μＬとすればよい。内因性ペルオキシダーゼ除去のためのブロッキング溶液の１回の滴下液量は５〜１０００μＬが好ましい。 In addition to the solution S containing the primary antibody, any of the above-described secondary antibody solution, blocking solution or other reagent is dropped on the glass substrate G on which the tissue specimen T is fixed. There is a case. Also in this case, the selected solution is dropped onto the glass substrate G on which the tissue specimen T is fixed by a similar operation in which the sample placement unit 2 and the solution supply unit 3 described above are linked. What is necessary is just to let the amount of drop solutions of a secondary antibody solution be 5-600 microliters at once. The amount of one dropping solution of the blocking solution for removing endogenous peroxidase is preferably 5 to 1000 μL.
本発明では、図７に示すように、試料載置ユニット２と電界撹拌ユニット４とが連係して動作することにより、一次抗体を含む溶液Ｓ等が供給された組織標本Ｔに対して抗原抗体反応が進められる。また、組織標本Ｔ中の抗原が賦活化される。 In the present invention, as shown in FIG. 7, the specimen mounting unit 2 and the electric field agitating unit 4 operate in association with each other so that the antigen antibody is applied to the tissue specimen T supplied with the solution S containing the primary antibody. The reaction proceeds. In addition, the antigen in the tissue specimen T is activated.
まず、組織標本Ｔへ向けて溶液（図７において、一次抗体を含む溶液Ｓ）が滴下されたガラス基板Ｇを載置するステージ２１がステージ搬送部２３により、電界撹拌ユニット４の上部電極４１の直下の位置まで搬送される。その上で、組織標本Ｔに対し、上部電極４１及び試料載置ユニット２の下部電極２２の間に電界が与えられ、一次抗体を含む溶液Ｓの撹拌によって、一次抗体を含む溶液Ｓ中の一次抗体と組織標本Ｔ中の抗原との抗原抗体反応が進められる。 First, the stage 21 on which the glass substrate G onto which the solution (the solution S containing the primary antibody in FIG. 7) is dropped toward the tissue specimen T is placed on the upper electrode 41 of the electric field stirring unit 4 by the stage transport unit 23. It is transported to a position directly below. Then, an electric field is applied to the tissue specimen T between the upper electrode 41 and the lower electrode 22 of the sample mounting unit 2, and the primary solution in the solution S containing the primary antibody is stirred by the solution S containing the primary antibody. The antigen-antibody reaction between the antibody and the antigen in the tissue specimen T is advanced.
具体的には、湿度６０±２０％に制御された環境下で、印加電界強度の主電圧としてプラス側に０．４〜１．５ｋＶ／ｍｍ、これにオフセット電界強度０．１５〜０．７ｋＶ／ｍｍが加えられて生成されるプラス側に偏った繰り返しの方形波の交流電界が与えられる。特に、与えられる交流電界として０．１〜３００Ｈｚの範囲から一次抗体を含む溶液Ｓが活発に撹拌される周波数が選択される。このような交流電界が上部電極４１及び下部電極２２の間に形成され、一次抗体を含む溶液Ｓが撹拌される。なお、上部電極４１、下部電極２２のどちらをプラス側としても良い。印加電界強度が、プラス側に１．５ｋＶ／ｍｍより強いと放電する可能性があり、０．４ｋＶ／ｍｍ未満より低いと撹拌が生じない可能性がある。オフセット電圧が、１ｋＶ／ｍｍより強いと放電する可能性があり、０．２ｋＶ／ｍｍより低いと生じない可能性がある。本発明では、一次抗体と組織標本Ｔ中の抗原との抗原抗体反応に必要な時間が従来に比べて大幅に短縮され、５〜７分で済む。 Specifically, in an environment controlled to a humidity of 60 ± 20%, the main voltage of the applied electric field strength is 0.4 to 1.5 kV / mm on the positive side, and the offset electric field strength is 0.15 to 0.7 kV. An alternating electric field of a repetitive square wave generated by adding / mm is applied. In particular, the frequency at which the solution S containing the primary antibody is actively stirred is selected from the range of 0.1 to 300 Hz as the applied AC electric field. Such an alternating electric field is formed between the upper electrode 41 and the lower electrode 22, and the solution S containing the primary antibody is stirred. Note that either the upper electrode 41 or the lower electrode 22 may be on the plus side. If the applied electric field strength is higher than 1.5 kV / mm on the plus side, there is a possibility of discharging, and if it is lower than less than 0.4 kV / mm, stirring may not occur. When the offset voltage is higher than 1 kV / mm, there is a possibility of discharging, and when it is lower than 0.2 kV / mm, there is a possibility that it will not occur. In the present invention, the time required for the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the antigen in the tissue specimen T is significantly shortened compared to the conventional case, and only 5-7 minutes are required.
また、上部電極４１及び下部電極２２の間で電界が形成される際には、ガラス基板Ｇ上に滴下された溶液が、一次抗体を含む溶液Ｓのほかに、二次抗体溶液、ブロッキング溶液又はその他の試薬である場合がある。この場合にも、上述した試料載置ユニット２と電界撹拌ユニット４とが連係した動作によって溶液が撹拌される。したがって、一次抗体と二次抗体との抗原抗体反応や非特異的反応を抑制するための反応等、免疫組織染色を構成する一連の反応を、電界付与に基づく撹拌によって迅速化することができる。 Further, when an electric field is formed between the upper electrode 41 and the lower electrode 22, the solution dropped on the glass substrate G is not only the solution S containing the primary antibody, but also a secondary antibody solution, a blocking solution or It may be other reagents. Also in this case, the solution is stirred by the operation in which the sample mounting unit 2 and the electric field stirring unit 4 described above are linked. Therefore, a series of reactions constituting the immunohistochemical staining such as an antigen-antibody reaction between the primary antibody and the secondary antibody and a reaction for suppressing a nonspecific reaction can be accelerated by stirring based on electric field application.
ここで、自動電界免疫組織染色装置１における電界付与に基づく撹拌により、抗原抗体反応等が迅速化する仕組みを、図８を参照しつつ説明する。 Here, a mechanism in which the antigen-antibody reaction or the like is accelerated by stirring based on the application of an electric field in the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus 1 will be described with reference to FIG.
図８に示すように、上部電極４１及び下部電極２２の間に形成されている交流電界の波形が突状となる瞬間において、撹拌される溶液（例えば、一次抗体を含む溶液Ｓ）は、上部電極４１に向けて吸引される（図８中のＩ参照）。また、交流電界の波形が凹状の（へこんだ）波形となる瞬間において、撹拌される溶液は、下部電極２２に向けて吸引されてへこんだ形状となる（図８中のＩＩ参照）。さらに、撹拌される溶液は、その波形が突状に復帰する瞬間においてへこんだ形状が回復し（図８中のＩＩＩ参照）、続いて、波形が突状となるのに伴って再び、上部電極４１に向けて吸引される（図８中のＩＶ参照）。このような撹拌により、溶液内でブラウン運動している粒子（一次抗体等）は、その運動速度が加速され、抗原と接触する機会が増えることとなる。その結果、抗原抗体反応が迅速化するのである。 As shown in FIG. 8, at the moment when the waveform of the AC electric field formed between the upper electrode 41 and the lower electrode 22 has a protruding shape, the stirred solution (for example, the solution S containing the primary antibody) It attracts | sucks toward the electrode 41 (refer I in FIG. 8). Further, at the moment when the waveform of the AC electric field becomes a concave (dented) waveform, the agitated solution is sucked toward the lower electrode 22 to have a dented shape (see II in FIG. 8). Further, the stirred solution recovers the concave shape at the moment when the waveform returns to the projecting shape (see III in FIG. 8), and then again, as the waveform becomes the projecting shape, the upper electrode again Suction toward 41 (see IV in FIG. 8). By such agitation, particles that undergo Brownian motion in the solution (primary antibodies, etc.) are accelerated in their speed of motion, increasing the chance of contact with the antigen. As a result, the antigen-antibody reaction is accelerated.
