FI121711B - Sieniperäinen seriiniproteaasi ja sen käyttö - Google Patents

Description

SIENIPERÄINEN SERIINIPROTEAASI JA SEN KÄYTTÖ KEKSINNÖN ALA

5 Esillä oleva keksintö koskee sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä, joka on käyttökelpoinen erilaisissa sovelluksissa, erityisesti pyykin- ja astianpesuaineissa Keksintö koskee mainittua entsyymiä koodaavaa mikleiinihappomolekyyliä, rekombinanttia vektoria, isäntäsolua mainitun entsyymin tuottamiseksi, mainittua entsyymiä käsittävää entsyymikoostumusta sekä menetelmää tällaisen koostumuksen 10 valmistamiseksi. Keksintö koskee myös erilaisia käyttöjä mainitulle entsyymille tai mainittua entsyymiä käsittävälle koostumukselle,

TAUSTAA

15 Mikrobiprateaasit kuuluvat merkittävimpiin hydrolyyttisiin entsyymeihin, ja niillä on käyttösovelluksia eri teollisuuden aloilla, kuten esimerkiksi pesuaine-, elintarvike-, nahka- ja lääke-aineteollisuudessa, diagnostiikassa, jätteiden käsittelyssä ja hopean talteenotossa. Mikrobien ekstrasellulaariset proteaasit muodostavat merkittävän osan, yli kolmanneksen, entsyymien maailmanlaajuisesta kokonaismyynnistä (Cherry ja Fidantsef, 20 2003). Noin 90 % kaupallisista proteaaseista on pesuaine-entsyymejä {Gupta ym., 2002).

,«j*. Useimmat kaupalliset proteaasit, pääasiassa neutraalit tai emäksiset proteaasit * « s valmistetaan sukuun Bacillus kuuluvilla organismeilla.

« * « * * * * .·. Subtilishniperheen seriiniproteaasit tai i?oe?/ms~lajeilia valmistettu subti.Usi.init « * » ,♦·«. 25 muodostavat teollisten proteaasien suurimman alaryhmän. Nämä entsyymit ovat * * a # .···. kaupallisesti merkittäviä proteiineja hajottavina aineosina tai pesuaineiden lisäaineina.

a * Tällä hetkellä käytössä olevat kaupalliset pesuainevalmisteet käsittävät luonnollisesti esiintyviä emäksisiä seriinlproteaaseja, jotka ovat peräisin i%mu&s-laieista tai jotka

« X

rekombinanttisia proteaasivalmisteita näistä (Maurer, 2004). Luonnollisten entsyymien * « * 30 muunnelmia, joilla on parantunut katalyyttinen teho ja/tai parantunut stabiilius «««*( * * lämpötilan, hapetusaineiden ja muuttuvien pesuolosuhteiden suhteen, on kehitetty A « ***** kohdennetulla ja/tai satunnaisella mutageneesillä. Esimerkkejä kaupallisista proteaaseista

A A

♦ **. ovat mm. subtilisiini Carlsberg (Alcalase®, Novozymes, DK), subtilisiini 309 « 9 (Savinase®, Novozymes, DK), subtilisiini 147 (Esp^erase®, Novozymes, DK), Purafect® Λ (Genencor Inc., USA), Kannase® (Novozyrnes, DK), Purafect® öx, Properase® (Genencor Inc., USA) ja BLAP S-ja X-sarjat (Henkel, DE).

Useita emäksisiä seriiniproieaaseja (EC 3.4.21} sekä näitä entsyymejä koodaavia geenejä S on myös eristetty eukaryoottisista organismeista, mukaan lukien hiivat ja rihmasieitei. US-patentissa nro 3,652,399 ja julkaisussa EP 519229 (Takeda Chemical industries. Ltd., JP) tuodaan esiin emäksinen proteaasi suvusta Fusarium (savuton tila, tdeomorfi) tai Gibberella (suvullinen tila, anamorfi), erityisesti lajeista Fusarium sp. $-19-5 (ATCC 20192, IFO 8884), F. oxysporum f. sp, Uni (IFO 5880) tai G. smbmeUi (ATCC 10 20193, IFÖ66G8), jotka ovat käyttökelpoisia pesuaineiden ja muiden puhdistusainekoostumusten formuloinnissa. Julkaisuissa WO 88/03946 ja WO 89/04361 (Novo Industri A/S, DK) tuodaan esiin entsymaattmen pesuaineiden lisäaine ja pesuainekoostumus, joka käsittää proteaasinja li paasin, jolloin sieniperäinen proteaasi on peräisin suvusta Fusarium, erityisesti lajeista F. oxysponm tai F. solani. Pesuaineiden 15 lisäaine, joka käsittää proteaasin, jolla on spesifisyyttä ainoastaan yhden ta? kahden spesifisen aminohapon lähellä oleville peptidisiduksiile, on tuotu esiin julkaisussa W089/06270. Julkaisu WO1994025583 (NovoNordisk A/S, DK) tuo esiin aktiivisen trypsiinin kaltaisen proteaasientsyymin, joka on saatavissa Fusamm-lajeista, erityisesti F. oxysponm -kannasta (DSM 2672), sekä tätä koodaavan DNA-sekvenssm. Uuden, :Y: 20 lajista Fusarium sp. BLB (FERM BP-10493) peräisin olevan proteesin 5 : ? aminohapposekvenssi tuodaan esiin julkaisussa WQ 2006101140 (SODX Co Ltd,

Nakamura), Myös sellaisista sienilajeista kuten Tritirachium ja Conidiobolus peräisin J ϊ ϊ olevia emäksisiä proteaaseja on selostettu (niistä ovat esittäneet katsauksen Amvar ja t Saleemuddin, 1998).

* 1 9 * ·>«

* X jUJ

+ 99

Sieniperäisten seriiniproteaasien käyttö erilaisissa sovelluksissa tunnetaan myös useista *J**i patenttihakemuksista, Esimerkiksi seilulaasin ja proteaasin yhdistelmä, erityisesti T1: trypsiinin kaltainen proteaasi kiista Fusarium sp. DSM 2672, pesuaineiden lisäaineena tai koostumuksena on tuotu esiin julkaisussa WO .1992018599 (NovoNordisk A/S).

* e .**·, 30 Tällaiset pesuainekoosiumukset. voivat edelleen käsittää käänteisiä proteaasi- * 9 »«« inhibilftoreita entsyymin tai entsyymien stabiloimiseksi, kuten on. tuotu esiin julkaisuissa

9 A

\ \ Wö 1992ÖÖ3529 ja W'0 1992005239 (NovoNordisk A/S). Menetelmiä likaantumisen tai * « 1 * 9 » 1 tahrojen poistamiseksi tai valkaisemiseksi selluloosakankaista käyttäen 3 entsyymihyöridiä, joka käsittää katalyyttisesti aktiivisen aminohapposekvenssi» kuten proteaasin liitettynä aminohapposekvenssiin, joka käsittää selluloosaa sitovan domeemn» on tuotu essut julkaisussa WO 1997028243 (NovoNordisk A/S). Julkaisussa WO 1997002753 (NovoNordisk A/S) tuodaan esiin menetelmä likaantuneen o prosessiiaiiteiston hellävaraista puhdistusta varten käyttäen lipaasiaja proteaasia, joka on edullisesti suvusta Fvsarium saatava serimiproteaasi.

Koska on tarpeen säästää energiaa, pesulämpötilat ovat laskussa. Lisäksi tämänhetkiset kuluttajien toiveet ja korkeita lämpötiloja sietämättömien synteettisten kuitujen 10 lisääntynyt käyttö ovat muuttaneet pesutottumuksia kohti alhaisten pesultmpötilojen käyttöä. Julkaisuissa EP 0290567 ja EP 0290569 (Novo Nordisk A/S, DK) tuodaan esiin alhaisen lämpötilan proteaaseja mikroorganismeista, jotka ovat sädesleni (Nocardiopm dassomiUei) ja sieni (Paediomyces marquandu).

15 Sosioekonomiset haasteet ja valtiolliset säädökset ovat pakottaneet pesuaineteollisnuden ottamaan huomioon monia ympäristönäkökohtia, mukaan lukien sekä vähemmän haitallisten kemikaalien käytön, joita voidaan käyttää pieninä määrinä ja jotka sen vuoksi saastuttavat ympäristöä vähemmän, että myös tarpeen säästää energiaa. Pesuaine-entsyymit, erityisesti proteaasii, ovat merkittävä aineosa pesuainekoostumuksissa. Tarve t l1i 20 säästää energiaa laskemalla pesulämpöiiloja sekä korkeita lämpötiloja sietämättömien : ί i synteettisten kuitujen lisääntynyt käyttö sekä tämänhetkinen elämäntyyli ovat > 1i1 suunnanneet kuluttajien tottumuksia kohti alhaisia pesuiämpötiloja ja aikaansaaneet j tarpeen uusille entsyymeille, jotka ovat tehokkaita alhaisissa lämpötiloissa.

»x« « « « * ♦ X * ί i 25 Huolimatta siitä tosiseikasta, että on julkaisu! useita patenttijulkaisuja, katsauksia ja artikkeleita, joissa on tuotu esiin seriiniproteaaseja eri mikro-organismeista, esimerkiksi *:**: alhaisen lämpötilan proteaaseja mikro-organismeista, jotka ovat sädesienlä (Mocardiopsis *i**i dassomillei) tai sieniä (Paediomyces marqumdii), esim, julkaisuissa EF 0290567 ja EF 0290569 (Novo Nordisk A/S, DK), on edelleen olemassa suuri tarve vaihtoehtoisille ♦ « ,·**. 30 seriiniproteaaseille, jotka soveltuvat proieiinimateriaalien tehokkaaseen muokkaamiseen, * 1 x«« „1 hajottamiseen ja poistamiseen erityisesti alhaisilla tai kohtalaisilla lämpötila-alueilla ja » 1 *. „ jotka ovat stabiileja ominaisuuksiltaan huomattavasti vaihteievien pesuaineiden ♦ ♦ 1 1 läsnäollessa.

Pesuaineteollisuudessa on otettu huomattavia edistysaskeleita uusien tuotteiden mukauttamisessa kuluttajien tarpeisiin ja tottumuksiin, uusien tekstiilituotteiden ominaisuuksiin sek! uusille pesukoneille. On selvää, että kehitettäessä uusia pesuaineita, erityisesti pyykinpesu- ja astianpesuainekoosramuksia, näiden on kyettävä täyttämään S suuri määrä vaihtelevia ja nopeasti muuttuvia tarpeita. Kaikkien pesuaineteoliisnuden ja valtiollisien säädösten asettamien vaihielevien edellytysten täyttämiseksi uusien pesuainekoostumuksiin tarkoitettujen seriiniproteaasiaineosien ei tule ainoastaan täyttää niiden tehtävää laajalla pH- ja lämpötila-alueella sekä pysyä stabiileina vaihieievissa olosuhteissa, mukaan lukien mekaaniset ja kemialliset toimenpiteet käyttäen useita 10 erilaisia pesuaineita, vaan on myös toivottavaa, että seriiniproteaasia voidaan tuottaa suuria määriä, joiden jälkikäsittely on kustannustehokasta, koska ne voidaan helposti erottaa fermentointiliemestä ja sienirihmastoista.

KEKSINNÖN YHTEENVETO

15

Esillä olevan keksinnön tavoitteena on aikaansaada sieniperäinen seriiniproteaasi, jolla on laaja substraattispesifisyys, joka on aktiivinen laajoilla pH-alueilla ja jolla on laaja lämpötiiaopiimL eli joka toimii sekä alhaisissa että kohtalaisissa lämpötiloissa. Pyykin-ja astianpesuaineisiin tarkoitettujen serliniproteaasien on oltava stabiileja myös i t ; 20 pesuaineiden läsnäollessa tai oltava yhteensopivia pesuaineiden kanssa. Erityisesti esillä t ; t olevan keksinnön tavoitteena on aikaansaada seriiniproteaasi, joka kykenee poistamaan *i‘ proteimimaieriaäiia, mukaan lukien pestävässä pyykissä tai tiskeissä olevia tahroja, t ; t tämänhetkisiä kaupallisia entsvvrm valmisteita alhaisemmissa lämpötiloissa, säästäen näin ϊ ί*ί energiaa. Sieniperäistä seriiniproteaasia voidaan valmistaa runsastuottoisissa sieni- t l 25 isännissä ja sen jälkikäsittely, esim. erottaminen iermentaatioiiemestä ja sienirihmastoista, on helppo suorittaa.

♦ * ";*·{ Esillä oleva keksintö koskee sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä, jolla on « serimiproieaasiaktiivisuutta ja joka käsittää sekvenssissä nro 18 määritellyn kypsän ,···, 30 Fa RF7182*entsyvmin aminohapposekvenssin tai aminohapposekvenssin, joka on * ♦ ' «*« ainakin 81-prosenttisesti identtinen sekvenssissä 18 määritellyn kypsän Fa RF7182- » « *, . entsyymin aminohapposekvenssin kanssa.

«· * « « «« * « s

Keksinnön entsyymi on saatavissa lajista Fusarhm acuminatum. edullisemmin talletetusta kassasta CBS 124084.

Entsyymin mokkyylimassa on 25-35 kDa. Entsyymin optimiiämpötila on alueella 30-5 70 °C pH:ssa 9. Mainitun entsyymin pH-optimi on alueella, joka on vähintään pH 6-12 lämpötilassa 50 1€. Optimiiämpötila ja pH-optimi määritettiin käyttäen 1$ minuutin reaktioaika® ja kaseiinia substraattina. Keksinnön seriiniproieaasi kykenee hajottamaan tai poistamaan proteiinitahroja pesuaineen läsnäollessa 10-60 °C;n lämpötilassa.

10 Keksinnön sieniperäistä smmiproteaasieutsyyrniä koodaa eristetty polynukleotidisekvenssi, joka hyhtidisoitun ankarissa olosuhteissa poiymikleotidisekvenssiin, joka sisältyy plastnidiin pAIK253Ö. joka käsittää nukleotidisekvenssin. nro 12 ja joka on talletettu E. coHsss, RF78Ö3 talietusnimterolla DSM 22208, 15

Mainittua entsyymiä koodaa eristetty polynuldeotidisekvenssi. joka koodaa polvpeptidiä, joka käsittää sekvenssissä nro 18 määritellyn kypsän Fa_RF? 128-entsyymin aminohapposekvenssin tai aminohapposekvenssin, joka on ainakin 81-prosenttisesti identtinen .sekvenssissä 18 määritellyn kypsät Fa_RF7128-entsyymin ϊΤί 20 aminohapposekvenssin kanssa. Edullisesti mainittua entsyymiä koodaa eristetty « nnkldmihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssin nro 17 nukleotidisekvenssin.

* »4» «1»« j Keksinnön täysniikää sieniperäistä seriimproteaasientsyymiä koodaa *** 1 :1:1? polynukleotidisekvenssi. joka sisältyy plasmidiin pALK2531. talletettu Escherichia ϊ''' 1 ϊ 25 colis sa RF7879 talleiusnumerolla DSM 22209.

»«« *:·«; Sieniperäinen seriiniproteaasi entsyymi valmistetaan rekombinauttisesta *ϊ**ί ekspressiovekiorista, joka käsittää nukleiimhappomofekyylm, joka koodaa keksinnön sieniperäistä seriiniproteaasia. toiminnallisesti liitettynä sääielysekvensseikin, jotka v « ,·**. 30 kykenevät ohjaamaan seriinipmteaasientsyynviä koodaavan geenin ilmentymistä Φ v * 1 1 ./ soveltuvassa isännässä. Soveltuviin isäntiin sisältyvät heteroiogiset Isännät, edullisesti \ ** mikrobi-isännät suvuista Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicok, 4 « » 1 Chrysosporimt, Neurospora, Rhizopus, Penicilliim ja Mortirieila.

6

Edullisesti mainittua entsyymiä taotetaan suvuissa Trichoderma tai Aspergillus, edullisimmin lajissa 7. reesei.

Esillä oleva keksintö koskee myös eristettyä nukldinihappomolekyyliäj joka koodaa 5 sieniperäistä proteaasiaitsyymiä, joka on valittu ryhmästä. jonka muodostavat: (a) nnkleimihappomoiekyyli, joka koodaa polypepödia, jolla on seriimprotea&siaktiivisuutia ja joka käsittää sekvenssissä nro 18 esitetyn aminohapposekvenssin; (b) nukleiimfaappomolekyyii, joka koodaa polypeptidia» jolla on 10 seriimproteaasiakäivisuutta ja joka on ainakin 81‘prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 18 aminohapposekvenssin kanssa; (e) nuklesinihappomoiekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 13 kuvatun nukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin; (d) imkleiinihappomolekyyli, joka käsittää DSM 22208:n tai DSM 222ö9:n 15 sisältämän polyaukleotidisekveassin koodaavan sekvenssin; (e) «ukidimhappomokkyyli, jonka koodaava sekvenssi eroaa minkä takansa kohdista (c)—<d) mMeiinihappomolekyylis koodaajasta sekvenssistä geneettiset koodin degeneraation vuoksi; ja (f) nukidiuihappomolekyyli, joka hyferidisoiiuu ankarissa olosuhteissa : Γ: 20 DSM22208:n sisältämään nukleiinikappomcdekyyiiin ja joka koodaa ♦ « * ί ϊ : polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasiaktiivisauita ja aminohapposekvenssi, joka *;· on ainakin 81-prosenttisesti identtinen sekvenssissä nro 18 esitetyn » x *y * v * * i i ϊ aminohaooosekvenssin kanssa, *** * *x * * s « « 4 * * « * ; 25 Keksintö koskee edelleen rekombinanttista ekspressiovektoria, joka käsittää keksinnön nukleotidisekvenssin, joka on toiminnallisesti liitetty·' sääteiysekveassdhin, jotka *i**i kykenevät ohjaamaan mainittua seriiniproteaasia koodaavan geenin ilmentymistä "**.* soveltuvassa isännässä. Soveltuviin isäntiin sisältyvät heterologiset isännät, edullisesti « mikix>hi*isännät suvuista Trichoderma. Aspergillus, Fusmium, Humicoia, * 9 ,·**. 50 Ckrvsosporium, N&urospom. Rhizomts, PemeUHum ia Mortirieila. Edullisesti mainittua * ♦ * * Λ * » Λ * ,/ entsyymiä tuotetaan suvuissa Trichoderma tai Aspergillus, edullisimmin lajissa 7. ressei.

9 * * 4» * 9 « * * Φ * «« * *

Keksintö koskee myös isäntäsolua, joka käsittää edellä kuvatun kaltaisen ekspressiovektorin, Edullisesti isäntäsolu on mikrobi-isäntä, kuten rihmasieni. Edulliset isännät kuuluvat sukuihin Trichoderma, Aspergillus, Fusaritm, Humieola,

Chrysospormm, Neurospora, Rhizopus, Penieiilium ja Mortiriella. Edullisemmin Isäntä 5 on Trichoderma tai Aspergillus, edullisimmin rihmasieni I reesei.

Esillä oleva keksintö koskee valmistusmenetelmää polypeptidille, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet keksinnön isäntäsolun viljelemiseksi ja polypeptidin talteen ottamiseksi. Keksintöön sisältyy myös 10 keksinnön nukleiinihapposekvcnssin koodaama polypeptldi, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja joka on saatavissa edellä kuvatulia menetelmällä.

Keksintö koskee menetelmää entsyymivalmisteen aikaansaamiseksi, menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa viljellään keksinnön isäntäsolua ja joko otetaan polypeptidi 15 talteen soluista tai erotetaan solut elatusaineesta ja kerätään supematantti. Esillä olevaan keksintöön sisältyy myös entsyymivalmiste, joka on saatavissa edellä kuvatulla menetelmällä.

Keksintö koskee entsyymivaimistetta, joka käsittää keksinnön seriimproteaasientsyymin.

«««

* 1 e IA

* 2 1 « :j l Keksinnön entsyymivalmiste voi edelleen sisältää muita entsyymejä, jotka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät proteaasi, amylaasi, seiluiaasi, Iinaasi, ksylanaasi, mannanaasi, ♦ « «J j kutinaasi, pektinaasi tai oksidaasi mediaattorin kanssa tai ilman, sekä myös soveltuvia * « « Y t lisäaineita, jotka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät stabilointiaineet, puskuroimiameet.

ϊΜ>! 25 pmta-a&tnvsset aineet, valkaisuaineet, mediaattorit, korroosionestoaineet, vedenpehmentäjät, uudelleen tarttumista estävät aineet, optiset kirkasteet, syövyttävät

A

"’3 aineet, hankausaineet, väriaineet, pigmentit ja säilöntäaineet, jne.

♦ ♦ ♦ ♦ 1 .1 * « * «·1·1 Tuottajaisäanän kätketty elatusaine voidaan käyttää sellaisenaan tai isäntäsolut voidaan .2% 30 poistaa ja/tai se voidaan konsentroida, suodattaa tai fraktioida. Se voidaan myös kuivata.

„1 Keksinnön entsyymivalmiste voi olla nesteen, jauheen tai rakeiden muodossa, e 1 « «» « « » « » 2 ♦ »« 3 K 1 8

Keksintöön sisältyy myös keksinnön seniniproteaasientsyymin tai entsyymivalmisteen käyttö pesuaineissa, kohujen käsittelyssä, villan, käsittelyssä, hiusten käsittelyssä, nahan käsittelyssä, elintarvikkeiden tai rehun käsittelyssä tai missä tahansa sovelluksissa, joihin liittyy proteiinimateriaalin muuntelu, hajotus tai poistaminen. Erityisesti entsyymi tai 5 enisyvmivaimiste on käyttökelpoinen pesuaineiden lisäaineena nestemäisissä ja jauhemaisissa pesuaineissa.

PIIRUSTUSTEN LYHYT KUVAUS

10 Kuvio 1 esittää Fusarium acuminatum RF7I82 Fa pHS8A -geenin nukleotidisekvenssin ja siitä johdetun aminohapposekvenssin. Oletettu signaalipeptidi, joka analysoitiin käyttäen ohjelmaa Signal? V3.Ö, on ilmoitettu pienin kirjaimin ja alleviivattuna, Prosekvenssi ja prosekvenssin johdetut aminohapot on ilmoitettu sienillä kinaimilla. Kypsät nukleotidi- ja peptidisefcvenssit on ilmoiteltu isoilla kirjaimilla (N-pään sekvenssi 15 määritettynä puhdistetusta villityypin Fa__RF71S2~proteimista). Oletetun intronisekvenssin sijainti on ilmoitettu pienillä kirjaimilla, kursivoituna ja merkittynä nukleotidisekvenssin alla olevalla katkoviivalla, Lopetuskodoni on esitetty asteriskilla sekvenssin alla. N-pään sekvenssi ja peptidisekvenssit, jotka on saatu villityypin Fa_RF7! 82-proteiinista, on korostettu harmaalla taustalla.

* * * : ; ; 20 * ί ί % Kuvio IA esittää Fa prtSA -geenin, nukleotidisekvenssin (nukleotidit 1.-900), χ<*Γ sekvenssialueen. joka koodaa Fa_RF7182-proteiinin aminohappoja Metl--Yal278.

