FI121712B - Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö - Google Patents

Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI121712B
FI121712B FI20095497A FI20095497A FI121712B FI 121712 B FI121712 B FI 121712B FI 20095497 A FI20095497 A FI 20095497A FI 20095497 A FI20095497 A FI 20095497A FI 121712 B FI121712 B FI 121712B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
enzyme
serine protease
seq
protease
fungal
Prior art date
Application number
FI20095497A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20095497A (fi
FI20095497A0 (fi
Inventor
Jari Vehmaanperae
Marja Paloheimo
Kari Juntunen
Leena Valtakari
Susanna Maekinen
Jarno Kallio
Pentti Ojapalo
Original Assignee
Ab Enzymes Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ab Enzymes Oy filed Critical Ab Enzymes Oy
Publication of FI20095497A0 publication Critical patent/FI20095497A0/fi
Priority to FI20095497A priority Critical patent/FI121712B/fi
Priority to US12/799,639 priority patent/US8603795B2/en
Priority to PCT/EP2010/055893 priority patent/WO2010125174A1/en
Priority to RU2011145540/10A priority patent/RU2566549C2/ru
Priority to KR1020117028611A priority patent/KR101739770B1/ko
Priority to BRPI1014959-7A priority patent/BRPI1014959B1/pt
Priority to EP10717135A priority patent/EP2424992B1/en
Priority to DK10717135.7T priority patent/DK2424992T3/da
Priority to CN201080030241.0A priority patent/CN102625843B/zh
Priority to MX2011011528A priority patent/MX2011011528A/es
Priority to JP2012507777A priority patent/JP5698217B2/ja
Priority to MYPI2011004819 priority patent/MY152952A/en
Priority to ES10717135T priority patent/ES2409890T3/es
Publication of FI20095497A publication Critical patent/FI20095497A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI121712B publication Critical patent/FI121712B/fi
Priority to US14/066,110 priority patent/US8937170B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/06—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38681—Chemically modified or immobilised enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21014—Microbial serine proteases (3.4.21.14)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

UUSI SIENIPERÄINEN PROTEAASI JA SEN KÄYTTÖ KEKSINNÖN ALA
5 Esillä oleva keksintö koskee sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä, joka on käyttökelpoinen erilaisissa sovelluksissa, erityisesti pyykin- ja astianpesuaineissa Keksintö koskee mainittua, entsyymiä koodaavaa niikleiimhapponiolekyyliä, rekornbinanttia vektoria, isäntäsolua mainitun entsyymin tuottamiseksi, mainittua entsyymiä käsittävää entsyymikoostumusta sekä menetelmää tällaisen koostumuksen 10 valmistamiseksi. Keksintö koskee myös erilaisia käyttöjä mainitulle entsyymille tai mainittua entsyymiä käsittäville koostumuksille,
TAUSTAA
15 Mikrofciproteaasit kuuluvat merkittävimpiin hydrolyyttisiin entsyymeihin, ja niillä on käyttösovelluksia eri teollisuuden aloilla, kuten esimerkiksi pesuaineissa, elintarvikkeissa, nahassa, lääkeaineissa, diagnostiikassa, jätteiden käsittelyssä ja hopean talteenotossa, Mikrobien ekstraseilulaariset proteaasit muodostavat merkittävän osan, yli kolmanneksen, entsyymien maailmanlaajuisesta kokonaismyynnistä (Cherry ja Fidantsef, .. 20 2003), Noin 90 % kaupallisista proteaaseista on pesuaine-entsyymejä (Gupta ym., 2002), e ««
Useimmat kaupalliset proteaasit, pääasiassa neutraalit tai emäksiset proteaasit, * a « « » « valmistetaan sukuun Bacillus kuuluvilla organismeilla.
» * 1 1 1 « t « « « * 1 1 .···, Subiilisiiniperheen seriiniproteaasit tai BaciUm~h)^U&' valmistetut snbtili&iinit » « e « 25 muodostavat teollisten proteaasien suurimman alaryhmän. Nämä entsyymit ovat K « »«1 kaupallisesti merkittäviä proteiineja, hajottavina aineosina tai pesuaineiden lisäaineina.
Tällä hetkellä kävtössä olevat kaupalliset pesuainevalmisteet käsittävät luonnollisesti .»»•j esiintyviä emäksisiä serimiproteaaseja, jotka ovat peräisin &2d//«s~lajdsta tai jotka ovat \ rekombinanttisia proteaasivalmisteita (Maurer, 2004). Luonnollisten entsyymien * » ,·«, 30 muunnelmia, joilla on parantunut katalyyttinen teho ja/tai parantunut stabiilius * 1 « 1 x lämpötilan, hapetusaineiden ja muuttuvien pesuolosuhteiden suhteen, on kehitetty « «
* »X
, kohdennetulla ja-tai satunnaisella rnutageneesillä. Esimerkkejä kaupallisista proteaaseista * « Ä * « « 1 ovat mm. snbtilisiini Carlsberg (Alcalasel), Novozymes, DK), subtilisiini 309 (Novozymes, DK), Purafect® (Genencor Inc., USA), Purafect® Ox, Ptoperase® (Genencof tae., USA) ja BLAP S~ ja X-sarjat (Henkel, DE).
Useita emäksisiä seriiniproteaaseja (EC 3.4.21) sekä näitä entsyymejä koodaavia geenejä 5 on myös eristetty eukaryoottisista organismeista, mukaan lukien hiivat ja rihmasienet, US~patentissa nro 3,652,399 ja julkaisussa EP 519229 (Takeda Chemical Industries, Ltd.. JP)· tuodaan esiin emäksinen proteaasi suvusta Fusarium (suvuton tila, teleomorfi) tai. Gibberella (suvullinen tila, anaroorfi), erityisesti lajeista Fusarhim sp. S-19-5 (ATCC 2GI92, IFO 8884). F. oxyspomm 1 sp. Imi (IFO 5880) tai G. suuhinetti (ATCC 10 20193. 1FO6608), jotka ovat käyttökelpoisia pesuaineiden ja muiden puhdistusäinekoostumusten formuloinnissa. Julkaisuissa WO 88/03946 ja WO 89/04361 (Novo Industri A/S, DK) tuodaan esiin entsvmaattinen pesuaineiden lisäaine ja pesuainekoosturnus,joka käsittää proteaasin ja lipaasin, jolloin sieniperäinen proteaasi on peräisin suvusta Fusarhim. erityisesti lajeista F. oxyspomm tai F. solani. Pesuaineiden 15 lisäaine, joka käsittää proteaasin, jolla on spesifisyyttä ainoastaan yhden tai kahden spesifisen aminohapon lähellä oleville peptidisidoksiile, on tuotu esiin julkaisussa W089/06270. Julkaisu W01994025583 (NovoNordisk A/S, DK) tuo esiin aktiivisen trypsiinin kaltaisen proteaasientsyymin, joka on saatavissa F«.varm/»-!ajeista, erityisesti F. oxyspomm -kannasta (DSM 2672). sekä tätä koodaavars. DNA-sekvenssin. Uoden, t\. 20 lajista Fumrium sp. BLB (PERM BP-10493) peräisin olevan, proteaasin 4 :Tj aminohapposekvenssi tuodaan esiin julkaisussa WO 2006101140 (SODX Co Ltd, * ♦1’ Nakamura). Myös sellaisista sienilajeista kuten Tritirachium ja Conidiobolus peräisin «s 1« v ; olevia emäksisiä proteaaseja on selostettu (niistä ovat esittäneet katsauksen Anwar ia *44 1 :1Γ: Saieemuddin, 1998).
* * 4 4 « 414
Sieniperäisten seriiniproteaasien käyttö erilaisissa sovelluksissa tunnetaan myös useista *;**3 patenttihakemuksista. Esimerkiksi selltrlaasin ja proteaasin yhdistelmä, erityisesti *:·1; trypsiinin kaltainen proteaasi lajista Fmimum sp. DSM 2672, pesuaineiden lisäaineena tai koostumuksena on tuotu esiin julkaisussa Wö 1992018599 (NovoNordisk A/S).
9 4 ,«··, 30 Tällaiset pesuainekoostumukset voivat edelleen käsittää käänteisiä proteaasi- * t *44 * inhibiittoreita entsvvmin tai entsyymien stabiloimiseksi, kuten on tuotu esiin iulkaisuissa «« ·»·<.· - 1· * 4 * ** WO 1992003529 ia WO 1992ÖÖ5239 (NovoNordisk A/S). Menetelmiä likaantumisen tai * « «· '· ' * 4 ♦ 1 tahrojen poistamiseksi tai valkaisemiseksi selluloosakanfc&ista käyttäen 3 entsyymihybridiä, joka käsittää kaialyyttisesti aktiivisen aminohapposekvenssin kuten proteaasin liitettynä aminohapposekvenssiin, joka käsittää selluloosaa sitovan domeeni», on tuotu esiin julkaisussa WO 1997028243 (NovoNordisk A/S). Julkaisussa WO 1997002753 (NovoNordisk A/S) tuodaan esiin menetelmä likaantuneen 5 prosessilaitteiston hellävaraista puhdistusta varten käyttäen lipaasia ja proteaasia, joka on edullisesti suvusta Fusarium saatava seriiniproteaasi.
Sosioekonomiset haasteet ja valtiolliset säädökset ovat pakottaneet pesusineieoHisuuden ottamaan huomioon monia ympäristönäkökohtia, mukaan lukien sekä vähemmän 10 haitallisten kemikaalien käytön, joita voidaan käyttää pieninä määrinä ja jotka sen vuoksi saastuttavat ympäristöä vähemmän, että myös tarpeen säästää energiaa. Pesuaine-entsyymit, erityisesti proteaasit ovat merkittävä aineosa pesuainekoostutmsksissa, Tarve säästää energiaa laskemalla pesulämpötiioja sekä korkeita lämpötiloja sietämättömien synteettisten kuitujen lisääntynyt käyttö sekä tämänhetkinen elämäntyyli ovat 15 suunnanneet kuluttajien tottumuksia kohti alhaisia pesulämpötiioja ja aikaansaaneet tarpeen uusille entsyymeille, jotka ovat tehokkaita alhaisissa lämpötiloissa.
Huolimatta siitä tosiseikasta, eitä on julkaistu useita patenttijulkaisuja, katsauksia ja artikkeleita, joissa on tuotu esiin seriiniproteaaseja eri mikro-organismeista, esimerkiksi 20 alhaisen lämpötilan proteaaseja mikro-organismeista, jotka ovat sädesieniä (jNoeardiopsis :Ti dassormlki) tai sieniä (Paeciiomyces marquandii}, esim. julkaisuissa EP 0290567 ja s *r EP 0290569 (Novo Nordisk A/S, DK), on edelleen olemassa suuri tarve vaihtoehtoisille *»** : ti seriiniproteaaseiile, jotka soveltuvat protenmmateriaalien tehokkaaseen muokkaamiseen, :Yt hajottamiseen ja poistamiseen erityisesti alhaisilla tai kohtalaisilla lämpötila-alueilla ja 25 jotka ovat stabiileja ominaisuuksiltaan huomattavasti vaihielevien pesuaineiden läsnäollessa, * * 6 *i·1: Pesuameteoilisuudessa on otettu huomattavia edistysaskeleita uusien tuotteiden mukauttamisessa kuluttajien tarpeisiin ja tottumuksiin, uusien tekstiilituotteiden * 1 „·»1. 30 ominaisuuksiin sekä uusille pesukoneille. On selvää, että kehitettäessä uusia pesuaineita, * 1
» 1 X
erityisesti pyykinpesu- ja astianpesuainekoostumuksla, näiden on kyettävä täyttämään * 1 % 1[ suuri määrä vaihtelevia ja nopeasti muuttuvia tarpeita. Kaikkien pesuaineteollisuuden ja * 1 1 1 valtiollisten säädösten asettamien vaihtelevien edellytysten täyttämiseksi uusien 4 pesuainekoostumuksiin tarkoitettujen seriiniproteaasiaineosien ei tule ainoastaan täyttää niiden tehtävää laajalla pH- ja lämpötila-alueella sekä pysyä stabiileina vaihteievissa olosuhteissa, mukaan lukien mekaaniset ja kemialliset toimenpiteet käyttäen useita erilaisia pesuaineita, vaan on myös toivottavaa, että seriimproteaasia voidaan tuottaa 5 suuria määriä, joiden jälkikäsittely on kustannustehokasta, koska ne voidaan helposti erottaa fermentointiliemestä ja sienirihmastoista.
