SE531041C2

SE531041C2 - Räkning av trombocyter

Info

Publication number: SE531041C2
Application number: SE0601563A
Authority: SE
Inventors: Per Erik Stellan Lindberg
Original assignee: Hemocue Ab
Priority date: 2006-07-17
Filing date: 2006-07-17
Publication date: 2008-11-25
Also published as: KR20090015114A; CA2650221C; SE0601563L; AU2007275926B2; US7782447B2; NO20090218L; JP2009541736A; AU2007275926A1; ZA200809200B; CA2650221A1; BRPI0714824A2; EP2041563A4; US20090153836A1; RU2009105243A; CN101490547A; EP2041563A1; JP4758507B2; RU2402017C1; KR101050651B1; MX2009000691A

Description

20 25 30 531 041 2 Det är önskvärt att möjliggöra att analysresultat kan erhållas så fort som möjligt i avsikt att minimera väntetidema för patienter och göra det möjligt för en läkare att ta beslut om behandling och diagnos direkt vid en första undersökning av patienten. Det vore därför föredraget att åstadkomma en analys som kan utföras snabbt av läkaren eller en sköterska utan att man behöver skicka iväg ett prov till ett laboratorium.

För närvarande så erhålls vanligen koncentrationen av trombocyter med hjälp av en automatiserad Coulter-räknare, varvid blcdkomponentema (celler och trombocyter) identifieras med hjälp av elektrisk konduktans, eller impedans. US-patentet 4 240 029 visar en apparat för räkning av blodplättar och röda blodkroppar med hjälp av en typ av transduktor med hål i som äri stånd att skilja mellan blodplättarna och de röda blodkropparna.

En annan automatiserad metod för räkning av blodplättar använder sig av Iaserljusspridning i en flödescytometer. Blodplättama identifieras genom sin relativt lilla storlek såsom anges med hjälp av den uppmätta ljus- spridningen. T ex US-patentet 5 817 519 visar en tillämpning av denna metod.

Andra nu förekommande sätt att uppskatta koncentrationen av blodplättar är genom att använda antikroppar som är specifika för blodplåttar, såsom visas i WO 00/25140, eller genom att man mäter mängden frisatt blodplättsgranulprotein, tex trombospondin eller ß-tromboglubin, i ett prov, såsom visas i US 6 027 904.

Trombocyter räknas även ibland i ett mikroskop i enlighet med metoden enligt Brecher-Cronkite, varvid ett blodprov blandas med en lösning av ammoniumoxalat varefter trombocyterna, vilka är synliga som ljusa prickar med mörk kant, räknas i ett faskontrastmikroskop. Ett annat känt sätt att räkna trombocyter är genom att använda det kommersiellt tillgängliga reagenset Plaxanm i kombination med en råknekoammare, såsom en Bürker-kammare. En räknekammare tillhandahålls med ett rutnät som delar upp kammaren i väldeﬁnierade små volymer. Koncentrationen trombocyter kan sedan bestämmas genom att man räknar antalet trombocyter per ruta i rutnåtet. Koncentrationen trombocyter erhålls manuellt av en person, som måste ha erfarenhet av att utföra analysen för att vara i stånd att utföra en 10 15 20 25 30 531 (MÅ 3 tillförlitlig analys. Dessa analyser är tidskrävande. Dessutom, eftersom de utförs manuellt, så kan analysresultaten variera beroende på vilken person som utför analysen.

Det förekommer fortfarande ett behov av att snabba upp och förenkla nu förekommande förfaranden för bestämning av en trombocytkoncentration på så sätt att analysen kan utföras på plats, nära patienten (”point of care”).

Sammanfattning av uppfinningen Ett syfte med uppﬁnningen är att åstadkomma en enkel analys för bestämning av en volymetrisk räkning av trombocyter. Det är ett ytterligare syfte med uppfinningen att åstadkomma en snabb analys utan behov av komplicerade apparater eller omfattande förbehandling av provet.

Dessa syften uppnås helt eller delvis genom en provtagnings~ anordning, ett förfarande och ett system i enlighet med de oberoende kraven.

Föredragna utföringsfonner framgår av de beroende kraven.

Således tillhandahålls en provtagningsanordning för volymetrisk räkning av trombocyter i ett blodprov. Provtagningsanordningen innefattar en mätkavitet för mottagande av ett blodprov. Mätkaviteten har en förbestämd fix tjocklek. Provtagningsanordningen innefattar vidare ett reagens, vilket är anordnat i en torkad form på en yta som deﬁníerar mätkaviteten, varvid nämnda reagens innefattar ett hemolyseringsmedel för lysering av röda blodkroppar i blodprovet, och, eventuellt, ett infärgningsmedel för selektiv infärgning av trombocyter i blodprovet.

Provtagningsanordningen tillhandahåller möjligheten att direkt erhålla ett prov av helblod in i mätkaviteten och tillhandahålla det för analys. Det finns inget behov av förbehandling av provet. Faktum är att ett blodprov kan sugas in i mätkaviteten direkt från en patients stuckna finger. Att man försett prov- tagningsanordningen med ett reagens möjliggör en reaktion i provtagnings- anordningen som färdigställer provet för en analys. Reaktionen påbörjas när blodprovet kommer i kontakt med reagenset. Det ﬁnns således inget behov för manuell preparation av provet, vilket gör analysen särskilt lämpad att utföras direkt i ett undersökningsrum medan patienten väntar. 10 15 20 25 30 531 04% 4 Eftersom reagenset tillhandahålls i en torkad form så kan prov- tagningsanordningen transporteras och lagras under en lång tid utan att prov- tagningsanordningens användbarhet påverkas. Provtagningsanordningen med reagenset kan således tillverkas och prepareras lång tid innan man utför analysen av blodprovet.