* « » « # « » « x i t l Kuvio IB esittää Fa prtSA -geenin nukleotidisekvenssin (nukleotidit 901-1.261), ! 1 25 sekvenssiähän, joka koodaa Fa_RF7l 82-proteii.nin aminohappoja Leu279-Aia4!2.

""’i Kuvio 2 esittää kaavamaisesti kasetin, jota käytetään Fa prtSSA -geenin, ilmentämiseksi « •5*** Trichoderma reeseissä.

♦ « ««««« * » ,**♦, 30 Kuvin 3 esittää osittain puhdistetun rekombinanttisen Fa RF7182-proteiinin * * * — „* analysoituna 12-prosenttisessa SDS PAGE -geelissä. Kaista 1. Näyte osittain

» X * «X

*. , puhdistetusta Fa RF7182:sta, 2, MW-markkeri (Bench Mark Protein Ladder, Invitrogen) x « * X «« « » 9

Kuvio 4A kuvaa rekombinanttisen proteiinin Fa_RF7182 lämpötilaprofiilin määritettyä pH-arvossa 9 käyttäen 1S min reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina. Datapisteet ovat keskiarvoja kolmesta erillisestä mittauksesta.

5 Kuvio 4B kuvaa pH:n vaikutusta rekornbinanttisen Fa_RF7I82-proteiinin aktiivisuuteen. Käytetty puskuri oli 40 raM Britton-Robinson-puskuri pHrssa 6-12. ja reaktioiämpötila oli 50 T. Reaktioaika oli 15 minuuttia, kaseiinia käytettiin substraattina. Datapisteet ovat. keskiarvoja kolmesta erillisestä mittauksesta.

10 Kuvio 5 kuvaa rekombinanttisen Fa__RF7! 82-proteiinin tehokkuutta veri/maito/muste-tahroihin (Art. 116, EMPA) 30 °C:ssa, pH 9, 60 min, Kaupallisia valmisteita Savinase® Ultra 161. (Novozvmes A/S. DK) ja Purafect# 4Ö00L (Genencor fee., USA) käytettiin vertailua varten. AL1 (deltat1) ::: entsyymikäsiteliyn kankaan vaaleusarvo L1 pelkällä puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin nollanäyte) vaaleusarvo L1.

15

Kuvio 6 esittää rekombinauttisen FaJRF?182-proteimin tehokkuutta veri/maito/muste-tahralle (Ari. 116, EMPA) 50 °C:ssa, pH 9, 60 min. Kaupallisia valmisteita Savinase® Ultra 16L ja Purafect® 4ÖÖÖL käytettiin vertailua varten. AL1 (deltaL1) = entsyymikäsiteliyn kankaan vaaleusarvo L1 - pelkällä puskurilla käsitellyn kankaan iVt 20 (entsyymin nollanäyte) vaaleusarvo ΙΛ ««4 X 1 1 * « » e j'V Kuvio 7 esittää rekombinanttisen Fa RF71S2~proteiinin tehokkuutta veri/maito/muste- |#|15 tahroihin (Art. 117, EMPA) pesuainejauheen läsnä ollessa (Art. 601, EMPA) 40 1C:ssa, ij Ϊ ja pH:ssa 10. Kaupallista valmistetta Purafect® 400ÖL käytettiin vertailua varten. AL1 ««4

i l 25 (delta L1> = entsyymikäsiteliyn kankaan vaaleusarvo L1 - pelkällä puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin nollanäyte) vaaleusarvo LA

4 * 1 *;**: Kuvio 8 esittää rekombinauttisen Fa_RF7182-proteiinin tehokkuutta, kun käytettiin « veri/maito/muste-tahraa (Art. 117, EMPA) ja nestemäistä pesuainetta Ariel Sensitive ,**·. 30 (ilman entsyymejä) 40 ^Ctssa, pH-arvon ollessa noin 7,9, 60 min. Kaupallista valmistetta «»«

Purafect® 4000L käytettiin vertailua varten. AL1 (delta!.,1) - entsyyrnikäsltellyn kankaan ♦ s

* 1 X

\ , vaaleusarvo L1 - pelkällä puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin nollanäyte) X Ψ » 8 « « 1 vaaleusarvo L1 .

10

Kuvio 9 esittää rekomblnanttisen Fa_RF7l82-proieiinin tehokkuutta veri/maho/ntuste-tahroihin (Art. 117. EMPA) erilaisilla värillisille kankaille tarkoitetun nestemäisen pesuainepohjan pitoisuuksilla 30 °C:ssa. Kaupallisia valmisteita Puraiset® 40ÖÖL ja Savinase® Ultra 16L käytettiin vertailua varten. AL* (delta!..*} — entsyymikäsitellyn 5 kankaan vaaieusarvo L* - pelkällä puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin noilanäyte} vaaleusarvo L*.

Kuvio 9A esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudeila 5 g/i ja pH:ssa 7,5.

lö Kuvio 9B esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudeila S g/1 (entsyymin annostus laskettu proteiinin määränä).

Kuvio 9C esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudeila 3.3 gd ja pH:ssa 7,4.

15 Kuvio 90 esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudeila 1 g/! ja pi rissä 7,3.

Kuvio 10 esittää rekombinanttisen Fa_RF7l82-proteiinin tehokkuutta veri/maiio/muste-tahroihin (Art. 117, EMPA) erilaisilla .Arid Sensitiven (ilman entsyymejä) pitoisuuksilla 30 °C:ssa. Kaupallisia valmisteita Pu.ra.fect® 4Ö0ÖL ja Saylnase® Ultra löL käytettiin * * * ij : 20 vertailua varten. AL* (deliaL*) =:: entsyymikäsitellyn kankaan vaaleusarvo L* - pelkällä ij J puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin noilanäyte) vaaieusarvo ΙΛ x *** « * jj : Kuvio 10A esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudeila 5 g/lja pirissä S.

««» * * ♦ * * ♦ * tx» * ♦ 25 Kuvio MB esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudeila 5 g/! (entsyymin annostus laskettu proteiinin määränä).

* ♦ k * * ♦ *ί**ί Kuvio 18C esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudeila 3,3 g/1 ja pHtssa 7.9, x x X « «·**„ 30 Kuvio löf> esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudeila 1 g/1 ja pirissä 7,6.

*** x X « » «« \ , Kuvio 1.1. esittää rekombinanttisen Fa_RF?l S2~proteiintR tehokkuutta erilaisiin tahroihin

* * K

* * a

Launder Ometer -kokeissa nestemäisellä, värillisille kankaille tarkoitetulla 11 pesuainepohjalla 30 °€:ssa. Kaupallisia valmisteita Savinase® Ultra 16L ja Puiafect® 4000L käytettiin vertailua varten. AL1 CdeltaL1} - entsyymikäsitellyn kankaan vaaleusarvo L1 - pelkällä puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin nolianäyte) vaakusarvo L1.

5

Kuvio 11A esittää tehokkuutta, kun kyseessä on veri/maito/muste/PE-puuviila (Ari. 117, EMPA).

Kuvio ΠΒ esittää tehokkuutta» kun kyseessä on veri/maito/muste/Puuvilla (Art. 116, 10 EMPA).

Kuvio 11C esittää tehokkuutta, kun kyseessä on ruoho (Ari. 164, EMPA).

Kuvio 11» esittää tehokkuutta, kun kyseessä on kaakao (Art. 112, EMPA).

15

Kuvio 12 esittää Fa_RF7182-entsyymivalmisteen kokonaistahranpoistotehokkuutta (deita%SR) kahdeksalle eri proteaasiherkälle tahralle (taulukko 5) täysimittaisissa pesukokeissa. Kaupallisia valmisteita Savinase# Ultra 16L ja Puraiset® 400ÖL käytettiin vertailua varten.

««« X « » « » « ♦ * > 1 ϊχί i Kuvio 12A esittää kokonaistahranpoistotehokkuutta, kun proteaasivalmisteita ♦ *ϊ1 annosteltiin aktiivisuuden mukaan.

««««

♦ X

* 1 e » « « ♦ 1 X « *** V 1 Kuvio 12B esittää kokonaistahranpoistotehokkuutta, kun proteaasivalmisteita %„1 25 annosteltiin proteiinin määrän mukaan.

* ***** Kuvio 13 esittää tahranpoistovaikutusta välillisille kankaille tarkoitetun nestemäisen * *·"« pesuainepohjan kanssa täyden mittakaavan kokeessa 30 °C:ssa.

x * »««« * 1 ·“1. 30 Kuvio 13A esittää tahranpoistovaikutusta, kun kyseessä on mdtokaakao/pigmentti/1 «.1 Puuvilla (C-Ö3-Ö3Ö/CFT).

* « Φ »» Φ ♦ ♦ 1 1 * «« x » 12

Kuvio 13B esittää tahranpoistovaikutusta, kun kyseessä on veri/maito/muste/Puuvilia (C- 05-Ö59b/CFT).

Kuvio 13C esittää tahranpoistovaikutusta, kun kyseessä on veri/maito/muste/TE-puuvilla S (C*Ö5“014/€FT).

Kuvio 131) esittää tahranpoistovaikutusta» kun kyseessä on maapähkinäöljy/maho/-PuuviHa (C-Ö5-Ö14/CFT).

10 Kuvio 13E esittää tahranpoistovaikutusta, kun kyseessä on munankeltuainen/pigmentti/-Puuvilia (CS-38-010/CFT).

SEKVENSSEISTÄ 15 Sekvenssi nro 1 Aminoteraunaaiisen. peptidin #3811 sekvenssi Fusarium acuminatum R.F7182 -proteaasista.

Sekvenssi nro 2 Trvptisen peptidin 1609,880 sekvenssi Fmarium acuminatum RF7182 -proteaasista, * · * 70 x « » v « ♦*;*; Sekvenssi nro 3 Trvptisen peptidin 1793.957 sekvenssi Fusarium acuminatum RF7182 - e *1* proteaasista.

«>*« » s

« » V

« * « ««* o **;*; Sekvenssi nro 4 Tryptisen peptidin 743,494 sekvenssi Fusarium acuminatum RF7182 - ♦ ***** 25 proteaasista.

*«( »;♦*! Sekvenssi nro 5 Tryptisen peptidin 2103,832 (aloitus 2045,06} sekvenssi Fusarium *ϊ**| acuminatum RF7i82 -proteaasista, x « X »«Φ* * e ,«*·, 30 Sekvenssi nro 6 Tryptisen peptidin 2103,832 (aloitus 1406,57) sekvenssi Fusarium * * 99* * acuminatum RF7182 -proteaasista.

* e « x e e * * * * * * *9 9 * 13

Sekvenssi nro 7 Tryptisen peptidin 3662,692 sekvenssi Fusarium acuminatum RF71S2 * proteaasssta.

Sekvenssi nro § Sekvenssi oiigonukieotidialukkeeiie PR0123. joka on peräisin 5 sekvenssin nro 3 peptidistä.

Sekvenssi nro 9 Sekvenssi oiigonukieotidiaiukkeeiie PRO 122. joka on peräisin sekvenssin nro 6 peptidistä.

10 Sekvenssi nro 1.0 Seriiniproteaasin konsensus-oligonukleotidialukkeen PRO60 sekvenssi.

Sekvenssi nro II Seriiniproteaasin konsensus-oligonukieoiidialukkeen PR061 sekvenssi, 15

Sekvenssi nro 12 Sekvenssi PCR-fragrnentille, joka oli saatu käyttäen alukkeita PR0123 (sekvenssi nro 8) ja PR061 (sekvenssi nro li) sekä Fmarium acuminatum RF7182:n genomista DNA:ta tempiaattina.

20 Sekvenssi nro 13 Täyspitkän Fusarium acumimtum RF7182 -proteaasigeenin :*«** {FaprtSSA) nukleotidisekvenssi.

« « « * *

«4*X

• Sekvenssi nro 14 Täyspitkän Fusarium acuminatum RF7I82 -proteaasin (Fa_RF?182) * « « 6 johdettu aminohapposekvenssi, mukaan lukien aminohapot Met1~Ala415.

* * « * \ ♦ * « « «

Sekvenssi nro 15 Nukleotidisekvenssi, joka koodaa Fusarium acumimtum RF7182 - ·*··· proteaasin proentsyym imuodon aminohapposekvenssiä, * * * ,J,· Sekvenssi nro 16 Fmarium acuminatum RF7182 -proteaasin proentsyymimuodon * * .·»», 30 aminohapposekvenssi, mukaan lukien sekvenssissä nro 14 määritellyn täyspitkän * * t;' Fa RF7!82:n aminohapot Ala21 -Ala 415.

* « ♦ « « « x e ♦ se ♦ XX ♦ * 14

Sekvenssi »ro Π Nukieotidisekvenssi, joka koodaa Fmarium aciminatim RF7s82 -proteaasin kypsän muodon aminohapposekvenssiä.

Sekveassi »ro 18 Fusctrium acuminatum RF7182 -proteaasin kypsän muodon 5 aminohapposekvenssi, mukaan lukien sekvenssissä nro 14 määritellyn täyspitkän

Fa__RF7182:n aminohapot Aial27---Ala415.

TALLETUKSET

lö Fmarium acuminatum RF7182 talletettiin 28.1,2009 Centraalbareau Voor Scbimmelcultures -kokoelmaan, Uppsalalaan 8, 35ÖS AD, Utrecht, Alankomaat, ja sille annettiin taiietusnumero CBS 124084, E. coli -kanta RF78Ö3, sisältäen plasmidin pALK253Ö, talletettiin 21,1.2009 kokoelmaan 15 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeiikuituren GmbH (DSMZ),

Inhoflfenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Saksa, ja sille annettiin taiietusnumero DSM 22208.

E. coli -kanta RF7879. sisältäen plasmidin pALK.2531, talletettiin 21,1.2009 kokoelmaan «*♦*; 20 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeiikuituren GmbH (DSMZ), 9 ***** Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Saksa, ja sille annettiin taiietusnumero * ... DSM 22209.

*9*9 * 9 * * « * X 9 *9* 9

:T: YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS

s 9 9* ~ c

* 9 / S

9 * "·>·' »»»

Esillä oleva keksintö koskee sieniperäistä seriimproteaasia, jolla on laaja ·;1: substraattispesifisyys, joka on stabiili laajoilla pH-aiueiiia ja jolla on laaja lämpötilaoptimi. eli jolla on hyvä suorituskyky sekä alhaisissa että kohtalaisissa ,t^j lämpötiloissa. Entsyymi on ihanteellinen pesuainesoveliuksiin, ja se kestää hapettavia * * «··. 30 aineita ja kelaatiumuodostajia ja on tehokas alhaisilla entsyymitasoiila * x 999 pesuaineiiuofcsissa. Erityisesti seriiniproteaasl on aktiivinen lämpötiloissa, jotka ovat x » ♦ " niinkin alhaisia kuin 10 °C. edullisen alueen ollessa 10-70 CC Näin ollen esillä oleva * * 9X9 *· keksintö aikaansaa vaihtoehtoisen seriiniproteaasin käytettäväksi pesuaine- ia muissa

IS

sovelluksissa, Sieniperäistä seriiniproteaasia voidaan valmistaa runsastuottoisissa sieni» isännissä ja sen jälkikäsittely, esim. erottaminen fermentaatioliemestä ja sienirihmastoista, on helppo suorittaa, S Tenneillä “seriiniproteaasl” tai "seriissienclopepfidaasr tai ‘'seriittiendnprotesnaasi" tarkoitetaan tämän keksinnön yhteydessä entsyymiä, joka saa luokituksen EC 3.4.21 kansainvälisen biokemian ja molekyylibiologiat} liiton lUBMBrn {International Union of Biochemistry and Molecular Biology ) nimistön mukaan. Seriimproteaaseja esiintyy sekä yksisoluisissa että monisoluisissa organismeissa. Niiden rakenteellisten 10 samankaltaisuuksien perusteella seriitviproicaaslt on ryhmitelty ainakin kuuteen klaaniin (SA, SB, SC, SE, SF ja S G; S merkitsee seriiniproteaasia), jotka on edelleen jaetaan perheisiin, joilla on samankaltaisia aminohapposekvenssejä sekä kolmiulotteinen rakenne (ks. esimerkiksi seriiniproteaasikotisiva http://www.biochem.wustl.edu/-protease/. Biokemian ja molekyylibiofysiikan laitos. Washingtonin lääketieteellinen yliopisto. St. 15 Louis, MO, USA), Näille proteiineja hydrolysoiville tai hajottaville entsyymeille on tunnusomaista nukleofiilisen seriiniryhmän läsnäolo niiden aktiivisessa kohdassa, ja klaanin SA ja klaanin SB proteeseille on myös tunnusomaista se, että niissä on välttämättömiä aspartaatti- ja histidiinijäännöksiä, jotka serimin kanssa muodostavat katalyyttisen triadin, :Y: 20 j***j Pääasiallisiin klaaneihin sisältyvät ‘'kyinotrypsiinm kaltaiset*', mukaan lukien * ··* kymotrypsiini, trypsiim ja elastaasi (klaani SA) ja “subtilisiiaiea kaltaiset" (klaani SB), l seriiniproteaasit. Entsyymien vaikutus kohdistuu eri alueille poiypeptidiketjua * ** x katkaisukohtaa ympäröivien aminohappojäännösten sivuketjujen perusteella. Esillä ϊ***ϊ 25 olevan keksinnön seriiniproteaasi kuuluu klaaniin SB.

·:**: Karakterisoidut "suhtilisimis kaltaiset seHmiproteaasit" tai *'subtslaasit" ovat *:*♦; oleellisesti bakteeriperäisiä. Tälle proteaasien luokalle, jota edustavat en Bacikus-iajst, kuten B. arnyMiquifaciem, B. lieheniformis ja B. sabtiUs (Rao ym., 199$}. ovat * * ,»·». 30 tunnusomaisia aromaattiset tai hydrofobiset jäännökset kuten tyrosiim, tenyyiiaianiin? ja < « «Vf * leusiini.

« * k ♦ ♦ * * ♦ K * * V ♦

♦ A

16

Keksinnön yhteydessä käytettynä termillä "serimiproteaasiaktiivisuus” tarkoitetaan hydrolyyttista aktiivisuutta proteiinia sisältävillä substraateilla kuten esim. kaseiini, hemoglobiini, keratiini ja BSA. Menetelmät proteolyyttisen aktiivisuuden analysoimiseksi ovat kirjallisuudessa hyvin tunnettuja, ja niihin on viitattu, esim. S julkaisussa Gupta ym. (2002).

Proteaasit voidaan luokitella käyttäen ryhmäspesifisiä inhibiittoreita, “Seriinipratestasi-inhibiittorien" moninaiseen ryhmään sisältyy synteettisiä kemiallisia inhibiittoreita ja luonnollisia proteiini-inhibiittoreita. Eräs luonnollisten inhibiittorien ryhmä on serpiinit 10 (lyhennetty seriiniproteaasi-inhibiittoreista), kuten antitrombiini ja alfa-l-aniitrypsiim. Keinotekoisiin synteettisiin inhibiittoreihin sisältyvät 3,4-dikioori-isokumarHm (3,4-DQ}? di-isopropyylifluorifosiaatti (DFP). fen>7limetyylisulfonyyllf1uoridi (PMSF) ja tosyyli-L-lysiinikJoorimetyyliketoni (TLCK). Joitain seriiniproteaaseja inhiboivat tiolireagenssit kuten p-klooriekdiopeahentsoaatti (PCMB) johtuen kysteiinijäännöksen 15 läsnäolosta aktiivisen kohdan lähellä. Näin ollen seriiniproteaasiafctiivisuus voidaan määrittää testillä, joka perustuu spesifisen substraatin pilkkomiseen, tai lestillä, jossa käytetään mitä tahansa proteiinipitoista substraattia spesifisen seriiniproteaasien spesifisen inhibiittorin kanssa tai ilman sitä soveltuvissa olosuhteissa.

Ϊ*Γ: 20 Seriiniproteaasit ovat yleensä aktiivisia neutraalissa tai emäksisessä pH:ssa, niin että S Γ: niiden pH~optims on välillä 7-11, ja niillä on laaja substraattispesifisyys. ''Emäksisillä *;* serimiproteaaselila” tarkoitetaan entsyymejä, jotka ovat aktiivisia ja stabiileja pEhssa 9- : : : 11 tai jopa pHrssa i0-12.5 (Shimoeaki vm.. .1991) ia joiden isoelektrinen piste on noin : Γ: pH:ssa 9. Nämä edustavat kaupallisten seriiniproteaasien suurinta alaryhmää. Emäksisten i 25 seriiniproteaasien molekyylimassat vaihtelevat välillä 15-35 kDa. Luonnollisten seriiniproteaasien lämpötila-optimit ovat noin 60 °C:ssa (Rao ym., 1998).

»« »«« * 0 *:**: Proteaasiakthvisnutta tuottamaan kykeneviä mikro-organismikantoja voidaan seuloa ja

A

erilaisien substraattien aktiivisuus voidaan määrittää. Valittuja kantoja voidaan viljellä * 0 * ,**·, 30 sopivassa elatusaineessa. Vaikka riittävä määrä kiinnostavia seriiniproteaaseja on 000 valmistettu, entsyymi voidaan eristää tai puhdistaa ja sen ominaisuudet voidaan määrittää x 0 » «0 *, . perinpohjaisernmin. Vaihtoehtoisesti eri organismeissa seriiniproteaaseja koodaavia 0 « 0 0 X » 0 β 17 geenejä voidaan eristää ja geenien koodaamaa aminohapposekvenssiä voidaan verrata tässä esimerkeissä eristetyn ja luonnehditun seriiniproieaasin aminohapposekvensseihin.

Tuotetut proteaasientsyymit, erityisesti seriiniproteaasit, voidaan puhdistaa käyttämällä 5 tavanomaisia entsyym{kemiallisia menetelmiä., kuten suolan valmistus, ultrasuodatus, ioninvaihtokromatografla, affimteeitikromatografia, geel (suodatus ja hydrofobinen vuorovaikutus -kromatogafia. Puhdistusta voidaan seurata proteiinien määrityksellä, entsyymlaktiivisuusmäärityksillä ja SDS-polyakryylianudigeeiieiektrotbreesilia. Puhdistetun entsyymin entsyymiaktiivisuus eri lämpötiloissa ja pH-arvoissa sekä sen 10 moolimassa ja isoelektrinen piste voidaan määrittää.

Esillä olevan keksinnön edullisen seriiniproieaasin puhdistus on esitetty esimerkissä Ib.

Suodatettu viljelysupematantti lisättiin Q Sepharose FF -kolonniin. Läpivirtausfraktio lisättiin fenyyli-Sepharose HP -kolonniin ja proteiinit eluoitän lineaarisella laskevalla 1.5 suolagradientilla. Proteaasiaktiivisuutta osoittavat fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin ja lisättiin Superdex 75 10/3ÖÖ GL -kolonniin. Puhdistusta seurasi vat aktiivisuusmääritykset resorufiini-ieimatulla kaseiinilla esimerkissä ib kuvatulla tavalla.

Luonnollisesti on mahdollista erottaa esillä olevan keksinnön entsyymi käyttäen muita tunnettuja puhdistusmenetelmiä tässä esitettyjen menetelmien sijaan tai lisäksi.

ϊΤ» 20 Rekomhinantriuen seräniproteaasi puhdistettiin esimerkissä 5 kuvatulla tavalla ja sitä « :T: käytettiin pH-ja lämpötilaprofiilien määrittämiseen.