KEKSINNÖN YHTEENVETO
10 Esillä olevat keksinnön tavoitteena on aikaansaada sieniperäinen seriiniproteaasi, jolla on laaja substraattispesifisyys, joka on aktiivinen laajoilla pH-aiueilla ja jolla on laaja lämpötilaoptimL eli joka toimii sekä alhaisissa että kohtalaisissa lämpötiloissa. Pyykin-ja astianpesuaineisiin tarkoitettujen seriiniproteaasien on oltava stabiileja myös pesuaineiden läsnäollessa tai oltava yhteensopivia pesuaineiden kanssa. Erityisesti esillä 15 olevan keksinnön tavoitteena on aikaansaada seriiniproteaasi» joka kykenee poistamaan proieiinimateriaalia, mukaan lukien pestävässä pyykissä tai tiskeissä olevia tahroja, tämänhetkisiä kaupallisia entsyymivalmisteita alhaisemmissa lämpötiloissa, säästäen näin energiaa. Sieniperäistä seriiniproteaasia voidaan valmistaa runsastuottoisissa sieni-isännissä ja sen jälkikäsittely, esim, erottaminen fermentaariöiiemesiä ja 2Ö sienirihmastoista, on helppo suorittaa, «
»XX
* * s s Φ * e ··· Esillä oleva keksintö koskee sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä, jolla on * ·’; seriiniproteaasiaktiivisuutta ja joka käsittää sekvenssissä nro 15 määritellyn kypsän s * 9 » :*♦** Pe_RP6318-entsyymin aminohapposekvenssin tai aminohapposekvenssin, joka on 25 ainakin 86-prosenttisesti identtinen sekvenssissä 15 määritellyn kypsän Fe jlF631S~ * * Φ entsyymin aminohapposekvenssin kanssa.
« ***** *j**i Keksinnön entsyymi on saatavissa lajista Fusarium eqttiseti, edullisemmin talletetusta kannasta CBS 119568.
»«»«« 30 f * 9 » » Entsyymin molekyylimassa on 25-35 kDa. Entsyymin optimiiämpötila on alueella 30- * « ^ ** 70 °C pH:ssa 9. Mainitun entsyymin pH-optimi on alueella, joka on vähintään pH 6-11 # *· « *♦ " lämpötilassa 50 °€. Lämpötila- ja pFLoptimit määritettiin käyttäen 15 minuutin 5 reakhoaikaa ja kaseiinia substraattina. Keksinnön seriiniptoteaasi kykenee hajottamaan tai poistamaan proteiinitahroja pesuaineen läsnäollessa 10-60 °C:n lämpötilassa.
Keksinnön sieniperäisiä setiiniptoteaasientsyymiä koodaa eristetty 5 polynukleotidisekvenssi joka hyhridisoituu ankarissa olosuhteissa polynukleotidisekvensslin, joka sisältyy piasmidiin pALK252i, joka käsittää aukieotidisekvenssin nro 9 ja joka on talletettu E. co/issa RF7664 talletusnumeroUa DSM2217L
10 Mainittua entsyymiä koodaa eristetty polynukleotidisekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, joka käsittää sekvenssissä nro 15 määritellyn kypsän Fe_RF631S-entsy'ymin aminohapposekvenssin tai aminohapposekvenssin, joka on ainakin 86-prosenitisesti identtinen sekvenssissä IS määritellyn kypsän Fe__RF6318~entsyymin aminohapposekvenssin kanssa. Edullisesti mainittua entsyymiä koodaa eristetty 15 nuHeiinihappomolekyyii, joka käsittää sekvenssin nro 14 nuMeotidisekvenssim
Keksinnön täyspitkiä sieniperäistä seriimproteaasientsyymiä koodaa poiytmkleöridisdcvenssi» joka sisältyy' piasmidiin pALK2529, talletettu Escherichia cö/tssa RF7800 tailetusnumeroila DSM 22172.
»5 20 « 1 « X 1 *♦.. Sieniperäinen serimiproteaasientsyymi valmistetaan mkombinanttiseaia « x » * · ekspressiovektorista. joka käsittää nukleiinihappomolekyylin, joka koodaa keksinnön & V1l sieniperäistä seriiniproteaasia, toiminnallisesti liitettynä säälei ysekvenssaihin, jotka *”.1 kykenevät, ohjaamaan seriimpsoteaasia koodaavan geenin ilmentymistä soveltuvassa * 1 x I1. 25 isännässä. Soveltuviin isäntiin sisältyvät heterologiset isännät» edullisesti mikrobi-isännät « » suvuista Trickodertm, Aspergilius, Fusarium, Humicola, Ckrysosporium, Neuraspom, v Rhizo&us, PemciUium ia Monirielia, ««<·«1 x 1' * 1 . Edullisesti mainittua entsyymiä tuotetaan suvuissa Trichoäerma tai Aspergiiius, «»««« 30 edullisimmin lajissa F, reeset e » * e #«s « » j 1« Esillä oleva keksintö koskee myös eristettyä nukleiimhappomolekyyliä, joka koodaa * 9 ϊ/«ϊ sieniperäistä proieaasientsyymiä, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat; 6 (a) nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla o» seruniproteaasidctiivisuutta ja joka käsittää sekvenssissä nro 15 esitetyn aminohapposekvenssin; (b) nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla «n 5 seriimproteaasiaktiivisuulta ja joka on ainakin 86-prosemtisesti identtinen sekvenssin aro 15 aminohapposekvenssin kanssa; (e) nukieiinihappornolekyyii, joka käsittää sekvenssissä nro 10 kuvatun nukieotidisekvenssin koodaavan sekvenssin; (d) nukldinihappomolekyylL joka käsittää DSM 22171. ;n tai DSM 22172:n 1Ö sisältämän polynukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin; (e) nukieiinihappornolekyyii, jonka koodaava sekvenssi eroaa minkä taliansa kohdista {c}--(d} nukleiinihappotnolekyylin koodaavasta sekvenssistä geneettisen koodin degeneraation vuoksi; ja (t) nukieiinihappomoldyylL joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa 15 DSM 22171 ;n sisältämään ntikleiimhappomolekyyliin ja joka koodaa polypeptidiä, jolla on seriirJproteaasiaktiivisrmtia. ja aminohapposekvenssi, joka on ainakin 86-prosenttisesti identtinen sekvenssissä nro 15 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa.
·♦. 20 Keksintö koskee edelleen rekornbinanttista ekspressiovektoria, joka käsittää keksinnön * »« „»j·, nukleotkiisekvenssin, joka on toiminnallisesti liitetty' säätelysekvensseikin, jotka * « » 9 ,·, kykenevät ohjaamaan mainittua senmiproteaasia koodaavan geenin ilmentymistä *♦** ♦ soveltuvassa isännässä. Soveltaviin isäntiin sisältyvät heterologiset isännät, edullisesti » « » .♦♦*4 mikrobi-isännät suvuista Trichoderma, Aspergillus, Fusaritm, Humimla, * * * * ,··♦, 25 ChrysGsporium, Nmrospora, Rhizopus, PenialHum ja Moräriella. Edullisesti mainittua * x «♦* entsyymiä tuotetaan suvuissa Trichoderma tai Aspergillus, eduihsjmmin lajissa T. reesei.
* «« * * * « «
Keksintö koskee myös isäntäsolua, joka käsittää edellä kuvatun kaltaisen.
* ♦ * ekspressiovektorin. Edullisesti isäntäsolu on mikrobi-isäntä, kuten rihmasieni. Edulliset > X X « Φ 30 isännät kuuluvat sukuihin Trichoderma, Aspergillus, Fmarium, Humicola, « « *»*♦* Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus„ Pemdllium ja Moräriella. Edullisemmin isäntä * * j **· on Trichoderma tai Aspergillus, edullisimmin rihmasi em I. reesei< s * « X « « SS Φ s t
Esillä oleva keksintö koskee valmistusmenetelmää polypeptidille, jolla on senmiproteaasiaktiivisuutta, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet keksinnön isäntäscdun viljelemiseksi ja poiypeptidin talteen ottamiseksi. Keksintöön sisältyy myös keksinnön nukleiinihapposekvenssin koodaama polypeptidk jolla on 5 setiini proteaasiaktii visuutta ja joka on saatavissa edellä kuvatulla menetelmillä.
Keksintö koskee menetelmää entsyymivaimisteen aikaansaamiseksi, menetelmin käsittäessä vaiheet, joissa, viljellään keksinnön isäntäsoiua ja joko otetaan polypeptidi talteen soluista tai erotetaan solut elatusaineesta ja kerätään supernatanhi. Esillä olevaan 10 keksintöön sisältyy myös entsyymivalmiste, joka on saatavissa edellä kuvatulia menetelmällä,
Keksintö koskee entsyymivalmistetta, joka käsittää keksinnön senim|Mrötewsientsyymm.
IS Keksinnön entsyymivalmiste voi edelleen sisältää muita entsyymejä, jotka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät proteaasi, amyl&asi, sellul-aasi, lipaasi, ksyianaasi, mammnaasi, kutinaasi, pektinaasi tai oLsidaasi mediaattorin kanssa tai ilman, sekä myös soveltuvia lisäaineita, jotka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät stabilointiaineet, puskurointiaineet, pinta-aktiivi set aineet, valkaisuaineet, mediaattorit, korroosionestoaineet, Γ» 20 vedenpehmeniäjät uudelleen tarttumista estävät aineet, optiset kirkasteet, väriaineet, » ♦*!*♦ pigmentit, syövyttävät aineet, hankausaineet ia säilöntäaineet jne.
* «♦o « ♦ »*» Tuottaiaisännän käytetty elatusaine voidaan käyttää sellaisenaan tai isantäsolut voidaan * * * '· «· ·· · x«e « «*J*« poistaa ia/tai se voidaan konsentroida, suodattaa tai fraktioida. Se voidaan myös kuivata.
·***» 25 Keksinnön entswmivalmiste voi olla nesteen, jauheen tai rakeiden muodossa.
* S v v ? ti» «♦*»· Keksintöön sisältyy myös keksinnön serikviproteaasientsyymin tai entsyymivaimisteen »**·· käyttö pesuaineissa, kuitujen käsittelyssä, villan käsittelyssä, hiusten käsittelyssä, nahan ♦ käsittelyssä, elintarvikkeiden tai rehun käsittelyssä tai missä tahansa sovelluksissa, joihin «***·» v ' «
« R
s»..g 30 liittyy proteiinimateriaalin muuntelu, hajotus tai poistaminen. Erityisesti entsyymi tai * * ♦* entsyymi valmiste on käyttökelpoinen pesuaineiden lisäaineena nestemäisissä ja » e 5 " jauhemaisissa pesuaineissa.