撹拌される溶液は、図９に示すように、選択される周波数が０．１〜３００Ｈｚの範囲と低周波であるので、温度上昇が起こりにくい。図９では、液量を１５０μＬとし、上部電極４１及び下部電極２２の間の電極間距離を５．４ｍｍとし、印加電圧を３ｋＶとし、周波数をそれぞれ２１Ｈｚ、９１Ｈｚとしたときの溶液の温度上昇を調べた結果を示している。したがって、自動電界免疫組織染色装置１を室温で使用する限り、タンパク質や組織の変性による非特異反応は生じ難い。また、図１０において、自動電界免疫組織染色装置１を使って溶液に所定の印加強度で電界を与えることにより、撹拌が進行し分散性が向上していることを、撹拌によりゼータ電位がマイナス方向へシフトすることを利用して示した。なお、図１０中の△（図１０において黒く塗りつぶされた三角形）で現される点は、公知の卓上ボルテックスミキサーにより任意の溶液を撹拌したときに示されたゼータ電位の値である。 As shown in FIG. 9, the solution to be stirred has a low frequency in the range of 0.1 to 300 Hz, so that the temperature does not easily rise. In FIG. 9, the temperature rise of the solution when the liquid volume is 150 μL, the interelectrode distance between the upper electrode 41 and the lower electrode 22 is 5.4 mm, the applied voltage is 3 kV, and the frequencies are 21 Hz and 91 Hz, respectively. The result of the investigation is shown. Therefore, as long as the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus 1 is used at room temperature, a nonspecific reaction due to protein or tissue denaturation hardly occurs. Further, in FIG. 10, by applying an electric field to the solution with a predetermined applied intensity using the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus 1, the agitation proceeds and the dispersibility is improved. Shown using shifting to. Note that a point represented by Δ in FIG. 10 (a triangle filled in black in FIG. 10) is the value of the zeta potential indicated when an arbitrary solution is stirred by a known tabletop vortex mixer.
本発明では、図示を省略するものの、試料載置ユニット２と電界撹拌ユニット４とが連係して動作することで、電界撹拌ユニット４の上部電極４１の直下に組織標本Ｔが固定されたガラス基板Ｇが位置したときに、組織標本Ｔに対して電界が与えられ、組織標本Ｔ中の抗原が賦活化される。なお、抗原の賦活化は、ガラス基板Ｇに固定されている組織標本Ｔに対し、一次抗体を含む溶液Ｓ等を供給する前の段階で行われる。図１１に示すように、抗原と一次抗体との抗原抗体反応前に、組織標本Ｔに対して電界を与えることで、電界を与えない場合に比べ免疫組織染色で染色される割合が向上し、抗原の反応性が高まる。図１１において、電界を３０秒〜３分間与えて抗原を賦活化したサンプルは電界を与えないサンプルに比べ、免疫組織染色で染色される割合が１０〜３０％程度向上している。 In the present invention, although not shown in the figure, the glass substrate in which the tissue specimen T is fixed directly below the upper electrode 41 of the electric field stirring unit 4 by operating the sample mounting unit 2 and the electric field stirring unit 4 in cooperation with each other. When G is positioned, an electric field is applied to the tissue specimen T, and the antigen in the tissue specimen T is activated. In addition, activation of an antigen is performed in the stage before supplying the solution S etc. which contain a primary antibody with respect to the tissue specimen T currently fixed to the glass substrate G. As shown in FIG. 11, by applying an electric field to the tissue specimen T before the antigen-antibody reaction between the antigen and the primary antibody, the ratio of staining with immunohistochemical staining is improved as compared with the case where no electric field is applied, Increases antigen reactivity. In FIG. 11, the ratio of staining with immunohistochemical staining is improved by about 10 to 30% in the sample in which the antigen is activated by applying an electric field for 30 seconds to 3 minutes compared to the sample in which the electric field is not applied.
自動電界免疫組織染色装置１で抗原が賦活化されるには、まず、組織標本Ｔが固定されているガラス基板Ｇを載置するステージ２１がステージ搬送部２３により、電界撹拌ユニット４の上部電極４１の直下の位置まで搬送される。その上で、組織標本Ｔに対し、上部電極４１及び試料載置ユニット２の下部電極２２の間に電界が与えられ、組織標本Ｔ中の抗原が賦活化される。 In order to activate the antigen in the automatic electroimmunohistological staining apparatus 1, first, the stage 21 on which the glass substrate G on which the tissue specimen T is fixed is placed on the upper electrode of the electric field stirring unit 4 by the stage transport unit 23. It is conveyed to a position directly below 41. Then, an electric field is applied to the tissue specimen T between the upper electrode 41 and the lower electrode 22 of the sample placement unit 2, and the antigen in the tissue specimen T is activated.
具体的には、印加電界強度の主電圧としてプラス側に０．４〜２ｋＶ／ｍｍ、これにオフセット電界強度０．２５〜１ｋＶ／ｍｍが加えられて生成されるプラス側に偏った繰り返しの方形波の交流電界が与えられる。特に、与えられる交流電界として０．１〜２０Ｈｚの範囲から抗原が活発に応答する適切な周波数が選択される。このような交流電界が、上部電極４１及び下部電極２２の間に形成される。なお、抗原を賦活化させる時間は３０秒〜３分とすることが好ましい。 Specifically, as a main voltage of the applied electric field strength, 0.4 to 2 kV / mm on the plus side, and an offset electric field strength of 0.25 to 1 kV / mm added thereto, and a repetitive square biased to the plus side is generated. A wave alternating electric field is applied. In particular, an appropriate frequency at which the antigen actively responds is selected from the range of 0.1 to 20 Hz as the applied AC electric field. Such an alternating electric field is formed between the upper electrode 41 and the lower electrode 22. The time for activating the antigen is preferably 30 seconds to 3 minutes.
自動電界免疫組織染色装置１内では、抗原が賦活化されるとき、湿度６０±２０％の環境下に制御されている。また、上部電極４１、下部電極２２のどちらをプラス側としてもよい。 In the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus 1, when the antigen is activated, it is controlled in an environment of 60 ± 20% humidity. Further, either the upper electrode 41 or the lower electrode 22 may be on the plus side.
本発明では、図１２に示すように、試料載置ユニット２と電界撹拌ユニット４と洗浄ユニット５とが連係して動作し、ガラス基板Ｇ上の溶液（図１２において、一次抗体を含む溶液Ｓ）が排出されたり、ガラス基板Ｇ上へ洗浄液が供給されたりすることで、組織標本Ｔが洗浄される。なお、この洗浄の間、組織標本Ｔが固定されているガラス基板Ｇが載置されたステージ２１は、上部電極４１の直下の位置に維持される。 In the present invention, as shown in FIG. 12, the sample mounting unit 2, the electric field agitating unit 4 and the cleaning unit 5 operate in conjunction with each other, and the solution on the glass substrate G (in FIG. 12, the solution S containing the primary antibody). ) Is discharged or the cleaning liquid is supplied onto the glass substrate G, whereby the tissue specimen T is cleaned. During this cleaning, the stage 21 on which the glass substrate G on which the tissue specimen T is fixed is placed at a position directly below the upper electrode 41.
まず、抗原と一次抗体との抗原抗体反応が進んだ組織標本Ｔに対し、排出管５１の管先が上部電極４１の貫通穴４１Ａに出し入れされながら、ガラス基板Ｇ上の組織標本Ｔへ向けて滴下されている一次抗体を含む溶液Ｓが吸引され、排出される。これにより、組織標本Ｔ中の抗原と未反応の一次抗体がガラス基板Ｇ上から除去される。 First, with respect to the tissue specimen T in which the antigen-antibody reaction between the antigen and the primary antibody has advanced, the tube tip of the discharge tube 51 is inserted into and removed from the through hole 41A of the upper electrode 41 toward the tissue specimen T on the glass substrate G. The solution S containing the dropped primary antibody is aspirated and discharged. As a result, the primary antibody that has not reacted with the antigen in the tissue specimen T is removed from the glass substrate G.
また、排出管５１によって一次抗体を含む溶液Ｓが排出された組織標本Ｔに対し、供給管５２の管先が上部電極４１の貫通穴４１Ａに出し入れされながら、ガラス基板Ｇ上の組織標本Ｔへ向けて洗浄液が供給される。特に、供給管５２を通じてガラス基板Ｇ上の組織標本Ｔへ向けて洗浄液が供給された後に、ガラス基板Ｇ上の洗浄液に対して電界が与えられ、洗浄液の撹拌によって組織標本Ｔが洗浄される。 In addition, with respect to the tissue specimen T from which the solution S containing the primary antibody has been discharged by the discharge pipe 51, the tube tip of the supply pipe 52 is taken into and out of the through hole 41 </ b> A of the upper electrode 41, and then to the tissue specimen T on the glass substrate G. The cleaning liquid is supplied toward the camera. In particular, after the cleaning liquid is supplied toward the tissue specimen T on the glass substrate G through the supply tube 52, an electric field is applied to the cleaning liquid on the glass substrate G, and the tissue specimen T is cleaned by stirring the cleaning liquid.