♦ ««»

X

« « « « J Puhdistetun seriiniproieaasin moolimassa voidaan määrittää massaspektrometrisesi! tai »«1 « ;T: SDS-PAGEflla tavalla, jonka on esittänyt Laemmii (1970). Moolimassa voidaan mvös 25 ennustaa entswmin aminohapposekvenssistä. Kypsän seriiniproteaasin tai kypsän seriiniproieaaskntsvymin moolimassa on tyypillisesti 20—35 kDA, tyypillisesti noin 25-*:♦1: 30 kDa (Rao ym., 1998), «1x«« * x

Serlimproteaasit. syntetisoidaan epäaktiivisina v‘zyi»Ggeemsma esiasteina-' tai k « ,1·1, 30 ”23?1»egeeneina” preproentsyymin muodossa, ja ne aktivoidaan poistamalla ♦ x ^ ««1 signaaltsekvenssi (erityksen signaalipeptidi tai prepeptidi) ja prosekvenssi (propeptidl), x « % ** niin että aikaansaadaan entsyymin aktiivinen, kypsä muoto (Chen ja Inouye, 2008).

* 1 1 ** Tähän aktivointiprosessi in liittyy proteaasien toiminta, ja se voi olla seurausta

IS

seriiniproteaasin rajoitetusta itsehajottavasta tai autokatalyyttisestä prosessoinnista. Frosekvenssi voidaan lohkaista esimerkiksi tuotannon translaation jälkeisillä vaiheilla tai käytetyssä elatusaineessa tai elatusaineen tai entsyymivalmisteen varastoinnin aikana. Proentsyymin aktivointi voidaan myös aikaansaada lisäämällä proteolyyttistä entsyymiä, 5 joka kykenee muuntamaan epäaktiivisen proentsyymin aktiiviseksi, kypsäksi entsyymiksi elatusaineessa, jossa isäniäorganismia viljellään, tai lisäämällä proteolyyttistä entsyymiä viljelyn supematanttiin viijeiyprosessln jälkeen. Entsyymin lyheneminen voidaan myös aikaansaada esimerkiksi typistämällä polypeptidiä koodaava geeni ennen kuin tuoiantoisäntä transformoidaan sillä, 10

Termi “kypsä” tarkoittaa sellaista entsyymin muotoa, joka signaalisefcvenssin ja propeptidin poistamisen jälkeen käsittää entsymaattisen tai katalyyttisen aktiivisuuden kannalta välttämättömät aminohapot. Rihmasienissä se on elatusaineeseen eritettävä muoto.

15

Seriiniproteaasin lämpötiiaoptimi voidaan määrittää soveltuvassa puskurointiaineessa eri lämpötiloissa käyttäen kaseiinia substraattina, kuten esimerkissä le on kuvattu, tai käyttämällä multa substraatteja ja puskurijärjestelmiä, joita on kuvattu alan kirjallisuudessa (Gupta yin., 2002). pH-optknin määritys voidaan suorittaa soveltuvassa ϊΤ: 20 puskurissa eri pH-arvoissa seuraamalla aktiivisuutta proteiinisubstraatilia.

x « « * 1 x * « X » *i· Proreaasiaktiivisuus perustuu yleensä liukoisten substraattien katoamiselle.

»«1x 1 % Pesuainesovelluksissa nroteaasien on toimittava aineille, sotka ovat ainakin osittain * 1 1 1 v ^ ίΤί liukenemattomia. Näin ollen merkittävä parametri pesuaineproteaasille on sen kyky % l 25 absorboida ja hydrolysoida näitä liukenemattomia fragmentteja.

'5··! Toinen merkittävä parametri pesuaineproreaaslen valinnalle on sen isoelekirinen piste tai T1: pi-arvo. Pesuaineproteaasit ovat tehokkaimmillaan, kun sen pesuaineliuoksen. jossa ne toimivat, pH-arvo on suurin piirtein sama kuin entsyymin pi-arvo. Pesuainesovelluksessa ♦ e »♦♦♦. 30 pH on yleensä emäksinen, pH 7-9 nestemäisille pesuaineille ja pH 9-10,5, kun käytetään * « „· jauhemaisia pesuaineita, pl voidaan määrittää isoelekiri selli .fokusoinnilla « 1 *, ** immobillsoidussä pH-gradienttigeeiissä, joka koostuu poiyakryyiiamidista, * 1 1 1 tärkkelyksestä tai agaroosista, tai arvioimalla pl aminohapposekvenssistä, esimerkiksi 19 käyttämä I la p 1/M W~ty oka 1 ua ExPASv-palvel ime! ia (http: //expas v. ore/ too Ismi tool, html: Gasteiger ym., 2003).

Ahdistetun protean in N-pää sekä sisäiset peptidit voidaan sekvensoida Edmanin 5 hajotuskemian mukaan (Edman ja Begg, 1967), kuten esimerkissä 2 on kuvattu, tai muilla alan. kirjallisuudessa kuvatuilla menetelmillä.

Keksinnön seriiniproteaasientsyymi voi olla peräisin mistä tahansa organismista, mukaan lukien bakteerit, arkkieläimet, sienet, hiivat ja jopa korkeammat eukaryootit, kuten 1.0 kasvit. Edullisesti mainittu entsyymi on peräisin sienestä, mukaan luiden rihmasienet ja hiivat, esimerkiksi suvusta, joka on valittu ryhmästä, joka käsittää Fusariumm, Sieniperäiset emäksiset proteaasit ovat edullisia bakteeriproteaaseille johtuen niiden jatkokäsittelyn helppoudesta mikrobtUoman entsyymin tai entsyymi valmisteen aikaansaamiseksi. Sienirihmasto voidaan poistaa helposti suodatusmenetelmillä ennen 15 entsyymin puhdistusta.

Esillä oleva keksintö koskee sieniperäistä setiiniproteaasia, jolla on hyvä tehokkuus ominaisuuksiltaan hyvin vaihtelevlen pesuaineiden läsnä ollessa laajoilla, esimerkiksi alhaisesta kohtalaiseen olevilla lämpötila-alueilla, kuten 1Ö~60 °C:ssa, *** _ .

» ♦ X Oit * ♦ * wl.* « ίΤί Esillä olevassa keksinnössä hvvä tehokkuus pesuaineen läsnä ollessa tarkoittaa sitä, että ♦;* entsyymi, tässä tapauksessa keksinnön sieniperäinen seriiniproteaasi, toimii i ϊ*: alhaisemmilla lämpötila-alueilla kuin useat tällä hetkellä kaupan olevat, subtiiisiinit.

» e « >

Toisin sanoen hyvä tehokkuus tarkoittaa sitä, että entsyymi kykenee hajottamaan tai » * ί"*; 25 poistamaan proteiinitahroja tai proteiinipitoista materiaalia alhaisesta kohtalaiseen olevilla lämpötila-alueilla, mutta erityisesti alhaisemmilla lämpötila-alueilla kuin ♦J**J nykyiset kaupalliset valmisteet, esimerkiksi kaupallinen enisyymivalmiste Purafect® *:♦*: 4ÖÖÖL (Genencor inc., USA).

« « ♦ » ,«·, 30 Keksinnön sieniperäinen seriiniproteaasi toimii alhaisilla lämpötila-alueilla. Esimerkiksi * ♦ *

«»X

„· pH-arvoa muuntelemalla, valitsemalla ominaisuuksiltaan soveltuvia pesuaineita, * « * V 9 , \ ^ sisällyttämällä valmisteeseen entsyymejä suojaavia aineita ja säätelemällä

* « X

’ * pesuolosuhteita keksinnön serimiproteaasin aktiivisuus voidaan säilyttää lämpötiloissa.

20 jotka ovat. niinkin alhaisia kuin 10 ö€. Siksi keksinnön seriiniproteaasi on pesuolosuhteista ja apu- ja lisäaineista riippuen käyttökelpoinen erityisesti lämpötiloissa, jotka ovat 50 °C tai alle. Entsyymi toimii myös lämpötiloissa, jotka ovat 45 °C tai alle, 40 °C tai alle, 35 °C tai alle, tai 30 '·'€ tai alle.

5

Pesuaineen läsnä ollessa keksinnön sieniperäinen seriiniproteaasi toimii määritellyllä tavalla välillä 10-60 *€ olevassa lämpötilassa, ja erityisesti mainitulla sieniperäisellä seriiniproteaasilla Fe_RF63I8 on hyvä tehokkuus pesuaineissa lämpötilassa 30 °C. Esimerkeissä 6-11 on kuvattu vertailuesimerkkejä, ja kuvioista 7-13 voidaan havaita, 10 että sieniperäisen seriiniproteaasin Fe RF6318 tehokkuus vaihtelevissa olosuhteissa ja erilaisille käsittelyille altistettuna, kohdistettuna useille erilaisille tahroille erilaisilla kangasmateriaaleiila ja määritettynä arvona deltaL* tai yhteen las kettu delta%SR, on huomattavasti parempi kuin kaupallisten tuotteiden Savinase® Ultra 16L (Novozymes A/S, DK)ja Purafect® 4Ö00L (Genencor Inc, USA) tehokkuus.

15

Mainituista koetuloksista voidaan päätellä, että keksinnön sieniperäinen seriiniproteaasi kykenee täyttämään pesuaineita ostavien asiakkaiden, pesuaineteollisuuden ja pesukoneiden valmistajien suuresti vaihtekvat vaatimukset sekä on myös hyvin yhteensopiva tulevaisuuden säädösten ja kuluttajatottumusten asettamien edellytysten jTi 2ö kanssa.

* * ♦ « x « « *:* Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti sieniperäinen proteaasientsyymi on tj : polypeptidi, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja joka käsittää kypsäsi Pa RF7182- « J*J entsyymin, jolla on sekvenssissä nro 18 määritelty aminohapposekvenssi tai l **: 25 aminohapposekvenssi, joka on ainakin 81-prosenttisesti identtinen sekvenssin 18 aminohapposekvenssin kanssa tai ainakin 80-prosenttisesti identtinen sekvenssin 14 *:*♦! aminohapposekvenssin kanssa. Edullinen entsyymi on. ainakin SI-prosenttisesti, Τ'ί edullisesti ainakin 83-prosenttisssti, edullisemmin ainakin 85-prosenttisesti ja vielä edullisemmin ainakin 8?-prosenttisesti identtinen. Vieläkin edullisemmin * * »••o, 30 aminohapposekvenssit ovat ainakin S9~prosenttisesti, tai ainakin 91-, 92-, 93-, 95- tai 97- * * * * * prosenttisesti, edullisemmin ainakin 98-prosesttisesti, edullisimmin 99-prosenttisesti * * *. ** identtisiä sekvenssin nro 18 aminohapposekvenssin kanssa. Kahden entsyymin * * « * *« * » 21 identtisyyksiä verrataan vastaavilla sekvenssialueilia, esim. seriiniproteaasm täyspitkässä tai kypsässä aineessa.

Esillä olevan keksinnön seriiniptoteaasia on merkitty Fa RF7182, ja se on eristetty 5 seriiniproteaasi, joka on peräisin Fusarium acuminahf mistä ja joka kuukin seriiniproieaasien klaaniin Sö, perheeseen 8.

Termillä “identtisyys" tarkoitetaan tässä identtisyyttä kahden aminohapposekvenssin välillä verrattaessa niitä toisiinsa vastaavan sekvenssialueen sisällä, jossa on suurin 10 piirtein sama määrä aminohappoja. Voidaan esimerkiksi verrata kahden aminohapposekvenssin täyspiikän tai kypsän sekvenssin identtisyyttä. Kahden verrattavan molekyylin aminohapposekvenssit voivat erota yhdessä tai useammassa asemassa, mikä ei kuitenkaan muuta molekyylien biologista toimintaa tai rakennetta. Tällaista vaihteina voi esiintyä luonnollisesti johtuen eri Isäntäorganismeista tai 15 mutaatioista aminohapposekvenssissä, tai niitä voidaan aikaansaada spesifisellä mutageneesillä. Vaihtelu voi olla seurausta deleetlosta. substituutiosta, inseruosta. additiosia tai kombinaatiosta yhdessä tai useammassa aminohapposekvenssin asemassa. Sekvenssien identtisyys määritetään käyttäen CiustalW-rinnastusta (esim. osoitteessa www.ehi.ac.uk/Tools/Ciustaiw). Käytetty matriisi on seuraava: BLOSUM, aukon tt”; 20 muodostus: 10. aukon laajennus: 0,5.

* ** » * * * * * T Edullisesti sieniperäinen seriiniproteaasi on saatavilla edullisemmin k « i Ϊ i lajista Fusarium acuminatum. Edullisimman suoritusmuodon mukaisesti keksinnön ««« s ί 5 % seriiniproteaasi on saatavilla kannasta, joka on talletettu Centraalbureau voor < *« S % 25 Schimmeicuhures -kokoelmaan tailetusnumerolla CBS 124084, ««» *i**i Keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto on sieniperäinen seriiniproieaasienisyymi, jolla '1**1 on seriiniproteaasiakiiivisuutta ja sekvenssissä nro 18 määritelty kypsän Fa RF7i82~ ,„,j entsyymin aminohapposekvenssi. Kypsältä entsyymiltä puuttuu signsaiisekvenssi tai 30 prepeptidi ja prosekvenssi tai prepeptidi. Keksinnön kypsä seriiniproteaasi sisältää sekvenssissä nro 13 esitetyn täyspiikän proieaasm .aminohapot Alal27-Ala4l5, Näin ♦ * *, . ollen keksintö kattaa myös täyspiikän Fa_RP7182«entsyymin, jolla on sekvenssi nro 13, * * x * ♦ * sisältäen signaalisekvenssin (prepeptidi} ia propeptidin ja kypsän entsyymin, sekä ?2 proentsyymimuodon. josta puuttuu signaalisekvenssi (prepeptidi) ja jolla on näin ollen sekvenssi nro 15.

Esillä oleva keksintö koskee sieniperäistä seriimproieaasientsyymld, jonka kypsän 5 muodon molekyylimassa tai molekyylipako (MW) on 20-35 kDa, edullisesti 25-33 kDa, edullisemmin 28-30 kDa. Edullisin MW on FaJRF?182:n ennustettu moiekyylimassa, joka on 29 kDa kypsälle polypeptidiketjoile ja loka on saatu käyttämällä Compute pi/MW -työkalua ExPASy-palveltmclla (Gasleiger ym... 2003).

10 Keksinnön entsyymi on tehokas proieiiniroateriaalin hajottamisessa laajalla lämpötila-alueella, Entsyymin optimaalinen lämpötila on 30-70 °C (noin 10 % maksimiaktiivisuudesta), edullisesti 30-60 'C (noin 30 % maksimiaktiivisuudesta) ja edullisemmin 40-60 CC (vähintään 60 % maksimiaktiivisuudesta), edullisimmin 50 '·'€ (maksimiaktiivisuus, Fa_RF71S2) määritettynä pH-arvossa 9 käyttäen 15 min 15 reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina esimerkissä 5 kuvatulla tavalla.

Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti sieniperäisen serimiproieaasientsyymin pH-optimi on alueella, joka on vähintään pH 6-12, jolloin

vähintään 10 % maksimiaktiivisuudesta esiintyy pH-arvossa 7 lämpötilan ollessa 50 °C

IS { 20 käyttäen 1.5 min reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina esimerkissä 5 kuvatulia tavalla.

««» IJ t Edullisesti entsyymin pH-optimi on alueella pH 6-11 (vähintään 40 % * <tT maksimiaktiivisuudesta). Erityisesti pH-optimi on välillä pH 6-10 (noin 55 % ♦ s • S ♦ maksimiaktiivisuudesta) ja edullisemmin välillä pii 6-9 (vähintään 80 % v * « tl i maksimiaktiivisuudesta), ja edullisimmin pH:ssa 7 lämpötilassa 50 °C käyttäen 15 min ♦ * e * 25 reaktioaikaa esimerkissä 5 kuvatulla tavalla sekä käytettäessä kaseiinia substraattina.

*a * x *!**· Keksinnön sieniperäisellä seriinipnoteaasilla on "’hyvä tehokkuus pesuaineen läsnä * T*{ ollessa"', toisin sanoen se kykenee hajottamaan tai poistamaan proteiinipitoisia tahroja $ värillisistä materiaaleista pesuaineen läsnä ollessa alhaisesta kohtalaiseen olevilla * < * ♦·**, 30 lämpötila-alueilla, erityisesti alhaisemmilla lämpötila-alueilla kuin nykyiset kaupalliset „* valmisteet, esimerkiksi kaupallinen entsyymivalmiste Furafect® 4000L (Genencor Inc., s * «· «« % . USA), Pesuaineen läsnä ollessa keksinnön entsyymi toimii lämpötilassa 10-60 °C\ Φ 8 «

« «X * X

23 edullisesti 20-50 °C, edullisemmin 50 CC tai alle. FaJRF? 182-entsyymi toimii myös lämpötiloissa, jotka ovat 45 °C tai alle, 40 °C tai alle, 35 °C tai alle tai 30 °C tai alle.

Keksinnön serilniproteaasientsyymiliä on pl, joka johdetun aminohapposekvenssin 5 perusteella ennustetulla tavalla on välillä pl 8,8-9,5, edullisesti pl 8,9-93. Keksinnön Fa__RF7182-entsyymin ennustettu pl on 9,1.

Puhdistetun entsyymin N~pään tai tryptisten peptidien aminohapposekvenssiin syntetisoituja oligonukieotideja tai edellä mainittuja oligonukleotideja käyttämällä 10 aikaansaatua PCR-tuotetta voidaan käyttää koeitimina eristettäessä cDNA:ta tai genomista geeniä, joka koodaa keksinnön seriimproteaasla. Koetin voidaan myös suunnitella perustuen homologisten seriiniproteaasien tunnettuihin nukleotidi- tai amlnohapposekvensselhin. Seriiniproteaasikiooneja voidaan myös seuloa perustuen niiden aktiivisuuteen maljoilla, jotka sisältävät entsyymin spesifistä substraattia, tai 15 käyttämällä seriiniproteaasijle spesifisiä vasta-aineita.

Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti sieniperäistä seriiniproteaasienisyymiä koodaa eristetty polynukleotidisekvenssi, joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa polynukleotldi- tai koetinsekvenssiin, joka sisältyy plasmidiin pALK2530, joka käsittää l i'i 20 nukleotidisekvenssin nro 12, E, coima Fa RF7S03, joka on talletettu kokoelmaan i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelikulturen (DSMZ) talletusnumerolla *:♦ DSM 222Ö8.

4 X « » * » # Ψ «XX f t Esillii olevassa kekssimössä Fa prtSA -geeni eristettiin koettime.Ua» joka valmistettiin.

ϊΜιί 25 PCR-tekoukalla käyttäen ankaraa hybridi sointia, kuten esimerkissä 3d on kuvattu.

Tavanomaista molekyylibiologian menetelmiä, esimerkiksi menetelmiä, jotka on kuvattu s *ϊ’*ί sellaisissa molekyylibiologian käsikirjoissa kuten Sambrook ja Russell, 2001. voidaan * **“*ί käyttää cDNA:n tai genomisen DNA:n eristämisessä isantäorganismista..

4 « «««»4 * 4 *’**. 30 Hybridisointi DNA-koettimen kanssa, kuten esimerkiksi sekvenssin nro 12, joka käsittää ,3 yli 100-200 nukleotidia, suoritetaan yleensä "erittäin ankarissa’' olosuhteissa eli X 4 * »4 *. , hybridtsoimalla lämpötilassa, joka on 20-25 °C täydellisen hybridin lasketun 4 V * vv 4 x * sulamislämpöiiian (Tm) alapuolella, niin että Tm on laskettu Boltonin ja McCarthy» 24 (1962) mukaan. Yleensä prehybridisointi ja hybridisointi suoritetaan vähintään 65 °C:ssa seuraavissa olosuhteissa: 6xSSC (tai bxSSPE), SxDenhardtän reagenssi. 0,5 % (w/v) SDS, löö pg/mi denaturoitu, fragmemoitu lohen maidin DNA. Prehybridisointi- ja hybridisointilämpötila laskee 42 öC:seen. kun lisätään formamidia (kunnes 50 %). Pesut 5 suoritetaan alhaisessa suolapitoisuudessa, esim. 2x$SC - Ö,5 % SDS (vv/v). 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, mitä seuraa 2xSSC-ö»l % SDS (w/v) huoneenlämpötilassa ja lopuksi Ö,lxSSC - 0,1 % SDS (w/v) vähintään 65 °C:ssa.

Erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti keksinnön sieniperäisiä 10 seriiniproteaasientsyymiä koodaa eristetty nukieiinihappomolekyyU, joka koodaa polypeptidiä, jolla on sekvenssissä nro IS määritelty aminohapposekvenssi, tai polypeptidiä. joka on ainakin 81-prosenttisesti identtinen sekvenssissä !8 määritellyn aminohapposekvenssin kanssa tai ainakin 80-prosenttisesti identtinen sekvenssissä 13 määritellyn aminohapposekvenssin kanssa. Edulliset entsyymit ovat ainakin 81« 15 prosenttisesti, edullisesti ainakin 83~prosenttisesti, edullisemmin ainakin 85-prosenttisesti ja vielä edullisemmin ainakin 87~prosenttisesti identtisiä. Vieläkin edullisemmin, aminohapposekvenssit ovat ainakin 89-, 91-, 93-prosentiisesti tai ainakin 97-prosemtisesti, edullisemmin ainakin 98-prosenttisesii, edullisimmin 99-prosentti.sesti identtisiä sekvenssin nro 18 aminohapposekvenssin kanssa. Kahden entsyymin ίΤ: 20 identtisyyksiä verrataan vastaavilla sekvenssialueilla. esim. seriiniproteaasin kypsässä, tai i täyspitkässä alueessa.

« «»«> » » i ♦ ϊ Näin ollen keksinnön suojapiiriin sisäiivv polvpeotidisekvenssk iota koodaa a s 9 Φ * vviwtx ' ««« t i t nuklekmhappomolekyyli, joka koodaa keksinnön täyspitkän seriiniproteaasin * * x t t 25 aminohapposekvenssiä, mukaan lukien prepeptidln (signaalisekvenssi) ja propeptidin entsyymin kypsän muodon lisäksi, ja joka aminohapposekvenssi on esitetty sekvenssissä te*5; nro 14, « «>«»> s « * .♦♦«j Keksinnön suojapiiriin sisältyy myös polypeptidisekvenssi, jota koodaa 30 nukieiinihappomolekwli. loka koodaa keksinnön seriiniproteaasientswmin * proentsyymimuotoa, sisältäen propeptidin entsyymin kypsän muodon lisäksi, ja joka ♦ x * »» *. , aminohapposekvenssi on esitetty sekvenssissä nro 16.

> « » * * * 25

Keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto on sieniperäinen serimiprotesasientsyymi, jota koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää nokleotidlsekvenssln, joka koodaa Fa RF7IS2-seriiniproteaasin kypsää muotoa, jolla on sekvenssi nro 18.

5 Erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti keksinnön sieniperäistä seriiniproteaasienisyymiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssin nro 17 nukleotidisekvenssin, joka koodaa PaJRF?182-eutsyyrain kypsää muotoa (sekvenssi nro 18).