* ♦ * *» »« « « s
PIIRUSTUSTEN LYHYT KUVAUS
Kuvio 1 esittää Fusarium equiseti RF63B Fe prtSSA -geenin nukleotidisekvenssm ja siitä johdetun aminohapposekvenssin. Oletettu signaalipeptidi, joka analysoitiin käyttäen 5 ohjelmaa Signal? V3.0, on ilmoitettu pienin kirjaimin ja alleviivattuna. Prosekvenssi ja prosekvenssin johdetut aminohapot on ilmoitettu pienillä kirjaimilla. Kypsät nukleotidi-ja peptidisekvenssit on ilmoitettu isoilla kirjaimilla (N-pään sekvenssi määritettynä puhdistetusta villityypin Fe_RF631 S-proteiinista). Oletetun intronisekvenssin sijainti on ilmoitettu pienillä kirjaimilla, kursivoituna ja merkittynä nukleotidisekvenssis alla 10 olevalla katkoviivalla. Lopetuskodoni on esitetty asteriskilla sekvenssin alia. N-pään sekvenssi ja peptidisekvenssit. jotka on saatu villityypin Fe_RF6318-proteiiöista, on korostettu harmaalla taustalla.
Kavio IA esittää Fe prtSA -geenin nukleotidisefcvenssin ATG-aloituskodonista CCT-15 kodoniin (nukleotidit 898-900). sekvenssialueen, joka koodaa Fe RF6318-proteiinm aminohapposekvenssiä Metl-Va!2?8.
Kuvin IB esittää Fe prtSA -geenin nukleotidisekvenssm CTC-kodonista (nukleotidit 901-903) TAA-Iöpetuskodoniin. sekvenssialueen, joka koodaa Fe RF6318~proteik«.n f*,, 20 aminohapposekvenssiä Leu279-Ala4I2.
a e * * * * « # « * ··· Kuvio 2 esittää kaavamaisesti kasetin, jota käytetään Fe prtSSA -geenin ilmentämiseksi »xt« » «*♦ Trichoderma teeseissä.
»«« « x»« * * * ♦ * * ♦***· 25 Kuvio 3 esittää osittain puhdistetun rekomfeinamtisen Fe_RF63!8-proteiimn xt« analysoituna 12~prosenttisessa SDS PAGE -geelissä. Kaista 1. Näyte osittain ♦*««♦ puhdistetusta FeJRP6318:sta, 2. MW-markkeri (Bench Mark Protein Ladder, Invitrogen) ♦ * *
Kuvio 4A kuvaa rekombinanitisen proteiinin Fe RF6318 lämpötilaprofriim määritettvnä *««»> A ---- t X » * * ... 30 pH-arvossa 9 käyttäen 15 min reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina. Datapisteet ovat « ♦ *♦ * keskiarvoja kolmesta erillisestä mittauksesta.
* » ♦ * * »♦ * « ♦ * « * * «t 9 4 9
Kavio 4B kuvaa pH:n vaikutusta rekombmanltisen Fe_RF6318-proteiinm aktiivisuuteen. Käytetty puskuri oli 40 mM Brilton-Robinson-puskuri, kaseiinia käytettiin substraattina» reaktioaika oli 15 min ja reaktioiämpöiila SO °C. Datapisteet ovat keskiarvoja kolmesta erillisestä mittauksesta.
5
Kuvio 5 kuvaa rekombinanttisen Fe JRF6318-proteiinin tehokkuutta ven/maito/musie-tahroihin (Art 116. EMPA) 39 °C:ssa. pH 9, 60 min. Kaupallisia valmisteita Savinase® Ultra 16L (Novozymes Ä/S, DK) ja Puraiset® 4000L (Geneneor Inc.» USA) käytettiin vertailua varten. AL* (deitaL*)::: entsyymikäsiteliyn kankaan vaaleusarvo L* - pelkällä lö puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin noiianäyte) vaaleusarvo L*.
Kuvio 6 esittää rekombinanttisen Fe_RF63i8-proteiinin tehokkuutta ven/maito/muste-tahralle (Art. 116, EMPA) 50 °€:ssa. pH 9. 60 min. Kaupallisia valmisteita Savinase® Ultra 161. ja Purafeet® 4ÖÖ0L käytettiin vertailua varten. AL* (deitaL*) :::: 15 entsyymikäsiteliyn kankaan vaaleusarvo L* pelkällä puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin noiianäyte) vaaleusarvo L*.
Kuvio 7A esittää rekombinanttisen FeJRF6318-proteiinin tehokkuutta veriAnaito/muste-tahroihin (An. 117, EMPA.) 40 °C:ssa. pH-arvon ollessa noin 10,60 min pesuainejaaheen 20 läsnä ollessa (Art. 60.1, EMPA). Kaupallista valmistetta Purafeet® 40001. käytettiin « ***** vertailua varten. AL* (delta L*) ~ entsyymikäsiteliyn kankaan vaaleusarvo L* - pelkällä « ♦»· puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin noiianäyte) vaaleusarvo L*.
«R«« » « * * * * S * «aa « ***** Kuvio 7B esittää rekombinanttisen Fe_RF6318-proteiinin tehokkuutta veri/malto/muste- « ·*“; 25 tahroihin (Art. 117, EMPA) 40 cC:ssa, pH-arvon ollessa noin 10, 60 min pesuainejauheen a x « ja valkaisuaineiden läsnä ollessa (Art. 604 ja 606, EMPA), Kaupallista valmistetta ***** Purafeet® 4ÖÖÖL käytettiin vertailua varten, AL.* (deitaL*) = entsyymikäsiteliyn kankaan ·;1« vaaleusarvo L* - pelkällä puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin noiianäyte) * vaaleusarvo L* .
* X * « « e * X * « J>0 * »
« X
Kuvio 8A esittää rekombinanttisen Fe RF631 8~proteiinin tehokkuutta veri/mako/fnuste-»« ”· } « · * 1 tahroihin (Ari. .117, EMPA) 50 °€:ssa, pH-arvon ollessa noin 10. 60 min pesuainejauheen «I 4' Λ ' 4 « » 1 läsnä ollessa (Art. 601, EMPA). Kaupallista valmistetta Purafeet® 4ÖÖÖL käytettiin 10 vertailua varten. AL* (deltaL1) = entsyvmikäsitellyn kankaan vaaleusarvo L* - pelkällä puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin nollanäyte) vaaleusarvo L1.
Kavio SB esittää rekombinanttisen Fe__RF63I 8-prote«nin tehokkuutta veri/maito/muste~ 5 tahroihin (Art. 117, EMPA) 50 °C:ssa» pFI-arvon ollessa noin 10,60 min pesuainejauheen ja valkaisuaineiden läsnä ollessa (Art, 604 ja 606, EMPA). Kaupallista valmistetta Puraiset®4Ö00L käytettiin vertailua varten, AL* (deltaL1) =: entsyymik&sitellyn kankaan vaaleusarvo L* - pelkällä puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin nollanäyte) vaaleusarvo L1.
10
Kuvio 9 esittää rekombinanttisen Fe RF631S-proteiinin tehokkuutta ve?i/ma!tcv mustetahroihin (Art. 117, EMPA) nestemäisen Ariel Sensitive» kanssa 40 °C:ssa, pH noin 7,9, 60 min. Kaupallisia valmisteita Savinase® Ultra 16L ja Purafect® 40ÖÖL käytettiin vertailua varten, X-akselilla on esitetty entsyymin annostus (aktiivisuusyksikköä/ml), Y~ 15 akselilla AL* (deltaL1) = entsyymikäsilellyn kankaan vaaleusarvo L* - pelkällä puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin nollanäyte) vaaleusarvo L1.
Kuvio 10 esittää rekombinanttisen Fe RF6318-proteiluin tehokkuutta veri/maito/muste-tahroihin (Art, 117, EMPA) erilaisilla värillisille kankaille tarkoitetun nestemäisen ♦ 20 pesuaiuepohjan pitoisuuksilla 30 °C:ssa. Kaupallisia valmisteita Purafect® 400ÖL ja ;*♦1« Savinase® Ultra 16L käytettiin vertailua varten, AL* (deltaL1) = entsyymikäsitellyn »;· kankaan vaaleusarvo L* - pelkällä puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin nollanäyte) «««« * ·1· vaaleusarvo L*.
»sk » ««» » K » * K 9 * ;***; 25 Kuvio IÖA esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudella 5 g/1 ja pH:ssa 7,5.
t»*
Kuvio JOB esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudella 5 g/i (entsyymin annostus laskettu ·;··· proteiinina), » » » * 30 Kuvio 1ÖC esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudella 3,3 g/1 ja pFhssa 7,4.
* 4 9 * « a 9 9 4 e ♦ " Kuvio löi.) esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudella 1 g/1 ja pl kssa 7,3.
a 9 « ♦ *« il
Kuvio 11 esittää rekx>mbmanttisen Fe_RF631 8-proteiinin tehokkuutta kankailla oleviin veri/maito/muste-tahroihin (Art, 117» EMPA) kankailla erilaisilla Ariel Senshiven (ilman entsyymejä) pitoisuuksilla 30 ö€:ssa. Kaupallisia valmisteita Purafect® 400ÖL ja Savinase® Ultra 16L käytettiin vertailua varten. AL* (dehaL*) = entsyymikäsheilyn 5 kankaan vaaieusarvo L* - pelkällä puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin noHanäyte) vaaieusarvo LA
Kuvio 11A esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudeila 5 g/i ja pHtssa S, 10 Kuvio HB esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudeila 5 g/l (entsyymin annostus laskettu proteiinina).
Kuvio 11C esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudeila 3,3 g/lja pBrssa 7.9.
15 Kuvio 11D esittää tehokkuuden pesuainepitoisuudeila 1 g/l ja pH:$sa 7,6.
Kuvio 12 esittää rekomhinanttisen Fe__RF6318~proteiinin tehokkuutta erilaisiin tahroihin Launder Ometer -kokeissa nestemäisellä pesuaineella Ariel Sensitive (Ilman entsyymejä) 30 Ahssa. Kaupallista valmistetta Savinase® Ultra 16L käytettiin vertailua varten, AL* Γ. 20 (deltat*) ::: entsyymikäsitellyn kankaan vaaieusarvo L* - pelkällä puskurilla käsitellyn e
**«*♦ kankaan (entsyymin noiianäyte) vaaieusarvo LA
* x * * V « « ♦*. Kuvio 12A esittää tehokkuutta, kun kyseessä on veri/maito/muste/PE-puuvlHa (Art. 117, « 6 <V « EMPA), * * x »XK Λί * 9 * * x««
Kuvio 12B esittää tehokkuutta, kun kyseessä on veri/maito/muste/Puuvilla (Art. 116, ...rt EMPA).
♦ * « * * . Kuvio 12C esittää tehokkuutta, kun kyseessä on ruoho (Art. 164, EMPA).
« * 30 « * « e T Kuvio 13 esittää rekomhinanttisen Fe_RF631 S-proteiinin tehokkuutta erilaisiin tahroihin « * « x * *' Launder Ometer -kokeissa nestemäisen värjätyille kankaille tarkoitetun pesuainepohjan 1
kanssa 30 ®C:ssa. Kaupallisia valmisteita Savinase® Ultra 16L ja Purafect® 4000 L
12 käytettiin vertailua varten. AL* (delta]-*}:::: entsyymikäsitellyn kankaan vaaleusarvo L* -pelkällä puskurilla käsitellyn kankaan (entsyymin noilanäyte) vaaleusarvo L*.
Kuvio I3A. esittää tehokkuutta, kun kyseessä on veri/maito/musie/PE-puwvUla (Art. i 17, 5 EMPA).