Medan många nu förekommande metoder äri stånd att räkna olika blodkroppar och till och med undergrupper av blodkroppar så är provtag- ningsanordningen enligt uppﬁnningen särskilt anpassad till att utföra volymetrisk räkning av trombocyter. Reagenset innefattar ett hemolyserings- medel vilket lyserar de röda blodkroppama i blodprovet. men inte trombo- cytema. Detta förstör möjligheten att räkna de röda blodkropparna i provet. Å andra sidan så förenklar lyseringen av de röda blodkroppama urskiljningen och identiﬁeringen av trombocytema inuti blodprovet. Även vissa intakta vita blodkroppar kan förekomma, men dessa är få ijämförelse med trombocytema och urskiljs lätt genom storlek och utseende från trombocytema.

Det valfria infärgningsmedlet åstadkommer en märkning av de individuella trombocytema. Detta är ett sätt att möjliggöra att trombocytema kan observeras eller detekteras individuellt. Ett annat sätt att möjliggöra att trombocytema kan observeras eller detekteras individuellt är genom att använda sig av ett angreppssätt med faskontrast, företrädesvis med ett faskontrastmikroskop. Det är även möjligt att använda ett infärgningsmedel i kombination med ett angreppssätt med faskontrast. Trombocytema kan t ex detekteras genom att man skannar mätkavlteten eller att man erhåller en bild av mätkaviteten. Trombocytkoncentrationen kan således erhållas genom att man summerar antalet individuellt detekterade trombocyter i en definierad volym.

Uppﬁnningen tillhandahåller även ett förfarande för volymetrisk räkning av trombocyter i ett blodprov. Förfarandet innefattar att man förvärvar ett blodprov in i en mätkavitet hos en provtagningsanordning, varvid nämnda mätkavitet håller ett reagens innefattande ett hemolyseringsmedel, och eventuellt ett infärgningsmedel för reaktion med provet på så sätt att trombocyterna infärgas, att man bestrålar provet med trombocytema, att man förvärvar en digital bild av en förstoring av det bestrâlade provet i 10 15 20 25 30 531 041 5 mätkaviteten, varvid trombocytema urskiljs genom selektiv infärgning med infärgningsmedlet och/eller genom faskontrast, och att man digitalt analyserar den digitala bilden i avsikt att identiﬁera trombocyter och att bestämma antalet trombocyteri provet.

Uppﬁnningen tillhandahåller vidare ett system för volymetrisk räkning av trombocyter i ett blodprov. Systemet innefattar en provtagningsanordning såsom beskriven ovan. Systemet innefattar vidare en mätapparat innefattande en provtagningsanordningshàllare anordnad att mottaga provtagningsanordningen vilken håller ett blodprov i mätkaviteten, och en ljuskâlla anordnad att bestråla blodprovet. Mätapparaten innefattar vidare ett avbildningssystem, innefattande ett förstoringssystem och ett digital- bildsförvärvningsorgan för förvärvning av en digital bild av en förstoring av det bestrålade provet i mätkaviteten, varvid trombocyter urskiljs i den digitala bilden genom selektiv infärgning med infärgningsmedlet och/eller genom faskontrast. Mätapparaten innefattar även en bildanalysator anordnad att analysera den förvärvade digitala bilden för identiﬁering av trombocyter och bestämning av antalet trombocyter i blodprovet.

Förfarandet och systemet enligt uppfinningen åstadkommer en mycket enkel analys av ett blodprov för bestämning av en trombocytkoncentration.

Analysen erfordrar inte komplicerad mätutrustning eller avancerade steg som utförs av en operatör. Således kan den utföras i direkt anslutning till att en patient undersöks, utan behov av en kvaliﬁcerad tekniker. Mätapparaten begagnar sig av provtagningsanordningens egenskaper för utförande av en analys av ett prov av outspått helblod som förvärvats direkt in i mätkaviteten.

Mätapparaten är anordnad att avbilda en volym av provet för utförande av en volymetrisk räkning av trombocytema ur denna enda bild.

Blodprovet tillåts blandas med reagenset i mätkaviteten. inom några få minuter kommer reaktionen mellan blodprovet och reagenset att ha hemolyserat de röda blodkroppama, och, ifall ett infärgningsmedel tillhandahålls, infärgat trombocytema, på så sätt att provet âr redo att introduceras till den optiska mätningen. Blodprovet kan blandas med reagenset genom tex dispersion eller diffusion av reagenset in i blodprovet 10 15 20 25 30 531 04-1 6 eller genom att man aktivt vibrerar eller rör på provtagningsanordningen så att en omröming skapas i mätkaviteten.

Provtagningsanordningen kan innefatta en stomme som har två plana ytor som deﬁnierar nämnda mätkavitet. De plana ytorna kan vara anordnade på ett förbestämt avstånd från varandra så att de bestämmer en provtjocklek för en optisk mätning. Detta medför att provtagningsanordningen tillhanda- håller en väldeﬁnierad tjocklek för den optiska mätningen, vilken kan användas för att korrekt bestämma antalet trombocyter per volymetrisk enhet av blodprovet. En volym av ett analyserat prov är väldeﬁnierad genom mätkavitetens tjocklek och den area av provet som avbildas. Således kan den väldeﬁnierade volymen användas till att sätta antalet trombocyter i relation till volymen av blodprovet på så sätt att det volymetriska antalet trombocyter bestäms.

