NO883368L

NO883368L - EFFECTIVE PROCEDURE FOR IN-VITRO-IN VIVOPRODUCTION OF MINIPOTETNULS.

Info

Publication number: NO883368L
Application number: NO883368A
Authority: NO
Inventors: Ferenc Foeglein; Zoltan Osvath; Jozsef Balogh
Original assignee: Novotrade R T
Priority date: 1986-12-01
Filing date: 1988-07-29
Publication date: 1988-08-01
Also published as: NO883368D0

Description

OppfinnelsesområdeField of invention

Foreliggende oppfinnelse gjelder en effektiv fremgangsmåte for in vitro-in vivo-produksjon av minipotetknoller. The present invention relates to an efficient method for the in vitro-in vivo production of mini potato tubers.

BakgrunnsteknikkBackground technology

.Før søknadsdagen for foreliggende oppfinnelse krever søkerne en beskyttelse i ungarsk patentsøknad nr. 1160/84, .Before the application date for the present invention, the applicants claim protection in Hungarian patent application No. 1160/84,

ikke publisert ennu, en fremgangsmåte for masseproduksjon av potetavlingsmateriale, fritt for virus og viroider, ved hjelp av plantevevkultur, hvilken fremgangsmåte omfatter, not yet published, a process for the mass production of virus and viroid-free potato breeding material by means of plant tissue culture, which process comprises,

at potetcellenes skuddtoppvev dyrkes og avles in vitro på næringsmedier, så dannes det skudd på røttene eller det induseres dannelse av miniknoller, plantene som er gitt røtter in vitro plantes i drivhus for å gi in vivo-morplanter eller det kan induseres knolldannelse in vitro, fra disse miniknollene kan ytterligere morplanter dyrkes og fra.disse kan det oppnåes frøplanter eller små knoller som avlingsmateriale, that the shoot tip tissue of the potato cells is cultured and bred in vitro on nutrient media, then shoots are formed on the roots or the formation of mini-tubers is induced, the plants that have been given roots in vitro are planted in greenhouses to give in vivo mother plants or tuber formation can be induced in vitro, from additional mother plants can be grown from these mini tubers and from these, seedlings or small tubers can be obtained as crop material,

eller miniknollene kan anvendes som avlingsmaterialer. Dannel-sen av frøplanter eller knoller kan styres ved påvirkning av patatin-syntesen i morplantene. or the mini tubers can be used as crop materials. The formation of seedlings or tubers can be controlled by influencing patatin synthesis in the mother plants.

I den nevnte søknad er teknikkens stand for fremstil-ling av in vitro-avlingsmateriale av poteter diskutert i de-talj , og det er funnet at mange verdifulle delresultater er tilgjengelige, men ingen komplekse systemer var kjente som In the aforementioned application, the state of the art for the production of in vitro crop material of potatoes is discussed in detail, and it is found that many valuable partial results are available, but no complex systems were known as

med hell kunne anvendes for produksjon av passende avlingsmateriale i stor skala. could be successfully used for the production of suitable crop material on a large scale.

Masseavling av potetavlingsmateriale er litt vanske-Mass production of potato breeding material is somewhat difficult-

lig, på grunn av denne platens natur.lig, due to the nature of this plate.

Formeringshastigheten for poteter avlet ved hjelp avThe propagation rate of potatoes bred using

en tradisjonell prosess er lav (maksimal 10-12 ganger årlig), slik at den tradisjonelle kultivaropprettholdelse krever 8-12 år. a traditional process is low (maximum 10-12 times annually), so that the traditional cultivar maintenance requires 8-12 years.

I kultivarer av poteter som for tiden er tilgjengelige, er utsatt for forskjellige sopp-, bakterie- og virussykdom- In cultivars of potatoes currently available are susceptible to various fungal, bacterial and viral diseases-

mer. Den tradisjonelle kultivaropprettholdelse kan bare gjen-nomføres i de land, der infeksjonsnivået er lavt nok på grunn av fordelaktige økologiske faktorer. more. The traditional cultivar maintenance can only be carried out in countries where the level of infection is low enough due to favorable ecological factors.