Kuvio Ί3Β esittää tehokkuutta, kun kyseessä on veri/maito/musle/lhnmlla (Art. 116, EMPA).
lö Kuvio 13C esittää tehokkuutta, kun kyseessä on ruoho (Art. 164, EMPA),
Kuvio 13B esittää tehokkuutta, kun kyseessä on kaakao (Art. 112, EMPA).
Kuvio 14 esittää FeJRF6318-entsyymivalmisteen tahranpoiston kokonaistehokkuutta 15 (delta%SR) kahdeksalle eri proteaasiherkäile tahralle (taulukko 5} täysimittaisissa pesukokeissa. Kaupallisia valmisteita Savinase® Ultra 16Lja Purafect® 4000L käytettiin vertailua varten.
Kuvio 14A esittää kokonaistahranpoistoiehokkuutta, kuu proteaasivaimisteita ?*♦ 20 annosteltiin aktiivisuuden mukaan.
K «X » » « » » X « *
Kuvio 14B esittää kokonaistahranpoistotehokkuutta, kun proteaasivalmisteita «««« ϊ .*« annosteltiin proteiinin määrän mukaan.
« « « * «XX « « * ♦ * X ♦ ,***, 25 Kuvio IS esittää tahranpoistovaikutusta värillisille kankaille tarkoitetun nestemäisen pesuainepchjan kanssa täyden mittakaavan kokeessa 30 *C:ssa.
x jt*** X «
Kuvio ISA esittää tahranpoistoa, kun kyseessä on veri/maito/muste/Puuvilia (C~05~ Ö14/CFT).
« « « x * to * * e ^ X * X * 7 Kuvio I.5B esittää tahranpoistoa, kun kyseessä on veri/maito/muste/PE-puuviila (C~Ö5> x « i 014/CFT).
« » « k « « »«
» V
Kuvio ISC esittää tahranpoisioa. kuu kyseessä on maitokaakao/pigmentti/?uuvilIa (€· 03-030/CFT).
Kuvio 1SI> esittää tahranpoIstoa, kun kyseessä on ntaapähkinäöIjy/maito/Puuvilia (€~05~ 5 0I4/CFT).
Kuvio 15E esittää tahraapoistoa» kun kyseessä on munankeituamen/pigmeutti/Fuuvilia (CS-3S-0I0/CFT).
10 SEKVENSSILISTA
Sekvenssi nro 1 Aminoterrainaalisen peptidin #3792 sekvenssi Fusarium equiseti RF6318 -proteaasista.
15 Sekvenssi nro 2 Ttypiiseu peptidin 1246,673 sekvenssi Fusarium equiseti RP6318 -proteaasista.
Sekvenssi nro 3 Tryptiseu peptidin 3341.633 sekvenssi Fusarium equiseti R.F63I8 ~ proteaasista.
♦♦ js\ * ♦ A* V x ♦ * »
Sekvenssi nro 4 Tryptisen peptidin 1503.799 sekvenssi Fusarium equiseti RF6318 - ♦ ... proteaasista.
***♦ * x « > » t « * Χβ« «i »*:*. Sekvenssi nro 5 Sekvenssi olkonukleotidialukfceelie PR087. joka on peräisin » « » V.· * « ♦***♦ 25 sekvenssin nro 1 antmoterrainaalista peptidistä.
♦·♦·♦ Sekvenssi nro 6 Sekvenssi oHgonukieotidiaiukkeeiie PR088, joka on peräisin •j*·; sekvenssin nro 1 amsnotenninaaiista peptidistä.
« «e»«* « x ... 30 Sekvenssi aro 7 Sekvenssi olisonukleotidialukkeeile PR089, joka on peräisin * s ^ ' * o T sekvenssin nro 4 peptidistä.
«« * ♦ * «« * x * * » * ♦ X» « 9 14
Sekvenssi »ro 8 Sekvenssi oligonukleotidiaiukkeeile PRÖ98, joka on peräisin sekvenssin nro 4 peptidistä.
Sekvenssi nro 9 Sekvenssi PCR-Trsgmenlille, joka oli saatu käyttäen aiukkeiia PR088 5 (sekvenssi nro 6) ja PR089 (sekvenssi nro 7) sekä Fusarhm equiseti RFö3l8:n genomista DNA:ta tempiaattina.
Sekvenssi nro 18 Täyspitkän Fusarmm equiseti RF6318 -proteaasigeenin (Fe prtSSA) nukleotidisekvenssi.
10
Sekvenssi nro 11 Täyspitkän Fusarmm equiseti RF6318 -proteaasin (Fe_RF63i8) johdettu aminohapposekvenssi, mukaan lukien aminohapot Meti~Ala412.
Sekvenssi nro 12 Nukleotidisekvenssi, joka koodaa Fusarmm equiseti RF6318 -15 proteaasin proentsyym imuodon aminohapposekvenssiä.
Sekvenssi nro O Fusarmm equiseti RF6318:n proentsyymimuodon aminohapposekvenssi, mukaan hakien täyspitkän proteaasin aminohapot Ala2I-Aia 412.
**♦ 28 Sekvenssi nro 14 Nukieotidisekvenssi, loka koodaa Fmaritm equiseti RF63I8 - « »» « ,*j». proteaasin kypsän muodon aminohapposekvenssiä.
« « » « «
** X
; Sekvenssi nro 15 Fusarmm equiseti RF63I8:n kypsän muodon aminohapposekvenssi, « i « «»x « mukaan lukien täyspitkän entsyymin aminohapot Alal24-Ala412.
« * * ♦ * * * ^ «S ·*-·- * x
TALLETUKSET
« « « ...,ϊ Fusarmm eauiseii RF6318 talletettiin 7,4.2886 Centraaibureau Voor Schimmelcaltures
» x A
* , "kokoelmaan, Uppsalahan 8, 3508 AD, Utrecht, Alankomaat, ja sille annettiin ««««« 30 talletusnumero CBS 119568.
x » » »
« « X
*
X K
: *** E. coli -kanta RF7664, sisältäen plasmidin pALK2521, talletettiin 14.1,2009 kokoelmaan a # ·."·! Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuituren GmbH (DSMZ), 15
Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Saksa, ja sille annettiin talletusnumero DSM 22171.
£'. coii -kama RF780Ö, sisältäen plasmidin pALK2529, talletettiin 14.1.2009 kokoelmaan 5 Deutsche Sammlung von Mifcroorganismen «sd Zellkulturen GmbH (DSMZ),
InholTenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Saksa, ja sille annettiin talletusnumero DSM 22172.
YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS
10
Esillä oleva keksintö koskee sieniperäistä seriiniproteaasia, jolla on laaja substraattispesifisyys, joka on stabiili laajoilla pH-alueilia ja jolla on laaja iämpötilaoptiml, eli jolla on hyvä suorituskyky sekä alhaisissa että kohtalaisissa lämpötiloissa. Entsyymi on ihanteellinen pesuainesoveiluksiin. ja se kestää hapettavia 15 aineita ja kelaaönmuodostajia ja on tehokas alhaisilla entsyymitasoiUa pesoaineliuoksissa. Erityisesti seriiniproteaasi on aktiivinen lämpötiloissa, jotka ovat niinkin alhaisia kitin 10 °C, edullisen aineen ollessa 10-60 °C Näin ollen esillä oleva keksintö aikaansaa vaihtoehtoisen seriiniproteaasin käytettäväksi pesuaine- ja muissa sovelluksissa. Sieniperäistä seriiniproteaasia voidaan valmistaa runsastuottoisissa sieni- ♦*. 20 isännissä ia sen jälkikäsittely, esim. erottaminen ferraeniaaiioiiemestä ja » * * » sienirihmastoisia. on helppo suorittaa.
« » « x « « : »♦. Termeillä “serimipreteaasi” tai **serii&iendopeptidaasP tai '^eriinieudoprotelnaasi” »»« x ,*j\ tarkoitetaan tämän keksinnön yhteydessä entsyymiä, joka saa luokituksen EC 3.4.21 $ « « v ^ x .·*·, 25 kansainvälisen biokemian ja molekyylibiologian liiton (International Ehtien of »«a
Biochemistry and Molecular Biology) nimistön mukaan. Seriiniproteaaseja esiintyy sekä yksisoluisissa että monisoluisissa organismeissa. Niiden rakenteellisten samankaltaisuuksien perusteella soriiniproieaasit on ryhmitelty ainakin kuuteen klaaniin * . (SA, SB, SC, SE, SF ja SG; S merkitsee seriiniproteaasia), jotka on edelleen jaetaan « » 30 perheisiin, joilla on samankaltaisia aminohapposekvenssejä sekä kolmiulotteinen rakenne e e « * 7 (ks. esimerkiksi seriiniproteaasikotisivu httn://mvw.biochem.wust.Ledu/---protease/, ♦ e ϊ *** Biokemian ja molekyylibiofysiikan laitos, Washington») lääketieteellinen yliopisto, St.
e x *. *5 Louis, MO, USA). Näille proteiineja hydrolysoiville tai hajottaville entsyymeille on 16 tunnusomaista nukleofiilisen seriiniryhmän läsnäolo niiden aktiivisessa kohdassa, ja klaanin SA ja klaanin SB proteaaseilk on myös tunnusomaista se, että niissä on välttämättömiä aspartaatti- ja histidiinijäännöksiä, jotka seriinin kanssa muodostavat katalyyttisen triadin.
5 Pääasiallisiin klaaneihin sisältyvät “kymotrypsit&m kaltaiset”, mokaan lukien kymotrypsimi, trypsiini ja elastaasi {.klaani SA) ja “subiiiisiinie» kaltaiset” (klaani SB), seriiniproteaasit. Entsyymien vaikutus kohdistuu eri alueille polypeptidikeijua katka!sukohtaa ympäröivien aminohappojäärmösfen sivuketjujen perusteella. Esillä 10 olevan keksinnön seriiniproteaasi kuuluu klaaniin SB,
Karakterisoidut 'sulnilisiinin kaltaiset serssasproteaasit” tai “subiiiaasif ovat oleellisesti bakteeriperäisiä, Tälle proteaasien luokalle, jota edustavat eri ΒααΠίίζ-Ιφι, kuten B. amyloiiquifaciens, B. licheniformis ja B. subiilis (Rao ym., 1998), ovat 15 tunnusomaisia aromaattiset tai hydrofobiset jäännökset kuten tyroslmi. fenyylialaniim ja leusiini.
Keksinnön yhteydessä käytettynä termillä !!sernmproteaasiaktliv?s««sv' tarkoitetaan hydrolyyttista aktiivisuutta proteiinia sisältävillä substraateilla kuten esim, kaseiini, .. 20 hemoglobiini, keratiini ja BSA. Menetelmät proieolyyttisen aktiivisuuden » «« '...t analysoimiseksi ovat kirjallisuudessa hyvin tunnettuja, ja niihin on viitattu esim.
x « 8 julkaisussa Gupta ym. (2002), x * 9 9 9*9 9*9 "*.* Proteaasit voidaan luokitella käyttäen ryhmäspesifisiä inhibitttoreita, “Seriinipreteaasi- »ex t 25 inhibiittorien*1 moninaiseen ryhmään sisältyy synteettisiä kemiallisia inhibiittordta ja 9 e luonnollisia proteiini-inhihiittoreita. Eräs luonnollisien inhibiittorien ryhmä on serpnnil ♦ (lyhennetty seriiniproieaasi-inhibliUoreista), kuten antitrombiini ja alfa-1 -antitrypsiini.
