SE456346B - Gel for att forhindra adhesion mellan kroppsvevnader och sett for dess framstellning - Google Patents

Description

456 346 - 2 - Rörformade implantat kan på motsvarande sätt användas för att åstadkomma förbättrat avflöde från främre kammaren och vidare för att motverka en obstruerad tàrkanal samt för att förbättra resultatet av dacryocystorhinostomi.

Vid en typ av ledoperationer, som beskrivs av Engkvist et al i Scand J Plast Reconstr. Surg 14 (1980) 71-87, inopereras silikonplattor Silasticä (Dow Corning) för att förhindra att broskhinnorna växer samman. Efter ca 12-16 veckor är det emellertid nödvändigt att genom ett operativt ingrepp ta bort implantatet. D v s med nuvarande teknik kräver de fall där ett material med god rigiditet och hög mekanisk stabi- litet måste användas att detta material efter en lämplig tidsrymd avlägsnas. Vid applikationer där kraven pà mekanisk stabilitet är små har icke-tvärbunden dextran resp hyaluronsyra kommit till användning. Även i det fall en så högviskös substans som hyaluronsyra applicerats i en kontaktyta uppnås emellertid en alltför kort period av skyddande effekt för att önskemålen ska tillmötesgàs.

Det föreligger således ett behov av en produkt som i lämplig form kan appliceras för att förhindra adhesion och sammanväx- ningar mellan vävnader och som samtidigt har egenskapen att den eventuellt nedbrytes efter en önskad tidsperiod.

Vi har nu funnit att en gel av en tvärbunden karboxylgrupp- innehållande polysackarid är mycket lämplig för användning som nedbrytbart implantat.

Föreliggande uppfinning avser därför en ny_nedbrytbar gel bestående av en karboxylgruppinnehállande polysackarid som t ex karboxymetylstärkelse, karboxymetyldextran, karboxymetyl- cellulosa och glukosaminoglykaner som t ex heparin, heparan- sulfat, kondroitinsulfat och hyaluronsyra, vilken polysackarid tvärbundits med en di- eller polyfunktionell epoxid. Exempel på sådana epoxider är t ex 1,4-butandioldiglycidyleter (BDDE), l,2-etandioldiglycidyleter (EDDE), l-(2,3-epoxypropyl)- 2,3-epoxycyklohexan (Bakelite epoxy resin ERL 4206, Union - s - 456 546 Carbide), N,N-diglycidylanilin (Leuktherm X50, Bayer) och epoxysubstituerad pentaerytritol (Shell 162). Dessa tvär- bindningsreagens, liksom övriga lämpliga epoxyföreningar, är emellertid välkända för fackmannen. Detsamma gäller till- gången på polysackarider vilka innehåller karboxylgrupper eller vilka kan derivatiseras till att innehålla sådana grupper. Tvärbindningen har därvid genomförts i sur miljö i närvaro av en sur katalysator. Ett stort antal substanser har befunnits fungera som katalysator för tvärbindnings- reaktionen. Exempel på sådana substanser är oorganiska syror som t ex svavelsyra, salpetersyra, saltsyra och fosforsyra.

Vidare organiska mono- och polykarboxylsyror, exempelvis lägre alifatisk sådana, t ex myrsyra, ättiksyra, propion- syra, mjölksyra, triklorättiksyra och bärnstenssyra, samt aromatiska mono- eller polyfunktionella karboxylsyror eller sulfonsyror, t ex bensoesyra, salicylsyra och paratoluen- sulfonsyra. Med termen polykarboxylsyror avses alla syror med mer än en karboxylgrupp. Förutom syraformen av nämnda substansgrupper kan eventuella korresponderande sura salter användas.

Uppfinningen avser vidare en metod för framställning av en nedbrytbar gel genom att en karboxylgruppinnehàllande poly- sackarid vid pH 2 till 5, företrädesvis 2,5 till 4,5, reageras med en bi- eller polyfunktionell epoxid i närvaro av en sur katalysator av ovan beskrivna slag.