.10 Näin ollen keksinnön suojapimin sisältyy polypeptidi, jota koodaa nakietinihappomoiekyyli, jolla on sekvenssin nro 13 nukieotidisekvenssi, joka käsittää entsyymin "koodaavan sekvenssin". Ilmaus “koodaava sekvenssi” tarkoittaa sitä nukleotidisekvenssiä, joka alkaa translation aloituskodouista (ATG) ja päättyy translaation lopetuskodoniin (TAA, TAG tai TGA). Translaatiosta syntyvä täyspitkä 15 polypeptidi alkaa yleensä metioniiniila ja käsittää inironialueita.

Keksinnön suojapiiriin sisältyy myös sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, jota koodaa nukieiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssin nro 15 nukleotidisekvenssin, joka koodaa Fa_RF?l 82>proeötsyymimootoa.

20 « « » λ :1:** Keksinnön erään muun edullisen suoritusmuodon mukaisesti sieniperäisiä seriiiuproieaasientsyynriä koodaa polyuukieo&hsekvenssi, joka sisältyy pALK2531 reen,

«»«X 1" V 1 VVA

: j1: joka on talletettu E. catissa. RF7879 talktusauraerolla DSM 22209.

* ++ s * ψ 1 * 1 1 25 Eräs keksinnön suoritusmuoto on seriiniproteaasienisyymi. joka valmistetaan rekomöisanttisesta ekspressiovektorista, joka käsittää nukieiimhappomolekyylis, joka ·:**! koodaa edellä määriteltyä sieniperäistä serimiproteaasia, toiminnallisesti liitettynä *«•15 säätelysekvensseiMn, jotka kykenevät ohjaamaan seriimproteaasientsyymiä koodaavan ,».,j geenin ilmentymistä soveltuvassa isännässä. Mainitun rekombmanttisen ekspressiovektorin * 1 1 ,**·. 30 rakentamista ja mainitun vektorin käyttöä on kuvattu yksityiskohtaisemmin esimerkissä 4.

x 1 * x 1 e X X » 1 * " Soveltuvia isäntiä sieniperäisen serimiproieaasientsyymin. tuottamista varten ovat ♦ 1 1 K ** homologiset, tai heterologiset isännät kuten mikrobi-isännät, mukaan lukien bakteerit, 26 hiivat, ja sienet. Rihmasienet kuten Trichoderma, Aspergillus, Fmarium., Humicota, Ckrysosporium Neurospora, Rhizopus, PemdUium ja Mortiriella, ovat edullisia tuotantoisäntiä johtuen jatkokäsittelyn ja entsyymkuotteen talteen ottamisen helppoudesta. Soveltuviin isäntälajeihin sisältyvät sellaiset kuten I reesei, A. niger, A 5 orysae, A. sojaes A. awamori tai A. japonicus -tyyppiset kannat, .F: vemmtum tai F. oxysponm, H. insolens tai H lanuginosa, N. erässä ja C. iuckrumense, joista osa on lueteltu entsyymien tuotannossa käytettävinä isantäorganismeinä esim. kaupallisten entsyymien luettelossa AMFEP 2007 (http;//www.amtep.org/iist.html). Edullisemmin entsyymi valmistetaan suvun Trichoderma tai Aspergillus ribmasieni-isäimässä, kuten 10 I reesei tai A. niger, A. oryzae tai A. awamori -kannoissa. Keksinnön, edullisimman suoritusmuodon mukaan sieniperäinen proteaasientsyymi valmistetaan T. reeseissä.

Esillä oleva keksintö koskee myös eristettyä nukkiinihappomoiekyyliä» joka koodaa sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä, joka on valittu seuraavasta ryhmästä:

: S

(a) nukieiinihappomoiekyyli. joka koodaa polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuuita ja joka käsittää sekvenssissä nro 18 esitetyn aminohapposekvenssin; (h) miklesinihappomolekyylh joka koodaa poiypeptidiä» jolla on o0 seriimproteaasiaktiivisuutta ja joka on ainakin 81 -prosenttisesti identtinen * * * sekvenssin nro 18 kanssa: i : ί * . (o) nukieiinihappomoiekyyli. joka käsittää sekvenssissä nro 13 kuvatun » ***» nukieotidisekvenssin koodaavan sekvenssin: : : · td) nukleiinihappomolekvvli. loka käsittää DSM 22208:n tai DSM 222Ö9:n : : : **** sisältämän polynukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin: « * *** (e) nukieiinihappomoiekyyli» jonka koodaava sekvenssi eroaa minkä tahansa • kohdista (cV-fd) nukieiinthappomolekvlin koodaavasta sekvenssistä geneettisen . koodin degeneraation vuoksi; ia.

•ί-ί . (f) nukieiinihappomoiekyyli. joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa 9 ** ’ ·>(} DSM 22208:n sisältämään nukieunihappomolekyyiiin ja joka koodaa * * ***** polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja aminohapposekvenssi, joka * ‘ i\. on ainakin 81-prosenttisesti identtinen sekvenssissä nro 18 esitetyn ***** aminohapposekvenssin kanssa.

27

Keksinnön nukieunihappomofekyyli voi olla RNA tai DNA. jolloin DNA voi koostua genonrisesta DNA:sta tai cDNA:sta.

Tavanomaisia molekyylibiologian menetelmiä voidaan käyttää eristettäessä ja 5 entsyymikäsiteitäessä polynukleotidisekvenssiä, joka koodaa keksinnön sieniperäistä seriiniproteaasia, mukaan lukien genomisers ja piasrnidi-DNA:n eristyksessä, DNA m pilkkomisessa DNA-fragmenttien aikaansaamiseksi, sekvensoinnissa, E. coti-transformaatioissa jne. Perusmenetelmiä on kuvattu tavanomaisissa molekyylibiologian käsikirjoissa, esim. teoksessa Sambrookja Russell, 2001.

10 Fä_RF7182-po]ypeptidiä koodaa van Fa priSSÄ -geenin eristäminen on kuvattu esimerkissä 3. Lyhyesti esitettynä, degeneroituneita oligonukieotidialukkeita PRO 123 (sekvenssi nro 8) ja PR061 (sekvenssi nro il) käyttämällä saatua 753 bp:n PCR-fragmenttia käytettiin Fa prtSA-geenin eristämisessä Fusarium acuminatum RF7182:st& 15 pBlueseript II KS+ -vektoriin. Täyspitkä Fusarium acuminatum Fa prtSHA -geeni sisällytettiin piasmidiin pALK2531, joka oli talletettu E. catissa. DSMZ-kokoelmaan talietusnumerolla DSM 22209. Seriiniproteaasin johdettu aminohapposekvenssi analysoitiin DNA-sekvenssistä.

ij i 20 Täyspitkän Fusarium acuminatum -seriiniproteaasin Fa prtSM nukleotidisekvenssi * X f ^ 'J i (sekvenssi nro 13) ja siitä johdettu sekvenssi (sekvenssi nro 14) on esitetty kuviossa IA- .Jj* B. Geenin pituus on 1353 bp (mukaan lukien lopetuskodoni). Löydettiin kaksi oletettua * « »e* » intronia» joiden pituudet olivat 51 bp ja 54 bp. Johdettu protennisekvenssi koostuu 415 * * *

ϊ aminohaposta, mukaan lukien ennustettu 20 aminohapon signaalisekvenssi (SignalP

*.,.ί 25 V3.0; Nielsen ym., 1997, sekä Nielsen ja Krogh. 1998) ja propeptidi Ala21~Argi26.

Kypsän polypeptidin ennustettu molekyyiimassa oh 29 kDa ja ennustettu pl 9,1, Nämä « ***** ennustukset suoritettiin käyttäen Compute pi/MW -työkalua ExPASy-paiveiimeiia ***** (Gasteiger ym., 2003), johdettu aminohapposekvenssi sisälsi kaksi mahdollista *»♦*« N-glykosylaatiokohtaa (Asn79 ja Asn258), mutia CBS-pal vei Imen NetNGIyc Vl.Ö:n ·***♦ 30 mukaan ainoastaan asemassa Asn?9 oleva kohta (sijaitsee propeptidissä) on «n todennäköinen. Ho.moiogioita julkaistuihin proieaasisekvensseihin nähden etsittiin * * * . käyttäen BLASTX-ohjeimaa, versio 2.2.9, NCBBssa (National Center for Biotechnology information) (Altschul ym., 1990). ClustalW-rinnastusta (matriisi; BLOSUM, aukon 28 muodostus; 10, aukon laajennus 0,5, esim. osoitteessa vvww.ebi.ae.nk/Tools/Cinstahv) käyttäen aikaansaadut, kypsän Fa_RF7182-sekvensstn identtisyysarvot vastaaviin homologisten sekvenssien kypsiin alueisiin nähden on esitetty taulukossa 3.

5 Esillä olevan keksinnön seriiniproteaasilla FaJRJF7182 oli eniten homologisuutta varattuna Gibbereiia seaen (Fusamm gmmineanan) hypoteettiseen proteiiniin PH» k lokustunoiste FG033I5.1 (EMBL-talletusnumero XP_38349I, julkaisematonj. Hypocrea iixiin (Trichoderma harziamm) CECT 2413 -seriiniendopeptidaasiin {EMBL~talletusn.ro CAL255Ö8, Suarez ym„ 2007} ja T. airovindsn emäksiseen proteinaasiesiasteeseen lö SÖ8.Ö66, ALP (EMBL-talletusnro M87516, Geremia ym. 1993), joists jälkimmäinen on tuotu esiin aminohapposekvenssinä nro 313 julkaisussa US 60/818,910 (Catalyst Bioscience Inc.}. Identtisyys G. seaen hypoteettiseen proteiiniin nähden oli täyspitkässä entsyymissä 79 %. Kun rinnastettiin kypsät polypeptidit ilman signaalisekvenssiä ja propeptidiä, identtisyys oli 80 %, Identtisyydet H. Iixiin CECT 2413 -15 seriiniendopeptidaasiin nähden olivat 73 % (täyspitkä entsyymi) ja 70 % (kypsä entsyymi). Identtisyydet 7' atroviriden ALPthen nähden olivat 71 % (täyspitkä entsyymi) ja 79 % (kypsä entsyymi).

Näin ollen keksinnön suojapitriin sisältyy eristetty polynnkleotidisekvmssi tai eristetty :Ti 20 nukfeiinihappomolekyyli, joka koodaa sieniperäistä seriimproteaasiemsyymiä tai ίΤϊ polypeptidiä. joka käsittää Fa_RF7182-entsyymin kypsän muodon *:♦ aminohapposekvenssin, joka on esitetty sekvenssissä nro 18, eli sekvenssin nro 14 : täyspitkän seriiniproteaasin aminohapot Alai27-Ala415.

♦ 1 * * e 1 « ;***i 25 Keksinnön suojapiiriin sisältyvät edelleen nukleiinihappomolekyylit, jotka koodaavat sieniperäisen seriiniproteaasipolypeptidin fragmenttia, jolla fragmentilla on Τ'ί seriiniproteaasiaktiivisuutta ja joka on ainakin 81-prosenttisesti identtinen sekvenssissä »;1♦! 18 määritellyn aminohapposekvenssin kanssa tai ainakin SÖ-prosenttisesti identtinen « sekvenssissä 14 määritellyn aminohapposekvenssin kanssa, Edulliset entsyymit ovat * x 30 ainakin 81-prosenttisesti, edullisesti ainakin 83-prosenttisesti, edullisemmin ainakin 85» * 1 * 1 Λ prosenttisesti ja vielä edullisemmin ainakin 87-prosentiisesti identtisiä. Vieläkin ♦ 1 % " edullisemmin aminohapposekvenssit ovat ainakin 89-prosenttisesti, tai ainakin 91«, 92-, » 1 1 '1 93-, 95- tai 97-prosenttisesti, edullisemmin ainakin 98-prosenttisesti, edullisimmin 99- 29 prosenttisesti identtisiä sekvenssin nro 18 aminohapposekvenssin kanssa. Kahden entsyymin identtisyyksiä verrataan vastaavilla sekvenssialueilla, esim, serimiproteaasm kypsässä tai täyspitkässä taialueessa.

5 Nukkiinihappomolekyyli on edullisesti molekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 13 esitetyn koodaavan sekvenssin, joka koodaa tämän keksinnön sieniperäisen seriiniproieaasientsyymin täyspitkiä muotoa.

Keksinnön eristetty nukleiinihappomolekyyli voi olla. molekyyli, joka käsittää koodaavan 10 sekvenssin DSM 22208:n tai DSM 22209:n sisältämästä polynukleotidisekvenssistä. DSM 22208 kantaa PCR-fragmentin nukleotidisekvenssiä (sekvenssi nro 12). jota käytetään kloonattaessa täyspitka Fa priSSA -geeni. DSM 22209 kantaa täyspitkän FaprtSSA -geenin nukleotidisekvenssiä (sekvenssi nro 13).

15 Keksinnön nukleiinihappomolekyyli voi myös olla edellä määritellyn nukieotidisekvenssin analogi. Termi “degeneraatio" viittaa sellaisiin nuklectidisekvenssin anaiogeihin, jotka eroavat yhden tai useamman nukleotidin tai kodonin suhteen, mutta jotka koodaavat keksinnön rekombinanttista proteaasia.

! ♦ s 20 Nukie.immappom.o!ekyyli voi myös o da nuk!eiinihappomolekyyii, joka hybridisohuu * 1 1 ti : ankarissa olosuhteissa PCR-koettimeen, joka sisältyy plasmidiin pÄLK2530, joka on Μ1ϊ1 talletettu E. emYssa talktusnumerolla DSM 22208 ja joka koodaa polypeptidiä, jolla on * t j seriiniproteaasiaktiivisuuda ja aminohapposekvenssi, joka vastaavalla sekvensslalueella ϊ ϊ i on ainakin 81 -prosenttisesti identtinen sekvenssissä nro 18 esitetyn » 1 1 , t i 25 aminohapposekvenssin kanssa. Hybridisoitirva DNA voi olla peräisin F»,%rrmm-iajin sienestä tai se voi olla peräisin jostain muusta sienilajista.

« « 1 Näin ollen keksinnön suojapuriin sisältyvät eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka * käsittää sekvenssissä nro 12, sekvenssissä nro 13. sekvenssissä nro 15 tai sekvenssissä * 1 ,1··. 30 nro 17 esitetyn nukieotidisekvenssin, sekä sen analogit.

*«« « «« « st * »« \ , Esillä oleva keksintö koskee myös rekombinanttista ekspressiovektoria tai 9 1 1 » «» 1 rekombinanttista ekpressiokonstmktia, jota voidaan käyttää valittua serliniproteaasia 30 koodaavan nukleiinihapposekvenssin lisäämiseksi tai ilmentämiseksi soveltuvassa prokaryoottisessa tai eukarvoottisessa isännässä» Rekombinanttinen skspressiovektori käsittää DNArta tai nukleunihapposekveussejä» jotka helpottavat tai ohjaavat seriiniproteaasia koodaavan sekvenssin ilmentämistä ja erittymistä soveltuvassa 5 isännässä, kitten promoottoreita, tehostajia, terminaattoreita (mukaan lokien transkription ja translaation päättäniissignaaiit) sekä signaalisekvenssejä, jotka ovat toiminnallisesti kytkeytyneitä mainittua seriiniproteaasia koodaavaan polynukleotidisekvenssi in. Ekspressiovektori voi edelleen käsittää markkerigeenejä transtormattikantojen valintaa varten, tai selektiomarkkeri voidaan lisätä isäntään toisessa vektorikonstruktissa 10 kotransformoinnin avulla. Mainitut säätelysekveussit voivat olla homologisia tai heteroiogisia tuotanto-organismiin kanssa, tai ne voivat olla peräisin siitä organismista, josta seriiniproteaasia koodaava geeni eristettiin.

Esimerkkeihin promoottoreista keksinnön seriiniproteaasin ilmentämiseksi rihmasieni-15 isännissä sisältyvät promoottorit seuraavista: A. oryzaen TAKA-amylaasi, emäksinen proteaasi ALP ja trioosifosfaiitii-isorneraasL Rhizopus miehem lipaasi, Aspergillus nigerin tai 4. mvamorin glukoamyiaasi (glaA), Fusarium oxysporunm trypsiinin kaltainen proteaasi, Chrysosporhm iaeknowensen sellohiohydroiaasi 1 -promoottori, Trichoderma reesem sellohiohydroiaasi i (Cel?A.) jne, :Τϊ 20 x

Hiiv oissa ilmentymisen aikaansaamiseksi voidaan käyttää esimerkiksi promoottoreita T seuraavssta; S. cerevisiaen enoiaasi (ENO-1), galaktofcinaasi (GALI), ϊ i1J alkohoiidehydrogenaasi (ADH2) ja 3-fosfbglyseraattikinaasi.

««« * ♦ ♦ » * 1 « :***i 25 Esimerkkejä promoottori sekvensseistä keksinnön seriiniproteaasin transkription ohjaamiseksi bakteeri-isännässä ovat seuraavat: Escherichia colm /«e-operonän *;**J promoottori, Slreptomyces coeiicoiorm agaraasigeenin dagA promoottori, B.

T’} lickenifbrmism alta-amylaasigeeoin iamyL'} promoottori, B. stearothermophiiusin maltogeenisen amulaasigeenin (iUuvM) promoottori, 8. suMiiis xyiA ja xylB -geenien « « .***„ 30 promoottorit, jne.

* x *♦1 k <· *. , Soveltuviin terminaattoreihin sisältyvät edellä mainittujen geenien terminaattorit tai * 1 1 1 mitkä tahansa karakterisoidut terminaattorisekvenssit.

31

Soveltuviin transformaatio- tai seldktiomatkkereihin sisältyvät ne, jotka täydentävät ponteita isännässä, esim. «/«/-geenit lajeista >9. subtiiis tai S. Hckemformis, tai ÄspergiUus amdS ja niaQ. Selektio voi myös pohjautua markkerille, joka antaa antibioottista resistenssiä, kuten smpisillnni-, kanamysimi-, kioramfenikoli-, teriasykiiiai·-, 5 pleomysiini- tai hygromysihiiresistenssiä.

Keksinnön seriiniproteaasin solan ulkoinen erittäminen on edullista. Näin ollen rekombinanitiiien vektori käsittää sekvenssejä, jotka helpottavat erittämistä valitussa isännässä. Keksinnön seriiniproteaasin signaalisekvenssi tai presekvenssi tai prepeptidi 10 voidaan sisällyttää rekombinanttiseen ekspressiovektoriin, tai luonnollinen signaalisekvenssi voidaan korvata toisella signaalisekvenssillä, joka kykenee helpottamaan erittämistä valitussa isännässä. Näin ollen valittu signaalisekvenssi voi olla homologinen tai heierologiuen valitun ilmentämisessä käytetyn isännän kanssa, 15 Esimerkkeihin soveltuvista signaaiisekvensselstä sisältyvät sieni- tai hiivaorganismien signaalisekvenssil, esimerkiksi hyvin ilmennetyjen geenien signaalisekvenssit, jotka ovat alalla hyvin tunnettuja,

Rekombinanttinen vektori voi edelleen käsittää sekvenssejä, jotka helpottavat vektorin ϊΤ: 20 sisällyttämistä isännän kromosomaaliseen DNAdran stabiilin ilmentämisen ♦ iTt aikaansaamiseksi, * «»« ♦ «««f I Keksinnön Fa_RF7182-ptoteaasi ilmennettiin sen oman signaaiisekvenssin karissa *«« « :T: T. teesein cbhl (cei7A) -promoottorista, kuten on kuvattu esimerkissä 4.

25 limentsmiskonstrukti, jota käytettiin T. reesei -isännin transibrmoimiseksi, sisälsi myös cd/ri-ierminaatiorm ja umr/i-markkerin traasformanttien valitsemiseksi *:**; transibrmoimattomisia soluista,

K

«· * ♦

Esillä oleva keksintö koskee myös isäntäsoluja, iotka kirittävät edellä kuvatun kaltaisen « s A ' .♦**. 30 rekombinanttisen ekspressiovektorin. Soveltuvia isäntiä sieniperäisen * « * ' *««r seriiniproteaasientsyyrnin tuottamista varten ovat homologiset tai helerologisel isännät

O X

*, . Kuten irnkrobi-isarmät, mukaan lukiot bakteerit, hiivat ja sienet, Mahdollisia ovat myös * * * * «« tuotantojärjestelmät kasvi- tai nisaklssoluissa.

32

Rihmasienet kuten Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Hmnicola. Chrysosporhm Neurospora, Rhizopus, Penicillhm ja Mortirielia, ovat edullisia valnustusisäntiä johtuen jatkokäsittelyn ja enrsyyrnituotteen talteen ottamisen helppoudesta. Soveltuviin ilmentämis- ja tuotantoisäntäjärjestelmiin sisältyvät esimerkiksi tuotantoj&jestehnä, joka 5 on kehitetty rihmasieni-isännälle Trichoderma reesei (EP 244234), tai Aspergillus-tuotantojärjestelmät, kuten A. oryzae tai A. niger (WO 9708325, US 5,843,745, US 5,770,418), A. awamori, A. sojae ja ,1 japonicus -tyyppiset kannat, tai tuotantojärjestelmät, jotka on kehitetty Fasurtum-Iajetlle kuten F. oxysporum (Malardier ym,, 1989} tai F. venenamm, sekä lajeille Neurospora erässä, Rhizopus miehet, 1Ö Mortirielia alpinis, H lanuginosa tai H imolem tai lajille Chrysosporium lucknowensee (US 6,573,086). Soveltuviin hiivoille kehitettyihin tuotantojärjestelmiin sisältyvät järjestelmät, jotka on kehitetty seuraaviiie: Saecharomyces, Schizosaccharomyces tai Pichia pastoris. Soveltuviin bakteereille kehitettyihin tuotantojärjestelmiin sisältyvät tuotantojänestehnät, jotka on kehitetty suvulle Bacillus, esimerkiksi lajeille B. suhlilis, B. IS licheniformis, B. amyloliquefaciem. tai E. celille tai sädesienifie Strepiomyces. Edullisesti keksinnön seriiniproteaasi valmistetaan suvun Trichoderma tai Aspergillus rihmasieni-isännässä, kuten 7’ teeseissä tai A. niger, A oryzae, A. sojae, A. awamori tai A. japonicus -tyyppisissä kannoissa. Keksinnön edullisimman suoritusmuodon mukaan sieniperäinen proteaasientsyymi valmistetaan I teeseissä.

; 11 20 V t Tuotantoisäntä voi olla homologinen tai heterologinen keksinnön seruniproieaasin * kanssa, isännältä voivat puuttua homologiset proteaasit johtuen proteaasien poistamisesta « x •J ♦ joko inaktivoimalla tai poistamalla yksi tai useampi Isännän proieaaseista, esim. tällaisia V * homogeenisia tai homologisia proteaaseja koodaavan yhden tai useammat? geenin ♦ »* ϊ ί 25 deleetionvuoksi.