Mätkaviteten har företrädesvis en likformig tjocklek på 50-170 mikrometer. En tjocklek på minst 50 mikrometer medför att mätkaviteten inte tvingar blodprovet att smetas ut till ett monolager och medger att en större blodvolym analyseras över en liten tvärsnittsarea. Således kan en tillräckligt stor volym av blodprovet analyseras i avsikt att ge tillförlitliga värden på trombocytkoncentrationen med användning av en relativt liten bild av blodprovet. Tjockleken är mer företrädesvis minst 80 mikrometer, vilket medger att en ännu mindre tvärsnittsarea analyseras eller att en större prowolym analyseras. Vidare så förenklar även en tjocklek på minst 50 mikrometer, och mer föredraget 80 mikrometer, tillverkning av mätkaviteten som har en väldeﬁnierad tjocklek mellan två plana ytor.

För de flesta prov, t ex ett blodprov, som är anordnade i en kavitet som har en tjocklek på cirka 100 mikrometer så kommer trombocytkoncentrationen vara så pass stor att det kommer förekomma awikelser på grund av att trombocytema är anordnade överlappande varandra. Effekten av sådana awikelser kommer dock att hänföra sig till trombocytkoncentrationen och kan således hanteras med hjälp av att man statistiskt korrigerar resultat åtminstone för stora värden på trombocytkoncentrationen. Denna statistiska korrigering kan baseras på kalibreringar av mätapparaturen. Ifall kavitetens tjocklek reduceras ytterligare, till t ex 50 pm, så kommer denna korrigering bli 10 15 20 25 30 53% C541 7 mindre komplex, men detta kan vägas mot de negativa effektema av en liten tjocklek som diskuteras ovan.

Dessutom så är tjockleken hos mätkaviteten tillräckligt liten för att möjliggöra att mätapparaturen kan erhålla en digital bild på så sätt att mätkavitetens hela djup kan analyseras simultant. Eftersom ett förstorings- system används i mätapparaturen så är det inte lätt att erhålla ett stort skärpedjup. Således bör mätkavitetens tjocklek företrädesvis inte överstiga 150 mikrometer för att hela tjockleken skall kunna analyseras simultant i en digital bild. Skärpedjupet kan anordnas att hantera en tjocklek hos mätkaviteten på 170 mikrometer.

Den digitala bilden kan erhållas med ett skärpedjup som åtminstone motsvarar mätkavitetens tjocklek. Såsom det används i föreliggande sammanhang så innebär ”skärpedjup” en längd i en riktning längs den optiska axeln som avbildas med tillräckligt fokus för att medge bildanalys i avsikt att identiﬁera celler som förekommer inom denna längd. Detta ”skärpedjup” kan vara större än ett konventionellt skärpedjup som deﬁnieras av de optiska inställningama.

Eftersom den digitala bilden erhålls med ett ”skärpedjup” som åtminstone motsvarar mätkavitetens tjocklek så kan tillräckligt fokus erhålles över hela provtjockleken så att mätkavitetens hela tjocklek simultant kan analyseras iden digitala bilden av provet. Genom att välja att inte väldigt skarpt fokusera på en speciﬁk del av provet så erhålles ett tillräckligt fokus över hela provtjockleken i avsikt att medge identiﬁering av antalet trombocyter i provet. Detta medför att en trombocyt kan vara något suddig men fortfarande anses vara i fokus hos skärpedjupet.

Reagenset, innefattande ett hemolyseringsmedel, och eventuellt ett infärgningsmedel, kan införas in i provtagningsanordningens mätkavitet löst eller suspenderat i en vätska. Reagenset kan sedan omvandlas till torkad form genom avdunstning vid rumstemperatur och atmosfärstryck, eller med hjälp av vänne eller vakuum, eller genom lyoﬁlisering. ifall reagenset skall avdunstas vid rumstemperatur och atmosfärstryck eller med hjälp av värme så är reagenset företrädesvis löst eller suspenderat i en ﬂyktig vätska, såsom metanol. 10 15 20 25 30 53% 94% 8 Det valfria infärgningsmedlet kan anordnas att selektivt infärga membranet, cytoplasman, granulema, eller vilken som helst annan del av trombocytema, eller en kombination därav. Detta innebär att trombocyterna kan identiﬁeras som färgade prickar och således lätt kan räknas i en digital bild.

Det valfria infärgningsmedlet kan vara vilket som helst ur gruppen metylenblått, eosin-metylenblått, azur-eosin-metylenblått, Plaxanf", hematoxylin, metylengrönt, toluidinblått, gentianaviolett, sudananaloger, gallocyanin, och fuchsinanaloger. Det bör dock inses att infärgningsmedlet inte är begränsat till denna grupp, utan många andra substanser kan beaktas.

Företrädesvis är det eventuella infärgningsmedlet eosin-metylenblått eller azur-eosin-metylenblått.

Hemolyseringsmedlet kan vara ett kvartärt ammoniumsalt, ett saponin, en gallsyra, såsom deoxycholat, ett digitoxin, ett ormgift, en glukopyranosid eller en nonjonaktiv detergent av typ Triton. Det bör dock inses att hemolyseringsmedlet inte är begränsat till denna grupp, utan många andra substanser kan beaktas. Företrädesvis är hemolyseringsmedlet ett saponin.

Provtagningsanordningen kan vidare innefatta ett provinlopp som gör att mätkaviteten står i förbindelse med provtagningsanordningens utsida, varvid nämnda inlopp är anordnat att mottaga ett blodprov. Provinloppet kan vara anordnat att dra upp ett blodprov genom kapillärkraft och mätkaviteten kan vidare dra blod från inloppet in i kaviteten. Som ett resultat härav kan blodprovet lätt erhållas in i mätkaviteten genom att man helt enkelt för provinloppet i kontakt med blod. Sedan drar provinloppets och mätkavitetens kapillärkrafter upp en väldeﬁnierad mängd blod in i mätkaviteten. Alternativt så kan blodprovet sugas eller tryckas in imätkaviteten genom att man anbringar en extem pumpkraft på provtagningsanordningen. I enlighet med ett ytterligare alternativ så kan det vätskeforrniga provet erhållas in i en pipett och sedan införas in i mätkaviteten med hjälp av pipetten.