I en föredragen utföringsform utgöres den karboxylgruppinne- hållande polysackariden av hyaluronsyra eller ett salt av denna, t ex natriumsaltet. Hyaluronsyran förekommer inom ett brett molekylviktsintervall, beroende pà källa och renings- metod, och produkter i intervallet 20 000 till 5 000 000, speciellt 500 000 till 3 000 000, är lämpliga vid fram- ställning av geler enligt uppfinningen. Koncentrationen i reaktionsblandningen av hyaluronsyra i de fall molekylvikten överstiger 106 är lämpligen 5 till 10 viktsprocent, För att åstadkomma gelbildning vid användning av làgmolekylär 45§ 346 - 4 - polysackarid måste koncentrationen ökas avsevärt. Mängden tvärbindare kan på motsvarande sätt varieras inom vida gränser, ca 10 - 500 % (viktsprocent, relativt mängden hyaluronsyra), beroende på gelens önskade egenskaper.

Reaktionen genomföres med fördel vid en förhöjd temperatur, 30 - 80 OC, men med tanke på risken för sur hydrolys före- drages en temperatur i intervallet 30 - 50 °C. Reaktions- tiden väljes vanligen i intervallet 3 till 20 tim, före- trädesvis 5 till 15 tim.

Torrhalten hos en gel svälld i fysiologisk saltlösning ligger företrädesvis i intervallet 0,5 till 10 % (viktsprocent).

En analys med IR av en gel framställd analogt med Exempel 1, pnedan, visade en signifikant topp i spektrat vid ca 1 745 cm_l vilket är karakteristiskt för en O-estergrupp. Denna topp kvarstod även sedan gelen behandlats med fosfatbuffert (pH 6,8) varvid huvuddelen av karboxylgrupperna föreligger i joniserad form och ej skulle kunna bidra till den observerade toppen. Resultaten indikerar således att de syrakatalyserade gelerna innehåller o-esterbryggor. Geler framställda genom alkalisk katalys (se t ex Laurent et al Acta Chim Scand. 18 (1964) 274-5) uppvisar ej denna topp vid 1 745 cm_l.

De nya gelerna enligt uppfinningen är nedbrytbara och en hyaluronatgel implanterad på råtta befanns genomgå en långsam svällning varvid den gradvis förlorade sin form och rigiditet. Efter 32 tim var den ej längre intakt. Dessa geler är således lämpliga för användning i fall då den kontaktförhindrande effekten avses kvarstå under någon eller nâgra dagar.

I de fall man önskar att nämnda effekt skall kvarstå under en längre tidsperiod väljes t ex en gel, enligt föreliggande uppfinning, med hög tvärbindningsgrad eller med fördel en alkalikatylserad gel av den typ som beskrivs i svenska patentansökan 8403090-7. Gelen av den tvärbundna hyaluronsyran - s - 456 346 bryts, speciellt i detta senare fall, endast långsamt ner och den kontaktförhindrande effekten kan kvarstå under flera månader. Från föreliggande uppfinning undantages den användning av alkalikatalyserade geler som glaskroppssubstitut vilken är beskriven i nämnda patentansökan.

Gelerna kan framställas i ett stort antal former beroende på applikationsomráde. Sedan de olika komponenterna tillsatts reaktionsblandningen överföres denna till en lämplig behål- lare i vilken den polymeriserade produkten får den önskade formen, t ex tunna skikt, stavar och rör. Efter polymerisa~ tionen kan gelen också krossas varvid en produkt erhålles vilken är lämplig att injicera för att på applikatione- stället fylla ut tillgängligt utrymme.

Det är av vikt att polysackariden renats från komponenter som kan förorsaka toxikologiska eller oönskade immunologiska reaktioner. På motsvarande sätt krävs att den färdiga gelen genom omsorgsfull tvättning befrias från t ex icke reagerat tvärbindningsmedel. Gelen kan steriliseras och autoklaveras.

Vid förfarandetlenligt uppfinningen,för att förhindra adhesion eller sammanväxningar mellan kroppsvävnader placeras ett eller flera gelstycken, under det operativa ingreppet, mellan de vävnader man önskar ska förbli åtskilda under en lämplig tidsperiod. Gelen är därvid åtminstone delvis svälld i en fysiologiskt accepterbar lösning. Alternativt kan den svällda gelen i krossad form injiceras pà det ställe där den adhesionsförhindrande effekten önskas.

