NO149843B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av peptider med tymopoietin-lignende aktivitet - Google Patents

Abstract

Peptider med tymopoietin-lignende aktivitet og med formelen:. hvor A erellerX er et egnet nbytralt alifatisk eller aromatisk amlnosyreresiduum, f.eks. et valgt fra gruppen bestående av ALA, 2-Me-ALA, GLY, LEU, ILE, LYS, THR, SER, PHE, MET, D-ALA, D-LEU, D-ILE, D-LYS, D-THR, allo-THR, D-SER, D-PHE, D-MET og SAR, Z erYr GLY, SER, THR, LEU,. ILE, VAL eller SAR, B er TYR-R', D-TYR-R', dekar-. boksy-TYR eller. i er 3 eller 4,. n er 1, 2 eller 3, R"' er hydrogen, C^-Cy-alkyl,6"1-aryl eller C--Cy-alkanoyl, og R og R' er substituenter som ikke i vesentlig grad påvirker peptidets biologiske aktivitet, forutsatt at man utelukker R-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-R'. Disse peptider har evnen til å indusere differensieringen av T-lymfocytter, men ikke komplementreseptor (CR)-B-lymfocyttene, og kan således brukes på en rekke terapeutiske områder. Fremstillingen av peptidene er beskrevet.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av nye peptider og deres derivater, hvilke forbindelser har terapeutisk aktivitet.

US-patent nr. 4.190.646 beskriver et pentapeptid med sekvensen H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH såvel som peptidsammen-setninger hvor de forskjellige grupper er substituert på de avsluttende amino- eller karboksylgrupper på dette pentapeptid. Nevnte patent inngår her som en referanse. For korthets skyld vil nevnte pentapeptid, hvis sekvens er gitt ovenfor, bli betegnet som "tymopoietin pentapeptid" eller "TP5". Det ovennevnte patent beskriver at nevnte tymopoietin-pentapeptid og dets derivater har en biologisk aktivitet som er lik den man finner i det langkjedede polypeptid som er kjent som tymopoietin og som er beskrevet i US-patentene nr. 4.002.740 og 4.077.949. Det angitte tymopoietin-pentapeptid som ble beskrevet som den mest aktive forbindelse i nevnte patent, viste en aktivitet i prøver i mus beskrevet i eksempel II, i konsentrasjoner varierende fra ng/ml til 10 yg/ml. Den biologiske aktiviteten av TP5 er også beskrevet i en artikkel av M.E. Weksler et al., J. Exp. Med. 148: 996-1006 (1978). Denne artikkel er her angitt som referanse.

De fremstilte peptider er overraskende og be-tydelig mer aktive enn nevnte tymopoietin-pentapeptid.

Det er følgelig en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe nye peptider og deres derivater som har evnen til å indusere differensiering av benmarg-celler til T-celler, slik at man gir opphav til tymusav-ledende lumfocytter, og som derfor er meget anvendbare i immunsystemet både hos mennesker og dyr, samt å tilveiebringe peptider som har denne differensierende evne i pikogram/ml-konsentrasjoner.

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles således peptider med biologisk evne til å indusere differensieringen av T-lymfocytter, men ikke komplementreseptor (CR<+>)-B-lymfocytter, hvor nevnte peptid har følgende sekvens: og farmasøytisk akseptable salter av dette peptid, hvor A er eller X er en egnet nøytralt, alifatisk eller aromatisk amino-syrerest valt fra.gruppen bestående av ALA, 2-Me-ALA-GLY, LEU, ILE, LYS, THR, SER, PHE, MET, D-ALA- D-LEU, D-ILE, D-LYS, D-THR, allo-THR, D-SER, D-PHE, D-MET, og SAR, Z er ILE, VAL eller SAR, B er TYR-R', D-TYR-R', dekarboksy-TYR, eller m er 3 eller 4, n er 1, 2 eller 3, R'" er hydrogen, C,-C_-alkyl, C -C, -aryl eller i-l b LJ. C-^-C^-alkanoyl, R og R' er terminale grupper på nevnte peptid som ikke i vesentlig grad påvirker peptidets biologiske egenskaper, hvor R er hydrogen, C -C -alkyl, C -C. „-aryl, Cg-C20-alkaryl, Cg-C^-aralkyl, C^- C^- alkanoyl, C^ C^ alkenyl, C2-C7~alkynyl, GLN, GLU, GLY, GLU-GLN, GLY-GLN, GLY-GLU, GLY-GLU- GLN;R' er OH, NH2, NHR", N(R")2# OR", VAL, GLN, LEU, TYR, VAL-GLN, VÅL-LEU, VAL-TYR, GLN-LEU, GLN-TYR, GLN-VAL, LEU-TYR, LEU-LEU, TYR-LEU, VAL-GLN.LEY-TYR, VAL-GLN- LEU-TYR-LEU, hvor R" er C^C-j-alkyl, C2-C.-,-alke-

nyl, C2-C7-alkynyl, Cg-C^-aryl, Cg-C^-aralkyl eller Cg-C20-alkaryl, forutsatt at ;R-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-R' er utelukket. j

Man har overraskende funnet at de fremstilte peptider er 10 000 ganger mer virksomme en tymopoietin-pentapeptidet. Ettersom det fremdeles ikke er mulig innen poly-peptidteknikken å forutsi effekten av substitusjoner i de aktive områder i et polypéptid, er det på ingen måte inn-lysende at forbindelsene med formel I skulle ha noen aktivitet i det hele, langt mindre den meget sterke virkning man har funnet. Denne forutsigbare natur vises bl.a. av ;-"' det f2 aktum at pentapeptide' t H-ARG-SAR-ASP-SAR-TYR-NH0■

.(SAR , SAR -TP5-amid) ble funnet å være aktiv ved en dose på 0,1 pg/ml i den prøven som er beskrevet i neden- f

stående eksempel II.

Generelt angår foreliggende oppfinnelse peptider med følgende formel: hvor A, X, Z, Y og B er som definert ovenfor, og R og R' er substituenter som ikke i vesentlig grad påvirker peptidenes biologiske aktivitet. Med det sistnevnte forstås at de terminale aminosyrer på dette pentapeptid kan modi-fiseres uten at man derved forlater oppfinnelsens inten-

sjon ved at man plasserer funksjonelle grupper eller derivater (R og R') på disse terminale aminosyrer som ikke i vesentlig grad påvirker molekylets biologiske aktivitet.

Det er således underforstått at den avsluttende amino- og avsluttende karboksylsyregruppe ikke er vesentlig for pentapeptidets biologiske aktivitet, noe som er tilfelle med visse andre polypeptider. Således innbefatter oppfinnelsen både usubstituerte pentapeptider (dvs. de hvor R

og R" = H og R' = OH) såvel som de som er terminalt substituert med én eller flere funksjonelle grupper som ikke i vesentlig grad påvirker den biologiske aktivitet som er beskrevet her.