*♦ * * *ί**5 Esillä oleva keksintö koskee myös valmistusmenetelmää poiypeptidiiie, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet keksinnön «..«i luonnollisen tai rekombinantin, keksinnön seriiniproteaasin rekombinanttista 30 ekspressiovektoria kantavan isäntäsolun viljelemiseksi soveltuvissa olosuhteissa ja polypeptidin talteen ottamiseksi. Tuotanioeiatusaine voi olla eiatusaine, loka soveltuu * » e c« ** . isäntäorganismin kasvattamiseen sekä sisältää tehokkaan ilmentämisen vaatimat * * i w « «* indusorit. Tällaiset elatusaineet ovat kirjallisuudesta hyvin tunnettuja.

\ A

Keksintö koskee polypeptidiä, jolla on seriimpmteaasiakthvisuuita, jota polypeptidiä koodaa keksinnön nukleiinihappomolekyyli ja joka on saatavissa edellä kuvatulla menetelmällä.

S Keksintö koskee edelleen menetelmää sellaisen entsyymivalmisteen aikaansaamiseksi» jolla on sedin ipmteaasiakiri visu uita, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa viljellään keksinnön ekpressiovektoria kantavaa isäntäsolna ja joko oietaan polypeptidi talteen soluista tai erotetaan solut eiatusaineesta ja otetaan talteen supematantti, jolla on seriimproieaasiakttivisuutta.

10

Esillä oleva keksintö koskee myös entsyymivalmistetta, joka käsittää edellä luonnehditun seriiniproteaasienisyymin. Entsyymi valmisteella tai koostumuksella on serilniproteaasiaktlivisuutta ja se on saatavissa keksinnön mukaisella menetelmällä.

15 Keksintö kattaa entsyymivalmisteen, joka käsittää keksinnön sieniperäisen seriiniproteaasin.

Mainittu entsyymivalmiste voi lisäksi käsittää erityyppisiä entsyymejä tämän keksinnön seriiniproteaasin lisäksi, esimerkiksi toisen proteaasin, amylaasin» lipaasin, sellufaasin, ί,ί ϊ 20 kutinaasiin, pektinaasin, mannaasin, ksylanaasin ja/tai oksidaasin kuten hkkaasin tai ·,ϊ ί peroksidaasin mediaattorin kanssa tai ilman sitä. Näiden entsyymien odotetaan M’j* tehostavan keksinnön seriiniproteaasien vaikutusta poistamalla käsiteltävässä « « ♦ * · materiaalissa olevia hiilihydraatteja ja öljyjä tai rasvoja. Mainitut entsyymit voivat olla »4 « ί,·' ί luonnollisia tai rekombinanttisia entsyymejä, jotka isäntäkanta on Ulottanut, tai ne * # * ίΜ<ϊ 25 voidaan lisätä viljelmän supematanttiin valmistusprosessin jälkeen.

*ϊ**ϊ Mainittu entsyymi'valmiste voi lisäksi käsittää soveltuvat? lisäaineen, joka on valittu « "**·* ryhmästä, johon sisältyvät pinta-aktiiviset aineet puskurointiaineet, korroosionestoaineet, * «...ί stabilointiaineet, valkaisuaineet, mediaattorit, vedenpehmentäjät, syövyttävät aineet, .·**♦ 30 hankausalneet, optiset, kirkasteet, uudelleen tarttumista estävät aineet, väriaineet, * ** pigmentit ia säilöntäaineet jne.

» «4 * « « » * 4 ♦ *« * * 34

Pinta-aktiiviset aineet ovat käyttökelpoisia rasvan emuigoinnissa ja pintojen kostuttamisessa. Pinta-aktiivinen aine voi olla ioniton, mukaan lukien semi~poiaarin.en, ja/tai anioninen ja/tai kationinen ja/tai kahtaisiomnen.

5 Entsyymivalmisteeseen voidaan lisätä puskurointiaineita pH:n säätämiseksi tai muiden aineiden tehokkuuteen tai stabiiliuteen vaikuttamiseksi.

Soveltuviin stabilointiaineisiin sisältyvät polyoiit kuten propyleeniglykoli tai glyseroli, sokeri tai sokerialkohoii, maitohappo, boorihappo tai hoorihappojohdsnnaiset, peptidit 10 jne.

Valkaisuaineita käytetään orgaanisten yhdisteiden hajottamiseksi ja hajottamiseksi. Esimerkkejä soveltuvista kemiallisista vaikaisujärjestelmistä ovat HjOarn lähteet kuten perboraatti tai perkarbonaatti perhappoa muodostavien valkaisuaktivaattorien kuten tetra-15 asetyylietyleenidiamiinin kanssa tai ilman, tai vaihtoehtoisesti peroksihapot kuten amidi-, imidl" tai sulfonityyppiset Kemiallisia hapettimia voidaan korvata osittain tai kokonaan käyttämällä hapettavia entsyymejä, kuten kkkaaseja tai peroksidaaseja. Monet lakkaasit eivät toimi tehokkaasti mediaatlorien puuttuessa.

ί1Γί 20 Vedenpehmentäjiin tai kompleksointiaineisiin sisältyvät sellaiset aineet kuten zeoiihti, ?T: difbsfaattk trifosfaatti, karbonaatti, sitraani jne. Entsyymivalmiste voi lisäksi käsittää 'j1 yhtä tai useampaa polymeeriä, kuten karboksimetyvliselluloosaa, polyCetyleenigiykoiia), * i : polvi vinyylialkoholia), polytvinyylipyrrolidonla), jne. Voidaan lisätä myös pehmentimiä, :Tj syövyttäviä aineita ja säilöntäaineita muiden aineosien pilaantumisen estämiseksi, ί i 25 hankaus&ineitaja vaahtoamis- ja viskosiieettlomiuaisuuksia muuttavia aineita.

*J**J Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti mainittu entsyymivalmiste on *:**: nesteen, jauheen tai rakeiden muodossa.

« * « » ,1··, 30 Esillä olevat} keksinnön sieniperäistä proteaasia voidaan muiden proteaasien, erityisesti »«« „· emäksisien proteaasien, tapaan käyttää pesuaine-, proteiini-, panimo-, liha-, valokuvaus-, ♦ 1 * «« V e nahka-, meijeri-ja lääkeaineteollisuudessa (Kaiisz, 1988, Rao ym., 1998), Sitä voidaan * ♦ 1 * 1« w 1 esimerkiksi käyttää vaihtoehtona kemikaaleille, joita käytetään kuituisen proienniiätieen 35 (esim. sarvi, höyhenet, kynnet, karvat) muuntamisessa käyttökelpoiseksi biomassaksi, proteiinikonsentraatiksi tai aminohapoiksi (Anwar ja Saleemuddin, 1998), Esillä olevan keksinnön sieniperäisen seriiniproteaasin käyttö voi muiden entsyymien tapaan osoittautua hyväksi nahan laadun parantamisessa sekä ympäristön saastumisen 5 vähentämisessä ja energian säästämisessä, ja se voi emäksisten proteaasien tapaan olla käyttökelpoinen peptidien synteesissä ja D,L-aminohappqien seoksen erottamisessa. Subtilisiini käytettynä yhdessä yhdessä laaja-aiaisten antibioottien kanssa palovammojen ja haavojen hoidossa on esimerkki seriiniproteaasien käytöstä lääketeollisuudessa, ja näin ollen esillä olevan keksinnön sieniperäisellä seriiniproteaasilla voi myös olla tällaista 1C käyttöä, ja sitä voidaan emäksisten proteaasien lapaan käyttää myös veren poistamisessa kirurgisista laitteista sekä piilolinssien tai tekohampaiden puhdistuksessa, Kuten lajista Comäioboius coronatus saatavaa emäksistä proteaasia, esillä olevan keksinnön sieniperäistä seriimproteaasia voidaan käyttää korvaaman trypsiini eiäinsoluviljelmissä. Keksinnön proteaaseja voidaan myös käyttää kaivojen puhdistuksessa sekä biofilmien IS tuhoamisessa. Leivonnassa proteaaseja käytetään gluteeniverkon hajottamisessa sitkottomien taikinoiden aikaansaamiseksi, joiden vedensitomiskyky on hyvin alhainen. Muissa elintarvikesovelluksissa ruoan proteiinit hydrolysoidaan proteaaseja käyttämällä esimerkiksi proteiinin soluhilisoinda, renderointia (suuremman proteiimmäärän erottamisesta eläinten luista), uusien makujen tuottamista, kitkeryyden vähentämisestä, ίΤί 20 emulgointiommaisuuksien muuttamista, bioaktiivisten peptidien tuottamista sekä ϊ*Γ; proteiinien allergiaa aiheuttavien ominaisuuksien vähentämistä varten tai hiivan tai ·;· maidon käsittelemiseksi, Suhstraatteihin sisältyvät eläin-, kasvi- ia mikrobiperäiset t proteiinit e 9 * e { « ft * Λ S « <* J***i 25 PesuaineteoUisuus, erityisesti pyykinpesuaineteollisuus, on osoittautunut suurimmaksi yksittäiseksi käyttäjäksi proteaaseille, jotka ovat aktiivisia korkealla pH-alueelia (Anwar *ϊ**| ja Saleemuddin, 1998), ihanteellisella protsaasilla tulisi olla laaja substraattispesifisyys *:**! lukuisten erilaisten tahrojen poistamisen helpottamiseksi, jotka syntyvät ruoasta, ruohosta, verestä ja muista ruumiiueritteistä. Sen täytyy olla aktiivinen pesuaineliuoksen * e ,«♦, 30 pH:ssa ja ionivahvuudessa, pesussa käytetyissä lämpötilassa ja pH:ssa ja sen on »«» kestettävä mekaanista käsittelyä samoin kuin pesuaineisiin lisättäviä kelaatiranuodostajia % ** ja hapetusaineita. Proteaasin plm on oltava lähellä pesuaineliuoksen piriä. Nykyisestä * « *

N

36 energiakriisistä ja energian säästämiseen kohdistuvista pyrkimyksistä johtuen on toivottavaa käyttää proteaasia alhaisemmissa lämpötiloissa.

Esillä oleva keksintö koskee myös sernöiproteaasientsyymin tai entsyymi valmisteen 5 käyttöä pesuaineissa, tekstiilikuitujen käsittelyssä, villan käsittelyssä, hiusten käsittelyssä, nahan käsittelyssä, elintarvikkeiden tai rehun käsittelyssä tai missä tahansa sovelluksissa, joihin sisältyy proteiinimateriaalin muuntelu, hajotus tai poistaminen.

Keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto on näin ollen edellä määritellyn 10 seriiniproteaasientsyymin käyttö pesuaineiden lisäaineena, joka on käyttökelpoinen pyykinpesu- ja astianpesukoostumuksissa, mukaan lukien astianpesukonekoosiumukset.

Ilmausta "pesuaine” käytetään viittaamaan sellaiseen aineeseen tai materiaaliin, joka on avuksi puhdistuksessa tai jolla on puhdistavia ominaisuuksia. Termi “puhdistuskyky”' 15 viittaa puhdistavan ominaisuuden läsnäoloon tai asteeseen. Puhdistuskyvyn astetta voidaan testata erilaisilla proteiinista koostuvilla tai sitä sisältävillä substraattimateriaaleiHa tai tahroilla tai tahraseoksilla, jotka ovat kiinnittyneinä kiinteään, veteen liukenemattomaan kantajaan, kuten tekstiilikuituihin tai lasiin. Tyypillisiin proteiimmaiertaaieihin sisältyvät veri, maito, muste, kananmuna, ruoho ja kastikkeet. ϊΤϊ 20 Koetarkoituksia varten proteiinitahrojen seoksia on kaupallisesti saatavilla. Pesuatne-;Ti entsyymin tehtävänä on hajottaa ja poistaa proteiinipitoisia tahroja. Testitulokset •S* riippuvat tahran tyypistä, pesuaineen koostumuksesta ja pesukokeessa käytettävien : :*J tekstiilien ominaisuuksista ja tilasta (Maurer 2004).

« x « « * » * :***Σ 25 Tyypillisesti prote&asi tai pesutehokkuus määritetään riahranpoistotehokkaatena·' tai “tahranpoistovaikutuksena" tai ''puhdistusominaisuuden asteena”, mikä tarkoittaa näkyvää ja mitattavissa olevaa vaaleutta tai värin muutosta tahrautuneessa materiaalissa, *:**: esim. keinotekoisesti liatuissa kangasnäytteissä ("swatch”) tai koekankaissa. Vaaleus tai » „„· muutokset väriarvoissa voidaan määrittää esimerkiksi mittaamalla väriä heijastusarvolna * * 30 spektrofotometriliä käyttäen L*a*h*-vMavarauskOordinaatteja, kuten esimerkeissä 6™1Ö * ♦

«»K

on kuvattu. Proteaasin tehokkuuden (tahranpoistotehokkuuden) osoittava proteiluitahran « V ♦ * * \ . haalistuminen tai häviäminen lasketaan esimerkiksi arvona ΔΙΛ joka tarkoittaa * φ » ’ * entsyymikäsitellyn kankaan vaaleusarvoa L*. josta vähennetään pelkällä puskurilla 37 käsitellyn kankaan (entsyymin nollanäyte) vaaleusarvo L*. Pesuaineen läsnäolo voi parantaa entsyymin tehokkuutta tahrojen poistamisessa.

Esillä olevan keksinnön seriiniproteaasi hajottaa erityyppisiä proteiinitahroja neutraalin 5 tai emäksisen pH:n olosuhteissa ja jopa koostumukseltaan erilaisten pesuaineiden läsnä ollessa (kuten on osoitettu esimerkeissä 6-11),

Kuten on esitetty esimerkissä 6, keksinnön seriiniproteaasi poisti veri/maito/muste~ standardkahran 50 °C:ssa ja erityisesti 30 °C:ssa pH-arvoltaan 9 olevassa puskurissa ja 10 säilöntäaineiden kanssa paremmin kuin. kaupalliset proteaaslvalmisteet Savinase® Ultra 161. ja Purafect® 4ÖÖÖL (kuviot 5 ja 6). Entsyymivaknisieei annosteltiin akliivistmsyksikkoinä.

Fa__RF7182-proteaasin tehokkuutta testattiin myös pesuainejauheessa lämpötilassa 15 40 °C /50 °C ja pH-arvossa 10 esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Määritettiin entsyymin kyky poistaa veri/maito/muste-standarditahroja polyesteri-puuviliamateriaalista (Ari. 117, EMPA) fosfaattipitoisen vertailupesuaineen läsnäollessa. Kutakin entsyymi valmistetta annosteltiin aktiivisuusyksikköinä (pmol tyrosimia/min), Kuten on esitetty kuvioissa 7 ja 8, keksinnön proteaasi soveltuu myös jauhemaisiin pesuaineisiin :T? 20 hyvin emäksisissä olosuhteissa. Fa RF7.!82-entsyvmin tehokkuus oli vastaava kuin :T; kaupallisen proteaasin Puraiset® 40Ö0L lämpötilassa 40 °C.

* s * * « V * <·« : t : Pa_R.P7182-proteaasi poisti veri/maito/muste-standarditahran polyesteri-puuvilla- t i*J materiaalista (Art. 117, EMPA) myös nestemäisen pesuaineen Ariel Sensitive (Procter & S* *; 25 Gamble, UK) läsnäollessa ilman entsyymejä, kuten on esitetty' esimerkissä k. Entsyymiä annosteltiin aktivisuusyksikköinä (pmol tyrosiinia/min/tilavuus). Annostus, joka oli 4-8 *:**: yksikköä kaupallisia entsyymi-valmisteita per mi nestettä, vastasi annostusta, joka oli noin *♦**: 0,2--0,5 % entsyymivalmistetta pesuaineen painoa kohden, mikä on tyypillinen s käyttömäärä pesuaine-entsyymeille, Pa R.F?!82:n tehokkuus oli erinomainen * * »**♦, 30 nestemäisen pesuaineen kanssa (kuvio 8) ja tahramateriaalin vaaleuden lisääntyminen oli » » « * « „· huomattavasti suurempi kuin kaupallisilla valmisteilla Savinase® Ultra 14L ja Purafect® : ** 400ÖL, * « * * o ·> t» » « 38

Vastaavia tuloksia saatiin, kun testaisin Fa_RF7182-enteyymin tehokkuutta käyttäen erilaisia pitoisuuksia nestemäistä pesuainetta (esimerkki 9, kuviot 9A--D ja lö A-~D), Fa_RF7182:jn tehokkuus veri/maito/muste-tahraan oli huomattavasti korkeampi verrattuna kaupallisiin valmisteisiin Purafect® 4000L ja Savinase® Ultra 16L 5 molemmilla pesuaineilla ja kaikilla pesuainepitoisuuksilla, kun annosteltiin sama afctimsuusmäärä. Myös siiloin, kun annostus laskettiin lisätyn proteiinin määränä (kuviot 9Bja 1ÖB), tahranpoistotehokkuus oli korkein Fa RF7182:11a

Puuvilla- tai polyesteri-puuvilia-kankailla olevien veri/maito/musie-tahmjen lisäksi 10 F&JIF7182«seriimproteaasi oli tehokas myös muiden tahrojen kuten ruohon (Art, 164, ΕΜΡΑ,ϊ ja kaakaon (Art. 112, EMPA) poistamisessa testattuna nestemäisissä pesuaineissa 30 °C:ssa. Käsittelyt suoritettiin ATLAS LP-2 Launder-Ometer -laitteella. Tulokset (kuvio li) osoittavat, että Fa (RT? 182 oli tehokas poistettaessa erilaisia tahroja alhaisissa lämpötiloissa, kuten 30 °C:ssa.

15 T. reeseissä valmistetun rekombinanttisen Fa__RF7182~entsyyrnivalmisteen tehokkuutta testattiin nestemäisen pesuamepohjan läsnä ollessa täydessä mittakaavassa pesukoneessa 30 °C:ssa (esimerkki i I) ja sitä verrattiin kaupallisiin valmisteisiin Savmase® Ultra 161, ja Puraiect# 4ÖÖÖL. Kahdeksan erilaista profeaasille herkkää seurantakangasta (’’tracer”) ;T: 20 haittavaikutusten testaamiseksi on esitetty taulukossa 5 ja prosessiolosuhteet taulukossa 6· Kokeissa käytetyt entsyymin annostukset on laskettu sekä entsyymiaktiivisuuksien että *:♦ entsyymin proteiinimäärän perusteella. Kuvioissa 12 ja 13 esitetyt tulokset erilaisille : tahroille osoittavat, että FaJRF71S2-profeaa$i oli tehokkaampi kuin kaupalliset eatsyvmivalmisteet. Fa.RF?182 oli tehokkain, kun kyseessä oli veri/maito/muste. 25 suklsa/maito. maapähkinäöljv/maito ja munankeltuainen (kuvio 13).

♦:**: Kuten havaitaan kuvioista 5-11, koemateriaalin vaaleus L1 lisääntyi huomattavasti, kun *:**: läsnä oli keksinnön sieniperäinen seriiniproteaasi. Käytettäessä FaJRF7l82- entsyymivalmistetta saatiin aikaan kilpaileviin tuotteisiin verrattuna parempi vaaleus * 1 ,1··, 30 vastaavalla entsyymiaktiivisuuden annostuksella, eli toisin sanoen aikaansaatiin x a *** kilpaileviin tuotteisiin verrattuna vastaava vaaleus alhaisempia entsyymiaktiivisuuden s ♦ annostuksella.

* 1 « x « « «» • 1 39

Fa_RF?l 82-proteaasia testattiin myös täyden mittakaavan kokeissa 30 °€:ssa käyttäen nestemäistä pesuainetta ja joukkoa proteaasiherkkiä seurantakankaita (esimerkki 11 >. Näissä kokeissa kokonaistahranpoistovaikutus» joka perustui kahdeksalla erilaisella proteaasiherkällä tahralla (tahrat 1-8, taulukko 5} saatuihin tuloksiin, oli huomattavasti 5 korkeampi Fa_RF7182:11a verrattuna kaupallisiin proteaasivalmisteisiin Porafeet® 4000L ja Savinase® Ultra I6L, kun proteaaseja annosteltiin aktiivisuuden määränä (kuvio 12A). Fa_RF7182 oli tehokas erityisesti, kun kyseessä oli veri/maito/muste, suklaa/maito. maapähkinäöljy/maito ja munankeituainen (kuviot 13A-E).

10 Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti keksinnön sieniperäinen seriiniproteaasl on käyttökelpoinen nestemäisissä tai jauhemaisissa pesuaineissa, kuten on osoitettu esimerkeissä 6-11. Keksinnön entsyymi tai entsyymivalmiste voidaan formuloida käytettäväksi käsinpesussa tai konepesussa, tai se voidaan formuloida käytettäväksi kotitalouksien kovien pintojen puhdistuksessa tai edullisesti astioiden pesussa käsin tai 15 astianpesukoneella.

ESIMERKKI 1. Fusarium acuminatum FaJRF7182 -proteaasin valmistus ja puhdistaminen ϊΤ: 20 (a) Fasarium acuminatum Fa RF71.82-pmteaasm viljely ♦ e k * « X « « » « *

Sienikanta, jolle oli alun perin annettu nimi TUB F-2008, oli eristetty aiemmin * * 4 * l ;*♦ maaperänävtteestä rihmasienenä, joka kasvo? emäksisellä (pH 8,5) agaroostlevyllä. Se * «o x v ;*♦*: aikaansai proteaasiaktiivisuutta agarlevylle sisällytetyn kaseiinin ja hemoglobiinin ;*”· 25 hydrolyysin perusteella. Koska viljelyt maljoilla suoritettiin noin 8-10 °C:ssa, tämä tulos viittasi siihen, että TUB F-2008 tuotto, proteaasia tai proteaaseja. jotka toimivat kylmissä ·«««♦ lämpötiloissa. TUB F-2008 tunnistettiin lajiksi Fusarium acuminatum Ellis & Everh ··*»* (tunnistaja Arthur de Cock, tunnistuspalvelut, Centraibureau Voor Schimmelcultures, „*φ* P.ö. Box 85167, 3508 AD Utrecht, Alankomaat), ja sille annettiin uusi nimi RF7.182.

4 * y. 30 Kamaa F. acumimtum Fa_RF7! 82 kasvatettiin, ylläpidettiin ja se saatettiin tuottamaan * 4 *·* itiöitä peruna-dekstroosi (PD) -agarissa (Difeo) -;-4 °C:ssa. Entsyymin valmistusta varten « x K ” itiöitä RF? 182-vinopmnoiita siirrostettiin elatusaineeseen, joka sisälsi 30 g/i * * « * * maissijauhoa (hieno jauhatus), 5 g/1 CSL-jauhetta (/Torn steep powder'), 4 g/1 40 soijajauhoa (vähärasvainen). 2 g/! KF^PO^a, 1 g/l NaCl:a ja I g/i parafiiniöljyä. Elatusaineen pH säädettiin ennen sterilointia NaOH:1.1a arvoon S»5 ja elatusametts käsiteltiin, autoklaavissa 30 min ajan 121 Arissa. Mikrobia viljeltiin 50 ml tilavuudessa ravistimessa (220 rpm) 28 °C:ssa 7 päivän ajan. Käytetyn viljelmän sopsmatantm S osoitettiin sisältävän emäksistä proteaasiaktiivisuutta, kun aktiivisuusmhtaukset suoritettiin (esimerkin le mukaisesti) eri pH-arvoissa (pH 7-1 ö). Tämän emäksisen aktiivisuuden vuoksi kanta RF7I82 valittiin oletetuksi proteaasigeenin luovuttajakannaksi.