Exempel 1. Framställning av geler av tvärbunden hyaluronsyra 1(a) 400 mg natriumhyaluronat med en molekylvikt av ca 3 x 106 löstes i 4 ml dest vatten i ett provrör av plast. Efter ca 2 tim tillsattes 600 /ul 456 346 1(b) l(c) l(d) l(e) l(f) 1,4-butandioldiglycidyleter (BDDE) och efter omrörning 150 /ul isättika. Blandningen fick därefter stå under 15 tim vid eo :in 10 °c varefter den bildade gelen tvättades med vatten.

Torrhalten hos den svällda gelen var 3,3 % (viktsprocent av svälld gel i fysiologisk koksalt- lösning).

Förfarandet enligt Exempel l(a) upprepades men med 200 /ul BDDE och 200 /ul isättika och reaktionstiden var 5 tim vid 50 OC. Gelens torrhalt var 5,0 %.

Förfarandet enligt Exempel l(a) upprepades men med 600 mg natriumhyaluronat, 400 /ul BDDE och 200 /ul isättika. Gelens torrhalt var 8,4 %.

Förfarandet enligt Exempel l(a) upprepades men med 400 mg natriumhyaluronat med en molekylvikt av ca l x 106 och 150 mg mjölksyra som katalysator.

Den bildade gelens torrhalt var 1,6 %.

Försöket enligt Exempel l(a) upprepade vidare med följande katalysatorer: 400 /ul ZN svavelsyra, 200 /ul 50 % trikloroättik- syra resp 200 /ul av en lösning av 1,5 g bensoesyra i 1,5 ml vatten och 1,5 ml dimetylsulfoxid.

I samtliga fall erhölls en gel av tvärbundet hyaluronat. 150 mg natriumhyaluronat med en molekylvikt av ca 3 x 106 löstes i 1,5 ml vatten. När lösningen var homogen tillsattes 75 /ul isättika och 75 mg epoxysubstituerad pentaerytritol (Shell 162, substitutionsgrad ca 3,5). Blandningen fick stå 1(9) l(h) l(i) 456 346 över natten vid 60 °C varefter den bildade gelen tvättades med vatten. Den svällda gelens torrhalt var 2,4 %.

Försöket enligt Exempel 1(a) upprepades men med 75 mg N,N-diglycidylanilin (Leuktheim X50, Bayer) som tvärbindingsreagens och med 400 /ul 2 N svavelsyra som katalysator. Gelens torrhalt var 3,7 %.

Försöket enligt Exempel l(a) upprepades men med 200 mg natriumhyaluronat med en molekylvikt av ca 500 000, 250 /ul BDDE och 100 /ul isättika.

Reaktionen fick fortgå via so °c över natten. I detta fall liksom i ett försök där 200 mg hyalu- ronsyra (syraformen) med en molekylvikt av ca 3 x 106, reagerades med 200 /ul BDDE i närvaro av 100 hyaluronsyra. /ul isättika bildades geler av tvärbunden I ett med Exempel I(a) analogt försök men med 300 mg natriumhyaluronat och 150 /ul BDDE i närvaro av 150 /ul isättika resp 250 /ul BDDE i närvaro av 250 /ul isättika erhölls geler med halten tvärbindare 9 resp 21 viktsprocent bestämd med GLC.

Framställning av geler av tvärbunden karboxymetyl- dextran, karboxymetylcellulosa och kondroitinsulfat 2(a) 600 mg karboxymetyldextran med en molekylvikt av ca 2 x 106 BDDE och 300 blandningen fick stà vid 50 °C över natten, varefter den bildade gelen tvättades med vatten. löstes i 3 ml vatten varefter 300 /ul /ul isättika tillsattes varefter v-Hq 456 546 - 8 _ 2(b) 400 mg karboxymetylcellulosa (Fluka CMC Na salt) löstes i 3 ml vatten varefter reaktionen genom- fördes som i Exempel 2(a) men med 200 /ul BDDE och 200 /ul isättika. En opalescent elastisk gel erhölls därvid. 2(c) 800 mg kondroitinsulfat (natriumsaltet, Sigma) löstes i 2 ml vatten varefter reaktionen genom- fördes som i Exempel 2(a) men med 200 /ul BDDE och 100 /ul isättika, varvid en fast gel bildades.