具体的には、印加電界強度の主電圧としてプラス側に０．４〜１．５ｋＶ／ｍｍ、これにオフセット電界強度０．１５〜０．７ｋＶ／ｍｍが加えられて生成されるプラス側に偏った繰り返しの方形波の交流電界が与えられる。特に、与えられる交流電界として００．１〜３００ＨｚＨｚの範囲から洗浄液が活発に撹拌する適切な周波数が選択される。このような交流電界が、上部電極４１及び下部電極２２の間に形成されて洗浄液が撹拌されることとなる。印加電界強度が、プラス側に１．５ｋＶ／ｍｍより強いと放電する可能性があり、０．４ｋＶ／ｍｍ未満より低いと撹拌が生じない可能性がある。また、オフセット電圧は、１ｋＶ／ｍｍより強いと放電する可能性があり、０．２ｋＶ／ｍｍより低いと生じない可能性がある。供給する洗浄液の液量は１回の洗浄あたり、５〜１０００μＬが好ましい。洗浄液に交流電界が与えるときにも、上部電極４１、下部電極２２のどちらをプラス側としてもよい。 Specifically, the main voltage of the applied electric field strength is 0.4 to 1.5 kV / mm on the positive side, and the offset electric field strength of 0.15 to 0.7 kV / mm is added to the positive side. A repeating square wave alternating electric field is applied. In particular, an appropriate frequency at which the cleaning liquid is vigorously stirred is selected from the range of 0 to 300 Hz Hz as the applied AC electric field. Such an AC electric field is formed between the upper electrode 41 and the lower electrode 22, and the cleaning liquid is stirred. If the applied electric field strength is higher than 1.5 kV / mm on the plus side, there is a possibility of discharging, and if it is lower than less than 0.4 kV / mm, stirring may not occur. Further, when the offset voltage is higher than 1 kV / mm, there is a possibility of discharging, and when it is lower than 0.2 kV / mm, it may not occur. The amount of the cleaning liquid to be supplied is preferably 5 to 1000 μL per cleaning. Even when an AC electric field is applied to the cleaning liquid, either the upper electrode 41 or the lower electrode 22 may be the positive side.
組織標本Ｔを洗浄した後の洗浄液は、排出管５１によって吸引され、排出されて、組織標本Ｔ中の抗原と未反応の一次抗体がガラス基板Ｇ上から除去される。これにより、従来の手作業による洗浄に比べて時間が短縮されるとともに、安定した洗浄によって染色のばらつきを抑制することができる。 The washing liquid after washing the tissue specimen T is sucked and discharged by the discharge tube 51, and the antigen and unreacted primary antibody in the tissue specimen T are removed from the glass substrate G. Thereby, time is shortened compared with the washing | cleaning by the conventional manual labor, and the dispersion | variation in dyeing | staining can be suppressed by stable washing | cleaning.
なお、ガラス基板Ｇ上に滴下される溶液が、一次抗体を含む溶液Ｓのほかに、二次抗体溶液、ブロッキング溶液又はその他の試薬である場合がある。この場合にも、上述した試料載置ユニット２と洗浄ユニット５が連係する同様な動作により、これらの溶液を除去するとともに洗浄液を供給し、ガラス基板Ｇ上の組織標本Ｔに対して適切な洗浄することができる。 In addition, the solution dripped on the glass substrate G may be a secondary antibody solution, a blocking solution, or another reagent in addition to the solution S containing the primary antibody. Also in this case, by the same operation in which the sample mounting unit 2 and the cleaning unit 5 described above work together, these solutions are removed and a cleaning liquid is supplied, and the tissue specimen T on the glass substrate G is appropriately cleaned. can do.
また、排出管５１を使った溶液の排出、供給管５２を使った洗浄液の供給は公知のポンプ等の装置を駆動させることにより達成することができる。このような組織標本Ｔに対する洗浄は、複数回繰り返すことができる。排出管５１を使った溶液の排出、供給管５２を使った洗浄液の供給を複数回、繰り返すことで染色のばらつきを確実に抑制することができる。排出管５１と供給管５２の本数及び配置は、特に限定するものではないが、上述したように１本ずつ設けるほか、供給管５２を中央に設け、その周囲に排出管５１を１本又は複数本設ける等の構成を例示することができる。 The discharge of the solution using the discharge pipe 51 and the supply of the cleaning liquid using the supply pipe 52 can be achieved by driving a device such as a known pump. Such washing of the tissue specimen T can be repeated a plurality of times. By repeating the discharge of the solution using the discharge pipe 51 and the supply of the cleaning liquid using the supply pipe 52 a plurality of times, variations in staining can be reliably suppressed. The number and arrangement of the discharge pipes 51 and the supply pipes 52 are not particularly limited. However, as described above, one supply pipe 52 is provided at the center and one or more discharge pipes 51 are provided around it. A configuration such as providing this can be exemplified.
本発明により、抗原の賦活化から、抗原と一次抗体との抗原抗体反応、ＰＢＳ洗浄、内因性ペルオキシダーゼ除去、ＰＢＳ洗浄、一次抗体と二次抗体との抗原抗体反応、ＰＢＳ洗浄までを自動化することができる。 According to the present invention, from antigen activation to antigen-antibody reaction between antigen and primary antibody, PBS washing, endogenous peroxidase removal, PBS washing, antigen-antibody reaction between primary antibody and secondary antibody, PBS washing can be automated. Can do.
ここで、本発明に係る自動電界免疫組織染色装置を構成するにあたり、電界撹拌ユニットの一方の電極について、図１３（ａ）に示すように、貫通穴を中心点として対称に突部を二箇所形成し、電界を局所的に集中させるようにした電界集中型上部電極４１０を採用してもよい。図１３（ｂ）に示すように、突部形状によって、上部電極及び下部電極の間に形成される電界の分布のバランスを崩すことで、形成した突部の数（二箇所）だけ溶液表面が吸引されることになるので、より大きな撹拌効果が得られる。さらに、撹拌時にははっ水リング２４の樹脂部分が防波堤のように機能することで溶液を内側へ跳ね返すため、溶液に乱流が生じ、撹拌がより活発化することになる。 Here, in constructing the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus according to the present invention, as shown in FIG. 13 (a), two protrusions are symmetrically formed with the through hole as a center point on one electrode of the electric field stirring unit. An electric field concentration type upper electrode 410 that is formed and locally concentrates the electric field may be employed. As shown in FIG. 13 (b), the surface of the solution has the same number of protrusions as the number of protrusions (two locations) formed by breaking the balance of the electric field distribution formed between the upper electrode and the lower electrode. Since it is sucked, a larger stirring effect can be obtained. Furthermore, since the resin part of the water-repellent ring 24 functions like a breakwater during stirring, the solution is bounced inward, so that turbulence occurs in the solution and the stirring becomes more active.
また、形成した突部の数（二箇所）だけ溶液表面が吸引されるため、吸引される溶液の高さが低くなり、溶液中の粒子（一次抗体等）と組織標本との接触頻度を増やすことができる。また、吸引される溶液の高さが低くなることにより、より電極間距離を狭くすることができ、電界強度を高めることができ、やはり撹拌効果を大きくすることができる。撹拌効果が大きいことにより、抗原抗体反応に要する時間を短くすることもできる。 Moreover, since the surface of the solution is sucked by the number of formed protrusions (two places), the height of the sucked solution is lowered, and the contact frequency between the particles (primary antibodies, etc.) in the solution and the tissue specimen is increased. be able to. Moreover, since the height of the sucked solution is lowered, the distance between the electrodes can be further narrowed, the electric field strength can be increased, and the stirring effect can also be increased. Due to the large stirring effect, the time required for the antigen-antibody reaction can be shortened.