10 (b) Proteaasin puhdistus F acuminatum FaJRF7J82:n elatusaineesta

Solut ja kiinteät aineet poistettiin käytetystä elatusaineesta sentrifugoimalla 30 min ajan 50 ÖÖÖ g:ssa lämpötilassa +4 °C (Sorvali RC6 plus), Supematantista 50 ml käytettiin proteaasin puhdistamiseen. Sentrifugoinnin jälkeen supematandn pH. säädettiin arvoon

15 8.0 lisäämällä HCI:a. Sitten supematantti suodatettiin 0,44 μηκη suodattimen (MILLEX

HV Millipores läpi ja lisättiin 5 ml:n Q Sepharose FF -kolonniin (GE Healthcare), joka

oli tasapainotettu 20 mM Tris-HChssa, pH 8. Läpivirtausfraktio otettiin talteen ja sen pH

laskettiin arvoon 7,5 lisäämällä HCka. Kiinteää ammoniumsulfaattia lisättiin läpivirtausfraktioon, niin että lopulliseksi suolapitoisuudeksi saatiin 1 M. Sitten iTi 20 läpivirtausfraktio suodatettiin 0,44 pm:.» suodattimen läpi emien kuin se lisättiin fenyyli- « ;*Γ; Sepharose HP (5 ml) -kolonniin (GE Healthcare), joka oh tasapainotettu 20 mM Iris- HChssa - IM ammoniumsulfaatissa, pH 7,5. Proteiinit eluoitiin lineaarisella laskevalla : ϊ"; ammoniumsuliäattigradientilla (1 —* 0 M). Fraktiot, joiden koko oli 5 ml, kerättiin ja analysoitiin proteaasin aktiivisuuden suhteen resoruilini-leimatulla kaseiinilla * Λ ;***; 25 (Boehringer Mannheim Biochemica) pHrssa 8,0 valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Fraktiot, joissa oh proteaasiakiiivisuutta, yhdistettiin ja ultrasuodat.ett.iin käyttäen 10 km. kaivoa (Amicon). Konsentroitu suodos lisättiin Superdex 75 10/300 GL -kolonniin *:♦*! (GE Healthcare), joka oli tasapainotettu käyttäen 20 rnM Tris-HCha ·· 200 mM NaCka, pH 7,5. Proteiinit «tuohiin samalla puskurilla ja 0,5 mi:n fraktiot otettiin talteen. Näiden * » „**·„ 30 .fraktioiden proteaasi aktiivi suos analysoitiin. Fraktiot, joissa oli proteaaslaktiivisuutta.

* * analysoitiin natriurndodekyylisulfaatri-polyakryyliamidigeelselektroforeesilla (SDS- * « % ** PAGE), Fraktioiden osoitettiin sisältävän yhden pääasiallisen proteiinikaistan, jonka ’ * moiekyylimassa oli noin 29 kt>a. Valitut fraktiot yhdistettiin. Yhdistettyjä fraktiotta 4! käytettiin valmistettaessa peptideitä (esimerkki 2). Aktimsuusmääritysten mukaan puhdistetun proteiinin pH-optimi oli arvossa pH 10. Tälle puhdistetulle F. acuminatum Fa__RF?182 -proteaasille annettiin nimi Fa_RF7182.

5 (e) Proteesin aktiivisuusmäärifys

Proteaasm aktiivisuus määritettiin kaseiini-Folin-Cioeakeau-menetelmäilä. Määrityksessä käytetty kaseiinisubstraatti valmistettiin seuraavalla tavalla: 6 g kaseiinia, Hammerstein Grade. MP Biomedicals. LLC (101289). liuotettiin 500 rnbaan seuraavia: 10 100 mM Tris» 20 μΜ CaCG, 2 μΜ MgCk, 25 μΜ NaHCOj. Substraatiiliuoksen pH

säädettiin arvoon 9,0 käyttäen BCi:a. Bntsyymireaktiot pysäytettiin käyttäen TCA-liuosta, Joka sisälsi 0,11 M T€A:a, 0,22 M natriumasetaattia, 0,33 M etikkahappoa ja 0,5 M NajCO^a 1 000 mkssa tislattua vettä. Määrityksessä käytetty Folin-reagenssi valmistettiin laimentamalla 25 ml 2 N Folin-Clocalteun fenolireagenssia (SIGMA, 15 F 9252) 100 milliiitraksi käyttäen tislattua vettä. Reaktio käynnistettiin inkuboimalla ensin 2,5 ml substraattiliuosta 5 min ajan annetussa lämpötilassa, minkä jälkeen lisättiin 0,5 ml entsyymiliuosta ja reaktiota jatkettiin 15 min tai 30 min. Kun reaktio oli jatkunut 15 min tai 30 min, 2.5 ml reaktion pysäytysliuosta lisättiin, sisällöt sekoitettiin ja niiden annettiin seistä 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Putkia sentrifugoinin nopeudella iT: 20 4 000 rpm 10 minuutin ajan (Hettich Rotanta 460). Yksi mi kirkasta supematanttia iT: pipetoitiin ja sekoitettiin 2,5 mkaan 0,5 Ml Na?€Oy.a ja 0,5 mkaan laimennettua Folin- *j* reagenssia. Kun oli odotettu 5 min (värin kehittyminen), seoksen absorbanssi (väri) l määritettiin aallonpituudella 660 nm entsyymin nollanäytteeseen verrattuna, Entsyymin «φψ ΐ ;Τϊ nollanäyte valmistettiin seuraavalla tavalla: 0,5 ml entsyymiliuosta sekoitettiin 2,5 mkaan * * ;***: 25 pvsävtysliuosta ia 2,5 mkaan substraattia ja seosta inkuboiiiin 15 tai 30 min annetussa ΦΦ * .VN·· lämpötilassa. Yksi entsyymiaktiivisuusyksikkö määritettiin sellaiseksi emsyys-nimääräksi, *;**: joka vapauttaa happoiiukoisen proteiinin hydrolyysituotetta määränä, joka vastaa 1 gg ♦j*·: tyrosiinia per yksi ml reaktioseosta minuutissa,.

* » x * X «« * * * X ««* * * X »» « * « « « « «» » « ESIMERKKI 2, Puhdisteta F, acuminatum RF?l82~pro$eaasi» N-termiaaaiisea ja mämen asiiaehapposekvessoisti

Sisäisten sekvenssien määrittämiseksi Coomassie Brilliant Blue -värjätty kaista leikattiin S iiti polyakryyiiamidigeelistä ja digestoitim oleellisesti ”in-geP\ kuten ovat kuvanneet Shevchenko ym. (Shevchenko ym., 1996). Proteiinit pelkistettiin ditictreitoliila ja aikyloitiin jodiasetamidilla ennen digestiota trypsiinillä (Sequencing Grade Modified Trypsin, V 5111, Promega).

10 Sähkösulhkutusiomsaatio-kvadrupoli-Iemoaika-tandemmassaspektrk de novo - sekvensointia varten tuotettiin käyttäen Q-TOF-iaitetta (Micromass, Manchester, UK), joka oli kytketty Ultimate-nano-nestekromatografiin (LC-Packmgs, Alankomaat) oleellisesti aiemmin kuvatulla tavalla (Poutanen ym., 2001), mutta käyttäen 159 pm x 1,0 mm -eristyskoionnia (3 pm, 120 Ä, #222403, SGE Ltd UK) peptidien 15 esikonsentromtia varten.

N-terminaalista sekvenssianalyysiä vartoi SDS-PAGE-eroteiiut proteiinit siirrettiin efektrobiottaamaila polyvinylideenidifluoridikalyolie (ProBlott: Perkin Elmer Applied Biosystems Division, Foster City. Kalif). Kun ne oli värjätty Coomassie Brilliant iT: 20 Bluella. kiinnostavat proteiinikaistat poistettiin ja niille suoritettiin N-terminaalinen ί : i sekvenssianalyysi Edman-haiotuksella Proeise 494A -proteiinisekvensseri$s§ (Perkin

Elmer Applied Biosystems Division, Foster City, Kalif.), » * ♦ « *

* ♦ X

**« * 1*1*i Puhdistetusta Fa_RF7182-proteaasista määritetyn N-terminaaliset ja sisäiset a «r * : : 25 peptidisekvenss.it on esitetty taulukossa 1. Peptidisekvensseillä oli havaittavissa homologiaa verrattuna julkaistuun hypoteettiseen Gibherella zeacn (Fusariim *ϊ**ί gnminearum) proteaasisekvenssiin nähden, jonka EMBL-talletusnurnero on XP 383491.

"**: Sekvenssien vertailun mukaan saadut pepiidisekvenssu sijaitsivat lähellä kypsän

Fa RF7182~proteiinin N-päätä.

« x ««« « * * * *s* « »« Φ X * «»

S

♦ * * * * X «« * « 43

Taulukko 1. F acuminatum RF7182 -proteaasssia FaJRF7182 määritetyt N-terminaaliset ja sisäiset peptMisekvenssk

Peptidi Sekvenssi Sekvenssi Kommentteja aro #3811 Ä(L/I)TXQSNÄPW Sekvenssi N-tenninaalinen nro 1 sekvenssi 1609Λ80.......SGAPWG(L/I)Q(L/I)SHK Sekvenssi nro 2 lm957 (ÄM)(AM)frpÄPWG.....................................Sekvenssi ’ “ (L/I)GA(L/I)SHK nro 3 "743,494 (A/N)(A/N){L/l){L/IjSVK Sekvenssi.......................................................

nro 4 2103,832 GGAHTB Sekvenssi (aloitus nro 5 2045,06} 21Ö3J32..... NGHGTHVAGT<M)NTK Sekvenssi (aloitus nro 6 1406.57) * « » _____ "3662,692 TSV(L/I)YDTTAGSGS¥GYWBSG(L/I) Sekvenssi x « » N(L/X}AHYS(L/I)NR nro 7 VK1 « ........................................................—......................................................................——'— --------— --------------------------------------------- «>«« * 1 » 1 » » X « «1« « ,» * X ♦ ♦ 1 1

Esimerkki 3. Fa_RF7182-proteiinia koodaavan E acuminatum RF7I82 -geenin « 1 "1"1 kloonaus

X

Χίΐ»ί V 1 , (a) l>NA:s eristäminen ja käytetyt molekyylibiologian menetelmät ♦ 1 » iö 1 Tavanomaisia molekyylibiologian menetelmiä käytettiin DNA:n eristämisessä ja *«1 * ♦ euisyynukäsittdyissä. (esim. plasmidi-DNArn eristäminen, DNA:n digestio DNA-:1·«, fragmenttien aikaansaamiseksi). E, coli -transformaatioissa, sekvensoinnissa jne. Näitä ϊ\: perusmenetelmiä käytettiin joko entsyymin, reagenssin tai pakkauksen valmistajan 44 ohjeiden mukaan tai tavalla, joka on kuvattu tavanomaisissa molekyylibiologian oppikirjoissa, esim. teoksessa Sambrook ja Russell (2001). Genomisen DNA;u eristäminen F. acuminatum RF7182:sta suoritettiin tavalla, jonka ovat yksityiskohtaisesti kuvanneet Raeder ja Broda (1985).

5 (b) Alukkeet koettisnien valmistusta varten

Koetin Fa_RF7182-proteiinia koodaavalle geenille monistettiin PCR-menetelmällä, Degeneroituneet sense-oiigonukieotidit suunniteltiin puhdistetusta RF?l82:sta saatujen lö peptidien aminohapposekvenssien perusteella (taulukko 1) ja amisense-oligonuMeotldit käyttäen valittua konsensusaluetta erilaisista julkaistuista S8-tyypin seriiniproteaasisekvensseistä, Konservo ihmeet sekvenssialueet määritettiin rinnastamalla sekvenssit, joiden tailetusnumerot olivat AARI 1460 {Trichophyton rubrum), CAD2401Ö iMicrosporum cams), AAT65816 {Peniciiiium nordicum}, Q5NDCÖ {Peniciiiium 15 chrysogenum) ja AAC27316 (Ftisarium oxysporum). Alukkeiden yhdistelmät PCR-reaktioissa valittiin julkaistuissa proteaasisekvensseissä olevien peptidihomologlen sijaintien perusteella, Alukkeiden sekvenssit on esitetty taulukossa 2 (sekvenssit nro 8~ 11).

x*« *i ϊ 20 Taulukko 2, Oligonakleotidit (sekvenssit nro S-8), jotka syntetisoitiin PCR» **« i.J » alukkeiksi koetinten monistuksessa. Oiigot, sekvenssinrot, oligojen pituudet ja * degeneraatiot, oligonukieotidit ja peptidin aminohapot, joita käytettiin * ♦ ϊ ί J olisonukleotidisekvenssin suunnittelussa.

*♦» * w »«a ♦ is s ί » s

Origo Sekvenssi Pituus Degene- Sekvenssi** i Peptidi^" nro (isukleo- raatiota tidiä) *:·*2 'PRO123 8 *20 1024 CARWCNGGNGCNCCOTGGGG 179p5? * ξ § ΐ "*/ 'PR0122’9......................+2Ö...............TÖ24.........CAYG^ '2103,832 (si (aloitus ______________ 1406,57) PRO60 10 22 64 GMRGCCA.tRGÄÖGTWCCRöfSÄ «,* _ _ (as)__

I "·· ?RG61 n...................+2G *32 GGMGMRGCCATRGAGGTWCC

.................................. (as) * * 1 45 {aR == A tai G. S =- C tai G, W = A tai T, M = A tai C, Y = T tai €, N ==== A, C, I tai G; “s” sulkeissa = sense-juoste, “as” sulkeissa = antisense-juoste Peptidiseksenssit on sisällytetty taulukkoon 1.

5 (e) PCR-reaktiot ja koeitimien valinta kloonausta varten F. acuminatum RF7182;n genomista DNA:ta käytettiin templaattina koettimien

synteesille. PCR-reaktioseoksen sisälsivät 1 x Phusion™ GC -puskuria, 0.25 roM

dNTPsta, 5 % DMSOta, 1 μΜ kutakin aluketta ja 2 yksikköä Phusion™ DNA- 10 polymeraasia (Finnzym.es, Suomi) sekä noin 3 pg genomista DNA:ta IÖ0 μΐ reaktiotilavuutta kohti. Olosuhteet PCR-reaktioilie olivat seutaavat: 1 niin aikudenaturaatio 98 °€:ssa, minkä jälkeen 29 sykliä seuraavaa: 10 s 98 °C:ssa» 30 s liittäminen 48-58,5 °C;ssa, 30 s pidentäminen 72 öC:ssa, sekä loppupidentäminen 72*€:ssa 5 min ajan, Aiukeyhdisteimä PRO 123 (sekvenssi nro 8) ja PR061 (sekvenssi 15 nro il) tuotti spesifisen DNA-tuotteen, jonka koko oli odotettu (laskettu julkaistujen sieniperäisten proteaasisekvenssien perusteella). DNA-tuote eristettiin ja puhdistettiin PCR-reaktioseoksesta ja kloonattiin pCR*4-TOPO* -vektoriin valmistajan ohjeiden mukaisesti (hiviirogen, USA). Kooltaan 753 bp:n PC-R-ftagmentti sekvensoitiin tästä plasmidista (sekvenssi nro .12). Tälle PCR-monistetun DNA-fragmentin sisältävälle **♦ ^ V * 20 pCR&4~TOPO^“plasmiöilie annettiin nimi pALK253ö. Plasmidin pALK2530 sisältävä E.

*·* * colt -kama RF78Ö3 talletettiin DSM-kokoelmaan taifetosnumeroila DSM 22208.

« *r S < * «««« ♦ ♦ X « » i*· * PCR-iragmentin johdettu aminohapposekvenssi sisälsi sekvenssit sisäisille RF7182- e *· * ^ ♦ ♦ * peptideille sekvenssintot 1-7. Sekvenssien nro 6 ia 7 peptidit sekä sekvenssin nro 2 * * * v « ♦ *♦·♦* 25 peptidin C-terminaatiaes. osa peptidit olivat osittain yhdenmukaisia johdetun aminohapposekvenssin kanssa. Sekvenssien nro 4 ja 5 peptidit sekä sekvenssin nro 3 » X ««« peptidin C-terntinaatinen osa olivat täysin yhdenmukaisia (taulukko 1 >. Tämä vahvistaa ♦ t»4»t sen, että PCR-reaktiolia aikaansaatu DNA-frasmentti oli osa Fa RF7i82-proteiinia *ί**ϊ koodaavaa geeniä, ja sitä käytettiin näin olleti koettimena täysphkän geenin seulomisessa i i 30 F. acuminatum RF7182 :n sanomisesta DNA:sta.

* * ♦ K < « « « * * » « « * « ♦ «> * * 46 (d) FaJRF7182-proteaasia koodaava» K acuminatum RF7182 -geenin kloonaus F. acwnimtumm genomiaen DNA digestoftiin useilla restriktioentsyymeillä Southern blot -analyysia varten. Hybridisaatio suoritettiin 771 kb:n £coRI-fragmeutin kanssa, joka S sisälsi sekvenssin nro 12. katkaistu plasmidista pALK2530 koettimena (esimerkki 3c). Edellä mainittu koetin leimattiin käyttäen digoksigenimiä valmistaan ohjeiden mukaisesti (Roche, Saksa). Hybridisaatio suoritettiin yön yli 65 °C:ssa. Hybridisation jälkeen suodattimia pestiin 2 x 5 min huoneenlämpötilassa käyttäen 2 x SS€:a - 0,1 % SDS:a, ja sitten 2 x 15 min 65 °C:ssa käyttäen 0,1 x SSC:a - 0,1 % SDS:a.

10 F. acuminatum RF7182:n digestoidusta genomisesta DNArsta voitiin havaita useita hybrldisoituvis fragmentteja. Genomiset Sar/I-digestiot sisälsivät hybridlsoltuvan fragmentin, jonka koko oli 5 kb. Julkaistuihin sieniperäisiin proteaasisefcvensseihin perustuvien laskelmien perusteella yksittäisen hybridisoituvan fragmentin koko oli 15 riittävän suuri sisäitääkseen täyspitkän RF7182-proteiinia koodaavan geenin. Genomiset DNA-fragmentit eristettiin RF7182:n genomisista Surfl-digestiosta hvbridisoituvan fragmentin kokoalueelta. Genomiset fragmentit eristettiin agaroosigeeiistä ja kloonattiin pBluescript II KS+ (Stratagene, USA) -vektoreihin katkaistuina Sn/ldla. Ligaatioseos transformoitiin Escherichia coli XLIÖ-Gokl -soluihin (Stratagene) ja msljatttin LB ·1·1♦ 20 (Luria-Bertani) -maljoille, jotka sisälsivät 50-1ÖÖ pg/mi ampisiiliinia. E. coli -pesäkkeet *‘;G seulottiin positiivisten kloonien suhteen käyttäen pesäkehybridisaatiota, pALK253ö:n s ollessa insertoitu koettimena. RF7182:n dlgestoiduille genomisille DNA-fragmenteille • 2· suoritettiin hybridisaatio kuvatulla tavalla. Maisoilta otettiin taiteen useita positiivisia e««1 e **♦2; klooneja ja yksi vahvistettiin sekvensoinnilla, Täyspitkä geeni, joka koodasi Fa Rf7182- ;3i 25 proteaasia (sekvenssi nro 13) sekvemoitiin 5 kb:n SuO-insertistä ia tämän laseriin ex1 sisältävälle plasmidille annettiin nimi pALK2531. Flasmidln pALK2531 sisältävä t, coli *i2j -kanta RF7879 talletettiin DSM-kokoelmaan talletusnumerolla DSM 222Ö9. Fa_RF7182« *i2i proteaasia koodaavalle geenille annettiin nimi Fa prtSSA.

« a * 1 X1« « 1 * 1 ***

X

** X « X 2 ft * 1 1 2 ♦ x» 3 Φ « .} "? *+ f (e) Fa_RF7i82~preteaasia koodatavan geenin karakterisointi ja johdetta aminohapposekvenssi faprtSBA -sekvenssi (sekvenssi nro 13) ja johdettu aminohapposekvenssi (sekvenssi nro 5 14) on esitetty kuvioissa IA ja IB. Geenin pituus on 1 353 bp (mukaan lukien lopetuskodom). Löydettiin kaksi oletettua intronia, joiden pituudet olivat 51 bp ja 54 bp (0!- ja 3’-rajasekvenssit sieniperäisten Intronien vastaavien mukaan, kuten ovat esittäneet Gurr ym. (1987), Johdettu proteiinisekvenssi (sekvenssi nro .14) koostuu 41.5 aminohaposta mukaan lukien 20 aminohapon ennustettu signaalisekvenssi (SignalP iö V3.0: Nielsen yra., 1997, sekä Nielsen ja Krogh, 199S). Sekvenssien nro 1.-3 peptiden N-terminaalisei osat, jotka eivät sisältyneet koetinsekvenssiin, sisällytettiin johdettuun aminohapposekvenssiin. Sekvenssin nro 3 peptidi oli täysin yhdenmukainen johdetun aminohapposekvenssin kanssa. Ennustettu molekyylimassa oli 28 568,64 Da kypsälle polypeptidiile ja ennustettu pl 9,08. Nämä ennusteet tehtiin käyttäen Compute pl/MW -15 työkalua ExPASy -palvelimella (Gasteiger ym.» 2003). Johdettu aminohapposekvenssi sisälsi kaksi mahdollista N-glykosylaatiokohtaa aminohappoasemissa Asn?9 ja Asn258 (kuvio !), mutta CBS-paivelimen NetNGlye VLö:n mukaan ainoastaan kohta asemassa Asn79 (sijaitsee propeptidissä) on todennäköinen.

:Ti 20 (f) Homologia-, identtisyys-ja rmsastustatkimekset * 1 * > « « * s 1 » •J" Homologkuta julkaistuihin proteaasisekvensseihin nähden etsittiin käyttäen BLASTX- : ohjelmaa, versio 2.2.9. NCBEssa (National Center for Biotechnology Information) :*Γ: oletusasetuksilla (Altschul vm., 1990). Suurimmat homoiogiat olivat hypoteettisen :***: 25 proteiiniin Gihberella zeaesta (Fusarium gramimarum) (EMBL~talletusnamero *«« ' XP_383491) ja Hypocrea Imin (Trichoderma karzianum) seriiriendopeptidaasiin *:**: (EMBL-talletusnumero CAL25508). Homoiogiaa todettiin myös sekvenssiin nähden, *i**i joka sisältyy patenttihakemukseen OS 60/818,910 (Catalyst Biosciences Inc.) sekvenssinä nro 313, Kypsä RF?IHl-aminohapposekvenssl rinnastettiin edellä .·♦% 30 mainittujen homologisten kypsien aminohapposekvenssien kanssa. Taulukossa 3 on ««4 esitetty identtisyysarvot, jotka saatiin käyttäen CiusialW-rinnastusta 9 « \ ** (www.ebi,ao.uk/Tools/elttötalw: matriisi: BLOSUM, aukon muodostus: Hi, aukon x « « 5 laajennus: 0,5.. EMBL-EBI), 48

Taulukko 3, Identtisyysarvot {%), jotka saatiin FaJRF7182~proteaasi» johdettujen am luo h a pposekven ss ien C lasta 1 W-rin o aste ksest a. Rinnastettiin kypsät aminohapposekvenssit pois lukien signaaiipeptidit ja propeptidit Mainisi: BLOSUM, aukon muodostus; 10, aukon laajennus: 0.5. EMBL_EBL G. zeee> XP_383491; 5 Ί. harziamm CAL25508; US 60/818,910, hakemuksen sekvenssi nro 313, .................Fa_RF7182 a'zeoe ^ 60/818,91^ ESIMERKKI 4, Rekombfuaattisen RF7182-proteaasin valmistus TricMenm reesemä 10 (a) Tuotanto- (isäntä”) vektorin valmistus

Ekspressioplasmidi pALK2536 aikaansaatiin rekombinanttisen RF7182-proteaasin valmistusta varten Trichoderma reeseissä.. Fa prtSSA -geeni oman signaalisekvenssinsä *«* V * 15 kanssa fuusioitiin tarkasti T. reesei cbhl (cellA) -promoottoriin PCR-menetelmällä.