Vanninnholdet i potetavlingsmateriale er omtrent 90%, slik at transport og lagring av det krever spesielle betingel-ser. I et gitt tilfelle kan transportkostnadene være høyere enn verdien av pofeten på produksjonsstedet. The water content of potato crop material is approximately 90%, so that its transport and storage require special conditions. In a given case, the transport costs may be higher than the value of the pofet at the place of production.

Den fremgangsmåte som er beskrevet i vår ungarske pa-tentsøknad nr. 1160/84 er egnet for eliminasjon av de ovenfor nevnte vanskelighetene. Ved bruk av den fremgangsmåte er avlingshastigheten høy, den tid som kreves for kultivaropprettholdelse kan reduseres til 1-2 år, det kan produseres friskt avlingsmateriale, transport- og lagringskostnadene kan reduseres betydelig ved avling av miniknoller. The method described in our Hungarian patent application no. 1160/84 is suitable for eliminating the above-mentioned difficulties. Using that method, the yield rate is high, the time required for cultivar maintenance can be reduced to 1-2 years, fresh crop material can be produced, transport and storage costs can be significantly reduced when harvesting mini tubers.

Ifølge denne tidligere prosessen må potetavlingsmateriale produseres i laboratorier og drivhus. På grunn av at investerings- og vedlikeholdskostnadene er høye, i begge til-feller, er således lønnsomheten ved prosessen avhengig av den mengde avlingsmateriale som produseres og et enhetsareale. Oppføring av drivhus er mer kostbart enn etablering av et laboratorium. According to this earlier process, potato breeding material must be produced in laboratories and greenhouses. Due to the fact that the investment and maintenance costs are high, in both cases, the profitability of the process thus depends on the amount of crop material produced and a unit area. Building a greenhouse is more expensive than setting up a laboratory.

Omplantningen av planter som er produsert i laboratorier krever godt teknisk nivå i drivhus (nøyaktige jordopp-varmingsanlegg, regulering av fuktighet, tilleggsbelysning). Idet det taes i betraktning at planter som er omplantet fra laboratorier til drivhus må dyrkes økonomisk og dette kan garanteres i tilfelle av miniknollproduksjon bare ved den beste anvendelsen av drivhus. The transplanting of plants produced in laboratories requires a good technical level in greenhouses (precise soil heating systems, regulation of humidity, additional lighting). Considering that plants transplanted from laboratories to greenhouses must be grown economically and this can be guaranteed in the case of mini tuber production only by the best use of greenhouses.

Ifølge vår tidligere prosess kan 400-800 pes miniknoller produseres pr. kvadratmeter. Dette faktum begrenser for-delingen av anvendelsen av drivhus for miniknollproduksjon. According to our previous process, 400-800 pes of mini tubers can be produced per square meters. This fact limits the distribution of the use of greenhouses for mini tuber production.

Søkerne har nu utarbeidet en ny fremgangsmåte for sig-nifikant å øke effektiviteten av miniknollproduksjon pr. enhetsareale. Ifølge denne fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, som ikke er selvsagt fra det som er kjent innen teknikkens stand, kan effektiviteten ved den tidligere prosessen økes med minst 300-500%. The applicants have now developed a new method to significantly increase the efficiency of mini tuber production per unit area. According to this method according to the invention, which is not obvious from what is known in the state of the art, the efficiency of the previous process can be increased by at least 300-500%.