この突部は、貫通穴を中心点として対称に２か所以上６か所以下形成されることが好ましい。貫通穴は内径が１０ｍｍ未満であり、電界集中型上部電極の外径が２２ｍｍ〜３０ｍｍであることが好ましい。その他、電界集中型上部電極の厚みは突部と突部との間の凹み（へこみ）の深さをαｍｍとしたときに、３ｍｍ＋αｍｍであることが好ましい。また、突部と突部との間の幅は、突部と突部との間の凹み（へこみ）の深さをαｍｍとしたときに、１．５αｍｍであることが好ましい。 The protrusions are preferably formed in two or more and six or less places symmetrically about the through hole. The through hole has an inner diameter of less than 10 mm, and the electric field concentrated upper electrode preferably has an outer diameter of 22 mm to 30 mm. In addition, the thickness of the electric field concentration type upper electrode is preferably 3 mm + α mm when the depth of the dent (dent) between the protrusions is α mm. Moreover, it is preferable that the width | variety between a protrusion is 1.5 (alpha) mm when the depth of the dent (dent) between a protrusion and a protrusion is set to (alpha) mm.
電界集中型上部電極４１０では、より大きな撹拌効果が得られるため、抗原抗体反応における撹拌、洗浄時の撹拌において有利である。ただし、抗原を賦活化する際には、上述した上部電極４１を使って電界を与えるのが好ましい。 The electric field concentrated upper electrode 410 is advantageous in stirring during antigen-antibody reaction and stirring during washing because a larger stirring effect can be obtained. However, when activating the antigen, it is preferable to apply an electric field using the upper electrode 41 described above.
また、本発明に係る自動電界免疫組織染色装置を構成するにあたり、基板に区分される複数の領域を形成し、この領域毎に組織標本を載置可能とすることで、複数の組織標本を一度に免疫組織染色することができる。具体的には、基板に設けるはっ水リングに関し、図１４に示すように、滴下領域が２箇所、区分されて形成されるように、内径２０ｍｍのリングが２つ形成された枠を有する２穴タイプのはっ水リング２４Ａを採用すればよい。これに対応し、自動電界免疫組織染色装置１では、図１に示すように、はっ水リング２４Ａより形成された複数の領域に基づいて、それぞれ上部電極４１及び下部電極２２が２つずつ設けられている。さらに、供給管５２及び排出管５１も２つずつ設けられている。 In configuring the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus according to the present invention, a plurality of regions divided into the substrate are formed, and a tissue specimen can be placed in each region. Can be immunohistologically stained. Specifically, as shown in FIG. 14, the water-repellent ring provided on the substrate has a frame in which two rings each having an inner diameter of 20 mm are formed so that two dripping regions are formed separately. A hole-type water-repellent ring 24A may be employed. Correspondingly, in the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus 1, as shown in FIG. 1, two upper electrodes 41 and two lower electrodes 22 are provided on the basis of a plurality of regions formed by the water-repellent ring 24A. It has been. Further, two supply pipes 52 and two discharge pipes 51 are also provided.
また、図１４に示すように、ガラス基板Ｇに設けたはっ水リング２４Ａの内側に、溶液（例えば、一次抗体を含む溶液Ｓ）が撹拌されたか否かが視認可能な陽性コントロールＰＣ又は陰性コントロールＮＣを固定することもできる。陽性コントロールＰＣは撹拌されると発色し、陰性コントロールＮＣは撹拌されると非発色となる。したがって、陽性コントロールＰＣが発色し、又は、陰性コントロールＮＣが非発色となることで、免疫組織染色反応が行われたか否かの指標にすることができる。 In addition, as shown in FIG. 14, a positive control PC or a negative that allows visual recognition of whether or not a solution (for example, a solution S containing a primary antibody) has been stirred inside a water-repellent ring 24A provided on a glass substrate G. The control NC can also be fixed. The positive control PC develops color when stirred, and the negative control NC becomes non-colored when stirred. Therefore, when the positive control PC is colored or the negative control NC is not colored, it can be used as an index as to whether or not the immunohistochemical staining reaction has been performed.
例えば、図１４に示すように、ガラス基板Ｇに設けた２つのリングを有するはっ水リング２４Ａの一方のリング内側に、陽性コントロールＰＣ又は陰性コントロールＮＣを固定した上で、他方のリング内側に組織標本Ｔを固定する。このような形態のガラス基板を用い、本発明に係る自動電界免疫組織染色装置を使って免疫組織染色を構成する一連の反応を進める。そうすると、陽性コントロールＰＣ又は陰性コントロールＮＣを指標に一連の反応が適切に進んだか否かを判断することができ、染色の失敗を未然に防いで免疫組織染色の品位を向上することができる。 For example, as shown in FIG. 14, a positive control PC or a negative control NC is fixed inside one ring of a water-repellent ring 24A having two rings provided on a glass substrate G, and then inside the other ring. Tissue specimen T is fixed. Using such a glass substrate, a series of reactions constituting immunohistochemical staining are advanced using the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus according to the present invention. If it does so, it can be judged whether a series of reaction progressed appropriately by making positive control PC or negative control NC into an index, and it can prevent the failure of staining beforehand and can improve the quality of immunohistochemical staining.
はっ水リング２４Ａにはその樹脂部分である枠上に、ガラス基板Ｇから剥がし易くするタグ２４Ａ１を１〜２箇所、設けることが好ましい。また、はっ水リングに関し、内径を１０ｍｍ程度とすれば３つのリングの枠を形成することもできる（図示省略）。 The water repellent ring 24 </ b> A is preferably provided with one or two tags 24 </ b> A <b> 1 that are easily peeled off from the glass substrate G on a frame that is a resin portion thereof. As for the water-repellent ring, if the inner diameter is about 10 mm, a frame of three rings can be formed (not shown).
このほか、本発明に係る自動電界免疫組織染色装置に、加温機構を具備させるようにしてもよい。下部電極を例えばペルチェ素子などのヒーターにて加温する。下部電極を３５〜３８℃に加温することで、抗原抗体反応の反応性が向上するからである。 In addition, the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus according to the present invention may be provided with a heating mechanism. The lower electrode is heated by a heater such as a Peltier element. This is because the reactivity of the antigen-antibody reaction is improved by heating the lower electrode to 35 to 38 ° C.
本発明に係る自動電界免疫組織染色装置を使った自動電界免疫組織染色方法に沿った基本プロトコールの例を下記［表１］に示す。また、下記［表２］に、比較例として免疫組織染色に係り、各社から市販されているキットを利用した従来のプロトコール例を示す。 [Table 1] below shows an example of a basic protocol according to an automatic electroimmunohistological staining method using the automatic electroimmunohistological staining apparatus according to the present invention. Moreover, the following [Table 2] shows the example of the conventional protocol using the kit marketed from each company regarding immunohistochemical staining as a comparative example.
すなわち、［表１］に示すように、本発明に係る自動電界免疫組織染色方法では、組織標本をアセトンでガラス基板に固定し、ＰＢＳによる洗浄を行った上で、自動電界免疫組織染色装置の試料載置ユニットにおける載置部に組織標本が固定されたガラス基板を載置する。この状態で、自動電界免疫組織染色装置を作動させる。 That is, as shown in [Table 1], in the automatic electric field immunohistochemical staining method according to the present invention, the tissue specimen is fixed to a glass substrate with acetone, washed with PBS, A glass substrate on which a tissue specimen is fixed is placed on the placement portion in the sample placement unit. In this state, the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus is operated.
自動電界免疫組織染色装置内では、試料載置ユニットが搬送されて、電界撹拌ユニットの上部電極の直下に組織標本が固定されたガラス基板が位置し、この組織標本に対して電界が３０〜６０秒間与えられて、組織標本中の抗原が賦活化される。続いて、試料載置ユニットが搬送されて、溶液供給ユニットの一次抗体を含む溶液が収容されている収容部の直下に、抗原を賦活化させた組織標本が固定されているガラス基板が位置し、この組織標本に対して一次抗体を含む溶液が滴下される。さらに、試料載置ユニットが搬送されて、電界撹拌ユニットの上部電極の直下にガラス基板が位置し、一次抗体を含む溶液が滴下された組織標本に対して電界が５〜７分間与えられ、一次抗体を含む溶液の非接触な撹拌によって一次抗体と組織標本中の抗原との抗原抗体反応が進む。 In the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus, the sample placement unit is transported, and a glass substrate on which the tissue specimen is fixed is located immediately below the upper electrode of the electric field agitating unit. Given for a second, the antigen in the tissue specimen is activated. Subsequently, the glass substrate on which the tissue specimen activated with the antigen is fixed is located immediately below the storage unit in which the sample mounting unit is transported and the solution containing the primary antibody of the solution supply unit is stored. The solution containing the primary antibody is dropped on the tissue specimen. Furthermore, the sample mounting unit is transported, the glass substrate is positioned directly below the upper electrode of the electric field stirring unit, and an electric field is applied to the tissue specimen on which the solution containing the primary antibody has been dropped for 5 to 7 minutes. The antigen-antibody reaction of the primary antibody and the antigen in the tissue specimen proceeds by non-contact stirring of the solution containing the antibody.