9 * . Keinotekoisiin synteettisiin inhibiittoreihin sisältyvät 3,4-di.kk>ori-isokumarnni (3,4- » 9 » e DC!), di-isopropyylilluorifosfaaiti (DFP), fenyylimetyyliaulfonyyli^uoridi (PMSF) ja 30 tosyyli-L-lysiinikloorimetyydiketoni (1'LCK). Joitain seriiniproteaaseja inhiboivat 9 9 **·»* tiolireagenssit kuten p-kloorielohopeabentsoaaiti (PCMB) johtuen kystelinifäännöksen * * * \* läsnäolosta aktiivisen kohdan lähellä. Näin ollen seriiniproteaasiaktiivisuus voidaan 8 * %*»; määrittää testillä, joka perustuu spesifisen substraatin pilkkomiseen, tai testillä, jossa 1? käytetään mitä tahansa proteiini piioista substraattia spesifisen seriiniproteaasien spesifisen inhibiittorin, kanssa tai liman sitä soveltuvissa olosuhteissa.
Seriiniproteaasit ovat yleensä aktiivisia neutraalissa tai emäksisessä pjp.ssa, niin eitä 5 niiden pH-optimi on välillä 7~I1, ja niillä on laaja substraattispesifisyys. “Emäksisillä seriiniproteaaseilia” tarkoitetaan entsyymejä, jotka ovat aktiivisia ja stabiileja pEkssa 9~ 11 tai jopa pH :ssa 10—12,5 (Shimogaki ym., 1991) ja joiden isoeiektrinen piste on noin pHrssa 9, Nämä edustavat kaupallisten seriimproteaasien suurinta alaryhmää. Emäksisten seriiniproteaasien molekyyiimassat vaihtelevat välillä 15-35 k.Da, latonnollisten 10 seriiniproteaasien lämpötila-optimit ovat noin 60 c€:ssa Olao vm., 1998).
Proteaasiaktiivisuutta tuottamaan kykeneviä mikro-organismikantoja voidaan seuloa ja erilaisten substraattien aktiivisuus voidaan määrittää. Valittuja kantoja voidaan viljellä sopivassa elatusaineessa. Vaikka riittävä määrä kiinnostavia serimiproteaaseja on 15 valmistettu, entsyymi voidaan eristää tai puhdistaa ja sen ominaisuudet voidaan määrittää perinpohjaisemmln. Vaihtoehtoisesti eri organismeissa seriiniproteaaseja koodaavia geenejä voidaan eristää ja geenien koodaamaa aminohapposekvenssiä voidaan verrata tässä esimerkeissä eristetyn ja luonnehditun seriiniproteaasin aminohapposekvenssethisv 20 Tuotetut proteaasientsyymit, erityisesti seriiniproteaasit, voidaan puhdistaa käyttämällä ϊΤ: tavanomaisia entsyymikemiallisia menetelmiä, kuten suolan valmistus, ultrasuodatus, *·♦ ioninvaihtokromatografia, aiftniteettikromatograna, geelisuodatus ia hydrofobinen j vuorovaikutus -kromatogafta. Puhdistusta voidaan seurata proteiinien määrityksellä, ««» * entsyymiaktimsuusmäärityksjilä ja SDS-polyakryyliamidigeeltelektrofbreesilla. * 1" * 1 !***: 25 Puhdistetun entsyymin entsyymiaktiivisuus eri lämpötiloissa ja pH-arvoissa sekä sen ett moolimassa ja isoeiektrinen piste voidaan määrittää.
» * * * * « * « *j‘*i Esillä olevan keksinnön edullisen seriiniproteaasin puhdistus on esitetty esimerkissä Ib.
Suodatettu viljelysupematantti lisättiin Q Sepharose FF -kolonniin. Upivirtausfraktio * v „♦»*, 30 lisättiin fenyyii-Sepharose HP -kolonniin ja proteiinit eluoitiin lineaarisella laskevalla » » * « * suoiagradientilia. Proteaasiaktiivisuutta osoittavat fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin ja * « \ ” lisättiin Saperdex 75 10/3ÖÖ GL -kolonniin. Puhdistusta seurasi vai x « * 1 aktiivisuusmääriiykset resorufiim-leimatulla kaseiinilla esimerkissä Ib kuvatulla tavalla.
IS
Luonnollisesti on mahdollista erottaa esillä olevan keksinnön entsyymi käyttäen muita tunnettuja puhdistusmenetelmiä tässä esitettyjen menetelmien sijaan tai lisäksi. Rekombinanttinen semrnproteaasi puhdistettiin esimerkissä 5 kuvatulla tavalla ja sitä käytettiin pH-ja iämpötiiaprofiifien määrittämiseen.
5
Puhdistetun seriiniproteaasin moolimassa voidaan määrittää massaspektrometri se st i tai SDS-PAGE:Ha tavalla, jonka on esittänyt Laemmli (1970). Moolimassa voidaan myös ennustaa entsyymin aminohapposekvenssistä. Kypsän seriiniproteaasin tai kypsän seriiniproteaasientsyymin moolimassa on tyypillisesti 20-35 kDA, tyypillisesti noin 25-10 30 kDa (Rao ym., 1998).
Seriiniproteaasit syntetisoidaan epäaktiivisina ' (ry mogeea isinä es iasteisjnr tai ’zymogeeneiaa" preproentsyymin muodossa, ja ne aktivoidaan, poistamalla signaalisekvenssi (erityksen signaalipeptidi tai prepeptidi) ja prosekvenssi (propeptidi), 15 niin että aikaansaadaan entsyymin aktiivinen, kypsä muoto (Chen ja Inouye, 2008). Tähän aktivointiprosessiin liittyy proteaasien toiminta, ja se voi olla seurausta seriiniproteaasin rajoitetusta itsehajottavasta tai autokaiälyyttisestä prosessoinnista. Prosek venssi voidaan lohkaista esimerkiksi tuotannon translaation jälkeisillä vaiheilla tai käytetyssä elatusaineessa tai elatusaineen tai entsyymivalmisteen varastoinnin aikana. 20 Proenisyymin aktivointi voidaan myös aikaansaada lisäämällä proteolyyttistä entsyymiä, « ·*;1 joka kykenee muuntamaan epäaktiivisen proentsyymin aktiiviseksi, kypsäksi entsyymiksi * **♦ elatusaineessa, jossa isäntäorganismia viljellään, tai lisäämällä proteolyyttistä entsyymiä • ·*» viljelyn supemafcanttän viljelyprosessln jälkeen. Entsyymin lyheneminen voidaan myös *** « ;*»*; aikaansaada esimerkiksi typistämällä polypeptidiä koodaava geeni ennen kuin 25 tuotantoisäntä transformoidaan sillä.
h X 9 ♦··“♦ Termi "(kypsä’' tarkoittaa sellaista entsyymin muotoa, joka slgnaalisekvenssin ja *t·»· propeptidin poistamisen jälkeen käsittää entsymaattisen tai katalyyttisen aktiivisuuden kannalta välttämättömät aminohapot. Rihmasienissä se on elatusaineeseen eritettävä * « *»* 30 muoto.
« 9 < * ««« 9 »« 9 λ \ 1 Seriiniproteaasin iämpötilaoptimi voidaan määrittää soveltuvassa poskurointiaineessa eri 9 9 » "* lämpötiloissa käyttäen kaseiinia substraattina, kuten esimerkissä 1c on kuvattu, tai 19 käyttämällä malta substraatteja ja puskurijärjestelmiä, joita on kuvattu alan kirjallisuudessa (Gupta ym., 2002). pH-optimin määritys voidaan suorittaa soveltuvassa puskurissa eri pH-arvoissa seuraamalla aktiivisuutta proteiimsubsiraaiilla.
5 Froteaasiaktiivisnus perustuu yleensä liukoisten substraattien hajoamiselle. Pesuainesoveiluksissa proteaasien on toimittava aineille, jotka ovat ainakin osittain liukenemattomia. Nain ollen merkittävä parametri pesuaineproteaasille on sen kyky absorboidaja hydrolysoida näitä liukenemattomia fragmentteja.
10 Toinen merkittävä parametri pcsuaineproteaasien valinnalle on sen isoelektrinen piste tai pl-arvo. Pesuaineproteaasit ovat tehokkaimmillaan, kun sen pesuaineliaoksen, jossa ne toimivat, pH-arvo on suurin piirtein sama kuin entsyymin pl-arvo. pl voidaan määrittää isoelektrisellä fokusoinnilla immobiiisoidussa pld-gradienttigeelissä. joka koostuu polyakryylianridista. tärkkelyksestä tai agaroosista, tai arvioimalla pl 15 aminohapposekvenssistä, esimerkiksi käyttämällä p!/MW~työk.aiua BxPASy-paiveiimeMa (http://expasv.org/tools/Di tool.html: Gasteiger ym,, 2003).
Puhdistetun, proteaasin N-pää sekä sisäiset peptidit voidaan sekvensoida Edmanin hajotuskemian mukaan (Edraan ja Begg, 1967), kuten esimerkissä 2 on kuvattu, tai Γ. 20 muilla alatt kirjallisuudessa kuvatuilla menetelmillä, * -j <· ««« Φ x « ♦·· Keksinnön seriiniproteaasientsyymi voi olla peräisin mistä tahansa organismista, mukaan ί ·** lukien bakteerit, arkkieläimeL sienet, hiivat ia jopa korkeammat eukarvootit, kuten « « « · -·..>» * » x « « j***j kasvit. Edullisesti mainittu entsyymi on peräisin sienestä, mukaan lukien rihmasienet ia ·***· 25 hiivat, esimerkiksi suvusta, joka on valittu ryhmästä, joka käsittää Fmariumm.
♦ x$
Sieniperäiset emäksiset proteaasit ovat edullisia bakieeriproteaaseille johtuen niiden ♦♦<·«* jatkokäsittelyn helppoudesta mikrobittoman entsyymin tai entsyymivalmisteen ····; aikaansaamiseksi. Sienirihmasta voidaan poistaa helposti suodatusmenetelmillä ennen entswmin puhdistusta.
« Φ > X « v v 4 30 x * « *
Esillä oleva keksintö koskee sieniperäistä seriiniproieaasia, jolla on hyvä tehokkuus ♦ o s * ♦ ** ominaisuuksiltaan hyvin vaihtelevien pesuaineiden läsnä ollessa laajoilla, esimerkiksi
X ψ X
** ** alhaisesta kohtalaiseen olevilla lämpötila-alueilla, kuten 10-60 °C:ssa.
20
Esillä olevassa keksinnössä hyvä tehokkuus pesuaineen läsnä ollessa tarkoittaa sitä» että entsyymi, tässä tapauksessa keksinnön sieniperäinen seriiniproteaasi, toimii alhaisemmilla lämpötila-alueilla kuin useat tällä hetkellä kaupat} olevat subtiltsiinit. Toisit} sanoen hyvä tehokkuus tarkoittaa sitä että entsyymi kykenee hajottamaan tai 5 poistamaan pioteimitahroja tai proteiinipitoista materiaalia alhaisesta kohtalaiseen olevilla lämpötila-alueilla, mutta erityisesti alhaisemmilla lämpötila-alueilla kuin nykyiset kaupalliset valmisteet, esimerkiksi kaupallinen entsyymivahniste Purafect® 40ÖÖL (Genencor inc,, USA).
10 Keksinnön sieniperäinen seriiniproteaasi toimii alhaisilla lämpötila-alueilla. Esimerkiksi pH-arvoa muuntelemalla, valitsemalla ominaisuuksiltaan soveltuvia pesuaineita, sisällyttämällä valmisteeseen entsyymejä suojaavia aineita ja säätelemällä pesuolosuhteita keksinnön seriiniproteaasin aktiivisuus voidaan säilyttää lämpötiloissa, jotka ovat niinkin alhaisia kuin 10 CC. Siksi keksinnön seriiniproteaasi on 15 pesuolosuhteista ja apu- ja lisäaineista riippuen käyttökelpoinen erityisesti lämpötiloissa, jotka ovat 50 °C tai alle. Entsyymi toimii myös lämpötiloissa, jotka ovat 45 °C tai alle, 40 °C tai alle, 35 °C tai alle, tai 30 °C tai alle.