Det fremgår av det ovenstående at disse funksjonelle grupper innbefatter en normal substitusjon såsom en acylering av den frie aminogruppen og en amidering av den frie karboksylsyregruppen såvel som substitusjon av ytterligere aminosyrer og peptider. Pentapeptidene med formel I er meget uvanlige ettersom de har samme biologiske aktivitet som det langkjedede naturlige peptid tymopoietin, hvor en del ligner foreliggende pentapeptider. Man antar der-

for at molekylets aktivitetskrav er utviklet av molekylets stereokjemi, dvs. den spesielle "bretting" man har på molekylet. Det er derfor underforstått at polypeptidbind-ingene ikke er stive og faste, men bøyelige, hvorved polypeptidene kan eksistere i flak, spiraler og lignende. Som et resultat av dette kan hele molekylet være bøyelig og kan "brettes" på en hvilken som helst måte. I foreliggende oppfinnelse har man nå oppdaget at pentapeptidet "bretter seg"

på samme måte som det langkjedede naturlige polypeptid og har derfor de samme biologiske egenskaper. Av denne grunn kan pentapeptidet substitueres med forskjellige funksjonelle grupper så lenge som disse substituenter ikke i vesentlig grad påvirker den biologiske aktivitet eller inn-virker på den naturlige "bøyingen eller brettingen" av molekylet.

At selve pentapeptidet har evne til å beholde sin biologiske aktivitet og naturlig bretting eller bøying,

er vist ved det faktum at det har samme aktivitet som beskrevet for nevnte tymopoietin-pentapeptid i ovennevnte patent, såvel som selve tymopoietinet.

Foretrukne forbindelser med formel I er de hvor m er 3 og n er 1 eller 2, mer foretrukket er de hvor m er 3 og n er 1. Foretrukne nye peptider har følgende formel:

hvor A er deamino-ARG eller R-ARG, X er valgt fra gruppen bestående av ALA, 2-Me-ALA, GLY, LEU, ILE, THR, SER, D-ALA, D-LEU, D-ILE, D-THR, allo-THR. D-SER, D-LYS og SAR, Z er ASP eller GLU, Y er VAL eller SAR, og B er dekarboksy-TYR, TYR-R<1> eller

og R og R' er som

definert ovenfor. Foretrukne forbindelser innen denne gruppen er de hvor Z er ASP.

Mer spesielt og foretrukket fremstilles nye peptider med følgende formel:

hvor Y er VAL eller SAR, :A er deamino-ARG eller H-ARG, B er dekarboksy-TYR, TYR-R' eller

og R'

er H, OH eller NH2- Mer foretrukne peptider er de med formel III hvor Y er SAR. De mest foretrukne peptider er de med formel III hvor Y er SAR, B er TYR-R' og R' er NH2-Forbindelsene med formel I innbefatter som nevnt også farmasøytisk akseptable salter av peptidene. Ettersom syrer er istand til å danne salter med peptidene, kan man som eksempel nevne uorganiske syrer slik som saltsyre, hydrobromsyre, perklorsyre, salpetersyre, tiocyansyre, svovelsyre, fosforsyre etc, samt uorganiske syrer slik som maursyre, eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, melkesyre, pyrodruesyre, oksalsyre, eplesyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, antranilinsyre, kanelsyre, naftalensulfonsyre og sulfanilinsyre.

Av hensiktsmessige grunner er aminosyrekompo-nentene i ovennevnte peptider identifisert ved hjelp av følgende forkortelser:

Begrepene deamino-ARG og dekarboksy-TYR slik de brukes her refererer seg henholdsvis til en L-arginingrup-pe som har sin a-aminogruppe erstattet med hydrogen og en L-tyrosingruppe som har sin kar-boksygruppe erstattet med hydrogen

Definisjonene som er gitt for A, B og Z ovenfor innbefatter både D- og L-formene, skjont L-formen er foretrukket. Således vil ARG-, TYR- og ASP-analogene i konfigurasjon til-svare aminosyreresidua (D eller L, men fortrinnsvis L), hvor disse analoger er optisk aktive. Dette vil også være tilfelle for alle bortsett fra deamino-ARG og dekarboksy-TYR og deres analoger, som ikke er optisk aktive.

Peptidene med formel I fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse ved at man a) binder L-tyrosin, beskyttet på sin a-aminogruppe og hydroksylgruppe, til en polymer harpiks ved hjelp av en kovalent binding, og hvor nevnte polymer inneholder en funksjonell gruppe til hvilken L-tyrosin kan bindes sterkt ved hjelp av nevnte kovalente binding; b) fjerner den a-aminobeskyttende' gruppe fra L-tyrosin-gruppen; c) omsetter L-tyrosinharpiksen med en Y-aminosyre beskyttet på sin a-aminogruppe og eventuelle andre reaktive grupper, men ikke på a-karboksylgruppen; d) fjerner den a-aminobeskyttende gruppe fra Y-aminosyre-gruppen; e) omsetter Y-L-tyrosinharpiksen med en Z-aminosyre beskyttet på sin a-aminogruppe pg eventuelle andre reaktive grupper, men ikke på a-karboksylgrupper; f) fjerner den a-aminobeskyttende gruppe fra Z-aminosyre-gruppen; g) omsetter Z-Y-L-tyrosinharpiksen med en X-aminosyre beskyttet på sin a-aminogruppe og eventuelt andre reaktive grupper, men ikke på a-karboksylgruppen; h) fjerner den a-aminobeskyttende gruppe fra X-aminosyre-gruppen; i) omsetter X-Z-Y-L-tyrosinharpiksen med en A-aminosyregruppe beskyttet på sin a-aminogruppe og sin guanidinogruppe, men ikke på sin a-karboksylgruppe; og j) fjerner harpiksen og alle beskyttende grupper fra peptidet ved hjelp av passende reagenser;

og, om ønsket, fremstiller farmasøytisk akseptable salter av produktene eller andre derivater hvor R og R"<1> er forskjellig fra H, og R' er forskjellig fra OH, og, om ønsket; bruker egnet beskyttet D-tyrosin isteden for L-tyrosin i trinn a) eller fremstiller tilsvarende C-terminal amidpeptider som beskrevet ovenfor, men bruker en benzhydrylaminharpiks i trinn a) isteden for nevnte klormetylharpiks, og kopler nevnte C-terminale aminosyre til harpiksen ved hjelp av et egnet koplingsmiddel slik som dicykloheksylkarbodiimid; og, om ønsket, fremstiller de tilsvarende peptider hvor B er dekarboksy-TYR eller ved å åndende en merkaptofenolharpiks til hvilken det er festet en egnet beskyttet Y-aminosyre via sin karboksylgruppe som i trinn a), utelater trinn b) og c), gjennomfører trinnene d) til og med i), oksyderer harpiksens svovelbindingsgruppe med m-klorperbenzosyre, hvorved man får en aktiv esterharpiks, behandler denne med en ekvivalent mengde av et egnet beskyttet aminosyrederivat for å kople dette derivat til Y-aminosyreresten ved en samtidig avspaltning av peptidet fra harpiksen, hvoretter man til slutt fjerner alle beskyttende grupper fra det resulterende blokkerte pentapeptid som i trinn j).

Peptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse har vist seg å ha egenskaper som tilsvarer det man finner i det 4 9-aminosyrepolypeptid som er isolert fra storfetymus (tymopoietin), som er beskrevet i de ovennevnte refererte US-patenter. Peptider med formel I er spesielt karakterisert ved sin evne til å indusere den selektive differensieringen av Thy-l<+->T-celler (men ikke CR<+->B-celler) i konsentrasjoner på 0,1 pg/ml - 10 ng/ml. Thy-l er et differensierings-alloantigen som er tilstede

på T-celler, men ikke på B-celler, mens CR er en komplementreseptor som er tilstede på B-celler, men ikke på T-celler.

Undersøkelser av disse syntetiske peptider i induksjonsrpøver in vitro har vist at de har samme induk-sjonsspesifitet som tymopoietin II. Dette betyr at de induserer differensieringen av Thy-l -celler til Thy-1<+->T-celler, men induserer ikke differensieringen av CR - celler til CR+-B-celler. Skjønt man har kunnet identifi-sere mange stoffer som kan etterligne tymopoietin in vitro og indusere T-celledifferensiering ved å heve den intrecellulære cykliske AMP, så skal det understrekes at bare få stoffer er aktive ved så lave konsentrasjoner, og at peptider med formel I er selektive ved at de induserer T-celledifferensiering, men ikke CR<+->B-celledifferensiering . • ■

På grunn av disse egenskaper kan de fremstilte peptider brukes terapeutisk ved behandling av mennesker og dyr, ettersom de har en evne til å indusere differensieringen av lymfopoietiske stamceller som oppstår i det hæmo-poietiske vev til tymus-avledede celler eller T-celler som er istand til å inngå i kroppens immunreaksjon. På grunn av dette antar man at peptidene med formel I har en terapeutisk anvendelse på flere områder. Ettersom forbindelsene har en evne til å utføre:visse av de angitte funksjoner for tymuskjertlen, så vil de primært ha anvendelse med hensyn til forskjellige tymuskjertelfunksjoner og immunitetsreak-sjoner. En primær anvendelse er ved behandlingen av Di-George-syndromet, dvs. en tilstand hvor man har et fra-vær av tymuskjertelen. Injeksjon av foreliggende peptider vil kunne gjøre at man unngår de ulemper som denne tilstand medfører. På grunn av sine biologiske egenskaper, dvs. at de er ekstremt aktive ved lave konsentrasjoner, så kan de også brukes for å hjelpe kroppens totale immunsystem, dvs. at peptidene vil søke å hjelpe den terapeutiske stimulering man har i den cellulære immunitet, og derved kunne brukes ved behandling av sykdommer som innbefatter kronisk infek-sjon in vivo, såsom sopp- og mycoplasmainfeksjoner, tuber-kulose, spedalskhet, akutte og kroniske virusinfeksjoner o.l. Videre kan forbindelsene brukes på ethvert felt hvor cellulær immunitet er viktig, og spesielt på slike felter eller for slike lidelser hvor det er en mangel på immunitet, f.eks. i nevnte DiGeorge-syndrom. I slike tilfeller hvor det er et overskudd av antistoffproduksjon på grunn av en ubalansert T-celle og B-cellepopulasjon, så kan forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen korrigere denne tilstand ved å stimulere T-celleproduksjonen. Således kan forbindelsene brukes terapeutisk i visse autoimmunologiske lidelser som skader de tilstedeværende antistoffer, såsom sys-temisk lupus erythematose. Videre, på grunn av peptidenes egenskaper har de en in vitro-anvendbarhet ved at de induserer utvikling av overflateantigener på T-cellene, hvorved man får indusert en utvikling av disse cellenes funksjonelle kapasitet til å oppnå en reaksjon overfor mito-gener og antigener foruten at man øker B-cellenes evne til å fremstille antistoffer. Videre kan peptidene brukes for å hemme en ukontrollert formering av tymopoietin-reaktive lymfocytter.

En viktig egenskap ved de fremstilte peptider er deres in vivo-evne til å reetablere celler som har samme egenskaper som T-cellene. Således har peptider med formel I en aktivitet på mange områder på grunn av sin evne til å bedre kroppens immunreaksjonssystem. Ettersom peptider fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse påvirker den neuromuskulære transmisjon, så vil høye doser av peptidene kunne brukes i forbindelse med lidelser hvor man har et overskudd av neuromuskulær transmisjon, såsom kramper etc.

En viktig egenskap ved peptider med formel I er at de er meget aktive i lave konsentrasjoner, dvs. fra 0,lpg/ml. Fortynningsmidlet eller bærestoffet som brukes kan være et av de mer velkjente for dette formål, f.eks. normale saltoppløsninger, fortrinnsvis med et proteinfor-tynningsmiddel såsom serumalbumin fra storfe (BSA) for å hindre adsorberende tap til glassveggen ved disse lave konsentrasjoner. Peptidene med formel I er aktive parenteralt ved doser på ca. 1 ng/kg kroppsvekt. For behandling av DiGeorge-syndromet kan polypeptidene tilføres i mengder fra 0,1 til 10 ng/kg kroppsvekt. Generelt kan det samme doseområdet brukes ved behandling av de andre tilstander eller lidelser som er beskrevet ovenfor.