抗原と一次抗体との抗原抗体反応の後、洗浄ユニットが搬送されて、排出管の管先が上部電極の貫通孔を通じて一次抗体を含む溶液に届き、一次抗体を含む溶液が吸引されて排出される。また、洗浄ユニットの供給管の管先が上部電極の貫通孔から組織標本へ向けて覗いて、洗浄液としてのＰＢＳがガラス基板上に供給される。このＰＢＳに対して電界が３０〜６０秒間与えられ、ＰＢＳの非接触な撹拌によって、組織標本が洗浄される。洗浄に用いたＰＢＳはガラス基板上から排出管により吸引して排出される。 After the antigen-antibody reaction between the antigen and the primary antibody, the washing unit is transported, the tube end of the discharge tube reaches the solution containing the primary antibody through the through hole of the upper electrode, and the solution containing the primary antibody is sucked and discharged. The Further, the tip of the supply pipe of the cleaning unit is looked into the tissue specimen from the through hole of the upper electrode, and PBS as a cleaning liquid is supplied onto the glass substrate. An electric field is applied to the PBS for 30 to 60 seconds, and the tissue specimen is washed by non-contact stirring of the PBS. PBS used for cleaning is sucked and discharged from the glass substrate through the discharge tube.
次に、自動電界免疫組織染色装置内では、試料載置ユニットが搬送されて、溶液供給ユニットの内因性ペルオキシダーゼ除去のためのブロッキング溶液が収容されている収容部の直下に、抗原と一次抗体との抗原抗体反応を終え、ＰＢＳにより洗浄された組織標本が固定されているガラス基板が位置し、このブロッキング溶液が滴下される。また、試料載置ユニットが搬送されて、電界撹拌ユニットの上部電極の直下にブロッキング溶液が滴下された組織標本が固定されているガラス基板が位置し、この組織標本に対して電界が１分間与えられる。ブロッキング溶液の非接触な撹拌によって、免疫組織染色で用いられる発色剤（ジアミノベンジジン液：ＤＡＢ液）に対する非特異的な発色が有効に抑えられる。 Next, in the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus, the sample mounting unit is transported, and the antigen and the primary antibody are placed directly under the storage unit in which the blocking solution for removing endogenous peroxidase of the solution supply unit is stored. After finishing the antigen-antibody reaction, a glass substrate on which the tissue specimen washed with PBS is fixed is located, and this blocking solution is dropped. In addition, a glass substrate on which the sample mounting unit is transported and a tissue specimen on which a blocking solution is dropped is positioned directly below the upper electrode of the electric field stirring unit is positioned, and an electric field is applied to the tissue specimen for 1 minute. It is done. By non-contact stirring of the blocking solution, non-specific color development with respect to the color former (diaminobenzidine solution: DAB solution) used in immunohistological staining can be effectively suppressed.
ブロッキング溶液の撹拌の後、洗浄ユニットが搬送され、排出管の管先が上部電極の貫通孔を通じてブロッキング溶液に届き、ブロッキング溶液が吸引されて排出される。また、洗浄ユニットの供給管の管先が上部電極の貫通孔から組織標本へ向き、ＰＢＳがガラス基板上に供給される。このＰＢＳに対して電界が３０〜６０秒間与えられ、ＰＢＳの非接触な撹拌によって、組織標本が洗浄される。洗浄に用いたＰＢＳはガラス基板上から排出管により吸引されて排出される。 After the blocking solution is stirred, the cleaning unit is transported, the tube end of the discharge pipe reaches the blocking solution through the through hole of the upper electrode, and the blocking solution is sucked and discharged. In addition, the tube tip of the supply tube of the cleaning unit faces the tissue specimen from the through hole of the upper electrode, and PBS is supplied onto the glass substrate. An electric field is applied to the PBS for 30 to 60 seconds, and the tissue specimen is washed by non-contact stirring of the PBS. The PBS used for cleaning is sucked and discharged from the glass substrate by the discharge tube.
さらに、自動電界免疫組織染色装置内では、試料載置ユニットが搬送されて、溶液供給ユニットの二次抗体溶液が収容されている収容部の直下に、抗原と一次抗体との抗原抗体反応、ＰＢＳによる洗浄及び、ブロッキング溶液によるブロッキングを終えた組織標本が固定されているガラス基板が位置し、二次抗体溶液が滴下される。また、試料載置ユニットが搬送され、電界撹拌ユニットの上部電極の直下に二次抗体溶液が滴下された組織標本が固定されているガラス基板が位置し、この組織標本に対して電界が５分間与えられる。二次抗体溶液の非接触な撹拌によって一次抗体と二次抗体との抗原抗体反応が進む。 Furthermore, in the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus, the sample mounting unit is transported, and the antigen-antibody reaction between the antigen and the primary antibody, PBS immediately below the storage unit storing the secondary antibody solution of the solution supply unit, PBS The glass substrate on which the tissue specimen that has been washed and blocked with the blocking solution is fixed is positioned, and the secondary antibody solution is dropped. In addition, a glass substrate on which the sample mounting unit is transported and a tissue specimen on which the secondary antibody solution is dropped is positioned directly below the upper electrode of the electric field stirring unit is positioned, and the electric field is applied to the tissue specimen for 5 minutes. Given. The antigen-antibody reaction between the primary antibody and the secondary antibody proceeds by non-contact stirring of the secondary antibody solution.
一次抗体と二次抗体との抗原抗体反応の後、洗浄ユニットが搬送され、排出管の管先が上部電極の貫通孔を通じて二次抗体溶液に届いて、これを吸引して排出する。また、洗浄ユニットの供給管の管先が上部電極の貫通孔から組織標本へ向き、洗浄液としてのＰＢＳガラス基板上に供給する。このＰＢＳに対して電界が１分与えられ、ＰＢＳの非接触な撹拌によって、組織標本が洗浄される。さらに、洗浄に用いたＰＢＳはガラス基板上から排出管により吸引して排出される。そして、自動電界免疫組織染色装置の作動を停止し、一連の反応を進めたガラス基板を試料載置ユニットから外部へ取り出す。 After the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the secondary antibody, the washing unit is transported, and the tube tip of the discharge tube reaches the secondary antibody solution through the through hole of the upper electrode, which is sucked and discharged. Further, the tip of the supply pipe of the cleaning unit is directed from the through hole of the upper electrode toward the tissue specimen and supplied onto a PBS glass substrate as a cleaning liquid. An electric field is applied to the PBS for 1 minute, and the tissue specimen is washed by non-contact stirring of the PBS. Further, the PBS used for cleaning is sucked and discharged from the glass substrate through the discharge tube. Then, the operation of the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus is stopped, and the glass substrate having undergone a series of reactions is taken out from the sample placement unit.
その後、ガラス基板上の組織標本に対し、二次抗体の標識酵素であるペルオキシダーゼと反応するジアミノベンジジンによって発色し（ＤＡＢ発色）、核染色により細胞核を染色し、発色が退色しないように封入する等の従来の免疫組織染色と同様な処理を行う。 Then, the tissue specimen on the glass substrate is colored with diaminobenzidine that reacts with peroxidase, which is a secondary antibody labeling enzyme (DAB coloring), and the cell nucleus is stained with nuclear staining, and sealed so that the coloring does not fade. The same treatment as in conventional immunohistochemical staining is performed.