Beskrivelse av oppfinnelsenDescription of the invention

Gjenstanden for foreliggende oppfinnelse er at sykdoms-frie og avlede planter som er produsert ifølge de kjente vevkulturmetodene rotsettes i flytende medier in vitro under sterile laboratoriebetingelser, når plantene har utviklet røtter flyttes næringsmediet med et medium som inneholder antigibberellinkjemikalium for induksjonen av knoller og planter inkuberes i dette medium. Etter induksjon av knoller behandles planter med et kjemikalium som fremmer rotdannelse og plantes i fast medium i drivhus. Den vegetative veksten av planter begrenses ved minskning av nivået av gibberellin til nivået av cytokinininnhold periodisk og regulært, og de produserte miniknollene oppsamles fra røtter, så plantes planter som er behandlet med et rotsettingshormon tilbake i faste medier og behandles regelmessig og periodisk med antigebberel-linkjemikalium, og så samles de produserte miniknollene igjen. The object of the present invention is that disease-free and derived plants produced according to the known tissue culture methods are rooted in liquid media in vitro under sterile laboratory conditions, when the plants have developed roots, the nutrient medium is moved with a medium containing antigibberellin chemical for the induction of tubers and plants are incubated in this medium. After tuber induction, plants are treated with a chemical that promotes root formation and planted in a solid medium in a greenhouse. The vegetative growth of plants is limited by reducing the level of gibberellin to the level of cytokinin content periodically and regularly, and the mini-tubers produced are collected from roots, then plants treated with a rooting hormone are replanted in solid media and treated regularly and periodically with anti-gibberell link chemical , and then the produced minitubers are collected again.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan gjennomføresThe method according to the invention can be carried out

ved at sykdoms-frie planter produseres fra vevkultur ved hjelp av kjente metoder. De virus- og sykdoms-frie plantene kan avles ved hjelp av hvilke som helst av de kjente vevkulturmetodene. Planter som er avlet ved vevkultur rotsettes i flytende medier. Etter rotsettingsfasen, hvor planter har nærlig-gende røtter, byttes rotsettingsmediet med et medium for knollinduksjon, som i hovedsak er et MS-medium (Murashige and Skoog: Physiol. Plant. 15. 473-397 /1962/ ) og det er en forskjell i"mengden av uorganisk nitrogenkilde (her er den 10% av den opprinnelige) og plantenes nitrogenbehov garanteres ved til-setning av en organisk nitrogenkilde (glutamin, asparagin) under induksjonen. Konsentrasjonen av saccharose i induksjons-mediet er høyere enn i MS-mediet, 40 g/l saccharose kan fortrinnsvis anvendes. in that disease-free plants are produced from tissue culture using known methods. The virus- and disease-free plants can be bred using any of the known tissue culture methods. Plants grown by tissue culture are rooted in liquid media. After the rooting phase, where plants have adjacent roots, the rooting medium is replaced with a medium for tuber induction, which is essentially an MS medium (Murashige and Skoog: Physiol. Plant. 15. 473-397 /1962/ ) and there is a difference i" the amount of inorganic nitrogen source (here it is 10% of the original) and the plants' nitrogen requirement is guaranteed by the addition of an organic nitrogen source (glutamine, asparagine) during the induction. The concentration of sucrose in the induction medium is higher than in the MS medium , 40 g/l sucrose can preferably be used.

De medier som anvendes for induksjon inneholder cytokininer i en høy konsentrasjon, i gjennomsnitt 5-10 mg/l er passe. De essensielle delene av mediene som anvendes for knollinduksjon er de forskjellige angibberellinene. Slike kjemi-kalier er coumarin og dets derivater, klor-cholin-klorid, (CCC), fortrinnsvis diklor-acetyl-hexamethylen-imin. Dette siste kjemikalium har vekstbegrensende og motgift-effekter. The media used for induction contain cytokinins in a high concentration, on average 5-10 mg/l is suitable. The essential parts of the media used for tuber induction are the various indicator lines. Such chemicals are coumarin and its derivatives, chloro-choline chloride, (CCC), preferably dichloro-acetyl-hexamethylene-imine. This last chemical has growth limiting and antidote effects.