For å fremstille farmasøytiske preparater kan polypeptidet med formel I eller et syreaddisjonssalt av dette, kombineres som den aktive ingrediens i blanding med et farmasøytisk akseptabelt bærestoff ved hjelp av vanlig kjent farmasøytisk teknikk, og bærestoffet kan ha en rekke forskjellige former avhengig av den måte man ønsker å til-føre preparatet på. Således kan preparatet være sublin-gualt, rektalt, nasalt, oralt eller parenteralt. Ved fremstilling av preparater i oral doseform så kan man bruke ethvert kjent farmasøytisk medium, såsom vann, glyk-oler, oljer, alkoholer, smaksstoffer, konserveringsstoffer, fargemidler o.l., og for orale flytende preparater kan man f.eks. anvende suspensjoner, eleksirer og oppløsninger, eller bærestoffer såsom stivelser, sukkere, fortynnings-midler, granuleringsmidler, smøremidler, bindemidler, ned-brytningsmidler o.l. i forbindelse med faste preparater, som videre kan være i form av pulvere, kapsler og tabletter. På grunn av at de lett lar seg tilføre, vil tabletter og kapsler være den mest fordelaktige doseringsform, og i slike tilfeller kan man bruke faste farmasøytiske bærestoffer. Hvis det er ønskelig, kan tablettene sukkerbelegges eller enterisk belegges på vanlig kjent måte. For parenteral anvendelse vil bærestoffet vanligvis innbefatte sterilt vann, skjønt man også kan tilsette andre ingredienser for å lette oppløseligheten eller for konserverende formål. Injiserbare suspensjoner kan også fremstilles, og man kan da bruke flytende bærestoffer, suspenderingsmidler o.l. Parenterale farmasøytiske preparater bør utformes slik at de tilfører polypeptider i mengder på 0,1-100 ng/kg kroppsvekt. De orale sammensetninger bør tilføre 100-1000 ganger doser for parenteral tilførsel, dvs. fra 10 ng/kg til 100 yg/kg kroppsvekt. Følgelig bør de parenterale sammensetninger pr. doseringsenhet inneholde fra 5 ng til 5 ug, mens de orale preparater bør pr. doseringsenhet inneholde fra 500 ng til 5 mg av polypeptidet.

Polypeptider med formel I kan fremstilles ved å bruke den fremgangsmåte som er beskrevet av Merrifield i Journal of American Chemical Society, 85, side 2149-2154, 1963. Syntesen innbefatter en trinnvis addisjon av beskyttede aminosyrer til en voksende peptidkjede som ved hjelp av kovalente bindinger bindes til en fast harpikspartikkel. Ved hjelp av denne fremgangsmåte vil reagenser og biprodukter kunne fjernes ved filtrering, og en omkrystallisering av mellomproduktene blir eliminert. Selve fremgangsmåten er avhengig av at man fester den C-terminale aminosyre av kjeden på en fast polymer ved hjelp av en kovalent binding, som så adderer de etterfølgende aminosyrer én for én på en trinnvis måte inntil man har den forønskede sekvens. Til slutt fjernes peptidet fra det faste underlag og de beskyttende grupper fjernes. Denne fremgangsmåte gir en voksende peptidkjede festet til en fullstendig uoppløselig fast partikkel hvorved denne er i en hensiktsmessig form slik at den kan filtreres og vaskes fri for reagenser og biprodukter.

Aminosyrene kan festes til enhver egnet polymer som lett må kunne skilles fra uomsatte reagenser. Polymeren kan være uoppløselig i de opplosningsmidler som brukes, eller kan være opploselig i visse opplosningsmidler og uopploselig i andre. Polymeren bor ha en stabil fysisk form som gjor det lett at den kan filtreres. Den må inneholde en funksjonell gruppe som den forste beskyttede aminosyren kan festes til ved hjelp av en kovalent binding. Forskjellige uoppløselige polymerer som er egnet for dette formål er f.eks. cellulose, polyvinylalkohol, polymetakrylat og sulfonert polystyren, men i foreliggende fremgangsmåte har man brukt en klormetylert sampolymer av styren og divinylbenzen. Polymerer som er oppløselige i organiske opplosningsmidler kan også brukes og som er uoppløselige i vandige opplosningsmidler. En slik polymer er polyetylenglykol med en molekylvekt på ca. 20.000 som er opploselig i metylenklorid, men uopploselig i vann. Bruken av denne polymer i peptidsynteser er beskrevet av F. Bayer og M. Mutter, Nature 237, 512 (1972), og de referanser som der er angitt.

De forskjellige funksjonelle grupper på aminosyren som er aktive, men som ikke skal inngå i reaksjonene, må beskyttes på vanlig kjent måte med beskyttende grupper av den type som brukes under slike polypeptidsynteser. Således må den funksjonelle gruppe på lysin beskyttes ved hjelp av beskyttende grupper som kan fjernes etter at sekvensen er bygget opp, uten at man derved skadelig påvirker selve sluttproduktet. I foreliggende syntese brukte man ninhydrin for å bestemme om koplingen var fullstendig. Hvis en fullstendig kopling ikke ble angitt, så ble koplingen gjentatt med samme beskyttede aminosyre for man fjernet den beskyttende gruppe. Den C-avsluttende eller terminale aminosyre kan festes til polymeren på en rekke forskjellige måter. En oversikt over fremgangsmåter for tilfestning til halogenmetylmetylharpikser er angitt av Horiki et a., Chem. Letters, side 165 - 168 (1978) og Gisin, Heiv. Chim. Acta, 56, 1476 (1973) og referanser som er angitt der. Hvis man skal fremstille et C-avsluttende eller terminalt amid, kan man bruke én av to fremgangsmåter. Enten kan peptidharpiksen fremstilles ved hjelp av Merrifield-teknikken, og så kan peptidet spaltes av fra harpiksen ved hjelp av vannfri ammoniakk, eller man kan bruke en benzhydrylaminharpiks. Avspalting fra sistnevnte harpiks med hydrogenfluorid gir et C-terminalt amidpeptid. Bruken av benzhydrylaminharpiks er f.eks. vist av J. Rivier et al., J. Med. Chem., 16, s. 545 - 549 (1973).

i

Den generelle fremgangsmåten for å fremstille C-terminale karboksylpeptider innbefatter forst at man forestrer L-tyrosin, som er beskyttet på sine amino- og hydroksylgrupper, til klormetylharpiksen ved hjelp av CsHCO^-metoden til Gisin. Den beskyttende gruppen på a-aminogruppen på tyrosin-aminosyren (f.eks. t-BOC, dvs. 5-butyloksykarbonyl) ble så fjernet uten at man påvirket de andre beskyttende grupper. Den koplede aminosyreharpiksen blir så filtrert, vasket og nøytralisert. Den resulterende koplede aminosyreharpiksen med en fri aminogruppe, ble så om-satt med beskyttet L-valin, fortrinnsvis oc-t-BOC-L-valin for å kople L-valinet til aminosyreharpiksen. Reaksjonene ble så gjentatt med beskyttet L-aspartinsyre, sarcosin og L-arginin til man hadde fremstilt det fullstendige mole-kyl. Denne fremgangsmåten ble brukt ved dannelsen av den basiske fem-aminosyre-aktive sekvens. Addisjon av andre noytrale aminosyreresidua på hver ende av kjeden ble ut-fo'rt ved å bruke samme reaksjonssekvens som er kjent fra tidligere synteser. Reaksjonssekvensen for å fremstille den aktive sekvens av nevnte fem aminosyrer kan utfores på folgende måte:

I den ovennevnte reaksjonssekvens vil R-^, R2°g R^ være beskyttende grupper på forskjellige reaktive grupper på aminosyre-sidekjedene og disse vil ikke påvirkes eller fjernes når den a-aminobeskyttende gruppe fjernes for å muliggjbre ytterligere reaksjon. I ovennevnte intermedi-ære pentapeptidharpikskjeder vil fortrinnsvis uttrykket R-L dekke tosyl (Tos), R2 står for benzyl (Bzl) mens R,

står for brombenzyloksykarbonyl. Som harpiksen kan man bruke enhver av de harpikser som er nevnt ovenfor for å fremstille et C-avsluttende karboksylpeptid.