本発明に係る自動電界免疫組織染色方法では、自動電界免疫組織染色装置を利用することにより、免疫組織染色を構成する一連の反応であるアセトン固定からＤＡＢ発色、核染色、封入等の操作までを２２．５分程度で完了することができる。また、自動電界免疫組織染色装置を利用することにより、抗原の賦活化から二次抗体による抗原抗体反応の後の洗浄までを自動で進めることができる。 In the automatic electric field immunohistochemical staining method according to the present invention, by using an automatic electric field immunohistochemical staining apparatus, a series of reactions constituting the immunohistochemical staining, from acetone fixation to DAB color development, nuclear staining, encapsulation, and other operations are performed. It can be completed in about 22.5 minutes. In addition, by using an automatic electroimmunohistological staining apparatus, it is possible to automatically proceed from antigen activation to washing after the antigen-antibody reaction with the secondary antibody.
一方、［表２］に示すように、各社から市販されているキットを利用した従来の免疫組織染色方法（比較例１〜３）では、アセトン固定からＤＡＢ発色、核染色、封入等の操作までに少なくとも２２３分以上を要する。 On the other hand, as shown in [Table 2], in conventional immunohistochemical staining methods (Comparative Examples 1 to 3) using kits commercially available from various companies, from acetone fixation to DAB color development, nuclear staining, encapsulation, and other operations. Takes at least 223 minutes.
また、上記特許文献１に係る特開２０１０−１１９３８８号公報に開示の電界撹拌技術を利用し、一次抗体と組織標本中の抗原との抗原抗体反応及び、一次抗体と二次抗体との抗原抗体反応を電界撹拌技術で進める一方、その前後の洗浄工程を手作業で進めた免疫組織染色の例として比較例４を取り上げた。比較例４の場合、アセトン固定からＤＡＢ発色、核染色、封入等の操作までに１５１分を要した。 Further, using the electric field stirring technique disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-119388 related to Patent Document 1, the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the antigen in the tissue specimen, and the antigen antibody between the primary antibody and the secondary antibody Comparative Example 4 was taken up as an example of immunohistochemical staining in which the reaction was advanced by an electric field stirring technique while the washing process before and after the reaction was advanced manually. In the case of Comparative Example 4, 151 minutes were required from operations such as acetone fixation to DAB color development, nuclear staining, and encapsulation.
特に、一次抗体と抗原との抗原抗体反応や一次抗体と二次抗体との抗原抗体反応の時間が、比較例１〜４において６０分程度、或いはそれ以上の時間を要する。これに対し、本発明において、それぞれ５分に短縮される。また、抗原抗体反応の前後の洗浄工程が、比較例において５分を３セット、すなわち１５分以上の時間を要する。これに対し、本発明において、それぞれ３０〜６０秒又は１分に短縮される。 In particular, the time of the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the antigen and the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the secondary antibody requires about 60 minutes or more in Comparative Examples 1 to 4. On the other hand, in the present invention, each is shortened to 5 minutes. In addition, the washing process before and after the antigen-antibody reaction takes 3 sets of 5 minutes, that is, 15 minutes or more in the comparative example. In contrast, in the present invention, the time is shortened to 30 to 60 seconds or 1 minute, respectively.
（実施例１）
実施例１では、ポジティブコントロールに対して本発明に係る自動電界免疫組織染色装置を利用し、免疫組織染色を行った。その基本プロトコールは、上記［表１］のとおりである。実施例１における免疫組織染色の結果である顕微鏡写真を、図１５（ｂ）に示す。図１５（ａ）には、比較例４として示したプロトコールにより免疫組織染色を行い、その結果である顕微鏡写真を示している。
Example 1
In Example 1, immunohistological staining was performed using the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus according to the present invention for positive control. The basic protocol is as shown in the above [Table 1]. The micrograph which is a result of the immunohistochemical staining in Example 1 is shown in FIG. FIG. 15A shows a micrograph of the result of immunohistochemical staining performed according to the protocol shown as Comparative Example 4.
また、実施例１における免疫組織染色に用いた一次抗体、二次抗体及びその液量、洗浄液の液量、はっ水リングの内径を下記［表３］に示した。 [Table 3] shows the primary antibody and secondary antibody used in immunohistochemical staining in Example 1 and the amounts thereof, the amount of washing solution, and the inner diameter of the water-repellent ring.
実施例１において、ポジティブコントロール標本中の抗原を賦活化するにあたって付与した電界条件は、以下のとおりである。ガラス基板上の組織標本に対して印加電界強度４．５ｋＶ、周波数１Ｈｚの矩形波で１分間の条件で電界を与えた。電極と組織標本との隙間は３．３ｍｍであった。 In Example 1, the electric field conditions given in activating the antigen in the positive control specimen are as follows. An electric field was applied to the tissue specimen on the glass substrate with a rectangular wave having an applied electric field strength of 4.5 kV and a frequency of 1 Hz for 1 minute. The gap between the electrode and the tissue specimen was 3.3 mm.
また、一次抗体と抗原との抗原抗体反応を進めるにあたって付与した電界条件は、以下のとおりである。内径２０ｍｍのはっ水リングに一次抗体を含む溶液をガラス基板上の組織標本へ向けて２００μＬ滴下し、この溶液に対して印加電界強度４ｋＶ、オフセット電圧２ｋＶ、周波数１〜３０Ｈｚの矩形波で４分３０秒間の条件で電界を与えた。電極と溶液との隙間は４．５ｍｍであった。 In addition, the electric field conditions given in proceeding with the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the antigen are as follows. 200 μL of a solution containing a primary antibody is dropped onto a tissue sample on a glass substrate on a water-repellent ring having an inner diameter of 20 mm, and an applied electric field strength of 4 kV, an offset voltage of 2 kV, and a rectangular wave with a frequency of 1 to 30 Hz is applied to this solution. An electric field was applied under the condition of 30 minutes. The gap between the electrode and the solution was 4.5 mm.
また、一次抗体と抗原との抗原抗体反応の後の洗浄工程を進めるにあたって付与した電界条件は、以下のとおりである。一次抗体を含む溶液を排出管により排出した後、供給管１２を用いて洗浄液であるＰＢＳを４００μＬ、ガラス基板上の組織標本へ向けて供給し、この洗浄液に対して印加電界強度４ｋＶ、オフセット電圧２ｋＶ、周波数１〜３０Ｈｚの矩形波で３０秒間の条件で電界を与えた。電極と洗浄液との隙間は６ｍｍであった。その後、洗浄液を排出管により排出した。なお、洗浄工程において、洗浄の時間は３０秒であり、その回数は１回で十分であった。 In addition, the electric field conditions given in proceeding with the washing step after the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the antigen are as follows. After the solution containing the primary antibody is discharged through the discharge tube, 400 μL of PBS as a cleaning solution is supplied toward the tissue specimen on the glass substrate using the supply tube 12, and the applied electric field strength is 4 kV and the offset voltage is applied to the cleaning solution. An electric field was applied with a rectangular wave having a frequency of 2 kV and a frequency of 1 to 30 Hz for 30 seconds. The gap between the electrode and the cleaning liquid was 6 mm. Thereafter, the cleaning liquid was discharged through a discharge pipe. In the cleaning step, the cleaning time was 30 seconds, and the number of times was sufficient.
一次抗体と二次抗体との抗原抗体反応を進めるにあたって付与した電界条件は、以下のとおりである。内径２０ｍｍのはっ水リングに二次抗体を含む溶液をガラス基板上の組織標本へ向けて２００μＬ滴下し、この溶液に対して印加電界強度４ｋＶ、オフセット電圧２ｋＶ、周波数１〜３０Ｈｚの矩形波で５分間の条件で電界を与えた。電極と溶液との隙間は４．５ｍｍであった。 The electric field conditions given when the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the secondary antibody is advanced are as follows. 200 μL of a solution containing a secondary antibody is dropped onto a water repellent ring having an inner diameter of 20 mm toward a tissue specimen on a glass substrate, and an applied electric field strength of 4 kV, an offset voltage of 2 kV, and a rectangular wave with a frequency of 1 to 30 Hz are applied to this solution. An electric field was applied for 5 minutes. The gap between the electrode and the solution was 4.5 mm.