Provtagningsanordningen kan vara av engångstyp, dvs. den är anordnad att användas endast en gång. Provtagningsanordningen tillhandahåller ett kit för utförande av trombocyträkning, eftersom provtagningsanordningen är i stånd att mottaga ett blodprov och håller 10 15 20 25 30 531 G41 9 samtliga reagens som behövs för att introducera provet till räkning. Detta är särskilt möjliggjort eftersom provtagningsanordningen är anpassad för användning endast en gång och kan formas utan att man behöver tänka på möjligheterna att tvätta provtagnlngsanordningen och sedan äterapplicera ett reagens. Wdare så kan provtagningsanordningen formas i ett plastmaterial och därigenom tillverkas till en låg kostnad. Sålunda kan det fortfarande vara kostnadseffektivt att använda en provtagningsanordning av engångstyp.

Ifall ett infärgningsmedel används så kan provet bestrålas med ljus som har en våglängd som överensstämmer med en absorbanstopp hos infärgningsmedlet. Som en konsekvens därav så detekteras de infärgade trombocytema vilka innehåller en ackumulering av infärgningsmedel genom en låg ljustransmittans. l detta fall så kan bestrålningen utföras med hjälp av en laserkälla.

Laserkällan kan åstadkomma ljus med en väldefinierad våglängd som passar infärgningsmedlets absorbans. Vidare så åstadkommer laserkällan kollimerat ljus, vilket minimerar störningar av avvikande ljus, på så sätt att en punkt med låg ljustransmittans klart kan urskiljas.

Bestrålningen kan altemativt utföras med hjälp av en lysdiod. Denna ljuskålla kan fortfarande åstadkomma tillräckliga bestrâlningsförhållanden för tillräcklig urskíljning av trombocyter från annat stoffi provet.

Alternativt, särskilt ifall faskontrast används, så kan en volframlhalo- gen-lampa användas till att bestråla provet.

Den digitala bilden kan förvärvas med användning av en förstoring av 3 till 200 gånger, mer företrädesvis 4 till 20 gånger. inom dessa förstorings- intervall så förstöras trombocytema tillräckligt för att detekteras, medan skärpedjupet kan anordnas att täcka provets tjocklek. En låg förstoring medför att ett stort skärpedjup kan erhållas. Om en låg förstoring används så kan dock trombocyterna vara svåra att detektera. En lägre förstoring kan användas genom att man höjer antalet bildpunkteri den förvärvade bilden, dvs. genom att förbättra den digitala bildens upplösning.

Ett alternativ är att använda ett faskontrastmikroskop, varvid man utnyttjar fasförskjutningen som härrör från att en del av ljuset som belyser ett blodprov träffar membran och andra strukturer, etc. l detta fall framträder 10 15 20 25 30 531 04% 10 trombocytema i blodprovet som analyseras som ljusa, glimrande prickar med en mörk periferi.

Analyserandet innefattar att man identiﬁerar ytor med hög ljus- absorbans i den digitala bilden. Analyserandet kan vidare innefatta att man identifierar svarta eller mörka prickar i den digitala bilden, eller, när faskontrast används (med tillräckligt stor förstoring), mörka ringar som motsvarar trombocytemas periferl.

Analyserandet kan vidare innefatta att man pâ elektronisk väg förstorar den förvärvade digitala bilden. Medan provet förstöras för förvärvande av en förstorad digital bild av provet så kan den digitala bilden i sig förstöras elektroniskt i avsikt att förenkla urskiljning av objekt som är avbildade mycket nära varandra i den förvärvade digitala bilden.

Kortfattad beskrivning av ritningarna Uppﬁnningen kommer nu att beskrivas i ytterligare detalj med hjälp av exempel och med hänvisning till de bifogade ritningama.

Fig. 1 är en schematisk vy av en provtagningsanordning l enlighet med en utföringsforrn av uppﬁnningen.

Fig. 2 är en schematisk vy av en provtagningsanordning i enlighet med en annan utföringsform av uppﬁnningen.

Fig. 3 är en schematisk vy av en mätapparat enligt en utföringsfonn av uppﬁnningen.

Fig. 4 är ett ﬂödesschema för ett förfarande enligt en utföringsform av uppﬁnningen.

Detaljerad beskrivning av en föredragen utföringsforrn Med hänvisning till ﬁg. 1 kommer nu en provtagningsanordning 10 i enlighet med en utföringsforrn av uppﬁnningen att beskrivas. Provtagnings- anordningen 10 är av engångstyp och kommer att kastas efter att ha använts för analys. Detta medför att provtagningsanordningen 10 inte erfordrar komplicerad hantering. Provtagningsanordningen 10 är utformad i ett plastmaterial och är tillverkad genom formsprutning. Detta gör tillverkningen 10 15 20 25 30 531 041 11 av provtagningsanordningen 10 enkel och billig, varigenom kostnaden för provtagningsanordningen 10 kan hållas nere.

Provtagningsanordningen 10 innefattar en stomme 12, som har en bas 14, vilken kan vidröras av en operatör utan att orsaka någon störning av analysresultat. Basen 14 har även projektioner 16 som passar en hållare i en analysapparat. Projektionerna 16 är anordnade på sådant sätt att prov- tagningsanordningen 10 kommer att positioneras korrekt i analysapparaten.