Pesuaineen läsnä ollessa keksinnön sieniperäinen seriiniproteaasi toimii määritellyllä ;'*t> 20 tavalla välillä 10-60 °C olevassa lämpötilassa, ja erityisesti mainitulla sieniperäisellä « seriiniproteaasilla Fe_ RF631S on hyvä tehokkuus pesuaineessa lämpötilan ollessa 30 °C, ♦ »·♦ Esimerkeissä δ-ll on kuvattu vertaiiuesimerkkejä, ja kuvioista 7-15 voidaan havaita, »iii ♦ i*j että sieniperäisen seriiniproteaasin Fe RJF6318 tehokkuus vaihtelevissa olosuhteissa ja ««« * ·*·*· erilaisille käsittelyille altistettuna, kohdistettuna useille erilaisille tahroille erilaisilla « ;1"· 25 kangasmateriaaleilla ja määritettynä arvona deltaL* tai deita%SR» on huomattavasti s * * parempi kuin kaupallisten tuotteiden Savinase® Ultra 16L (Novozymes A/S, DK) ja «»·*♦ Puraiset® 4000L (Genencor Inc, USA) tehokkuus.
* * « ♦ Mainituista koetuloksista voidaan päätellä, että keksinnön sieniperäinen seriiniproteaasi « « 30 kykenee täyttämään pesuaineita ostavien asiakkaiden, pesuaineteollisu.ud.en ja φ φ pesukoxteiden valmistajien suuresti vaihtelevat vaatimukset sekä on myös hyvin ♦ * « & * " yhteensopiva tulevaisuuden säädösten ia kuluttajatottumusten asettamien edellytysten « « * « * * 1 kanssa.
21
Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti sieniperäinen proteaasientsyymi on poiypeptldi. jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutfe ja joka käsittää kypsän Fe_RF6318-entsyymin, jolla on sekvenssissä nro 15 määritelty aminohapposekvenssi tai aminohapposekvenssi, joka on ainakin 86-prosentti$esti identtinen sekvenssin 15 5 aminohapposekvenssin kanssa tai ainakin 86-prosenttisesti identtinen sekvenssin 11 aminohapposekvenssin kanssa. Edullinen entsyymi on ainakin 86-prosentiisesti, edullisesti ainakin 87-prosenttisesti, edullisemmin ainakin 88-prosenitisesti ja vielä edullisemmin ainakin 90-prosertttisesti identtinen. Vieläkin edullisemmin aminohapposekvenssit ovat ainakin 92-prosenirisesti, tai ainakin 94-prosenttisesti tai 96-10 prosenttisesti, edullisemmin ainakin 98-prosenttisesti, edullisimmin 99-prosenttisesti identtisiä sekvenssin nro 1.5 aminohapposekvenssin kanssa. Kahden entsyymin identtisyyksiä verrataan vastaavilla sekvenssialueilla, esim, seriiniproteaasin kypsässä tai täyspitkässä alueessa.
15 Esillä olevan keksinnön seriiniproteaasia on merkitty Fe RF6318, ja se on eristetty seriiniproteaasi, joka on peräisin Fusarium equisetiste ja joka kuuluu serliniproteaasien klaaniin SB, perheeseen 8.
Termillä ‘Identtisyys" tarkoitetaan tässä identtisyyttä kahden aminohapposekvenssin :·, 20 välillä verrattaessa niitä toisiinsa vastaavan sekvenssialueen sisällä, jossa on suurin * piirtein sama määrä aminohappoja. Voidaan esimerkiksi verrata kahden ,5, aminohapposekvenssin täyspiikän tai kypsän sekvenssin identtisyyttä. Kahden : .·, verrattavan molekyylin aminohapposekvenssit voivat erota yhdessä tai useammassa **« * /:*, asemassa, mikä ei kuitenkaan muuta molekyylien biologista toimimaa tai rakennetta.
K
«***, 25 Tällaista vaihteina voi esiintyä luonnollisesti johtuen eri isäntäorganismeista tai 4** mutaatioista aminohapposekvenssissä, tai niitä voidaan aikaansaada spesifisellä mutageneeslllä. Vaihtelu voi olla seurausta öeieetiosta, substituutiosta, insertiosta, additiosta tai kombinaatiosta yhdessä tai useammassa aminohapposekvenssin asemassa.
* . Sekvenssien identtisyys määritetään käyttäen ClusialW-rinnastusta (esim. osoitteessa »4««« ... 30 www.ehi.afc.uk/Tools/CiustaIw). Käytetty matriisi on seuraava: BL.OSUM, aukon * * « * T muodostus: 10, aukon laajennus: 0,5.
♦ e ♦ * « Λ* « «
* X O
* ®* * * 22
Edullisesti sieniperäinen seriiniproteaasi on saatavilla Fiminmn-smmia, edullisemmin lajista Fmarium equiseti. Edullisimman suoritusmuodon mukaisesti keksinnön seriiniproteaasi on säätävillä kannasta, joka on talletettu Centraalbureau voor Schimmelealtures -kokoelmaan talktusnumerolla CBS 119568.
·£
Keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto on sieniperäinen seriiniproleaasientsyymi, jolla on seriiniproteaasiaktnvisuutta ja sekvenssissä nro 15 määritelty kypsän Fe_RF6318~ entsyymin aminohapposekvenssi. Kypsältä entsyymiltä puuttuu signaalisekvenssi tai prepeptidi ja prosekvenssi tai propeptidi. Keksinnön kypsä seriiniproteaasi sisältää 10 sekvenssissä nro 11 esitetyn täyspkkän. proteaasin aminohapot Akl24~A1a412. Näin ollen keksintö kattaa myös täyspkkän Fe_RF63l 8-entsyymin, jolla on sekvenssi nm 11, sisältäen signaalisekvenssin (prepeptidi) ja propeptidin ja kypsän entsyymin, sekä proentsyymimuodon, josta puuttuu signaalisekvenssi (prepeptidi) ja jolla on näin ollen sekvenssi nro 13.
15
Esillä oleva keksintö koskee sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä, jonka kypsän muodon molekvylimassa tai molekyylipaino (MW) on 20-35 kDa, edullisesti 25-33 kDa, edullisemmin 28-30 kDa, Edullisin MW on Fe_RF6318m ennustettu molekyykmassa, joka on 29 kDa kypsälle poiypeptidiketjuife ja joka on saata 20 käyttämällä Compute pl/MW -työkalua ExPASy-paivelimella (Gasteiger ym.f 2003).
e * * * « X 4 *
Keksinnön entsyymi on tehokas proteiinimateriaalin hajottamisessa laajalla lämpötila- V««4 : .% alueella. Entsyymin optimaalinen lämpötila on 30-70 °C (noin 20 % ««« s maksimiaktiivisuudesta). edullisesti 40-60 CjC (vähintään noin 40 % .*·*« 25 maksimiaktiivisuudesta}, ja edullisemmin 50-60 °C (vähintään 70 % * * « X * maksimiaktiivisuudesta). edullisimmin 60 *€ (maksimiaktiivisuus, Fe RF6318) määritettynä pH-arvossa 9 käyttäen 15 min reakiioaikaa ja kaseiinia substraattina esimerkissä 5 kuvatulla tavalla.
« * « ««« ** ♦ * 30 Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti sieniperäisen 4 * T seriinlproieaasientsyymin p.H-optimi on alueella,, joka on vähintään pH 6-11, jolloin yli 4 » ί “ 40 % maksinriaktiivisuudesta esiintyy pH-arvossa lö, lämpötilan ollessa 50 °€ käyttäen » « « « « N 15 min reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina esimerkissä S kuvatulla tavalla. Erityisesti 23 pH-optiml on välillä pH 6—10 (noin 60 % maksimiakdivisuudesta) ja edullisemmin välillä pH 9-10 (noin 80 % maksimiaktiivisumesta), ja edullisimmin pH:ssa 10 lämpötilassa 50 °C.
5 Keksinnön sieniperäisellä seriiniproteaasilla on "hyvä tehokkuus pesuaineen läsnä ollessa”, toisin sanoen se kykenee hajottamaan tai poistamaan proteiinitahrqja tai proteiinipitoista materiaalia pesuaineen läsnä ollessa alhaisesta kohtalaiseen olevilla lämpötila-alueilla, erityisesti alhaisemmilla lämpötila-alueilla kuin nykyiset kaupalliset valmisteet, esimerkiksi kaupallinen entsyymivalmiste Puraiset® 4ÖÖ0L (Genencor Inc., 10 USA). Pesuaineen läsnä ollessa keksinnön entsyymi toimii lämpötilassa 1.0-60 °C, edullisesti lämpötilassa 50 °€ tai alle. Fe JRF6318-entsyymi toimii myös lämpötiloissa, jotka ovat 45 r'C tai alle, 40 °C tai alle, 35 °C tai alle tai 30 °C tai alle.
Keksinnön seriiniproteaasientsyymiHä on pl, joka johdetun aminohapposekvenssin 15 perusteella ennustetulla tavalla on välillä pl 9-9,5, edullisesti pl $.1-9,4. Keksinnön Fe__RF6318-entsyymin ennustettu pl on 9,3.
Puhdistetun entsyymin N-pään tai tryptisten peptidien aminohapposekvenssiin syntetisoituja cligonukleotideja tai edellä mainittuja oiigonukieotiäeja käyttämällä V» 20 aikaansaatua PCR-tuoietta voidaan käyttää koettimlna eristettäessä cDNA:ta tai X * * * .*:*« sanomista geeniä, joka koodaa keksinnön seriiniproteaasia. Koetin voidaan myös
» X Λ \*· S? · V
e 4. suunnitella perustuen homologisten seriiniproteaasien tunnettuihin nukleotidi- tai ♦ «** aminohaooosekvensseihin. Serimiproteaaslklooneia voidaan mvös seuloa perustuen ί X « Aa . ‘ * * * * * * «T» niiden aktiivisuuteen malloilla, jotka sisältävät entsvvmin spesifistä substraattia, tai
♦ * * -· V V X
.***♦ 25 käyttämällä seriiniproteaasilb spesifisiä vasta-aineita.
««»
Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti sieniperäistä seriiniproteaasientsyymlä «»..« koodaa eristetty polynukleotidisekvenssi, joka hybridiseituu ankarissa olosuhteissa * . poivnukleotidi- tai koetinsekvenssiin, joka sisältyy piasm.idi.in pALK2521, loka käsittää mt*«« * * ... 30 nukleotidisekvenssin nro 9, E. catissa RF/664, loka on talletettu kokoelmaan Deutsche 9 » * « *Γ Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen (DSMZ) talletusnumeroUa s « ϊ *·* DSM 22171.
♦ x * » K
9 »» X * 24
Esillä olevassa keksinnössä Fe prt8A -geeni eristettiin koettimella, joka valmistettiin PCR-tekniikalla käyttäen ankaraa hybridisointia, kuten esimerkissä 3d on kuvattu. Tavanomaisia molekyylibiologian menetelmiä, esimerkiksi menetelmiä, jotka on kuvattu sellaisissa molekyylibiologian käsikirjoissa kuten Sambrook ja Russell 2001, voidaan 5 käyttää cDNA :n tai genomisen DNA:n eristämisessä isäntäorgani&mista.