I planter har det en effekt på knolliriduksjonen ved å minske nivået av gibberellin sammenlignet med cytokininer og har en fordelaktig innvirkning på strukturen av cellemembranene i planter. Ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan diklor-acetyl-hexamethylen-imin anvendes i en konsentrasjon på 6-20 mg/l. In plants, it has an effect on tuber reduction by reducing the level of gibberellin compared to cytokinins and has a beneficial effect on the structure of cell membranes in plants. According to the method according to the invention, dichloro-acetyl-hexamethylene-imine can be used in a concentration of 6-20 mg/l.

Planter inkuberes i induksjonsmediene ved 18-20°C ogPlants are incubated in the induction media at 18-20°C and

8 timers belysning i 10-14 dager.8 hours of lighting for 10-14 days.

Etter induksjonen utvikles potetknoller i faste medier i drivhus. Før omplantning til drivhus vaskes induksjonsmediene ut av røttene og for å fremme rotdannelse og å hindre plantene fra infeksjon med "Rhizoctonia" dyppes plantene i en væske som inneholder 0,05 mg/l indol-eddiksyre og 0,2% Previcur-N (=propyl-N-(3-dimethylaminopropyl)-carbamathydro-klorid). After induction, potato tubers are developed in solid media in greenhouses. Before transplanting to the greenhouse, the induction media is washed out of the roots and to promote root formation and to prevent the plants from infection with "Rhizoctonia", the plants are dipped in a liquid containing 0.05 mg/l indole-acetic acid and 0.2% Previcur-N (= propyl N-(3-dimethylaminopropyl)-carbamate hydrochloride).

Etter oppnåelse av røtter sprøytes plantene i drivhu-sene (3 uker etter omplantning) med en løsning inneholdende 10 mg/l coumarin og/eller 5-10 mg/l diklor-acetyl-hexamethylen-imin én gang i uken. På denne måten forblir plantene små, men deres fysiologiske tilstand er egnet for knolldannelse. Om nødvendig kan plantene knipes tilbake for å hindre ytterligere vekst. After obtaining roots, the plants in the greenhouses (3 weeks after transplanting) are sprayed with a solution containing 10 mg/l coumarin and/or 5-10 mg/l dichloro-acetyl-hexamethylene-imine once a week. In this way, the plants remain small, but their physiological state is suitable for tuber formation. If necessary, the plants can be pinched back to prevent further growth.

Etter omplantning i drivhus (1,5-2 måneder senere) fjernes bunten av planter fra jorden og knoller som er større enn 0,5 cm samles fra røttene. Omtrent 1000 knoller pr. kvadratmeter kan samles fra planter som er dyrket på denne måten den første gangen. After transplanting in a greenhouse (1.5-2 months later), the bundle of plants is removed from the soil and tubers larger than 0.5 cm are collected from the roots. Approximately 1000 tubers per square meters can be collected from plants grown in this way the first time.

Røtter kan ødelegges under fjerning av planter og knoller. Bunten av planter dyppes igjen i en løsning inneholdende 0,05 mg/l indol-eddiksyre og 0,2% Previcur-N, og plantes så Roots can be destroyed during the removal of plants and tubers. The bundle of plants is dipped again in a solution containing 0.05 mg/l indole-acetic acid and 0.2% Previcur-N, and then planted

i den opprinnelige eller ny jord. Etter rotdannelsesfasen gjentaes de tidligere behandlingene (10 mg/l coumarin og/eller 6 mg/l diklor-acetyl-hexamethylen-imin). Fjerning av bunter av planter og knoller, behandling med den ovenfor beskrevne in the original or new soil. After the root formation phase, the previous treatments are repeated (10 mg/l coumarin and/or 6 mg/l dichloro-acetyl-hexamethylene-imine). Removal of bundles of plants and tubers, treatment with the above described

løsning, omplantning av planter kan gjentaes etter 3-4 uker.solution, transplanting plants can be repeated after 3-4 weeks.