また、一次抗体と二次抗体との抗原抗体反応の後の洗浄工程を進めるにあたって付与した電界条件は、以下のとおりである。二次抗体を含む溶液を排出管により排出した後、供給管１２を用いて洗浄液であるＰＢＳを４００μＬ、ガラス基板上の組織標本へ向けて供給し、この洗浄液に対して印加電界強度４ｋＶ、オフセット電圧２ｋＶ、周波数１〜３０Ｈｚの矩形波で３０秒間の条件で電界を与えた。電極と洗浄液との隙間は６ｍｍであった。その後、洗浄液を排出管により排出した。なお、この洗浄工程において、洗浄の時間は３０秒であり、その回数は２回で十分であった。 Moreover, the electric field conditions given in proceeding with the washing step after the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the secondary antibody are as follows. After discharging the solution containing the secondary antibody through the discharge tube, 400 μL of PBS, which is a cleaning solution, is supplied to the tissue specimen on the glass substrate using the supply tube 12, and the applied electric field strength is 4 kV and offset with respect to this cleaning solution. An electric field was applied under the condition of a rectangular wave having a voltage of 2 kV and a frequency of 1 to 30 Hz for 30 seconds. The gap between the electrode and the cleaning liquid was 6 mm. Thereafter, the cleaning liquid was discharged through a discharge pipe. In this cleaning step, the cleaning time was 30 seconds, and two times was sufficient.
本発明は、免疫組織染色の所要時間が２２．５分であって、比較例４の所要時間（１５１分）の約７分の１に短縮されている。にもかかわらず、実施例１において、図１５（ｂ）に示す本発明による免疫組織染色の結果は、図１５（ａ）に示す比較例４によるものと同等に明瞭であることが理解される。 In the present invention, the time required for immunohistochemical staining is 22.5 minutes, which is shortened to about 1/7 of the time required for Comparative Example 4 (151 minutes). Nevertheless, in Example 1, it is understood that the result of the immunohistochemical staining according to the present invention shown in FIG. 15 (b) is equally clear as that in Comparative Example 4 shown in FIG. 15 (a). .
（実施例２）
実施例２では、リンパ節組織に対して本発明に係る自動電界免疫組織染色装置を利用し、免疫組織染色を行った。その基本プロトコールは、上記［表１］のとおりである。実施例２における免疫組織染色の結果である顕微鏡写真を、図１６（ｂ）に示す。図１６（ａ）は、比較例５として行った免疫組織染色の例であり、その結果である顕微鏡写真を示している。比較例５では、上記［表１］の基本プロトコールにおいて、抗原抗体反応やＰＢＳによる洗浄時に電界を付与せず、溶液や洗浄液を撹拌しないで免疫組織染色を進めた。
(Example 2)
In Example 2, immunohistochemical staining was performed on lymph node tissue using the automatic electric field immunohistochemical staining apparatus according to the present invention. The basic protocol is as shown in the above [Table 1]. The micrograph which is the result of the immunohistochemical staining in Example 2 is shown in FIG. FIG. 16 (a) is an example of immunohistochemical staining performed as Comparative Example 5, and shows a micrograph as a result. In Comparative Example 5, in the basic protocol of [Table 1] above, immunohistochemical staining was advanced without applying an electric field during antigen-antibody reaction or washing with PBS and without stirring the solution or washing solution.
実施例２における免疫組織染色に用いた一次抗体、二次抗体及びその液量、洗浄液にお液量、はっ水リングの内径を下記［表４］に示した。 [Table 4] below shows the primary antibody and secondary antibody used in immunohistochemical staining in Example 2 and the amount of the solution, the amount of solution in the washing solution, and the inner diameter of the water-repellent ring.
実施例２において、一次抗体と抗原との抗原抗体反応を進めるにあたって付与した電界条件は、以下のとおりである。内径２０ｍｍのはっ水リングに一次抗体を含む溶液をガラス基板上の組織標本へ向けて２００μＬ滴下し、この溶液に対して印加電界強度４ｋＶ、オフセット電圧２ｋＶ、周波数１０Ｈｚの矩形波で５分間の条件で電界を与えた。電極と溶液との隙間は４．５ｍｍであった。 In Example 2, the electric field conditions given when the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the antigen is advanced are as follows. 200 μL of a solution containing a primary antibody is dropped onto a tissue sample on a glass substrate on a water-repellent ring having an inner diameter of 20 mm, and an electric field strength of 4 kV, an offset voltage of 2 kV, and a rectangular wave with a frequency of 10 Hz are applied to this solution for 5 minutes. An electric field was applied under conditions. The gap between the electrode and the solution was 4.5 mm.
また、一次抗体と抗原との抗原抗体反応の後の洗浄工程を進めるにあたって付与した電界条件は、以下のとおりである。一次抗体を含む溶液を排出管により排出した後、供給管１２を用いて洗浄液であるＰＢＳを４００μＬ、ガラス基板上の組織標本へ向けて供給し、この洗浄液に対して印加電界強度４ｋＶ、オフセット電圧２ｋＶ、周波数１０Ｈｚの矩形波で３０秒間の条件で電界を与えた。電極と洗浄液との隙間は６ｍｍであった。その後、洗浄液を排出管により排出した。なお、洗浄工程において、洗浄の時間は３０秒であり、その回数は１回で十分であった。 In addition, the electric field conditions given in proceeding with the washing step after the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the antigen are as follows. After the solution containing the primary antibody is discharged through the discharge tube, 400 μL of PBS as a cleaning solution is supplied toward the tissue specimen on the glass substrate using the supply tube 12, and the applied electric field strength is 4 kV and the offset voltage is applied to the cleaning solution. An electric field was applied with a rectangular wave of 2 kV and a frequency of 10 Hz for 30 seconds. The gap between the electrode and the cleaning liquid was 6 mm. Thereafter, the cleaning liquid was discharged through a discharge pipe. In the cleaning step, the cleaning time was 30 seconds, and the number of times was sufficient.
一次抗体と二次抗体との抗原抗体反応を進めるにあたって付与した電界条件は、以下のとおりである。内径２０ｍｍのはっ水リングに二次抗体を含む溶液をガラス基板上の組織標本へ向けて２００μＬ滴下し、この溶液に対して印加電界強度４ｋＶ、オフセット電圧２ｋＶ、周波数１０Ｈｚの矩形波で５分間の条件で電界を与えた。電極と溶液との隙間は４．５ｍｍであった。 The electric field conditions given when the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the secondary antibody is advanced are as follows. 200 μL of a solution containing a secondary antibody is dropped on a water repellent ring having an inner diameter of 20 mm toward a tissue specimen on a glass substrate, and a rectangular wave with an applied electric field strength of 4 kV, an offset voltage of 2 kV, and a frequency of 10 Hz is applied to the solution for 5 minutes. An electric field was applied under the conditions of The gap between the electrode and the solution was 4.5 mm.
また、一次抗体と二次抗体との抗原抗体反応の後の洗浄工程を進めるにあたって付与した電界条件は、以下のとおりである。二次抗体を含む溶液を排出管により排出した後、供給管１２を用いて洗浄液であるＰＢＳを４００μＬ、ガラス基板上の組織標本へ向けて供給し、この洗浄液に対して印加電界強度４ｋＶ、オフセット電圧２ｋＶ、周波数１０Ｈｚの矩形波で３０秒間の条件で電界を与えた。電極と洗浄液との隙間は６ｍｍであった。その後、洗浄液を排出管により排出した。なお、この洗浄工程において、洗浄の時間は３０秒であり、その回数は１回で十分であった。 Moreover, the electric field conditions given in proceeding with the washing step after the antigen-antibody reaction between the primary antibody and the secondary antibody are as follows. After discharging the solution containing the secondary antibody through the discharge tube, 400 μL of PBS, which is a cleaning solution, is supplied to the tissue specimen on the glass substrate using the supply tube 12, and the applied electric field strength is 4 kV and offset with respect to this cleaning solution. An electric field was applied with a rectangular wave having a voltage of 2 kV and a frequency of 10 Hz for 30 seconds. The gap between the electrode and the cleaning liquid was 6 mm. Thereafter, the cleaning liquid was discharged through a discharge pipe. In this cleaning step, the cleaning time was 30 seconds, and the number of times was sufficient.
実施例２において、図１６（ｂ）に示す本発明による免疫組織染色の結果が、図１６（ａ）に示す比較例５によるものより明瞭であることが理解される。なお、実施例２では、電界付与による抗原の賦活化を行っていない。 In Example 2, it is understood that the result of immunohistochemical staining according to the present invention shown in FIG. 16 (b) is clearer than that in Comparative Example 5 shown in FIG. 16 (a). In Example 2, antigen activation by applying an electric field is not performed.