Hybridisointi DNA-koettimen kanssa, kuten esimerkiksi sekvenssin nro 9, joka käsittää yli iöö~2öö nukleotidia, suoritetaan yleensä “erittäin ankarissa:' olosuhteissa eli hyhridisoimalla lämpötilassa, joka on 2Ö--25 ÖC täydellisen hybridin lasketun 10 suJamisiämpötilan (Tm) alapuolella, niin että Tm on. laskettu Qoltonin ja McCarthyn (1962) mukaan. Yleensä prehybridisointi ja hybridisointi suoritetaan vähintään 65 °C:ssa selväävissä olosuhteissa: 6xS$€ (tai 6xSSPE), SxDenhardtin reagenssi, 0,5 % (w/v) SDS, 100 pg/ml denaturoitu, fragmentoitu lohen maidin DNA, Prehybridisointi- ja hybrkilsomliiämpöiila laskee 42 °C:see.n, kun lisätään formamidia (kunnes 50 %). Pesut 1.5 suoritetaan alhaisessa suolapitoisuudessa, esim. 2xSSC ~ 0,5 % SDS (w/v), 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, mitä seuraa 2xSSC 0,1 % SDS (Wv) huoneenlämpötilassa ja lopuksi 0,!xSSC - 0,1 % SDS (w/v) vähintään 65 cC:ssa.
Erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti keksinnön sieniperäistä 20 seriiniproteaasientsvymiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa a polyoeptidiä, loHa on sekvenssissä nro 15 määritelty aminohapposekvenssi, tai »e* *x“ “ v * oohmeptidiä, joka on ainakin 86-prosenttisesti identtinen sekvenssissä 15 määritellyn « *· <* 4 ‘ ‘ »»«» ; aminohapposekvenssin kanssa tai ainakin 86-prosenttisesti identtinen sekvenssissä 11 * ♦ * * K * * ,*t‘, määritellyn aminohapposekvenssin kanssa. Edulliset entsyymit, ovat ainakin 86- 25 prosenttisesti, edullisesti ainakin 87-prosentiisesti, edullisemmin ainakin 88-prosenttisesti * » v ja vielä edullisemmin ainakin 90-prosenttisesti identtisiä. Vieläkin edullisemmin aminohapposekvenssit ovat ainakin 92-prosenttisesii, tai ainakin 94-prosenttisesti tai 96-.♦..S prosenttisesti, edullisemmin ainakin 98-prosenttisesti. edullisimmin 99-prosenttisesti * . identtisiä sekvenssin nro 15 aminohapposekvenssin kanssa. Kahden entsyymiin * * K « 4 * * ... 30 identtisyyksiä verrataan vastaavilla sekvenssialueilla, esim. seriiniproteaasin kypsässä tai * * e « T täyspitkässä alueessa, ♦ x * * « X ♦ ·> « * « » X ««
« X
25 Näin ollen keksinnön suojapiiriin sisältyy polypeptidisekvenssi, jota koodaa nukleimihappomolekyyli, joka koodaa keksinnön täyspiikän seriiniproteaasin aminohapposekvenssiä, mukaan lukien prepeptidin (signaalisekvenssi) ja propeptidln entsyymin kypsän muodon lisäksi, ja joka aminohapposekvenssi on esitetty sekvenssissä 5 nro 11.
Keksinnön suojapiiriin sisältyy myös polypeptidisekvenssi, jota koodaa nukkiimhappomolekyyli. joka koodaa keksinnön serimiproteaasientsyymin propeptidiä, sisältäen propeptidln entsyymin kypsän muodon lisäksi, ja joka aminohapposekvenssi on 10 esitetty'sekvenssissä nro il.
Keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto on sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, jota koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodaa Fe_RF6318-seriimproteaasin kypsää muotoa, jolla on sekvenssi nro ISIS
Erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti keksinnön sieniperäisiä serisniproteaasientsyymiä koodaa eristetty' uukieiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssin nro 14 nukleotidisekvenssin. joka koodaa Fe_RF6318-entsyyrnin kypsää muotoa (sekvenssi nro 15), 20 * ♦♦ « Näin ollen keksinnön suojapiiriin sisältyy poiypepddi, jota koodaa **♦ nukleiimh&ppornolekyyli, jolla on sekvenssin nro 10 nukleotidlsekvenssi, joka käsittää * ·** entswmin "koodaavan sekvenssin". Ilmaus “koodaava sekvenssi" tarkoittaa sitä * * φ *· '· *** * ;*♦*. nukleotidisekvenssiä, joka aikaa translaation aioituskodonista (ATG) ja päättyy f. 25 translaation lopetuskodoniin (TAA, TAG tai TGA). Translaatiosta syntyvä tävspiikä polypeptidi alkaa yleensä metiominilia ja käsittää intronialueita.
x 4 β ««« X «
Keksinnön suojapiiriin sisältyy myös sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, jota koodaa * . nukkusiihappomolekyyii, joka käsittää sekvenssin nro 12 nukleotidisekvenssin.. joka *x»»« « « ... 30 koodaa Fe_RF6318-proentsyymimuotoa.
» * * « «4> * X X * * o «* o
« X
* X * * »»
» «I
26
Keksinnön erään muun edullisen suoritusmuodon mukaisesti sieniperäistä seriiniproteaasieixtsyjmriä koodaa polyaukleotidisekveassi, joka sisältyy pALK2529:ään, joka on talletettu E. colissn RF7890 taitetusaumerolla DSM 22172, 5 Eräs keksinnön suoritusmuoto on seriinipmteaasientsyymi, joka valmistetaan rekotnbinaattisesta ekspressiovektorista, joka käsittää nukleiinihäppomolekyytin, joka koodaa edellä määriteltyä sieniperäistä seriiniproteaasia, toiminnallisesti liitettynä sääieiysekvensse&in, jotka kykenevät ohjaamaan seriimproieaasientswmia koodaavan geenin ilmentymistä soveltuvassa isännässä. Mainitun rekonxbinanttisen 10 ekspressio vektorin rakentamista ja mainittua vektorin käyttöä on kuvattu yksityiskohtaisemmin esimerkissä 4.
Soveltuvia isäntiä sieniperäisen seriiniproteaasientsyymin tuottamista varten ovat homologiset tai heterologiset isännät kuten mikrobi-isännät, mukaan lukien bakteerit, 15 hiivat ja sienet, Rihmasienet. kuten Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicoia, Chrysosporium Neurospara, Rhizopus. Peniciliium ja Morärielia, ovat edullista tuotantoisäntiä johtuen jatkokäsittelyn ja entsyymituotteen talteen ottamisen helppoudesta. Soveltuviin isäntäl&jeihin sisältyvät sellaiset kuten T reeseL A. niger„ A oryzae, A. sojae, A. awamori tai A. japonieus -tyyppiset kannat, F. venemtum tai F, .♦ 20 oxysporum, H, insolens tai K lanuginosa, N. erässä ja C. luokaamme, loista osa cm x «« *... lueteltu entsvymies tuotannossa käytettävinä isäntiorsanismeina esim, kunnallisten « « » entsyymien luettelossa AMFEP 2007 (htm://Vww.amfen.org/list.htmiI, Edullisemmin ««» * ‘ .............. *" * n.
***I entsyymi valmistetaan suvun Trichoderma tai Aspergillus rihmasieni-isännässä, kuten » s « ’«,* T. reesei tai A. niger, A. oryzae tai A. awamori. Keksinnön edullisimman suoritusmuodon « » « I.» 25 mukaan sieniperäinen proteaasientsyymi valmistetaan I teeseissä* * * *
Esillä oleva keksintö koskee myös eristettyä nakieiinihapponxolekyyliä, joka koodaa « * . sieniperäistä smimnroteaasientswmilL joka on valittu seuraavasta ryhmästä: »«««« * * --x e * »«««* * * 30 (a) nukidimhappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla on *** ♦ * ***** smiiniproteaasiaktiivismxtia ja joka käsittää sekvenssissä nro 15 esitetyn » aminohapposekvenssin; ♦ <· « e «
X «V « X
?7 (b) nukieiinihappornolekyyli. joka koodaa poiypeptidM, jolla on seriiniproteaasiakdivisuutta ja joka on ainakin 86-prosenttisesii identtinen sekvenssin nro 15 kanssa; (e) nukieiinihappornolekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro H) kuvatun 5 nukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin; (d) nukleiinthapporoolekyyH, joka käsittää DSM 221?l:n tai DSM 22172:n sisältämän, poiynukleotidisekvenssln koodaavan sekvenssin; (e) nukleiinihappornoiekyyli, jonka koodaava sekvenssi eroaa minkä tahansa kohdista <c)—(d) nukleiinihappornolekyim koodaavasta sekvenssisiä geneettisen 10 koodin degeneraation vuoksi; ja (f) nukleiinihappornoiekyyli, joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa DSM 22171 ;n sisältämään nukieiinihappomofekyyiiin ja joka koodaa polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja aminohapposekvenssi, joka on ainakin 86-prosenttisesti identtinen sekvenssissä nro 15 esitetyn 1S aminohapposekvenssin kanssa.
Keksinnön nukieiinihappornolekyyli voi olla RNA tai DNA, jolloin DNA voi koostua genomisesta DNArsta tai cDNArsta.
20 Tavanomaisia molekyylibiologian menetelmiä voidaan käyttää eristettäessä ja * 4« .·♦·, entsyymikäsiteltäessä polynukleoiidisekvensslä, joka koodaa keksinnön sieniperäistä 4 « * x „·, seriiniproteaasia, mukaan lukien genomisen ja piasraidi-DNA:n eristyksessä, DNA:n * *44* * pilkkomisessa DNA-fragmenttien aikaansaamiseksi, sekvensoinnissa, E. coli - e «f * «** * ,···, transformaatioissa jne. Perusmenetelmiä on kuvattu tavanomaisissa molekyylibiologian « x « * ,**·, 2S käsikirjoissa, esim. teoksessa Sambrook ja Russell, 2001.
* * ««» „M; Fe RF6318-polypeptidiä koodaavan Fe prtSSA -geenin eristäminen on kuvattu esimerkissä 3. Lvhvesti esitettynä, degeneroituneita oikonukleotidialukkeita (sekvenssit * , nro 6 ja 7) käyttämällä saatua 866 bp:n PCR-iragmenttia käytettiin Fe prtSA:n 30 eristämisessä Fmarium equiseä RF6318;sta pBIuescript il KS+ -vektoriin, Täyspitkä x * *;· Fmarium equiseä Fe prtSBA -geeni sisällytettiin plasmidiin pALK2529, joka oli x < t *** talletettu E. coiissa DSMZ-kokoelmaan talletusnumeroila DSM 22172. Serilniproteaasin « 4 V*t johdettu aminohapposekvenssi analysoitiin DNA-sekvenssistä.