Peptidharpiksen kan spaltes for å frigjore peptidet fra harpiksen, og beskyttende grupper R-j_, R2 og R-^

og t-AOC kan samtidig fjernes hvorved man får sluttproduktet. De beskyttende grupper og harpiksen spaltes på vanlig kjent måte, f.eks. ved en behandling med vannfri hydrogenfluorid hvoretter peptidet innvinnes.

Som nevnt ovenfor så er det nbdvendig for å gjen-nomføre fremgangsmåten å beskytte eller blokkere aminogruppene for derved å kunne kontrollere reaksjonen og oppnå det forønskede produkt. Egnede amino-beskyttende grupper som kan brukes innbefatter saltdannelse for å beskyt-

te sterkt basiske aminogrupper, eller uretan-beskyttende substituenter såsom benzyloksykarbonyl og t-butyloksykarbonyl. Det er foretrukket å bruke t-butyloksykarbonyl (t-BOC) eller t-amyloksykarbonyl (t-AOC) for å beskytte a-aminogruppen i aminosyrer som undergår reaksjon på karboksyl-enden av molekylet, ettersom BOG-og AOC-beskyttende grupper lett lar seg fjerne etter en slik reaksjon og for det etter-følgende trinn (hvor en slik aminogruppe i seg selv undergår en reaksjon), ved en relativt svak virkning av syrer (f.eks. trifluoreddiksyre). Denne behandlingen påvirker ellers ingen av de beskyttende grupper på sidekjedene. Det er således underforstått at a-aminogruppen kan beskyttes ved en reaksjon med enhver kjent forbindelse som vil beskytte a-aminogruppen i de etterfølgende reaksjoner, men som lett kan fjernes under betingelser som ellers ikke vil påvirke molekylet. Eksempler på slike forbindelser er organiske karboksylsyrederivater eller karbonsyrederivater som vil acylere aminogruppen.

Vanligvis kan aminogruppene beskyttes ved en reaksjon med en forbindelse som inneholder en gruppe med folgende formel:

hvor R< er enhver gruppe som vil beskytte aminogruppen fra å inngå i de etterfølgende koplingsreaksjoner og som så kan fjernes uten å destruktere eller odelegge molekylet. Således kan R^ være en rett eller grenet alkylgruppe som kan være umettet, fortrinnsvis med fra 1-10 karbonatomer og fortrinnsvis halogen- eller cyano-substituert, aryl, fortrinnsvis med fra 6-15 karbonatomer, cykloalkyl, fortrinnsvis med fra 5 -: 8 karbonatomer, aralkyl, fortrinnsvis med fra 7-18 karbonatomer, alkaryl, fortrinnsvis med fra 7-18 karbonatomer, eller heterocykliske forbindelser, f. eks. isonikotinyl. Aryl-, aralkyl-og alkarylgruppene kan videre være substituert med én eller flere alkylgrupper med fra 1-4 karbonatomer. Foretrukne grupper for R^ innbefatter t-butyl, t-amyl, tolyl, xylyl og benzyl. Meget foretrukne spesifikke,aminobeskyttende grupper innbefatter benzyloksykarbonyl, substituert benzyloksykarbonyl hvor fenylringen er substituert med étt eller flere halogenatom-er, f.eks. klor eller brom, nitro, lavere alkoksy, f.eks. metoksy, eller lavere alkyl, t-butyloksykarbonyl, t-amyloksykarbonyl, cykloheksyloksykarbonyl, vinyloksykarbonyl, adamantyloksykarbonyl, bisfenylisopropoksykarbonyl o.l. Andre beskyttende grupper som kan brukes innbefatter iso-nikotinyloksykarbonyl,' ftaloyl, p-tolylsulfonyl, formyl o.l.

Ved gjennomføring av den generelle fremgangsmåte ifolge foreliggende oppfinnelse blir peptidet bygget opp ved at man reagerer den frie a-aminogruppen med en forbindelse som inneholder en blokkert a-aminogruppe. For reaksjon eller kopling kan karboksylkomponenten i forbind-elsen som skal festes til molekylet være aktivert i sin karboksylgruppe slik at denne lett kan reagere med den frie a-aminogruppen på peptidkjeden. For å oppnå en akti-vering kan karboksylgruppen omdannes til en reaktiv gruppe såsom en ester, et anhydrid, azid, syreklorid eller lignende. Alternativt kan man bruke et egnet koplingsmiddel under reaksjonen. Egnede koplingsreagenser er f.eks. beskrevet av Bodanszky et al, Peptide Synthesis, Interscience, 2. utgave, 1976, kapittel 5, og innbefatter karbodiimider (f.eks. dicykloheksylkarbodiimid), karbonyldiimidazol o.l.

Det er videre underforstått at under disse reaksjoner så vil aminosyregrupper som inneholder både aminogrupper og karboksylgrupper vanligivs ha én av disse grupper beskyttet mens den andre reagerer. For koplingstrinnet må den beskyttende gruppe på a- eller den terminale aminogruppe på peptidet som er festet til harpiksen, fjernes under betingelser som ikke vil påvirke de andre beskyttende grupper, f.eks. gruppen på hydroksygruppen på tyro-sinmolekylet. Den foretrukne fremgangsmåte for gjennom-føring av dette er mild syrehydrolyse, f.eks. ved en reaksjon ved romtemperatur med trifluoreddiksyre.

Det fremgår av det ovennevnte at den serie pro-sesstrinn som er beskrevet til resultere i produksjon av et spesifikt pentapeptid med folgende formel:

De substituerte pentapeptider med formel I hvor de terminale ARG- og TYR-aminosyregrupper kan være ytterligere substituert som beskrevet ovenfor, kan så fremstilles ved en reaksjon mellom dette pentapeptid eller den beskyttede peptidharpiks med egnede reagenser for derved å få fremstilt de foronskede derivater. Reaksjoner av denne type såsom acylering, forestring, amidering o.l. er velkjente. Videre kan andre aminosyrer, dvs. aminosyregrupper som ikke påvirker det basiske pentapeptidets biologiske aktivitet, festes til peptidkjeden ved hjelp av samme reaksjonssekvens som ved hjelp av hvilken pentapeptidet ble syntetisert.

De tilsvarende C-terminale amidpeptider kan beskrives som ovenfor, men man anvender en benzhydrylaminharpiks istedenfor klormetylharpiksen, og kopler den C-'terminale aminosyre ved hjelp av et egnet koplingsmiddel til harpiksen, f.eks. kan man bruke dicykloheksylkarbodiimid.