Provtagningsanordningen 10 innefattar vidare ett provinlopp 18.

Provinloppet 18 deﬁnieras mellan motstående väggar inom provtagnings~ anordningen 10, varvid väggarna är anordnade så pass nära varandra så att en kapillärkraft skapas i provinloppet 18. Provinloppet 18 står i förbindelse med provtagningsanordningens 10 utsida i avsikt att medge att blod dras in i provtagningsanordningen 10. Provtagningsanordningen 10 innefattar vidare en mätkavitet 20 anordnad mellan motstående väggar inuti provtagnings- anordningen 10. Mätkaviteten 20 är anordnad i förbindelse med provinloppet 18. Väggama som deﬁnierar mätkaviteten 20 är anordnade närmare varandra än väggarna hos provinloppet 18, så att en kapillärkraft kan dra blod från provinloppet 18 in i mätkaviteten 20.

Mätkavitetens 20 väggar är anordnade vid ett avstånd från varandra på 50-170 pm, företrädesvis 80-150 um. Avståndet är likformigt över hela mätkaviteten 20. Mätkavitetens 20 tjocklek deﬁnierar volymen blod som undersöks. Eftersom analysresultatet skall jämföras med volymen hos det blodprov som undersöks så måste mätkavitetens 20 tjocklek vara mycket exakt, dvs endast mycket små variationer vad gäller tjockleken är tillåtna inom mätkaviteten 20 och mellan mätkaviteter 20 hos olika provtagningsanord- ningar 10. Tjockleken medger att en relativt stor prowolym analyseras inom en liten area hos kaviteten. Tjockleken medger teoretiskt att trombocyter anordnas ovanpå varandra inom mätkaviteten 20, men detta kan tas hänsyn till med hjälp av en statistisk modell.

En yta hos en vägg hos mätkaviteten 20 är åtminstone delvis belagd med ett reagens 22. Reagenset 22 kan vara frystorkat, värrnetorkat eller vakuumtorkat och anbringat till ytan hos mätkaviteten 20. När ett blodprov införs in i mätkaviteten 20 så kommer blodet att komma i kontakt med det 10 15 20 25 30 53% G4? 12 torkade reagenset 22 och påbörja en reaktion mellan reagenset 22 och blodet.

Reagenset 22 anbringas genom att man inför reagenset 22 in i mätkaviteten 20 med användning av en pipett eller dispenser. Reagenset 22 är löst i vatten eller ett organiskt lösningsmedel när det införs i mätkaviteten 20. Lösningsmedlet tillsammans med reagenset 22 fyller mätkaviteten 20.

Därefter utförs torkning på sådant sätt att lösningsmedlet avdunstas och reagenset 22 anbringas ytomas hos mätkaviteten 20. l enlighet med en altemativ tillverkningsmetod så formas provtagningsanordningen 10 genom att man sammanför två delar med varandra, varvid en del bildar måtkavitetens 20 bottenvägg och den andra delen bildar mätkavitetens 20 toppvägg. Detta medger att reagenset 22 torkas fast på en öppen yta innan de två delarna sätts ihop med varandra.

Reagenset 22 innefattar ett hemolyseringsmedel, och eventuellt ett infärgningsmedel. Hemolyseringsmedlet kan vara ett kvartärt ammoniumsalt, ett saponin, en gallsyra, såsom deoxycholat, ett digitoxin, ett ormgift, en glukopyranosid eller en nonjonaktiv detergent av typ Triton, företrädesvis ett saponin. Infärgningsmedlet, och använt, kan vara metylenblått, eosin- metylenblått, azur-eosin-metylenblått, Plaxanm, hematoxylin, metylengrönt, toluidinblått, gentianaviolett, en sudananalog, gallocyanin, eller en fuchsinanalog. När ett blodprov kommer i kontakt med reagenset 22 så kommer hemolyseringsmedlet verka till att lysera de röda blodkropparna på så sätt att de röda blodkroppama blandas med blodplasman. Vidare så kan infârgningsmedlet, om använt, ackumuleras i trombocytema, tex i deras membran. ifall ett infärgningsmedel används så bör reagenset 22 innehålla tillräcklig mängd infärgningsmedel för att klart infärga samtliga trombocyter.

Således kommer det ofta förekomma ett överskott av infärgningsmedel, vilket kommer att vara blandat med blodplasman. Överskottet av infärgningsmedel ger en homogen, låg bakgrundsnivå av infärgningsmedel i blodplasman. Det ackumulerade infärgningsmedlet i trombocytema kommer att kunna urskiljas över infärgningsmedlets bakgrundsnivå.

Reagenset 22 kan även innefatta andra beståndsdelar, vilka kan vara aktiva, dvs tar del i den kemiska reaktionen med blodprovet, eller icke aktiva, 10 15 20 25 30 531 041 13 dvs inte ta del i den kemiska reaktionen med blodprovet. De aktiva beståndsdelarna kan t ex vara anordnade att katalysera hemolyseringen eller infärgningen. De icke aktiva beståndsdelama kan t ex vara anordnade att förbättra fästningen av reagenset 22 till ytan hos en vägg hos mätkaviteten 20. inom några minuter så kommer blodprovet att ha reagerat med reagenset 22 på sådant sätt att de röda blodkroppama lyserats och infärgningsmedlet, om använt, ackumulerats i trombocytema.