Framställning av alkalikatalyserad gel av tvärbunden hxaluronsvra 2,5 g natrumhyaluronat med en molekylvikt av 3 x 106 löstes i 18,75 ml 0,5 % NaOH under omrörning till en klar homogen lösning. 0,94 ml BDDE tillsattes och efter noggrann blandning överfördes lösningen till en behållare vari en gel med önskad form bildades vid 50 OC under 2 tim. Före användning tvättades gelen omsorgsfullt och steriliserades i en autoklav.

Detta är ett exempel pà den stabilare typ av geler av tvärbunden karboxylgruppinnehàllande polysackarid vars framställning utförligare är beskriven i SE 8403090-7.

Nedbrytning av hyaluronatgel in vivo (råtta) En gel framställd analogt med Exempel 1 skars i små stycken vilka vägdes och placerades i små kammare av Plexiglasß vilka täcktes med ett nylonnät och därefter implanterades subkutant på råtta. Gelstyckena avlägsnades, vägdes och analyserades med avseende pà hyaluronatinnehâll efter lämpliga tidsintervall med nedan angivna resultata. Hyaluronatinnehâllet bestämdes enligt tre oberoende metoder orcinol- (Mejbaum W, Physiol Chem 258 (1939) 456 346 117), hyaluronidase- (Dische Z, J Biol Chem 167 (1947) 189) resp carbazolmetoden (Jourdian G.W. et al, Anal Biochem 96 (1979) 474). Då överenstämmelsen mellan korresponderande tester var god redovisas endast resultat erhållna med carbazolmetoden. mfi(um)vm¿fme vflxefiær inplantering ínplantering NU) mg) 133 - 131 - 24 144 zosb 24 141 21sb 32 133 24sb 32 128 zssb a dubbelprover analyserades Mängd hyahnxmat kvari.gelen R av ursprungligxæügd) 100 100 106 89 b proverna har tagit upp vatten och övergått till lösare gel

Claims (2)

1. 456 346 Patentkrav Gel av tvärbunden karboxylgruppinnehàllande polysackarid för användning som implantat för att förhindra sammanväx- ningar och adhesion mellan kroppsvävnader. Gel enligt krav 1 k ä n n e t e c k n a d av att den består av en karboxylgruppinnehàllande polysackarid vilken tvärbundits med en di- eller polyfunktionell epoxid vid ett pH i intervallet 2 till 5, företrädesvis i intervallet 2,5 till 4,5. Gel enligt krav 2 k ä n n e t e c k n a d av att den vid IR analys uppvisar en topp i absorbtionsspektrat vid 1 745 cm_1. Gel enligt något av kraven 1 till 3 k ä n n e t e c k- n a d av att polysackariden utgöres av hyaluronsyra. Sätt att framställa en gel bestående av en tvärbunden karboxylgruppinnehàllande polysackarid k ä n n e t e c k- n a t av att polysackariden vid ett pH i intervallet

2. - 5, företrädesvis i intervallet 2,5 - 4,5, reageras med en bi- eller polyfunktionell epoxid i närvaro av en syra. Sätt enligt krav 5 k ä n n e t e c k n a t av att syran är vald bland oorganiska och organiska syror eller sura salter av dessa. Sätt enligt krav 6 k ä n n e t e c k n a t av att syran utgöres av en oorganisk syra, t ex saltsyra, svavelsyra, salpetersyra och fosforsyra eller ett surt salt av syran. Sätt enligt krav 6 k ä n n e t e c k n a t av att syran utgöres av (a) lägre alifatiska mono- eller polykarboxylsyror, t ex myrsyra, ättiksyra, propionsyra, -11_ 456 346 mjölksyra, triklotättiksyra och bärnstenssyra, eller (b) aromatiska mono- eller polykarboxylsyror och sulfonsyror, t ex bensoesyra, salicylsyra och paratoluen- sulfonsyra eller sura salter av syrorna enligt (a) och (b) Sätt enligt något av kraven 5 till 8 k ä n n e t e c kn a t av att polysackariden utgöres av hyalurbnsyra.