De andre høstene av knoller kan være 2-3000 pes/kvadratmeter.The other harvests of tubers can be 2-3000 pes/square meter.

Når plantene eldes, 4 måneder etter planting, fjernes de og ødelegges. Planter som er behandlet på den ovenfor beskrevne måten kan produsere 2500-4000 pes knoller/kvadratmeter avhengig av kultivarer, og denne mengden er 3-4 ganger større enn det som kan oppnåes med den tidligere metoden. When the plants age, 4 months after planting, they are removed and destroyed. Plants treated in the manner described above can produce 2500-4000 pes tubers/square meter depending on cultivars, and this amount is 3-4 times greater than what can be achieved with the previous method.

De samlede knollene forkorkes i to uker, under diffustThe collected tubers are corked for two weeks, under diffuse

lys og 70% fuktighet, graderes så og lagres ved 2-5°C.light and 70% humidity, then graded and stored at 2-5°C.

Denne fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan gjentaesThis method according to the invention can be repeated

2,5 ganger årlig, hvilket betyr at effektiviteten av miniknoll-produksjonen økes 4-5 ganger sammenlignet med den tidligere metoden. 2.5 times annually, which means that the efficiency of mini tuber production is increased 4-5 times compared to the previous method.

Beste utførelsesform av oppfinnelsenBest embodiment of the invention

Følgende eksempel illustrerer oppfinnelsen:The following example illustrates the invention:

EksempelExample

Potetkultivaren "Somogy Gyongye" avles ved vevkulturThe potato cultivar "Somogy Gyongye" is bred by tissue culture

på kjent måte. Etter oppnåelse av det riktige planteantallet, rotsettes skudd i flytende medier. Etter to ukers rotsetting byttes det flytende mediet med et annet for knollinduksjon. Sammensetningen av mediet for knollinduksjon: Murashige og Skoog (MS) basisk medium, 1/10 konsentrasjon, NH4NC>3 og KNO^, in a known manner. After achieving the correct plant number, shoots are rooted in liquid media. After two weeks of rooting, the liquid medium is replaced with another for tuber induction. The composition of the medium for tuber induction: Murashige and Skoog (MS) basic medium, 1/10 concentration, NH4NC>3 and KNO^,

20 mg/l glutaminsyre, 40 g/l saccharose, 5 mg/l benzyladenin,20 mg/l glutamic acid, 40 g/l sucrose, 5 mg/l benzyladenine,

2 5 mg/l coumarin og 6 mg/l diklor-acetyl-hexamethylen-imin. Plantene inkuberes i dette medium for knollinduksjon i 10 2 5 mg/l coumarin and 6 mg/l dichloro-acetyl-hexamethylene-imine. The plants are incubated in this medium for tuber induction for 10

dager under 8 timers 200 lux/m<2>belysning, ved 18°C. Etter induksjonen fjernes bunter av planter fra dyrknings-kolbene, plantene vaskes i vann fra springen og ristes for fjerning av overskudd av vann og dyppes i en løsning inneholdende 0,08 mg/l indol-eddiksyre og 0,2% Previcur-N, plantes så en torv-blanding, 50 bunter av planter/m 2. Etter rotdannelsen av plantene dannes en liten drillformasjon (2 cm), fra den andre uken etter plantingen sprøytes så plantene med en løsning inneholdende 10 mg/l coumarin og 6 mg/l diklor-acetyl-hexamethylen-imin én gang i uken. Etter planting, 1,5-2 måneder senere, fjernes buskaktige bunter av planter fra jorden på dyrkningssenger. Knoller som er større enn 0,5 cm samles med days under 8 hours of 200 lux/m<2>lighting, at 18°C. After the induction, bundles of plants are removed from the cultivation flasks, the plants are washed in tap water and shaken to remove excess water and dipped in a solution containing 0.08 mg/l indole-acetic acid and 0.2% Previcur-N, planted sow a peat mixture, 50 bundles of plants/m 2. After the root formation of the plants, a small drill formation (2 cm) is formed, from the second week after planting the plants are then sprayed with a solution containing 10 mg/l coumarin and 6 mg/l dichloro-acetyl-hexamethylene-imine once a week. After planting, 1.5-2 months later, bushy bundles of plants are removed from the soil on cultivation beds. Tubers larger than 0.5 cm are collected