V * FapnSSA. -geenifragmentti katkaistiin sen 3-päästä So/nHEila (paikka, joka luotiin .,*„** lopetuskodonm jälkeen PCR:ssä). Näin konstruktiin ei jää alkuperäistä Fa priSSÄ - •Jf ; terminaattoria ennen cM/-tetminaattorisekvenssiä< Konstruktiin lisättiin amdS- * s « V * markkerigeeni, joka sisälsi cbhl-prommttotm, Fa prtSSA -geenin ja cMMerminaaiiorin.

20 Konstrukti on vastaava sen kanssa, jonka ovat kuvanneet Paloheimo ym. (2003). ja 8,7 kb:n lineaarinen ekpressiokasetti on esitetty kuviossa 2. Ekspressiokasettl eristettiin » ”*7 vektorirungosta JsooRl-äigestion jälkeen ja sitä käytettiin 7 reesem protoplastien ***** transtormoimiseen. Käytetty isäntäkania ei tuota mitään pääasiallisista 7 reesem ♦«*» sellulaaseista (CBHL CBHII, EGI, EGI1). Transformaatiot suoritettiin kuten ovat ♦***· 25 esittäneet Penttilä ym. (1987) niillä muutoksilla, jotka ovat kuvanneet Karhunen ym.

«»» ♦.* (1993). Transfonnantit puhdistettiin selektiivisillä maljoilla yksittäisinä kuroumaitiöinä * * x ** , ennen niiden itiöittämistä PDdiM.

* ♦ * * «« « » 49 (b) Profeaasin valmistus ravistuspulloissa ja laboratoriomittakaavaa bioreaktorissa

Transformantit siirrostetiiin PD-vinopmnoiJta ravistuspuiloihin, jotka sisälsivät 50 ml kompleksista laktoosipohjaista sellulaasla indusoivaa elatusainetta (loutsjoki ym., 1993), 5 joka oli puskuroitu 5 % KHhPO^ila, pH:ssa 6,0, Transformanttien proteaasin tuotanto analysoitiin viljelmästä sen jälkeen, kun niitä oli kasvatettu 7 päivää 30 ''C:ssa, 250 rpm. SDS-PAGE-geeleissä käytetystä viljelmän supernatantista havaittiin pääasiallinen noin 29 kDa:n proteiinikaista, joka vastasi rekombinanttista Pa_RP?lk2~proieassia. Proteaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen kaseiinia substraattina esimerkissä le kuvatulia 10 tavalla. Viljelmän supematanteista mitattiin selvästi kasvaneita aktiivisuuksia isäntään verrattuna. Ekspressiokasetin sisällyttäminen sienigenomeihin vahvistettiin valituista transformanteista käyttämällä Southern hiot -analyysia, johon sisällytettiin useita digestoituja genomisia fragmentteja ja ilmentämiskasettia käytettiin koettimena.

15 Ne I reesein transformantit jotka tuottivat parhaat proteaasiaktiivisuudei ravistuspuiloissa, valittiin viljeltäviksi laboratoriomittakaavan bioreaktoreissa. Selkdaasia indusoivaa kompleksisia elatusainetta kastettiin viljelyissä. Viljelyistä saatua käytettyä elatusainetta käytettiin lähtöaineena soveiluskokeissa (esimerkit 6-11) ja lähtöaineena rekomblnanttisen FaJRF71S2-proteaasin puhdistusta ja tarkempaa karakterisointia 20 varten.

* «MX « « « » « * *i* ESIMERKKI S. Rekombissaniiisen Fa JRE71 S2-proieaasi« puhdistus ja * j*; karakterisointi x«« «

X « M

• ♦ ♦ « :***: 25 Solut ja kiinteät aineet poistettiin käytetystä elatusaineesta. joka oli saatu fermentaatiosta **♦ * (esimerkki 4) sentrifugoimaila 30 min sian 50 000 g:ssa lämpötilassa 4-4 °C (Sorvali RC6 plus). Supernaianusta 15 ml käytettiin proteaasin puhdistamiseen. Kaikki *tt*l puhdistusvaiheet suoritettiin kylmähuoneessa. Senmtugoinnin jälkeen näyte suodatettiin 0,44 pm:n suodattimen (MILLEX HV Millipore) läpi ennen kuin se lisättiin HiPrep * « ,·*, 30 26/10 -suolanpoistokolonniin (valmistajalta GE Healthcare), joka oli tasapainotettu * » 2ömM Tns-H€l:ssa, pH 8,5. Geelisuodatettu näyte lisättiin 20 mhn Q Sepharose FF - » « ” kolonniin (valmistajalta GE Healthcare), joka oli tasapainotettu 20 mM Tris-HCkssa, « * « * s * « * 50 pH 8,81 Läpiviitausfraktio otettiin taiteen ja se analysoitiin 12 % SDS PAGE -geelissä (kuvio 3). Tätä entsyvmmäytettä käytettiin pH- ja lämpotilaproftilien selvittämisessä.

Lämpötila profiili 5 Lämpotiiaprofiiii saatiin Fa_RF7182-proteaasiIle pH:ssa 9 käyttämällä esimerkissä le kuvattua määritystä ja käyttäen 15 min reaktioaikaa. Tulokset on esitetty kuviossa 4A. Profeaasin optimilämpötila on noin 50 °C.

10 pM-profiili

Froteaasin pH-profiili määritettiin 50 °C:ssa käyttäen kaseiinia substraattina esimerkissä le kuvatulla tavalla. Reaktion pH säädettiin arvoon pH 6—12 käyttämällä 40 mM. Britton-Robinson-puskuria. Tulokset on esitetty kuviossa 4B. Rekombtnanttisella S.5 FaJRF?i82-p.roteaasiila on suhteellinen aktiivisuus, joka on yli 85 % pB:ssa 6-9.

ESIMERKKI 6. Rekoa» binasttlse» proteiinin FaJRF7182 tehokkaita pH 9 “puskurissa erilaisissa lämpötiloissa :Ti 2ö Testattiin rekombinanttisen Fa RF7iS2~proteiimvalmisteen, joka oli valmistettu ♦ :1:1i Trichodermassa (kuten esimerkissä 4 on kuvattu), kyky poistaa standardeja *j1 veri/ntäiio/musteAabroia (Art. 116, 100 % puuvilla, EMPA Testmaierialen AG. Sveitsi) * 1 1 1 “

; lämpötiloissa 30 ®C ia 50 CC. Kaupallisia proteaasivalmisteita Savinase® Ultra 16 L

**♦ 1 ‘ ϊΤ: (Novozymes) ia Purafeci# 40Ö0L (Genencor international) sekä käsittelyä ilman 25 entsyymiä (verrokki) käytettiin vertailua varten. Tahrakangas leikattiin ensin 1,5 cm x *«♦ ' 1 1,5 cm kangasnäytteiksi ja paloja pyöristettiin leikkaamalla kulmat Palat, sijoitettiin ·;·1: mikrotiitterilevyjen (Nuoc 15Ö20Ö) kuoppiin. Jokaiseen kuoppaan, jonka häikäisyä oli 2 ·;··; cm, lisättiin kankaan päälle 1,5 ml entsyymin laimennosta G!ysiini-NaöH-puskurissa, pH 9. Kutakin entsyymiä annosteltiin Ö, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 4 ja 8 aktiivisuasyksikköä 4 1 .1··. 30 (ttmol tyrosiima/min) kohti 1,5 mi puskuria. Aktiivisuus määritettiin käyttäen 30 min ♦ 1 reaktioaikaa esimerkissä 1c kuvatulla tavalla, paitsi että käytettiin pH:ta 8,5 la 9 « *, . pysäytysliuosta, joka sisälsi ainoastaan 0,11 M TCA:a, Mikrotiiiterilevyjä näytteiden » « # 1 kanssa inkuboitiin vaakaravistimessa 30 Arissa ja 50 °C;ssa 60 min nopeudella 1.25 rpm.

51 Tämän jälkeen kangasnäytteet huuhdeltiin huolellisesti juoksevan veden alla (noin 45 ÖC) ja niitä kuivattiin yön yli sisäilmassa säleikOssä päivänvalolta suojattuina

Tahranpoistovaikutus arvioitiin mktamaalla väri refkktanssiarvoina Minolta CM 2500 -5 spekirofetometriliä käyttäen L1a1b1~väriavanmskoordinaatteja (valonlähde D65/21}. Väri molemmilta kangasnäytteen puolilta määritettiin käsittelyn jälkeen. Kukin arvo oli keskiarvo ainakin kahdesta rinnakkaisesta kangasnäytteestä mitattuna kankaan molemmilta puolilta. Veri/maito/muste-tahran haalistuminen, joka osoitti proieaasin tehokkuuden (tahranpoistotehon). laskettiin arvona AL1, joka tarkoittaa 10 entsyymikäslteliyn kankaan vaaleusarvoa ΙΛ josta on vähennetty pelkällä puskurilla käsitellyn kankaan vaaleusarvo L1 (entsyymin nollanäyte. verrokki).

Tulokset on esitetty kuvioissa S ja 6. Fa__RF7l 82-proteaasivalmiste osoitti huomattavasti korkeampaa tahranpoistokykyä erityisesti 30 ö€;ssa pH 9 -puskurissa verrattuna 15 kaupallisiin proteaasivaimisteisiin Savinase® Ultra 16L ja Purafect® 4ÖÖÖL.

ESIMERKKI 7. Rekombinanttisen proteiinin Fa_RF7182 tehokkuus pesaainejaehees kanssa 40 °C;ssa ja pHtssa 10 :Ti 20 Testattiin rekomblnanttisen Fa_RF7182-proteimivalrnisteen> joka oli valmistettu I l i Trlchoikrmassii (kuten esimerkissä 4 on kuvattu), kyky poistaa standardeja *i1 veri/maito/muste-tahroja fosfaattipitoisen vertailupesuaineen kanssa 40 1€:$$& (pH noin * iö). Standarditahraa Art. 11? (veri/maito/muste, polyesteri + puuvilla, EMPA) käytettiin ϊ t1t koemateriaalina. Kaupallista proteaasla Purafect® 4Ö00L ja käsittelyä ilman entsyymiä t j 25 (verrokki) käytettiin vertailua varten. Kutakin entsvvmlä annosteltiin Ö„ 0.2, 0,4. 0.S, 1 A>, ««« '1 vv 4 ja 8 aktiivisuusyksikköä (pmol tyrosilnia/min) per ml pesunestettä. Aktiivisuus *!**; määritettiin esimerkissä 6 esitetyllä tavalla.

* « « « x 1 * e » Määrä, joka käsitti 3.3 g fosfaattia, sisältäen ECE-vertailupesualnetta 77 ilman optista X « ♦**% 30 kirkastetta (Art. 601, EMPA), liuotettiin 1 litraan vesijohtovettä (vesi, dH < 4), ♦ 1 "" sekoitettiin hyvin magn.eettisekoittimella ja temperoitiin lämpötilaan 40 °C. Tahrafcangas * φ χ φ « , leikattiin paloiksi esimerkissä 6 kuvatulia tavalla. Kangasnäytteet sijoitettiin X « « * <4 1 nukrotiitterilevyjen (Nune 150200) kuoppiin ja 1,5 ml pesunestettä, joka sisälsi 52 pesuainetta ja entsyymin laimennosta vedessä (alle 70 μ!) lisättiin kankaan päälle. Levyjä näytteiden kanssa inkuboitiin 60 min yaakaiavistimessa 40 °C:ssa nopeudella .125 rpm. Tämän jälkeen kangasnäytteet huuhdeltiin huolellisesti juoksevan veden alla (noin 45 °C) ja niitä kuivattiin yön yli sisäilmassa säleikössä suojattuina päivänvalolta.

5

Kangasnäytteiden väri käsittelyn jälkeen määritettiin Minolta CM 2500 -spektrofotometriliä käyttäen L1a1b1»väriavaruuskoordmaatteja ja tahranpoistovaikutusta, joka. laskettiin arvona AL”1 esimerkissä 6 kuvatulla tavalla.

10 Tulokset (kuvioi 7) osoittivat, että proteaasi Fa_RF7!82 soveltuu myös jauhemaisiin pesuaineisiin hyvin emäksisissä olosuhteissa. Sen tehokkuus oli vastaava kuin kaupallisella proteaasilla Purafect® 4000L lämpötilassa 40 1€.

ESIMERKKI 8, Rekombinanttisen proteuaiu FaJRF7182 tehokkuus nestemäisen 15 pesuaineen kanssa 40 °C:ssa

Testattiin rekombinanttisen F a RF7182-proteiinivalmisieeu, joka oli valmistettu. Trichödermassa (kuten esimerkissä 4 o?? kuvattu), kyky poistaa standardeja ver^maito/muste-tahroja nestemäisen pesuaineen Ariel Sensitive (Procter & Gamble» jT: 20 Englanti) läsnä ollessa ilman entsyymiä lämpötilassa 40 °C ja piLssa, joka oli noin 7,9.

?T: Standarditahraa, keinotekoisesti liattua koekangasta Art. 117 (veri/maito/musie, x polyesteri + puuvilla, EMPA) käytettiin koemateriaalina. Kaupallisia proteaasivalmisteita : Puraiset® 4ÖÖÖL ia Savinase® Ultra 16 L ja käsittelyä ilman entsyymiä (verrokki) *♦1 x “ ϊ1Γϊ käytettiin vertailua varten. Kutakin entsyymiä annosteltiin 0, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 4 ja 8 * 1 v t 1i 25 akttivisuusvksikköä (umol tvrosiinia/min) kohti ml pesunestettä. Aktiivisuus määritettiin ««« ’ 1 esimerkissä 6 esitetyllä tavalla.

* * 1 ·:·1! Määrä, joka käsitti 3,3 g of Ariel Sensltiveä, liuotettiin 1 litraan vesijohtovettä (dB < 4), sekoitettiin hyvin magneettisekoittimella ja tempenoitiin lämpötilaan 40 °C. Tahmkangas * 1 ,···, 30 leikattiin paloiksi esimerkissä 6 kuvatulla tavalla, Kangasnäytteet sijoitettiin ♦ 9 mikrotiitterilevyjen (None .150200) kuoppiin ja 1,5 ml pesunestettä, joka sisälsi « » *, 1, pesuaineita ja entsyymin laimennosta vedessä (< 70 μ!) lisättiin kankaan päälle. Levyjä * 1 1 1 näytteiden kanssa inkuboitiin vaakaravistimessa 40 °C:s$a 60 mm nopeudella 125 rpm.

53 Tämän jälkeen kangasnäytteet huuhdeltiin huolellisesti juoksevan veden alla (noin 45 °€) ja niitä kuivattiin yön yli sisäilmassa säidkössä suojattuina päivänvalolta.

Kangasnäyttelden väri käsittelyn jälkeen määritettiin Minolta CM 2500 - 5 spektrofotornetriiiä käyttäen L1a1h1-väriavarauskOordinaattejaja tahranpoistovaikutusia, joka laskettiin arvona AL1 esimerkissä 6 kuvatulia tavalla.

Kuviossa S esitettyjen tulosten perusteella Fa_R.F7182-prot.eaasitla on erinomainen tehokkuus nestemäisen pesuaineen kanssa 40 öC:ssa. Fa_RF7.182:n tehokkuus 10 veri/malto/nruste-tahralie (polyesteri v puuvilla) oli huomattavasti korkeampi verrattuna kaupallisiin valmisteisiin Puraiset® 4ÖÖÖL ja Savina.se® Ultra 14 L, kun annosteltiin sama määrä pfoteaasiaktiivlsuutta. Kaupallisten entsyymien annostus, joka oli 4-S yksikköä kaupallisia entsyymejä per mi pesunestettä, vastasi annostusta, joka olin noin 0,2-0,5 % entsyymivakttistetla pesuaineen painoa kohden, mikä on tyypillinen 15 käyttömäärä pesuaine·-entsyynieil le.

ESIMERKKI 9, Rekombinanttisea proteiini» FaJRF7iS2 tehokkuss erilaisten nestemäisen pesuaineen koasentraaiioides kanssa 30 ®C:ssa •T: 20 Testattiin rekombinanttisen Fa_RF71.82-prote.Univalmisteen, joka oh valmistettu v ♦T: Trkkoäermm$& (kuten esimerkissä 4 on kuvattu), kyky poistaa standardeja * *i1 veri/maito/muste-tahroja nestemäisen pesuaineen kanssa pitoisuuksina 1-5 g/1 j 2; Lämpötilassa 30 T, Pesuaineina käytettiin Ariel Sensitives (Procter & Gamble, Englanti), iT; joka ei sisältänyt entsyymejä, sekä nestemäistä, värillisille kankaille tarkoitettua * ' i3i 25 pesuainepohjaa, joka sisälsi 25 % pesuaktiivisia aineita, polvelta ja polymeerejä Φ ♦ 1 (taulukko 4), ja standardi tahraa Art. 117 (veri/maito/muste, puuvilla v polyesteri, EMPA) : käytettiin koemateriaalina. Kaupallisia proteaasivalmisteita Purafeet® 40ÖÖL, Savinase® ·:1·; Ultra 16 L ja käsittelyä ilman entsyymiä (verrokki) käytettiin vertailua varten. Kutakin „1.· entsyymiä annosteltiin 0» 0,2, 0.4, 0,8, 1,6, 4 ja 8 aktimsuusyfcsifcfcöä x « ,1«, 30 (ttmöi tyrosiinia/min) kohti ml pesunestettä. Aktiivisuus määritettiin esimerkissä 6 ♦ x esitetyllä tavalla, <t φ * «« » « « « 2 ♦ «« 3 * s 54

Taulukko 4, Värilliselle kankaalle tarkoitetun nestemäisen pesua tiepohjan koostumus

Valmistusaineet %

NaLES (naöiumiaury>:lieeitörisu}faaiti) 4,9 lornton C12-1S 7EO (etyieenioksidi) 15

Na-saippua (palmuaydin-FA) 4,4

Kookosglukosidi 1 <Pinkt~aktiivi$et aineet yhteensä> <25JÖ>

Polyoli (glyseriini) 5

Fosfonaaiti 02 %) (ThermPhos) 2 ‘ PVP-SÖkäläi RP 53 (BASF) ............................. Ϊ

Sokalan PA 15 (BASF) 1 ,56

Sorez-100 (1SP) Ö4

Vettä kunnes 1.00 % 5 Määrät, jotka käsittivät 1, 3,3 ja 5 g nestemäistä pesuainetta, liuotettiin 1 litraan vesijohtovettä MH < 4), sekoitettiin hyvin magneeitisekoittlmeila ja iemperoäiiin lämpötilaan 30 ®C. Pesuliuosten pH oli noin 7,3-7.5 pesualnepohjan kanssa tai noin 7,6-8,0 Anelin kanssa pesuainepHoisuudesta riippuen. Tahrakangas leikattiin paloiksi »4« «ex *·* * esimerkissä 6 kuvatulla tavalla, Kangasnäytteet sijoitettiin mikrotiitteriievyjen (None ««« ^ * e e e *·" * 10 1582ÖÖ) kuoppiin ia 1,5 ml pesunestettä, joka. sisälsi pesuainetta |a entsyymin M * *’ ' ·** laimennosta vedessä (alle 70 μΐ) lisättiin kankaan päälle. Levyjä näytteiden kanssa * **♦ »4 * inkuboitiin vaakaravistimesss 30 °C:ssa 60 min nopeudella 125 rpm. Tämän jälkeen * M * ‘ ♦ * » *·* * kangasnäytteet huuhdeltiin huolellisesti juoksevan veden alla (noin 45 °C) ja niitä * * *»··* kuivattiin yön yli sisäilmassa säleikössä päivänvalolta suojattuina.

15 «·

Kangasnäytteiden väri käsittelyn jälkeen määritettiin Minolta CM 2500 - spefctrototcanetrUlä käyttäen L* a*b*-väriavanmskoordinaatteja ja tahranpoistovaikutusta, * ”“i joka. laskettiin arvona AL* esimerkissä 6 kuvatulla tavalla.

**♦ 4 4 ♦ ♦ 444 J*. 20 Värillisille kankaille tarkoitetulla pesuainepohjalla saadut tulokset on esitetty kuvioissa * : 9A—D ia Ariel Sensitiven kanssa saadut tulokset on esitetty kuvioissa 1ÖA--D, * * * * * *

Fa_RF?l82:n tehokkuus veri6maito/muste-tahralie oli huomattavasti korkeampi 55 verrattuna kaupallisiin valmisteisiin Paraiset® 400ÖL ja Savinase® Ultra 14 L molemmilla pesuaineella ja kaikilla pesuainepitoisuuksilla, kun annosteltiin sama aktuvisuusmäärä. Myös silloin, kun annostus laskettiin lisätyn proteiinin määränä (kuviot 9B ja I0B), tahranpoistotehokkous oli suurin Fa_RF7182:11a. Entsyymivalnristeklen 5 proteiinimäärä määritettiin Bio-Rad-proteiinimäMtyksellä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) käyttäen naudan gammaglobuliinia (Bio-Rad) standardina. Näiden kokeiden tulokset osoittavat, että Fa_RF?182-proteaasilla on erinomainen tehokkuus nestemäisten pesuaineiden kanssa alhaisissa lämpötiloissa, kuten 30 °C:ssa.

10 ESIMERKKI 10. Rekomhinantrisen proteiinin Fa_RF7.1.82 tehokkuus erilaisilla tahroille nestemäisten pesuaineiden kanssa 30 eC:ssa (Launder Ometer)

Testattiin rekombinanttisen FaJRF7182-proteiinivalmisteen, joka oli valmistettu Triehodermassa (kuten esimerkissä 4 on kuvattu), kyky poistaa erilaisia tahroja 15 nestemäisen pesuaineen kanssa 30 °C:ssa, ja sitä verrattiin kaupallisiin proteaasivalmisteisiin Puraiset® 4ÖÖÖL ja/tai Savinase® Ultra 16 L. Käytettiin seuraavia keinotekoisesti liattuja EMPAm koekankaita: veri/maito/muste (Art. 117, polyesteri -f puuviila), veri/maito/muste (Art. 116, puuvilla), ruoho (Ari, 164, puuvilla) ja kaakao (Art. 112, puuvilla). Kangas leikattiin kooltaan 9 cm x 12 cm oleviksi kangasnäytteiksi ja iTi 20 reunat siistittiin siksak-ompeleella, Pesuaine oli sama kuin on kuvattu esimerkissä 9.