Med hänvisning till ﬁg. 2 så kommer nu en annan utföringsforrn av provtagningsanordningen att beskrivas. Provtagningsanordningen 110 innefattar en kammare 120 som utgör mätkaviteten. Provtagnings- anordningen 110 har ett inlopp 118 in till kammaren 120 för transport av blod in i kammaren 120. Kammaren 120 är kopplad till en pump (ej visad) via en sugslang 121. Pumpen kan pâföra en sugkraft in i kammaren 120 via sugslangen 121 på sådant sätt att prov sugs in i kammaren 120 genom inloppet 118. Provtagningsanordningen 110 kan kopplas bort från pumpen innan mätning utförs. Liksom mätkaviteten 20 hos provtagningsanordningen 10 i enlighet med den första utföringsforrnen så har kammaren 120 en vâlcleﬁnierad tjocklek som definierar tjockleken hos provet som undersöks.

Vidare så är ett reagens 122 anbringat till väggama hos kammaren 120 i avsikt att reagera med provet.

Med hänvisning till Fig. 3 kommer nu en apparat 30 för volymetrisk räkning av trombocyter att beskrivas. Apparaten 30 innefattar en provhållare 32 för mottagande av en provtagningsanordning 10 med ett blodprov.

Provhållaren 32 är anordnad att mottaga provtagningsanordningen 10 på så sätt att mätkaviteten 20 hos provtagningsanordningen 10 positioneras korrekt inuti apparaten 30. Apparaten 30 innefattar en ljuskälla 34 för belysning av blodprovet inuti provtagningsanordningen 10. Ljuskällan 34 kan vara en glödlampa, vilken utstrålar ljus över hela det synliga spektrumet.

Ifall ett infärgningsmedel används så kommer infärgningsmedlet som ackumulerats i trombocyterna att absorbera ljus med särskilda våglängder, på så sätt att trombocytema framtråderi en digital bild av provet. Ifall en färgbild förvårvas så framträder trombocyterna som prickar med särskild färg. Ifall en 10 15 20 25 30 531 üâ-'B 14 svart-vit bild förvärvas så framträder trombocytema som mörka prickar mot en ljusare bakgrund. lfall ett angreppssätt med faskontrast används så behövs ingen infärgning, men det kan vara praktiskt att färga in ändå i avsikt att ytterligare underlätta detektion av trombocytema, och trombocytema framträder som ljusa prickar med mörk omkrets.

Ljuskällan 34 kan alternativt vara en laser eller en lysdiod. Denna kan användas till att förhöja kontrasten i bilden så att trombocyterna lättare kan detekteras. l detta fall så är ljuskällan 34 anordnad att stråla elektromagnetisk strålning med en våglängd som motsvarar en absorptionstopp hos infärgningsmedlet. våglängden bör även väljas på så sätt att absorptionen av blodsubstansema är relativt liten. Dessutom bör provtagningsanordningens väggar vara i huvudsak transparenta för våglängden. T ex, ifall metylenblått används som ett infärgningsmedel, kan ljuskällan 34 anordnas att stråla ljus med en våglängd på 667 nm.

Apparaten 30 innefattar vidare ett avbildningssystem 36, vilket är anordnat på en motstående sida av provhållaren 32 i relation till ljuskällan 32.

Sålunda är avbildningssystemet 36 anordnat att mottaga strålning som transmitterats genom blodprovet. Avbildningssystemet 36 innefattar ett förstoringssystem 38 och ett bildförvärvningsorgan 40. Förstoringssystemet 38 är anordnat att tillhandahålla en förstoring av 3 till 200 gånger, mer företrädesvis 4 till 20 gånger. inom dessa förstoringsintervall så är det möjligt att urskilja trombocyterna. Wdare så kan förstoringssystemets 38 skärpedjup fortfarande vara anordnat så att det åtminstone motsvarar mätkavitetens 20 tjocklek.

Förstoringssystemet 38 innefattar en objektivlins eller ett objektivlinssystem 42, som är anordnat nära provhållaren 32, och en okularlins eller ett okularlinssystem 44, som är anordnat vid ett avstånd från objektivlinsen 42. Objektivlinsen 42 tillhandahåller en första förstoring av provet, vilken ytterligare förstoras av okularlinsen 44. Förstoringssystemet 38 kan innefatta ytterligare linser i avsikt att åstadkomma en lämplig förstoring och avbildning av provet. Förstoringssystemet 38 är anordnat på sådant sätt 10 15 20 25 30 531 04? 15 att provet i mätkaviteten 20, när det är placerat i provhâllaren 32, kommer att fokuseras på ett bildplan hos bildförvärvningsorganet 40.

Ifall ett faskontrastrnikroskop innefattas i mätapparaten i Fig. 3 så inkluderas en kondensor och en kondensoröppning mellan ljuskällan 34 och provhållaren 32, och en fasplatta inkluderas mellan objektivlinsen 42 och bild- förvärvningsorganet 40.

Bildförvärvningsorganet 40 är anordnat att förvärva en digital bild av provet. Bildförvärvningsorganet 40 kan vara vilken som helst typ av digital kamera, såsom en CCD-kamera. Digitalkamerans pixelstorlek sätter en begränsning på avbildningssystemet 36 på sådant sätt att oskärpecirkeln i bildplanet inte får överskrida pixelstorleken inom skärpedjupet. Digital- kameran 40 förvärvar en digital bild av provet i mätkaviteten 20, varvid hela provtjockleken är tillräckligt fokuserad i den digitala bilden för räkning trombocytema. Avbildningssystemet 36 deﬁnierar en area hos mätkaviteten 20, vilken avbildas i den digitala bilden. Den avbildade arean tillsammans med mätkavitetens 20 tjocklek deﬁnierar volymen hos provet som avbildas.