en kam fremstilt for dette formål eller for hånd. Torv og jord ristes fra de fjernede buntene av planter, som så dyppes i en løsning inneholdende 0,08 mg/l iridoleddiksyre"og 0,2% Previcur-N, plantes så tilbake i den opprinnelig jorden og vannes. Behandlingen av plantene fortsettes ved å sprøyte dem med en løsning inneholdende 10 mg/l coumarin og 6 mg/l diklor-acetyl-hexamethylen-imin. Etter 3-4 uker kan fjerningen og plantingen gjentaes. Planter kan knipes tilbake for å holde den riktige lille størrelsen på plantene. Disse stiklingene uten røtter kan anvendes for ytterligere dyrkning og knoll-setting. a comb made for this purpose or by hand. Peat and soil are shaken from the removed bundles of plants, which are then dipped in a solution containing 0.08 mg/l iridoleacetic acid" and 0.2% Previcur-N, then planted back into the original soil and watered. The treatment of the plants is continued by to spray them with a solution containing 10 mg/l coumarin and 6 mg/l dichloro-acetyl-hexamethylene-imine. After 3-4 weeks the removal and planting can be repeated. Plants can be pinched back to keep the correct small size of the plants. These cuttings without roots can be used for further cultivation and tuber setting.

De "Somogy Gyongye"-plantene som er indusert og dyrket på denne måten, produserer 3500 pes miniknoller/m 2 på 4 måneder . The "Somogy Gyongye" plants induced and cultivated in this way produce 3500 pes mini tubers/m 2 in 4 months.

Claims

1. Method for the production of mini potato tubers from in vitro plants that were bred by tissue culture and rooted in a liquid medium, characterized in that tuber formation is induced in vitro on rooted plants, the induced plants are planted in solid medium in a greenhouse and tubers are developed in a greenhouse, while the growth of the plants' stem is limited by spraying with anti-gibberellin chemical, regularly and periodically, the developed minitubers are collected, and the plants are planted back in the soil, the growth of the stem is further limited and the removal and replanting is repeated periodically during the plants' vegetation period.

2. Method according to claim 1, characterized in that the tuber formation is induced using MS basic medium containing NH^ NO^ and KNO^ in 1/10 concentration, 20 mg/l glutamic acid, 40 g/l sucrose, 5 mg/l benzyladenine, 25 mg/l coumarin and 6 mg/l dichloro-acetyl-hexamethylene-imine.

3. Method according to claim 1, characterized in that, before planting in a greenhouse, the plants are treated with a chemical that promotes root formation and with an agent that prevents infection with Rhizoctonia, if necessary.

4. Method according to claim 3, characterized in that this treatment is carried out by using indole-acetic acid and, if necessary, a solution containing propyl-N-(3-dimethylaminopropyl)-carbamate hydrochloride.

5. Method according to any one of claims 1 - 3, characterized in that the transplanted plants are treated with coumarin and/or dichloro-acetyl-hexamethylene-imine.

6. Method according to claim 1, characterized by the fact that, after collecting the mini-tubers, the plants are again treated, before transplanting, with a solution containing a chemical that promotes root formation and another that prevents infection with Rhizoctonia, if necessary.

7. Method according to claim 1, characterized in that the transplanted plants are treated with coumarin and/or dichloro-acetyl-hexamethylene-imine.

8. Method according to any one of the claims characterized in that the removal of plants, ) collection of mini tubers and replanting of the plants can be repeated several times during the plants' vegetation period.