以上、本発明の実施形態を例示して詳述したが、上記実施形態は、出願人が最良であるものと信じて開示する形態であって、本発明がこれに限定されるものではない。本発明は、特許請求の範囲に記載された事項を逸脱することがなければ、種々の設計変更を行うことが可能である。 As mentioned above, although embodiment of this invention was illustrated and explained in full detail, the said embodiment is a form which believes that an applicant is the best and is disclosed, Comprising: This invention is not limited to this. The present invention can be modified in various ways without departing from the scope of the claims.
例えば、本発明を実施するに際し、抗原との非特異的な反応を抑制し、免疫組織染色の染色性を向上させるためのブロッキング工程は不要であるが、敢えてブロッキング工程を行っても免疫組織染色自体に支障は生じない。さらに、ＣＫやＣＤ２０等の反応性の高い抗体を用いる場合、抗原を賦活化する工程を行う必要の無い場合がありうる。そして、上述したように、本発明は、免疫組織染色を時間的な制約がある術中迅速病理診断に適用可能とする。また、抗体試薬を希釈、すなわち節約して免疫組織染色をすることが可能となる。本発明は、凍結切片を用いた術中迅速診断、パラフィン切片を用いた免疫染色診断に適用可能であるほか、核酸のハイブリダイゼーション、その他の抗原抗体反応等の迅速化、自動化に貢献することもできる。 For example, when carrying out the present invention, a blocking step for suppressing non-specific reaction with an antigen and improving the staining property of immunohistochemical staining is not necessary. There is no problem in itself. Furthermore, when a highly reactive antibody such as CK or CD20 is used, it may not be necessary to perform an antigen activation step. As described above, the present invention enables immunohistochemical staining to be applied to intraoperative rapid pathological diagnosis with time constraints. In addition, it is possible to dilute, ie save, the antibody reagent for immunohistochemical staining. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be applied to rapid intraoperative diagnosis using frozen sections and immunostaining diagnosis using paraffin sections, and can also contribute to the acceleration and automation of nucleic acid hybridization and other antigen-antibody reactions. .
また、上記実施形態では、試料載置ユニットが搬送されて、免疫組織染色を構成する一連の反応が行われる構成を説明したが、本発明がこれに限定されるものではない。本発明は、試料載置ユニットが固定されたままで、溶液供給ユニット、電界撹拌ユニット及び洗浄ユニットが搬送されることにより、免疫組織染色を構成する一連の反応が行われる構成とすることも可能である。このような構成において本発明は、試料載置ユニットで基板上に滴下された溶液等が、決してこぼれることがないというメリットを有することとなる。 Moreover, although the sample mounting unit was conveyed and the series of reaction which comprises immunohistochemical staining was demonstrated in the said embodiment, this invention is not limited to this. The present invention can also be configured such that a series of reactions constituting immunohistochemical staining are performed by transporting the solution supply unit, the electric field stirring unit, and the washing unit while the sample placement unit is fixed. is there. In such a configuration, the present invention has an advantage that the solution or the like dropped on the substrate by the sample mounting unit is never spilled.
１・・・・自動電界免疫組織染色装置（本発明）
２・・・・試料載置ユニット
２１・・・ステージ
２１Ａ・・載置部
２２・・・下部電極（他方の電極）
２３・・・ステージ搬送部
２４・・・はっ水リング
２４Ａ・・２穴タイプのはっ水リング
２４Ａ１・タグ
３・・・・溶液供給ユニット
３１・・・シリンジ
３１Ａ・・フランジ部
３１Ｂ・・本体部
３１Ｃ・・筒先部
３２・・・カセット体
３２Ａ・・シリンダ収容部
３３・・・プランジャロッド
３４・・・ピストン
３５・・・カセット搬送部
４・・・・電界撹拌ユニット
４１・・・上部電極（一方の電極）
４１Ａ・・貫通穴
４１０・・電界集中型上部電極
４２・・・上部電極搬送部
５・・・・洗浄ユニット
５１・・・排出管
５２・・・供給管
５３・・・洗浄管搬送部
Ｇ・・・・ガラス基板
Ｓ・・・・一次抗体を含む溶液
Ｔ・・・・組織標本
ＮＣ・・・ネガティブコントロール
ＰＣ・・・ポジティブコントロール
1 ... Automatic electric field immunohistochemical staining apparatus (present invention)
2 .... Sample placement unit 21 ... Stage 21A ... Placement part 22 ... Lower electrode (the other electrode)
23 ... Stage transport unit 24 ... Water repellent ring 24A ... 2 hole type water repellent ring 24A1 / tag 3 ... Solution supply unit 31 ... Syringe 31A ... Flange part 31B ... Body part 31C ... Cylinder tip part 32 ... Cassette body 32A ... Cylinder housing part 33 ... Plunger rod 34 ... Piston 35 ... Cassette transport part 4 ... Electric field stirring unit 41 ... Upper part Electrode (one electrode)
41A ... Through hole 410 ... Electric field concentration type upper electrode 42 ... Upper electrode transport part 5 ... Cleaning unit 51 ... Discharge pipe 52 ... Supply pipe 53 ... Cleaning pipe transport part G・ ・ ・ Glass substrate S ... Solution containing primary antibody T ... Tissue specimen NC ... Negative control PC ... Positive control
Claims (6)
前記組織標本が固定された基板が載置されるステージを有する試料載置ユニットと、
前記抗体を含んだ溶液が収容される収容部及び、前記収容部から前記溶液を前記基板上の前記組織標本へ向けて滴下する滴下部材を備える溶液供給ユニットと、
前記基板に滴下された溶液を撹拌するための相対する電極の一方である環状電極を備えた電界撹拌ユニットと、
前記電界撹拌ユニットの上部に設けられ、前記基板上の前記組織標本へ向けて滴下された前記溶液及び前記組織標本を洗浄する洗浄液を排出する排出管と、洗浄液を供給する供給管とを備え、前記組織標本へ滴下された前記溶液を排出した後に前記組織標本への前記洗浄液の供給及びその排出により前記組織標本を洗浄する洗浄ユニットと、
前記抗体を含んだ溶液を前記基板に滴下するときには前記試料載置ユニットを前記溶液供給ユニットへ搬送し、前記基板に滴下された溶液を撹拌及び前記組織標本を洗浄するときには前記試料載置ユニットを前記電界撹拌ユニットへ搬送するためのステージ搬送部と、
を有し、
前記洗浄ユニットは、前記組織標本へ滴下された前記溶液と前記組織標本へ供給された前記洗浄液とを排出するとき又は前記洗浄液を前記組織標本へ供給するときには、前記排出管又は前記供給管を前記環状電極の貫通穴にそれぞれ挿入して行うことを特徴とする自動電界免疫組織染色装置。 An automatic electric field immunohistochemical staining apparatus in which a series of reactions constituting immunohistochemical staining for detecting an antigen in a tissue specimen to be tested is accelerated and automated by a stirring phenomenon based on electric field application using a predetermined antibody Because
A sample placement unit having a stage on which a substrate on which the tissue specimen is fixed is placed;
A solution supply unit comprising: a storage unit that stores the solution containing the antibody; and a dropping member that drops the solution from the storage unit toward the tissue specimen on the substrate;
An electric field stirring unit provided with an annular electrode which is one of opposing electrodes for stirring the solution dropped on the substrate ;
An upper part of the electric field agitation unit, comprising: a discharge pipe for discharging the solution dropped onto the tissue specimen on the substrate and a cleaning liquid for cleaning the tissue specimen ; and a supply pipe for supplying the cleaning liquid , A cleaning unit for cleaning the tissue specimen by supplying and discharging the cleaning liquid to the tissue specimen after discharging the solution dripped onto the tissue specimen ;
When the solution containing the antibody is dropped onto the substrate, the sample placement unit is transported to the solution supply unit, and when the solution dropped onto the substrate is stirred and the tissue specimen is washed, the sample placement unit is removed. A stage transport unit for transporting to the electric field stirring unit;
Have
When the cleaning unit discharges the solution dripped onto the tissue specimen and the cleaning liquid supplied to the tissue specimen or supplies the cleaning liquid to the tissue specimen, the cleaning unit is configured to connect the discharge pipe or the supply pipe to the tissue specimen. An automatic electric field immunohistochemical staining apparatus, which is performed by inserting each through a through hole of an annular electrode .
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