De tilsvarende peptider med formel I hvor A er deamino-ARG kan fremstilles ved å substituere en ekvivalent mengde av et egnet beskyttet deamino-arginin istedenfor beskyttet L-arginin i ovennevnte syntesesekvens.

De tilsvarende peptider med formel I hvor B er

dekarboksy-TYR eller

kan fremstilles ved å bruke den fremgangsmåte som er beskrevet av T.W. Kirby og P.K. Warme, Analytical Biochemistry, 85, 367 (1978). I denne fremgangsmåten bruker man en merkaptofenolharpiks til hvilken man har festet den nest siste egnede beskyttede aminosyre via dens karboksylgruppe (f.eks. a-BOC-L-Val-OH i syntese av forbindelse IV). Den gjenværende del av det blokkerte peptid blir så syntetisert som beskrevet ovenfor, hvoretter den bindende svovelgruppen på harpiksen blir oksydert med m-klorperbenzosyre, hvorved man får en aktiv esterharpiks. Behandling av denne aktive esterhar-piksen med en ekvivalent mengde av et egnet beskyttet aminosyrederivat

kopler dette derivat til det nest siste amino-

syreresiduet ved at man samtidig fjerner peptidet fra harpiksen. Til slutt blir det resulterende blokkerte pentapeptid behandlet, f.eks. med vannfritt hydrogenfluorid, for derved å få fjernet alle beskyttende grupper.

Skjønt polypeptider med formel I ble syntetisert ved. å bruke Merrifield's fastfasesyntesteteknikk slik denne er beskrevet ovenfor, så er det klart at man også kan bruke en klassisk synteseteknikk i opplbsning hvis dette er bnskelig. Se f.eks. M. Bodanszky og M.A. Ondetti i Peptide Synthesis, Interscience, 1966.

De fblgende eksempler illustrerer oppfinnelsen, og alle deler er pr. vekt hvis intet annet er angitt.

Eksempel I

Ved fremstillingen av et peptid med formel I ble de følgende forbindelser kjopt kommersielt. Alfa-AOC-N-Tos-L-arginin, Alfa-BOC-sarcosin, Alfa-BOC-0-benzyl-L-aspartinsyre, Alfa-BOC-L-valin, Alfa-BOC-0-brombenzyloksykarbonyl-L-tyrosin.

I ovennevnte former er BOC t-butoksykarbonyl, AOC er t-amyloksykarbonyl .og Tos er tosyl. "Sequenal" kvalitetsreagenser for aminosyresekvensbestemmelse, dicykloheksylkarbodiimid, ninhydrin og harpiksen ble også

kjbpt kommersielt. Den brukte harpiksen var en poly-styrendivinylbenzenharpiks, 200 - 400 mesh stbrrelse inne-holdende 1% divinylbenzen og 0,75 mM klorid pr. gram harpiks .

Ved fremstillingen av pentapeptidet ble oc-BOC-O-brombenzyloksykarbonyl-L-tyrosin forestret til den klor-metylerte harpiksen ved hjelp av CsHCO-j-metoden som det er referert til i ovennevnte Gisin-artikkel. Den resulterende beskyttede aminosyreharpiksen inneholdt 0,4 - 0,5 mmol aminosyre pr. gram harpiks. Idet man brukte et Schwarz/ Mann automatisk peptidsynteseapparat, ble det fblgende pro-gram brukt for å kople hver BOC-beskyttet aminosyre til den nevnte BOC-aminosyreharpiksen: 1. Forvasking med 40% TFA i CH2C12, én gang, 1,5 minutter, 2. Fjerning av beskyttelse med 40% TFA i CH2C1^, én gang, 20 minutter, 3. Vasking med. CHCl^, én gang, 1,5 minutter, 4. Vasking med EtOH, én gang, 1,5 minutter, 5. Vasking med CH2C12, to ganger, 1,5 minutter, 6. Forvasking med 10% Et-,N i CH2C12, én gang, 1,5 minutter, 7. Nøytralisering med 10% Et^N i CH2C12, én gang, 10 minutter, 8. Vasking med CH2C12, tre ganger, 1,5 minutter, 9. Addisjon av BOC-beskyttet aminosyre (5-molart overskudd( i DMF og CH?C1? (et 1:9 volum/volum-forhold), 10. Tilsetning av DCC i CH2C12 (0,5-molar og et 5-molart overskudd), reaksjonstiden var opp til 2 timer, 11. Vasking med CH2C12, to ganger, 1,5 minutter.

Deretter ble oc-BOC-eller a-AOC-aminosyrene på lignende måte koplet til den ikke-beskyttede a-aminogruppen på peptidharpiksen i den korrekte rekkefolge, hvorved man fikk et peptid ifolge foreliggende oppfinnelse ved å bruke ekvivalente mengder av dicykloheksylkarbodiimid. Etter hver koplingsreaksjon ble en prove av harpiksen pro-vet med ninhydrin, og hvis man fant et positivt resultat, var koplingen å anse for ufullstendig og ble gjentatt med samme beskyttede aminosyre. Som et resultat av flere kop-lingsreaks joner fikk man den folgende pentapeptidharpiks:

hvor AOC er amyloksykarbonyl, Tos er tosyl, Bzl er benzyl og BrZ er brombenzyloksykarbonyl.

Denne peptidharpiks ble spaltet og de beskyttende grupper fjernet i et Kel-F avspaltningsapparat (Peninsu-la Laboratories, Inc.), idet man brukte 10 ml vannfri hydrogenfluorid pr. gram harpiks ved 0°C i 1 time og med 5 ml anisol pr. gram peptidharpiks som rensemiddel. Etter for-dampning i vakuum til torrhet ble residuet vasket med vannfri eter. Det urene peptid ble opplost i 10% vandig eddiksyre og filtrert. Harpiksen ble vasket med 10% vandig eddiksyre,.og de samlede filtrater ble oppsamlet og lyo-filisert til et urent peptid. Dette urene peptid ble renset ved motstromsfordeling idet man brukte n-butanol: eddiksyre:vann (4:1:5) som den skillende fase, hvorved man fikk et rent peptid. Det resulterende polypeptid hadde fblgende sekvens:

For identifikasjon ble det brukt tynnsjiktskromatografi og elektroforese. Aminesyresammensetningen ble bestemt ved å bruke et aminosyre-analyseapparat.

Tynnsjiktskromatografi ble utfort på 20 ^ug prover på silisiumdioksydgel (Kieselgel, 5 x 20 cm) idet man brukte 1:1:1:1 n-butanol:eddiksyre:etylacetat:vann som opplbsningsmiddelsystem (Rf"'") og på cellulose 6064 (Eastman 20 x 20 cm) idet man brukte 15:10:3:12 n-butanol: pyridin:eddiksyre:vann som opplbsningsmiddelsystem (Rf ). R^-verdiene i forhold til H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH var Rf 1 = 1,84 og Rf 2 =1,11. Ninhydrin ble brukt som påvis-ningsreagens.