Avbildningssystemet 36 är uppställt för att passa för avbildning av blodprov i provtagningsanordningar 10. Det ﬁnns ingen anledning att andra avbildnings- systemets 36 uppställning. Företrädesvis är avbildningssystemet 36 anordnat med en kåpa så att uppställningen inte förändras av misstag.

Apparaten 30 innefattar vidare en bildanalysator 46. Bildanalysatorn 46 år kopplad till digitalkameran 40 i avsikt att mottaga digitala bilder som förvärvats av den digitala kameran 40. Bildanalysatorn 46 är anordnad att identiﬁera mönster i den digitala bilden som motsvarar en trombocyt i avsikt att beräkna antalet trombocyter som förekommer i den digitala bilden.

Således kan bildanalysatorn 46 vara anordnad att identiﬁera mörka prickar mot en ljusare bakgrund. Bildanalysatom 46 kan vara anordnad att först elektroniskt förstora den digitala bilden innan den analyserar den digitala bilden. Detta medför att bildanalysatorn 46 kan vara i stånd att på ett lättare sätt urskilja trombocyter som är avbildade nära intill varandra, fastän den elektroniska förstoringen av den digitala bilden gör den digitala bilden något suddig. 10 15 20 25 30 531 G41 16 Bildanalysatorn 46 kan beräkna antalet trombocyter per volym blod genom att den dividerar antalet trombocyter som identiﬁeras i den digitala bilden med blodprovets volym, vilken är väldeﬁnierad såsom beskrivits ovan.

Det volymetriska antalet trombocyter kan presenteras på en bildskärm hos apparaten 30.

Bildanalysatorn 46 kan förverkligas som en processenhet, vilken innefattar koder för att utföra bildanalysen.

Med hänvisning till F ig. 4 kommer ett förfarande för volymetrisk räkning av trombocyter att beskrivas. Förfarandet innefattar att man förvärvar ett blodprov i en provtagningsanordning, steg 102. Ett outspätt prov av helblod införs i provtagningsanordningen. Provet kan förvärvas från kapillärt blod eller venblod. Ett prov av kapillärt blod kan dras in i mätkaviteten direkt från en patients stuckna finger. Blodprovet kommer i kontakt med ett reagens i provtagningsanordningen varvid en reaktion påbörjas. De röda blodkropparna lyseras och ett infärgningsmedel ackumuleras i trombocytema. Inom några få minuter från det att blodprovet förvärvats så är provet redo för analys.

Provtagningsanordningen placeras i en analysapparat, steg 104. En analys kan påbörjas genom att man trycker på en knapp hos analysapparaten.

Altemativt så påbörjas analysen automatiskt genom att apparaten detekterar förekomsten av provtagningsanordningen.

Provet bestrålas, steg 106, och en digital bild av en förstoring av provet förvärvas, steg 108. Provet bestrålas med elektromagnetisk strålning med en våglängd som motsvarar en absorptionstopp hos infärgningsmedlet. Detta innebär att den digitala bilden kommer innehålla svarta eller mörka prickar vid trombocyternas positioner.

Den förvärvade digitala bilden överförs till en bíldanalysator, vilken utför bildanalys, steg 110, i avsikt att räkna antalet svarta prickar i den digitala bilden.

Förfarandet och apparaten som presenteras häri kan t ex vara anordnade att räkna cirka 25 000 trombocyter, vilket ger bättre statistisk säkerhet vad gäller de erhållna resultaten. En normal, frisk vuxen har en trombocytkoncentration på cirka 250x10° trombocyter per liter blod. Detta innebär att 25 000 trombocyter påträffas i prov som har en volym på cirka 10 531 G41 17 0,1 pl. T ex, om en yta på 1,0x1,0 mm i mätkaviteten som har en tjocklek på 100 um förstoras så är den avbildade volymen 0,10 pl. En del av den förvärvade bilden kan väljas för analys. Således, kan den förvärvade bilden först grovanalyseras så att inga anomaliteter tillåts i den del av bilden som används för bestämning av trombocytkonoentrationen. Den del av den förvärvade bilden som väljs för analys kan väljas så att den har en lämplig storlek så att en tillräcklig volym av blodprovet analyseras.

Det bör påpekas att de föredragna utföringsforrnerna som beskrivs häri inte på något sätt är begränsande och att altemativa utföringsformer är möjliga inom det skydd som ges av de bifogade kraven.

Claims

10 15 20 25 30 53'i üli-'i 18 PATENTKRAV

1. Provtagningsanordning för volymetrisk räkning av trombocyter i ett blodprov, varvid nämnda provtagningsanordning innefattar: en mätkavitet för mottagande av ett blodprov, varvid nämnda mätkavitet har en förbestämd ﬁx tjocklek, ett reagens, vilket är anordnat i en torkad form på en yta som deﬁnierar mätkaviteten, varvid nämnda reagens innefattar ett hemolyseringsmedel för lysering av röda blodkroppar i blodprovet och varvid nämnda reagens även innefattar ett infärgningsmedel för selektiv infärgning av trombocyter i nämnda blodprov.

2. Provtagningsanordning enligt kravet 1, varvid provtagninge- anordningen innefattar en stomme som har två plana ytor som deﬁnierar nämnda mätkavitet.

3. Provtagningsanordning enligt kravet 2, varvid de plana ytorna är anordnade vid ett förbestämt avstånd från varandra för bestämning av en provtjocklek för en optisk mätning.

4. Provtagningsanordning enligt något av de föregående kraven, varvid mätkaviteten har en iikformig tjocklek på 50-170 pm, företrädesvis 80-150 pm.

5. Provtagningsanordning enligt något av kraven 1-4, varvid infärgningsmedlet är anordnat att selektivt infärga trombocytemas membran.