««« s « * * 9 ♦ ♦j» Tahranpoistokäsittelyt suoritettiin LP-2 Launder-Ometer -laitteella seuraavalla tavalla.

; ft Launder Ometer esikuamennettiin ensin 30 °C:seen. Säiliöihin, jotka sisälsivät tahrat J*:*J Art, 116 ja Ari. 117 tai tahrat AA, 164 ja Art, 112, lisättiin 450 mi temperoitua i***j 25 pesunestettä, joka sisälsi 5 g pesuainetta kohti litraa vesijohtovettä (dll < 4) ja entsyymin laimennosta. Entsyymejä annosteltiin Ö, 1 ja/tai 2, 5 ja 10 aktiivisuusvksikkdä (pmol *i**j tyrosiinia/min) kohti ml pesunestettä veri/maito/muste-tahroille ja Ö, S, 10 ja 20 *:**: aktiivisuusyksikköä (pmol tyrosiinia/min) kohti ml pesunestettä ruoholle ja kaakaolle.

Aktiivisuus määritettiin esimerkissä 6 esitetyllä tavalla. Launder Ometer -laitetta e * .»·♦. 30 käytettiin 30 °C:ssa 60 min pH:n ollessa noin 7,5. laman jälkeen kangasnäytteet ♦ * huuhdeltiin huolellisesti juoksevan veden alla (noin 20 *C) ja niitä kuivattiin yön ylt * » ·. e sisäilmassa säleikössä päivänvalolta suojattuina.

* * ♦ * X4 « « 56

Kangasnäytteiden väri käsittelyn jälkeen määritettiin Minolta CM 2500 - spektrofotometrillä käyttäen L1a1b1-värlavaniuskoordinaaiteja ja tahrmipoistovaikutusta,, joka laskettiin arvona AL1 esimerkissä 6 kuvatulla tavalla. Väri molemmilta kangasnäytteen puolilta määritettiin käsittelyn jälkeen. Kukin arvo oli keskiarvo 5 vähintään 2.0 mittaukselle kangasnäytettä kohti. Mittausten suorittamista vältettiin sellaisilta aluilta, joille oli muodostunut rasvajäikiä käsittelyn aikana kankaan taittumisen seurauksena (puuvillatahroissa Art. 116 ja Ari. 112).

Värillisille kankaille tarkoitetun pesuainepohjan (5 g. 1) kanssa saadut tulokset (kuviot 10 11A-C) osoittavat, että tehokkuus veri/maiio/muste-, ruoho- ja kaakaotahroille oli huomattavasti korkeampi Fa_RF71S2:n kanssa verrattuna kaupallisiin valmisteisiin Savina.se® Ultra 16L ja Puraiset® 40001... lämpötilassa 30 °C. kun annosteltiin sama määrä proteaasiaktiivisuutta. Annostus, joka oli 10 yksikköä kaupallisia entsyymejä per mi pesunestettä, vastasi annostusta, joka olin noin 0,4 % entsyymivafmistetta pesuaineen 15 painoa kohden, mikä on tyypillinen käyttömäärä pesuaine-entsyymeille. Näiden kokeiden tulokset osoittavat, että Fa_RF?l 82-proteaasi on tehokas useille tahroille alhaisissa lämpötiloissa, kuten 30 °C:ssa.

ESIMERKKI 11. Rdkombinanttisen proteiinin Fa_RF7IS2 tehokkuuden arviointi :1Γ: 20 nestemäisessä pwMnpesuaineessa täyden mittakaavan kokeissa 3Θ ®€:ssa.

««« « x « « » » *:1 Testattiin rekomhinanttista Fa RF7! 82-proteiinivalmisteita, joka oli valmistettu : Trichodermass® (kuten on kuvattu esimerkissä 4). nestemäisessä pesuaineessa ««1 « ‘ pyykinpesukoneessa 30 °€:ssa, ja sitä verrattiin kaupallisiin proteaasivalmiateisön :1“1i 25 Puraiect&40ÖÖL ja Savinase® Ultra 16L sekä käsittelyyn ilman entsyymiä. Käytettiin nestemäistä värillisille kankaille tarkoitettua pesuainepchjaa, kuten esimerkissä 9 on ·:·1: kuvattu, sekä kahdeksaa erilaista proteaasilie herkkää seurantakangasta (taulukko 5), *i**: Lisäksi kaksi kappaletta likakuormituskangasta ("ballast soil'·, CFT-SBL) pesua kohti x sijoitettiin pesoverkkoon. jotta muihin kangasnäytteisiin syntyvän kontaktin aiheuttama 30 likaantuminen voitaisiin välttää. Seurantakankaat olivat valmistajalta CFT (Center For ««»

Testinaterials BV, Alankomaat). Kooltaan 10 cm x 10 cm olevat tahrakangasnäytteet * 1 ", # ommeltiin keittiopyyhkeisiin. Prosessiparametrit ja olosuhteet on kuvattu taulukossa 6.

Φ X « • » 1 1 Entsyymin annostukset kokeissa laskettiin sekä entsyymiaktiivisuuksina (noin 0-1.4 57 aktiivisuusyksikkeä per yksi mi pesuliuosta) sekä proteiinin määränä (noin 0-2,5 mg per liira pesuliuosta). Valmisteiden pmieaasiaktiivisuudel ja proteiinipitoisuudet määritettiin esimerkeissä 6 ja. 9 kuvatulia tavalla.

5 Taulukko S, Kokeessa käytetyt proteaasiile herkät seurantakankaat

Nro Seursutaraeneteims/kangasoäne Substraatti Ϊ CFT/CS-011106 Veri (vanha) / Puuvilla 2 CFT/C-03-030 Maitokaakao/pigR)«ntti/Pu«vi!la 3 CFT/C-05~059b Veri/maito/muste/Puuviiia 4 CFT/PC-G5-014 Veri/?aaito/muste/PE-Pouvilla ..........5...............CFT/CS-Q8-Ö69 Ruoho/Puuvilla 6 CFT/C-3 0-18<$b Maapälikinäöijy/maltc/Puuvilla 7 CFT/CS-25-Ö16 Pinaatti/Puuviiia 8 CFTCS-3 8-010 Munankeltuaineo/pignserati/Pumdiia

Taulukko 6. Prosessiparamefrii ja olosuhteet

Kone Mtele N-Tronte Frontstar ... Ohjelma 30 1C lyhyt ohjelma ♦ ♦ 1 * 1 1

Veden kovuus noin 11,2 1dH sisäänotolla 13 litraa ♦ x ♦ ♦ 1 1 * , Kuormitus 2.5 kg iakanoita/kyipypyyhkeitä ja **" keitdöpyyhkeitä « X «

Pesuaineen annostus SO g / konetäyttö » 1 » "" * 1 1 )„ Kunkin seurantaankaan määrä 2 tahrakaistaletta 10 cm x 10 cm per kone • 1

Pesujen määrä 2 , 10 * 1 «

« X

, Tahranpoistovaikutukseu arviointi perustui reflektanssin (remission) mittaukseen (R 457 1 nm) Dataeolor-spektrofotometrillä ÖV-suodattimelia, ja se laskettiin prosentuaalisena x « « %..1 tahranpoistovaikutuksena (% SR).

:·: H

* 1 1 y ~ « % SR - Reflektanssi pesun jälkeen - Reflektanssi ennen pesua x 100 %

Tahraamattoman kankaan reflektanssi - Reflektanssi ennen pesua 58

Tulokset laskettiin arvona Δ% SR (deita%SR), joka tarkoittaa entsyymillä käsitellyn kankaan arvoa %SR miinus ilman entsyymiä tapahtuneen käsittelyn (pelkkä pesuaine) %SR.

5 Suoritettiin kaksi pesua, jotka sisälsivät kaksi kangasnäytettä kustakin tahrasta jokaisella entsyymin annostuksella, ja jokaisesta takranäytekankaasta mitattiin kolme mittausta, joten arvot perustuvat 12 mittaukseen per tahra per tuote.

Tulokset kokonaistahranpolstotehokkuuksista (delia%SR) on esitetty kuvioissa 12A-B ja 10 kuvioissa 13A-E. Kokonaistahranpoisiovaikums. joka perustui tulosten summaan, jotka saatiin kahdeksalla erilaisella ptoteaasiherkällä tahralla (tahrat 1-8, taulukko 5), oli huomattavasti korkeampi Fa_RF7I82:lla verrattuna kaupallisiin proteaasivahnisteisim Purafect# 400ÖL ja Savinase® Ultra 16L, kun proteaaseja annosteltiin aktiivisuuden määrään perustuen (kuvio 12A). Fa_RF7182 oli tehokas erityisesti veri/maito/musie-, 15 suklaa/maitO", maapähkinäöljy/maito- ia munankeltuaistahroiile (kuviot 13A~E).

Yleista puhdistuskyvyn määrittelemisessä käytettyä seuramakang&sta (pigmentti/öljy) käytettiin verrokkina tolstokokeissa eri koneilla. Eri kokeiden välillä ei havaittu eroja.

* X <· ♦ * *

* 9 X K

» » < * 9 Λ 4 4 «4«

X

* « * > * 4 4« 5 99 4 444 X 9 « 4 « 4 4 * * 9 * * * 9 9X9 9 44444 V 9 9 99X99

* X

9 * 9 99 X Φ X X 9 9 * «9« 9 9 X 9 X 44 » K 9 * S *

* XX

9 9 59

VIITTEET

Altschul SF, W Gish, W Miller, EW Myers ja DJ Lipman, 1990. Basie local alignment search tool. JJ MoU Biol. 215: 403-410.

5 AMFEP, 2007. Association of Manufacturers and Fomiuiators of Enzyme products, kaupallisten entsyymien luettelo osoitteessa http://\vwsv.amfep.org/iist.html (päivitetty 30.11.2007).

Anwar, A ja M Saleentuddin. 1998, Alkaline proteases: A review. Bioresource TechnoL 64: 175-103.

10 Chen, Y~J, ja M Inouye, 2008. The intramolecular chaperone-mediated protein folding. Curr. Opin, Struct. Biol. 18: 765-770.

Cherry. J. R„ ja Fidantsef, A. L, 2003. Directed evolution of industrial enzymes: an update. Curr. Opin, Biotechno!. 14: 438-443.

Edman Pja G Begg. 1967. A. protein sequenaior. Eur. J. Biochem. 1: 80-91.

15 Gasteiger, E, A Gattiker, C Hoogland, ! Ivanyi, RD Appel ja A Bairoch. 2003. ExPASy: the proteiomics server tor in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31: 3784—3788.

Geremia RA, Goldman GH, Ardiles W. Vila SB, Van Montagu M, Herrera-Estrelia A. 1993) Molecular characterization of the proteinase-encoding gene. prbL related to ϊ Γ: 20 myeoparasitism by Trichoderma harzimum. Mol. Microbiol. 8(3): 603—613.

ίΤί Gupta, R, QK Beg, S Khan ja 8 Chauhan. 2002. An overview on fermentation, •I* downstream processing and properties of microbial alkaline protease. Appi. Microbiol, ϊ Biotechnoi 60; 381-395, * * s * iT: Gurr, SJ, Uncles, SE, ja Kinghom JR. 1987, The structure and organization of nuclear ί*“: 25 genes in filamentous fungi. S. 93-139, Teoksessa (JR Kinghom, toim.) Gene Structure in

Eukaryotic Microbes. IRL Press, Oxford.

*;**: Joutsioki, VV, TK Torkkeli ja KMH Nevalainen. 1993. Transformation οϊ Trichoderma *:**: reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P (gamP) gene: production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei. Curr. Genet. 24: 223-228.

,·*, 30 Kalisz HM. 1988. Microbial proteinases. Adv. Biochem. Eng. Biotechnoi. 36: 1-65.

* ♦

Karhunen T, A Mäntylä, KMH Nevalainen ja PL Suominen. 1993. High frequency one- « * *, , step gene replacement in Trichoderma reesei. f. Endogiucanase i overproduction. Mot.

♦ A » % *5 Gen. Genet 241:5!5-522.

60

Laemmli UK, 197Ö. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680--685,

Malardier L, MJ Daboussi, J Julien, P Roussel, C Scazzoechio ja Y Brygoo. 1989. Cloning of the nitrate reductase gene (niaD) of Aspergillus nidulam and its use for 5 transformation oHFusarium oxysportm. Gene 78; 147--156.

Maurer K-H. 2004, Detergent proteases. Curr. Opin, Biotechno!, 15: 330-334,

Nielsen H, i Engelbrecht, S Bmnakja G von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10; I—6.

10 Nielsen H ja A Krogh. 1998. Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model Julkaisussa: Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6). AAAI Press, Menlo Park, Kalifornia, s. 122-130.

Paloheimo M, A Mäntylä, J Kallio ja P Suominen. 2003, High»yield production of a 15 bacteria! xylanase in the filamentous fungus Triehoderma reesei requires a carrier polypeptide with an intact domain structure. Appi. Env. Microbiol. 69: 7073—7082. Penttilä M, H Nevalainen, M Rättö, E Salminen ja J Knowles. 1987. A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Triehoderma reesei. Gene 61: 155-164, :T; 20 Poutanen, M, L Saiusjärvi, L Ruohonen. M Penttilä ia N Kalkkinen. 2ÖÖ1. Use of matrix- « :*Γί assisted laser desorption/ionization tirne-oi-flight mass mapping and nanospray •j* liquklchromatograohy/eiectrosprav ionization tandem mass spectrometry sequence tag J :*i analysis for high sensitivity identification of veast proteins separated by two-dimensional tVt gel electrophoresis. Rapid Common. Mass Spectrom. 15: 1685-1692 :*’*i 25 Raeder U ja P Broda. 1985, Rapid preparation of DNA from filamentous fungi, Lett.

Appi Microbiol. : 17-20.

•j**; 'Rao MB, AM Tanksale, MS Ghatge ja W Deshpsnde. 1998. Molecular and ‘Γ: biotechnological aspects of microbial proteases, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 597-635.

Sambrook J ja DW Russell. 2001. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring v * .*··. 30 Harbor Laboratory, New York, US.

« «

Shevchenko, A, M. Wllm, O. Vomi, M Mann. 1996. Mass spectrometrie sequencing of 9 * *, , protems Irom sliver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem, 68: 850-858.

♦ * *

* * X

« x 61

Shimogaki H. K Takenchi, T Nishino, M Ohdera, T Kudo, K. Ohba, MV Iwaraa ja M Erie. 1991. Purification and properties of a novel surface protease from Beciiius sp. Y. Agric. Biol Chem. 55: 2251-2258.

Suarez ME, Vizcaino JA, Lobell A, ja Monte E. 2007. Characterization of genes 5 encoding novel peptidases in the biocontrol Trichoderma harziaman CECT 2413 using the TrichoEST functional, genomics approach, Curr. Genet. 51(5): 331-342.

xxt ♦ * * « Φ * * » « «

♦ 4 X

« « »»» «

««»X

* » ♦ « *

* * X

XX* « ¢¢4 V « « * * * 4 *SV * s X 4 SV <

X

X4«44 * * * 44»X« * « X*i«4 9 « tv«

* X

* * **4 X 9 4 « 4 «« * 4 « « « 4 * 44

Claims (38)

62

1. Sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitulla entsyymillä on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja se käsittää sekvenssissä nro 18 määritellyn kypsän

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu 10 siitä, että mainittu entsyymi on saatavissa lajista Fusarium acuminatum, edullisemmin talletetusta kannasta CBS 124084.

3. Patenttivaatimusten 1 tai 2 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitulla entsyymillä on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja se käsittää 15 sekvenssin nro 18 mukaisen aminohapposekvenssin.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitun entsyymin kypsän muodon molekyylimassa on 20-35 kDa, edullisesti 25-33 kDa, edullisemmin 28-30 kDa, 20 edullisimmin 29 kDa.

5. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-4 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitun entsyymin optimilämpötila pH:ssa 9 käyttäen 15 min reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina on 30-70 °C, edullisesti 25 30-60 °C ja edullisemmin 40-50 °C, edullisimmin 50 °C.

5 Fa_RF7182-entsyymin aminohapposekvenssin tai aminohapposekvenssin, joka on ainakin 81-prosenttisesti identtinen sekvenssissä 18 määritellyn kypsän Fa_RF7182-entsyymin aminohapposekvenssin kanssa.

6. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasi, tunnettu siitä, että mainitun entsyymin pH-optimi 50 °C:ssa käyttäen 15 min reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina on pH-alueella, joka on vähintään pH 6-12, 30 edullisesti pH-alueella, joka on välillä pH 6-11, ja edullisemmin välillä pH 6-10,vielä edullisemmin välillä pH 6-9, edullisimmin pH:ssa 7. 63

7. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-6 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi kykenee hajottamaan tai poistamaan proteiinitahroja pesuaineen läsnäollessa lämpötilassa, joka on 10-60°C, edullisesti 50 °C tai alle. 5

8. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-7 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittua entsyymiä koodaa eristetty polynukleotidisekvenssi, joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa polynukleotidisekvenssiin, joka sisältyy plasmidiin pALK2530, joka käsittää sekvenssin 10 nro 12 nukleotidisekvenssin ja joka on talletettu Escherichia colissa RF7803 talletusnumerolla DSM 22208.

9. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-8 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittua entsyymiä koodaa eristetty 15 polynukleotidisekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, joka käsittää sekvenssissä nro 18 määritellyn kypsän Fa_RF7182-entsyymin aminohapposekvenssin tai aminohapposekvenssin, joka on ainakin 81-prosenttisesti identtinen sekvenssissä 18 määritellyn kypsän Fa_RF7182:n aminohapposekvenssin kanssa.

10. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-9 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittua entsyymiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, joka käsittää sekvenssissä nro 18 esitetyn aminohapposekvenssin.

11. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-10 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittua entsyymiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 17 esitetyn nukleotidisekvenssin.

12. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-11 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittua entsyymiä koodaava polynukleotidisekvenssi sisältyy plasmidiin pALK2531, joka on talletettu Escherichia colissa RF7879 talletusnumerolla DSM 22209. 64

13. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-12 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi valmistetaan rekombinanttisesta ekspressiovektorista, joka käsittää nukleiinihappomolekyylin, joka 5 koodaa minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-12 mukaista keksinnön sieniperäistä seriiniproteaasia, toiminnallisesti liitettynä säätelysekvensseihin, jotka kykenevät ohjaamaan seriiniproteaasia koodaavan geenin ilmentymistä soveltuvassa isännässä.

14. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-13 mukainen sieniperäinen 10 seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi tuotetaan heterologisessa isännässä.

15. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-14 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi tuotetaan mikrobi- 15 isännässä.

16. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-15 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi tuotetaan isännässä, joka kuuluu johonkin suvuista Trichoderma, Aspergillus. Fusarium, Humicola,

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi tuotetaan suvussa Trichoderma tai Aspergillus.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi tuotetaan lajissa T. reesei.

19. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat: (a) nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja joka käsittää sekvenssissä nro 18 esitetyn aminohapposekvenssin; 30 65 (b) nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja joka on ainakin 81-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 18 aminohapposekvenssin kanssa; (c) nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 13 kuvatun 5 nukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin; (d) nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää DSM 22208:n tai DSM 22209:n sisältämän polynukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin; (e) nukleiinihappomolekyyli, jonka koodaava sekvenssi eroaa minkä tahansa kohdista (c)—(d) nukleiinihappomolekyylin koodaavasta sekvenssistä geneettisen 10 koodin degeneraation vuoksi; j a (f) nukleiinihappomolekyyli, joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa DSM 22208:n sisältämään nukleiinihappomolekyyliin ja joka koodaa polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja aminohapposekvenssi, joka on ainakin 81-prosenttisesti identtinen sekvenssissä nro 18 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa. 15

20. Rekombinanttinen ekspressiovektori, joka käsittää patenttivaatimuksen 19 mukaisen nukleotidisekvenssin, joka on toiminnallisesti liitetty säätelysekvensseihin, jotka kykenevät ohjaamaan mainittua seriiniproteaasia koodaavan geenin ilmentymistä soveltuvassa isännässä. 20

20 Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium ja Mortiriella.

21. Isäntäsolu, joka käsittää patenttivaatimuksen 20 mukaisen rekombinanttisen ilmentämisvektorin.

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on 25 mikrobi-isäntä.

23. Patenttivaatimuksen 21 tai 22 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on rihmasieni.

24. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 21-23 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että isäntä kuuluu johonkin suvuista Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chiysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium ja Mortiriella. 66

25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on Trichoderma tai Aspergillus.

26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on 5 T. reesei.

27. Valmistusmenetelmä polypeptidille, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet minkä tahansa patenttivaatimuksista 21-26 mukaisen keksinnön isäntäsolun viljelemiseksi ja polypeptidin talteen ottamiseksi. 10

28. Patenttivaatimuksen 19 mukaisen nukleiinihapposekvenssin koodaama polypeptidi, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja joka on saatavissa patenttivaatimuksen 27 mukaisella menetelmällä.

29. Menetelmä entsyymivalmisteen aikaansaamiseksi, menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa viljellään minkä tahansa patenttivaatimuksista 21-26 mukaista isäntäsolua ja joko otetaan polypeptidi talteen soluista tai erotetaan solut elatusaineesta ja kerätään supematantti.

30. Entsyymivalmiste, joka on saatavissa patenttivaatimuksen 29 mukaisella menetelmällä.

31. Entsyymivalmiste, joka käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-18 mukaista seriiniproteaasientsyymiä. 25

32. Patenttivaatimuksen 30 tai 31 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että mainittu valmiste käsittää muita entsyymejä, jotka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät proteaasi, amylaasi, sellulaasi, lipaasi, ksylanaasi, mannanaasi, kutinaasi, pektinaasi tai oksidaasi, mediaattorin kanssa tai ilman. 30

33. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 30-32 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että mainittu valmiste käsittää soveltuvan lisäaineen, joka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät stabilointiaineet, puskurointiaineet, pinta-aktiiviset aineet, 67 vedenpehmentäjät, valkaisuaineet, mediaattorit, korroosionestoaineet, uudelleen tarttumista estävät aineet, syövyttävät aineet, hankausaineet, optiset kirkasteet, väriaineet, pigmentit ja säilöntäaineet.

34. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 30-33 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että mainittu entsyymivalmiste on nesteen, jauheen tai rakeiden muodossa.

35. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-18 mukaisen seriiniproteaasientsyymin tai minkä tahansa patenttivaatimuksista 30-34 mukaisen entsyymivalmisteen käyttö 10 pesuaineissa, kuitujen käsittelyssä, villan käsittelyssä, hiusten käsittelyssä, nahan käsittelyssä, elintarvikkeiden tai rehun käsittelyssä tai missä tahansa sovelluksissa, joihin liittyy proteiinimateriaalin muuntelu, hajotus tai poistaminen.

36. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-18 mukaisen seriiniproteaasientsyymin tai 15 minkä tahansa patenttivaatimuksista 30-34 mukaisen entsyymivalmisteen käyttö pesuaineen lisäaineena.

37. Patenttivaatimuksen 36 mukainen käyttö nestemäisissä pesuaineissa.

38. Patenttivaatimuksen 36 mukainen käyttö jauhemaisissa pesuaineissa. 68