Elektroforesen ble utfort på en 100 ^ug prove av Whitman nr. 3 papir (5,7 x 55 cm) idet man brukte en pH 5,6 pyridin-acetatbuffer ved en spenning på 1000 V

i 1 time. Pentapeptidet hadde en mobilitet på 0,29 mot katoden i forhold til H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH. Ninhydrin og Pauli påvisningsreagenser ble brukt.

Eksempel II

For å bestemme aktiviteten og egenskapene på polypeptidet fra eksempel I, ble det utfort bestemmelser på friske 5-6 uker gamle nu/nu mus av begge kjbnn, og musene var avlet på en BALB/c-bakgrunn (tymocytter som ut-trykte Thy-l,2-overflateantigen) og ellers holdt under vanlige betingelser. For antisera ble anti-Thy-l,2-sera fremstilt i Thy-l-kongenisk mus.

For induksjonen in vitro av Thy-l<+->T-celler eller

CR<+->B-celledifferensiering, ble induksjon av tymocyttdiffer-ensiering fra protymocytter in vitro utfort som beskrevet av Komuro og Boyse (Lancet, 1, 740, 1973)» idet man brukte erhvervelsen av Thy-l,2 som en markor på T-celledifferen-sieringen. Induksjonen av CR<+->B-cellediffererensiering fra CR~-B-celleforlopere in vitro ble utfort under lignende betingelser idet man brukte som kriterium CR<+->B-cellenes evne til å binde saueerytrocytter belagt med sub-agglutinerende mengder av kaninantistoff og non-lytisk komplement. Miltcellepopulasjoner fra friske nu/nu-mus fraksjonert på diskontinuerlig storfeserum-albumingradi-enter ble brukt som en kilde for begge for]opertyper (Thy-l" og CR"), fordi de har få eller ingen Thy-l<+->celler og lavt antall CR<+->celler.

Som et resultat av denne bestemmelsen fant man at polypeptidet hadde en selektivitet når det gjelder virkning som tilsvarer den man finner for tymopoietin II ved induksjon av differensiering av T-lymfocytter, men ikke for komplementreseptorer (CR<+>) B-lymfocytter. Pentapeptidet induserte differensiering av Thy-l<+->T-celler i konsentrasjoner som varierte fra 1 pg - 10 ng/ml. Det induserte ikke differensiering av CR<+->B-celler ved samme konsentrasjoner.

Eksempel III

Ved å bruke samme fremgangsmåte som i eksempel I, men istedenfor sarcosin brukte man en ekvivalent mengde av et passende beskyttet D-alanin, så fikk man fremstilt folgende pentapeptid, H-ARG-D-ALA-ASP-VAL-TYR-OH. Dette pentapeptid hadde samme biologiske aktivitet som pentapeptidet hvis fremstilling er beskrevet i eksempel I.

Eksempel IV

Ved å bruke samme fremgangsmåte som i eksempel I og ekvivalente mengder av passende aminosyrer (egnet beskyttet) fikk man fremstilt de folgende pentapeptider (benzhydrylaminharpiks ble brukt for å fremstille "B"):

Disse pentapeptider har samme biologiske aktivitet som pentapeptidet fra eksempel I.

Sekvensene i disse peptider ble bestemt ved hjelp av et analyseapparat for aminosyrer. Tynnsjiktskromatografi og elektroforese av B og C under de samme betingelser som i eksempel I, ga fblgende informasjon

Eksempel V

De beskyttede pentapeptidharpikser fremstilt som beskrevet i eksemplene I og II ble alle amidert (spaltet) ved en reaksjon med vannfri ammoniakk ved hjelp av kjente fremgangsmåter, fulgt av en fjerning av beskyttende grupper og rensing, hvorved man fikk fremstilt fblgende pentapeptidamider:

Eksempel VI

Peptidene fremstilt som beskrevet i eksemplene I, III og IVA ble forestret for derved å fremstille etyl-alkoholderivatene. Ved fremstillingen av denne ester et det nbdvendig å blokkerene syregruppen på aspartinsyren med en svak syresensitiv blokkerende gruppe under fremstillingen, og den foretrukne blokkerende gruppe er t-butyl. Den a-aminoblokkerende gruppe er sensitiv overfor svake baser og er fortrinnsvis fluorenylmetoksykarbonyl. Ved å bruke en slik a-aminoblokkerende gruppe så kan denne fjernes for addering av hvert enkelt aminosyreresiduum uten å forstyr-re den syrefblsomme beskyttende gruppe på aspartinsyreresiduet. Etter fremstillingen av den beskyttede penta-peptidharpiksen fulgt av en behandling med en mild base og en mild syre, så vil man få fjernet disse to beskyttende grupper. Transforestring med etylformat idet man bruker sulfurylklorid som katalysator vil spalte pentapeptidet fra harpiksen og selektivt danne den C-avsluttende ester. Forestringen vil ikke skje ved den frie syregruppen på aspartinsyreresiduet. De gjenværende beskyttende grupper ble så fjernet og man innvant et peptid med folgende formel:

Eksempel VII

Man brukte fremgangsmåten fra eksempel VI, men spaltet peptidet fra harpiksen ved å bruke metylamin istedenfor etylformat og sulfurylklorid, og man fikk dan-net folgende derivater som ble innvunnet:

Eksempel VIII

Man brukte fremgangsmåtene fra eksemplene I, III og IVB, men erstattet den beskyttede L-arigin med den ekvivalent mengde av beskyttet N-metylarginin, og fikk derved fremstilt de folgende substituerte derivater:

Eksempel IX

Man brukte fremgangsmåten fra eksemplene I, III og IVB, men erstattet det beskyttede L-arginin med en ekvivalent mengde av beskyttet N-fenyl-L-arginin, og fikk derved fremstilt de folgende fenylsubstituert polypeptider:

Eksempel X

Ved. å bruke fremgangsmåten fra eksempel VI, men ved å bruke ekvivalente mengder av passende beskyttede aminosyrer fikk man fremstilt de folgende peptider:

Eksempel XI

Ved å bruke fremgangsmåten fra eksemplene I, IVA og IVB, men ved å erstatte det beskyttede L-arginin med en ekvivalent mengde av egnet beskyttet deaminoarginin, fikk man folgende peptider:

Eksemplene XII - XXI

Ved å bruke den reaksjonsteknikk som er beskrevet ovenfor for en forlengelse av polypeptidkjeden, ble de folgende polypeptider fremstilt som inneholdt den aktive aminosyresekvensen, men som var substituert på den avsluttende amino- og karboksylsyregruppen med R og R', hvorved man fikk polypeptider med fblgende formel:

hvor Y er SAR eller VAL, og som er substituert med de aminosyrer som er angitt i den fblgende tabell:

De polypeptidderivater som er fremstilt i eksemplene V - XXI beholder sin biologiske aktivitet slik denne er beskrevet for det usubstituerte pentapeptid med formel I.