6. Provtagningsanordning enligt något av kraven 1-5, varvid infärgningsmedlet är vilket som helst ur gruppen metylenblått, eosin- metylenblått, azur-eosin-metylenblått, PlaxanW, hematoxylin, metylengrönt, toluidinblått, gentianaviolett, en sudananalog, gallocyanin, eller en fuchsínanalog.

7. Provtagningsanordning enligt något av de föregående kraven, varvid hemolyseringsmedlet är ett kvartärt ammoniumsalt, ett saponin. en gallsyra, ett digitoxin, ett ormgift, en glukopyranosid eller en nonjonaktiv detergent av typ Triton, företrädesvis ett saponin. 10 15 20 25 30 531 041 F?

8. Provtagningsanordning enligt något av de föregående kraven, vidare innefattande ett provinlopp som sätter mätkaviteten i förbindelse med provtagningsanordningens utsida, varvid nämnda inlopp är anordnat att förvärva ett blodprov.

9. Förfarande för volymetrisk räkning av trombocyter i ett blodprov, varvid nämnda förfarande innefattar: att man förvärvar ett blodprov in i en mätkavitet hos en provtagnings- anordning, varvid nämnda mätkavitet håller ett reagens innefattande ett hemolyseringsmedel och eventuellt ett infärgningsmedel för reaktion med provet på så sätt att trombocytema infärgas, varvid reagenset är anordnat i en torkad form i nämnda mätkavitet, att man bestrålar provet med trombocyterna, att man förvärvar en digital bild av en förstoring av det bestrâlade provet i mätkaviteten, varvid trombocytema urskiljs genom selektiv infärgning med infärgningsmedlet och/eller genom faskontrast, varvid nämnda digitala bild förvärvas med ett skärpedjup som åtminstone motsvarar mätkavitetens tjocklek, och att man digitalt analyserar den digitala bilden i avsikt att identiﬁera trombocyter och att bestämma antalet trombocyter i provet.

10. Förfarande enligt krav 9, varvid blodprovet blandas med reagenset i mätkaviteten.

11. Förfarande enligt krav 9 eller 10, varvid mâtkaviteten har en tjocklek på 50-170 pm, mer företrädesvis 80-150 um.

12. Förfarande enligt krav 11, varvid en volym av ett analyserat prov är väldeﬁnierad av mätkavitetens tjocklek och en yta av provet som avbildas.

13. Förfarande enligt något av kraven 9-12, varvid provet bestrålas med ljus med en våglängd som överensstämmer med en absorptionstopp hos infärgningsmedlet.

14. Förfarande enligt något av kraven 9-13, varvid nämnda bestrålning utförs med hjälp av en laserkälla.

15. Förfarande enligt något av kraven 9-13, varvid nämnda bestrålning utförs med hjälp av en lysdiod. 10 15 20 25 30 531 Üﬁﬂi 20

16. Förfarande enligt något av kraven 9-15, varvid den digitala bilden förvärvas med användning av en förstoring på 3-200x, företrädesvis 4-20><.

17. Förfarande enligt något av kraven 9-16, varvid nämnda analys- erande innefattar att man identiﬁerar ytor med hög ljusabsorption i den digitala bilden.

18. Förfarande enligt krav 17, varvid nämnda analyserande innefattar att man identiﬁerar svarta prickar i den digitala bilden.

19. Förfarande enligt något av kraven 9-18, varvid nämnda analyserande innefattar att man förstorar den förvärvade digitala bilden elektroniskt.

20. System för volymetrisk räkning av trombocyter i ett blodprov, varvid nämnda system innefattar". en provtagningsanordning enligt något av kraven 1-8, och en mätapparat innefattande: en provtagningsanordningshâllare anordnad att mottaga provtagningsanordningen vilken håller ett blodprov i mätkaviteten, en ljuskälla anordnad att bestråla blodprovet, ett avbildningssystem, innefattande ett förstoringssystem och ett digitalbildsförvärvningsorgan för förvärvning av en digital bild av en förstoring av det bestrålade provet i mätkaviteten, varvid trombocyter urskiljs i den digitala bilden genom selektiv infärgning med infärgningsmedlet och/eller genom faskontrast, och en bildanalysator anordnad att analysera den förvärvade digitala bilden för identifiering av trombocyter och bestämning av antalet trombocyter i blodprovet.

21. System enligt krav 20, varvid förstoringssystemet är anordnat med ett skärpedjup på åtminstone provtagningsanordningens mätkavitets tjocklek.

22. System enligt krav 20 eller 21, varvid en volym av ett analyserat prov är vâldeﬁnierat av mätkavitetens tjocklek och en yta av provet som avbildas.

23. System enligt något av kraven 20-22, varvid ljuskällan är anordnad att utstråla ljus med en våglängd som överensstämmer med en absorptions- topp hos infärgningsmedlet. 10 531 C141 2|

24. System enligt något av kraven 20-23, varvid nämnda ljuskälla innefattar en Iaserkälla.

25. System enligt något av kraven 20-23, varvid nämnda ljuskälla innefattar en lysdiod.

26. System enligt något av kraven 20-25, varvid förstoringssystemet har en förstoringsgrad på 3-200><, företrädesvis 4-20x.

27. System enligt något av kraven 20-26, varvid bildanalysatom är anordnad att identiﬁera ytor med hög ljusabsorption i den digitala bilden.

28. System enligt krav 27, varvid bildanalysatom är anordnad att identifiera svarta prickari den digitala bilden.

29. System enligt något av kraven 20-28, varvid biidanalysatorn år anordnad att förstora den förvärvade digitala bilden elektroniskt.