Eksempel XXII

Ved å bruke fremgangsmåten fra eksempel 1 og ekvivalente mengder av passende aminosyrer (egnet beskyttet) fikk man fremstilt folgende pentapeptider (benzhydrylaminharpiks ble brukt for å fremstille peptidamider):

Eksempel XXIII

Peptider med dekarboksy-TYR eller

som det C-terminale aminosyreresiduum ble fremstilt ved å folge fremgangsmåten til Kirby og Warme slik den er beskrevet ovenfor. Ved å bruke egnede mengder av passende aminosyrer og aminosyrederivater (alle egnet beskyttet) , fikk man fremstilt de folgende:

Peptider og derivater fremstilt i eksemplene XXII og XXIII har samme biologiske aktivitet som pentapeptidet fremstilt som beskrevet i eksempel I.

Claims (3)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av et peptid med biologisk evne til å indusere differensieringen av T-lymfocytter, men ikke komplementreseptor (CR<+>)-B-lymfocytter, hvor nevnte peptid har følgende sekvens: og farmasøytisk akseptable salter av dette peptid, hvor A er X er en egnet nøytralt alifatisk eller aromatisk aminosyre-rest valgt fra gruppen bestående av ALA, 2-Me-ALA-GLY, LEU, ILE, LYS, THR, SER, PHE, MET, D-ALA, D-LEU, D-ILE, D-LYS, D-THR, allo-THR, D-SER, D-PHE, D-MET, og SAR, Z er Y er GLY, SER, THR, LEU, ILE, VAL eller SAR, B ér TYR-R', D- TYR-R', dekarboksy-TYR, eller m er 3 eller 4, n er 1, 2 eller 3, R'" er hydrogen, C^-C^-alkyl, C,-C. -aryl eller C,-C_-alkanoyl, R og R' er terminale b L2. -L / grupper på nevnte peptid som ikke i vesentlig grad påvirker peptidets biologiske egenskaper, hvor R er hydrogen, C^-C^-alkyl, C6-C12-aryl, Cg-C^-alkaryl, C6-C2Q-aralkyl, C^C^-alkanoyl, C2-C7-alkenyl, C2~C7-alkynyl, GLN, GLU, GLY, GLU-GLN, GLY-GLN, GLY-GLU, GLY-GLU-GLN; R' er OH, NH2, NHR", N(R")2, OR", VAL, GLN, LEU, TYR, VAL-GLN, VAL-LEU, VAL-TYR, GLN-LEU, GLN-TYR, GLN-VAL, LEU-TYR, LEU-LEU, TYR-LEU, VAL-GLN-LEU, VAL-GLN-LEU-TYR, VAL-GLN-LEU-TYR-LEU, hvor R" er C^C..,-alkyl, C2-C7-alkenyl, C2~C7-alkynyl, Cg-C^-aryl, c6"c2o_ aralkyl eller Cg-C^-alkaryl- forutsatt at R-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-R' er utelukket, karakterisert ved at man a) binder L-tyrosin- beskyttet på sin a-aminogruppe og hydroksylgruppe, til en polymer harpiks ved hjelp av en kovalent binding, og hvor nevnte polymer inneholder en funksjonell gruppe til hvilken L-tyrosin kan bindes sterkt ved hjelp av nevnte kovalente binding; b) fjerner den a-aminobeskyttende gruppe fra L-tyrosin- c) omsetter L-tyrosinharpiksen med en Y-aminosyre beskyttet på sin a-aminogruppe og eventuelle andre reaktive grupper, men ikke på a-karboksylgruppen; d) fjerner den a-aminobeskyttende gruppe fra Y-aminosyre-gruppen; e) omsetter Y-L-tyrosinharpiksen med en Z-aminosyre beskyttet på sin a-aminosyregruppe og eventuelle andre reaktive grupper, men ikke på a-karboksylgruppen; f) fjerner den a-aminobeskyttende gruppe fra Z-aminosyre- g) omsetter Z-Y-L-tyrosinharpiksen med en X-aminosyre beskyttet på sin a-aminogruppe og eventuelt andre reaktive grupper, men ikke på a-karboksylgruppen; h) fjerner den a-aminobeskyttende gruppe fra X-aminosyre-gruppen; i) omsetter X-Z-Y-L-tyrosinharpiksen med en A-aminosyregruppe beskyttet på sin a-aminogruppe og sin guanidinogruppe, men ikke på sin a-karboksylgruppe; og j) fjerner harpiksen og alle beskyttende grupper fra peptidet ved hjelp av passende reagenser; og, om ønsket, fremstiller farmasøytisk akseptable salter av produktene eller andre derivater hvor R og R"<1> er forskjellig fra H, og R<1> er forskjellig fra OH, og, om ønsket, bruker egnet beskyttet D-tyrosin isteden for L-tyrosin i trinn a) eller fremstiller tilsvarende C-terminal amidpeptider som beskrevet ovenfor, men bruker en benzhydrylaminharpiks i trinn a) istedenfor nevnte klormetylharpiks, og kopler nevnte C-terminale aminosyre til harpiksen ved hjelp av et egnet koplingsmiddel slik som dicykloheksy1-karbodiimid; og, om ønsket, fremstiller de tilsvarende peptider hvor B er dekarboksy-TYR eller ved a anvende en merkaptofenolharpiks til hvilken det er festet en egnet beskyttet Y-aminosyre via sin karboksylgruppe som i trinn a), utelater trinn b) og c), gjennomfører trinnene d) til og med i), oksyderer harpiksens svovelbindingsgruppe med m-klorperbenzosyre, hvorved man får en aktiv esterharpiks, behandler denne med en ekvivalent mengde at et egnet beskyttet aminosyrederivat for å kople dette derivat til Y-aminosyreresten ved en samtidig avspaltning av peptidet fra harpiksen, hvoretter man til slutt fjerner alle beskyttende grupper fra det resulterende blokkerte pentapeptid som i trinn j).

2. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av et pentapeptid med følgende sekvens: karakterisert ved at man anvender en benzhydrylaminharpiks i trinn a), en SAR-aminosyre i trinn c), en ASP-aminosyre i trinn e), en SAR-aminosyre i trinn g) og en ARG-aminosyre i trinn i).

3. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av et pentapeptid med følgende sekvens: karakterisert ved at man bruker en klormetylert sampolymer av styren og divinylbenzen i trinn a), en VAL-aminosyre i trinn c), en ASP-aminosyre i trinn e), en SAR-aminosyre i trinn g) og en ARG-aminosyre i trinn i).