28 Täyspitkän Fusarium equiseti -seriiniproteaasigeenin Fe prtSSA (sekvenssi nro iö) mikleotidisekvenssi ja siitä johdettu sekvenssi (sekvenssi nrol l) on esitetty kuviossa 1A-B. Geenin pituus on 1303 bp (mukaan lukien lopetuskodoni). Löydettiin yksi oletettu introni, jonka pituus oäi 64 bp. Johdettu proteunisekvenssi koostuu 412 aminohaposta, 5 mukaan lukien ennustettu 20 aminohapon signaaiisekvenssi (Signal? ¥3.0; Nielsen ym., 1997, sekä Nielsen ja Krogh. 1998} ja propeptidi Aia21---Argl23. Nämä villitvvpin Fe_RF631S:sta puhdistetut peptidit olivat yhtenäisiä johdetun aminohapposekvenssin kanssa, mikä viittaa siihen, että kloonattu geeni koodaa proteaasia, joka oli puhdistettu Fusarium equiseti -isännästä RF631.8» talletettu CBS-kokoeimaan talleiusnumerolla 10 CBS 119568. Kypsän polypeptidin ennustettu molekyylimassa oli 29 kDa ja ennustettu p! 9,30. Nämä ennustukset suoritettiin käyttäen Compute pI/MW -työkalua ExPASv-palvelimella (Gasteiger ym., 2003). Johdettu aminohapposekvenssi sisälsi kaksi mahdollista N-glykosyiaatiokohtaa (Asn77 ja Asti255), mutta CBS-palvelimen NetNGlyc VLÖ:n mukaan ainoastaan yksi kohta, Asn77 (sijaitsee prosekvenssissä) on 15 todennäköinen. Homologioita julkaistuihin proteaasisekvensseihin nähden etsittiin käyttäen BLAST-ohjelmaa, versio 2.2.9, NCBhssa (National Center for Biotechnology Information) (Aitsehul ym., 1990). CiustaiW-rinnastusta (matriisi: BLÖSUM, aukon muodostus: 10, aukon laajennus 0,5, esim. osoitteessa www.ebl.ac.uk/Tools/Clustaiw) käyttäen aikaansaadut kypsän Fe_RF6318-sekvenssin identtisvysarvot vastaaviin *·, 20 homologisten sekvenssien alueisiin nähden on esitetty taulukossa 3.
» ♦ » « « Φ x « *,·, Esillä olevan keksinnön seriiniproteaasilia Fe_RF6318 oli eniten homologisuutta « • venattuna Gihhereiia zeaen hypoteettiseen proteiiniin PH-i, lokustunniste FG033I5.1 « 1 1 ,«·, (EMBL-talletusnumero XP 383491, julkaisematon), T. kamammm CECT 2413 - c « s ,1♦1, 25 seriiniendopeptidaasiin (EMBL-talletusnro CAL.255Ö8, Suarez ym., 2ÖÖ7) ja » 1 T. airoviriden emäksiseen proteinaasiesiasteeseen S08.Ö66, ALP (EMBL-talletusnro MS7516, Geremia ym. 1993), joista jälkimmäinen on tuotu esiin aminohapposekvenssinä * » MM; nro 313 julkaisussa US 60/818,910 (Catalyst Biosekmee lue,). Identtisyys G. zeaen e 1 * s hypoteettiseen proteiiniin nähden oh täyspitkässä entsyymissä 85 %, Kun rinnastettiin * 1 30 kypsät polypeptidit ilman stgnaalisekvenssiä ja propeptidiä, identtisyys oli 85 %, * ♦ **;·1 identtisyydet T. harziammim CECT 2413 -seriiniendopeptidaasiin nähden olivat 70 % 1·· (täyspitkä entsyymi) ja 75 % (kypsä entsyymi). Identtisyydet Γ. eiroviriden ALP:hen * ί V1j nähden olivat 69 % (täyspitkä entsyymi) ja 74 % (kypsä entsyymi).
29 Näin ollen keksinnön suojapiiriin sisältyy eristetty polynokleotidisekvenssi tai eristetty nukleiimhappomokkyyli, joka koodaa sieniperäistä seriimproteaasieutsyymiä tai polypepttdiä, joka käsittää FeJRF6318-entsyymia kypsän muodon aminohapposekvenssin, joka on esitetty sekvenssissä nro 15. eii sekvenssin nro H 5 täyspitkän seriiniproteaasin aminohapot Ala!24-AIa412.
Keksinnön suojapiiriin sisältyvät edelleen nukleiimhappomolekyylit, jotka koodaavat sieniperäisen seriiniproteaasipoiypeptidin fragmenttia, jolla fragmentilla on seriiniproteaasiakiiivisuutta ja joka on ainakin 86-prosenttisesti identtinen sekvenssissä 10 15 määritellyn aminohapposekvenssin kanssa tai ainakin 86-prosenttisesti identtinen sekvenssissä 11 määritellyn aminohapposekvenssin kanssa. Edulliset entsyymit ovat ainakin 86-prosenttisestk edullisesti ainakin 87-proseuttisesti, edullisemmin ainakin 88-prosenttisesti ja vielä edullisemmin ainakin 90-prosenttisesti identtisiä. Vieläkin edullisemmin aminohapposekvenssit ovat ainakin 92-prosenttisesii» tai ainakin 94-15 prosenttisesti tai 96-prosenttisesti. edullisemmin ainakin 98-prosenttisesti, edullisimmin 99~prosenttisesti identtisiä sekvenssin nro 15 aminohapposekvenssin kanssa. Kahden entsyymin identtisyyksiä verrataan vastaavilla sekvenssialueilla, esim. seriiniproteaasin täyspitkässä tai kypsässä alueessa, ··. 20 Nukteimihappomolekyyli on edullisesti molekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro lö s * * ,·*·, esitetyn koodaavan sekvenssin, joka koodaa tämän keksinnön sieniperäisen « « * * seriiniproteaasientsyyinin täyspitkiä muotoa, ♦ «»«· * ♦ * * * « « ♦ .·»♦. Keksinnön eristetty' nukleiinihappomolekyyli voi olla molekyyli, joka Käsittää Koodaavan « « « .««% 25 sekvenssin DSM 22i?i:n tai DSM 221?2:n sisältämästä pohmukleotidisekvenssistä, * * DSM 22171 kantaa PCR-fragmentin nukleotidisekvenssiä (sekvenssi nro 9). jota käytetään kloonattaessa täyspltkä Fe prtSSA -geeni. DSM 22172 kantaa täyspilkän Fe « x prtSSA -geenin nukleotidisekvenssiä (sekvenssi nro lö).
* « w e 30 Keksinnön nukleiinihappomolekyyli voi myös olla edellä määritellyn a « "* nukleotidisekvenssin analogi. Termi “degeneraatio” viittaa sellaisiin ; *♦· nukleotidisekvenssin anaiogeihin, jotka eroavat yhden tai useamman nukleotidin tai * * • /*! kodon!» suhteen, mutta jotka koodaavat keksinnön rekombinanöista proieaasia.
30
Nukleiinihappomolekyyli voi myös olla nukleitnihappomolekyylt, joka hybrtdisoitöu ankarissa olosuhteissa PCR-koetiimeen, joka sisältyy plasmidnn pALK252i, joka on talletettu £. coiissz talietusnumerofla DSM 22171 ja joka koodaa polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasiaktimsoutta ja aminohapposekvenssi, joka vastaavalla sekvenssiaiueelia 5 on ainakin 86»prosenttisesti identtinen sekvenssissä nro 15 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa. Hybridisoifcrva DNA voi olla peräisin FusariumA&jm sienestä tai se voi olla peräisin jostain, muusta sienilajista.
Näin ollen keksinnön suojapiirim sisältyvät eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka 10 käsittää sekvenssissä nro 10, sekvenssissä nro 12 tai sekvenssissä nro 14 esitetyn nukleotidisekvenssm, sekä sen analogit.
Esillä oleva keksintö koskee myös rekombinanttista ekspressiovektoria tai rekombinanttista ekpressiokonstruktia, jota voidaan käyttää valittua seriiniproteaasia 15 koodaavan mikleitnihapposefcvenssin lisäämiseksi tai ilmentämiseksi soveltuvassa prokaryoottisessa tai euknryoottisessa isännässä. Rekombmanttinen ekspressiovektori käsittää DNA:ta tai nukkimihapposekvenssejä, jotka helpottavat tai ohjaavat.
seriiniproteaasia koodaavan sekvenssin ilmentämistä ja erittymistä soveltuvassa isännässä, kuten promoottoreita, tehostajia, terminaattoreita (mukaan lokien transkription „ 20 ja translaation paättämissignaalit) sekä signaalisekvenssejä. jotka ovat toiminnallisesti « * « «« kytkeytyneitä mainittua seriiniproteaasia koodaavaan polynukleotidisekvenssiin.
< 9 * « 4< * * , Ekspressiovektori voi edelleen käsittää rnarkkerigeenejä transformatlikantojen valintaa «*« * **** varten, tai selektiomarkkeri voidaan lisätä isäntään toisessa vektorikonstruktissa * i ♦ * * * *“,* kotransfonnoirmin avulla. Mainitut säätelysekvenssit voivat olla homologisia tai * 8 <· * 8 * !„ 25 beteroloÄisia tuotanto-organismiin kanssa, tai ne voivat olla peräisin siitä organismista, t ϊ "* josta seriiniproteaasia koodaava geeni eristettiin.
* x « , Esimerkkeihin promoottoreista, keksinnön seriiniproteaasin ilmentämiseksi rihmasieni- v * . isännissä sisältyvät promoottorit seuraavista: A. oryzaen TAKA-amylaasi, emäksinen « *** ’ 30 proteaasi ALP ja irioositbsiäatri-isomeraasi, Rhizofms miekem lipaasi, Aspergillus »« x nigerin tai .4. ewantarin glukoamyiaasi iglaA), Fusarmm oxyspommm trypsiinin x kaltainen proteaasi, Chrysosporiam luchumensen seilobiohydrolaasi 1 -promoottori, « **»,; Tnchoäerma reesein seilobiohydrolaasi 1 (Cel7A) jne.
9 X
31
Hiivoissa ilmentymisen aikaansaamiseksi voidaan käyttää esimerkiksi promoottoreita seuraavista: S. cerevisiaen «solaa» (ENO-1), galaktokinaasi (öALi), alkoholidehydrogenaasi (ADH2) ja 3-fosfoglyseraattikinaasi.
5 Esimerkkejä promöottorisekvensseistä keksinnön semaiproteaasin transkription ohjaamiseksi bakteeri-isännässä ovat seuraavat: Escherichia coirn /öc-operonm promoottori, Streptamyces coeUcoior.in agaraasigeeaia äagA promoottori» B.
HckeniformMti alfa-amykasigeenin (amyL) promoottori, B, stearotkemophihtsm maltogesnisen amulaasigeenin (rnsyM) promoottori, B. sublitis xylA ja xyiB -geenien. 10 promoottorit, jne.
Soveltaviin tenrnnaattoreihin sisältyvät edellä mainittujen geenien terminaattorit tai mitkä tahansa karakterisoidut tenniiiaattorisekvenss.it.
15 Soveltaviin transformaatio- tai selektiomarkkereilim sisältyvät ne» jotka täydentävät puutetta isännässä, esim. dai-geenit lajeista B. subtilis tai B. iiehänifarmis, tai Aspergillus amdS ja niäD. Selektio voi myös pohjautua niarkkerille, joka antaa antibioottista resistenssiä» kuten ampisillum-, kanamysiini-, kloramienikoli-, tetrasykliini-, pieomysiini- tai hygromysiimresistenssiä, 20 «Tt Keksinnön seriiniproteaasin solan ulkoinen erittäminen on edullista. Näin ollen 4 ·;· rekombinanttinen vektori käsittää sekvenssejä» jotka helpottavat erittämistä valitussa «««» * ϊ*; isännässä. Keksinnön semniproteaasin signaalisekvenssi tai presekvenssi tai prepeptidi ♦*:*: voidaan sisällyttää rekombinanttiseen ekspressiovektoriln, tai luonnollinen 25 signaalisekvenssi voidaan korvata toisella signaalisekvenssillä, joka kykenee helpottamaan erittämistä valitussa isännässä. Näin ollen valittu signaalisekvenssi voi olla T·: homologinen tai heterologinen valitun ilmentämisessä käytetyn isännän kanssa.
* 4)Mt«4 * 4
Esimerkkeihin soveltuvista signaalisekvensseisiä sisältyvät sieni- tai hiivaorganismien * * ,···, 30 signaalisekvenssi!, esimerkiksi siguaalisekveassit hyvin ilmennetyistä geeneistä. Tällaiset 4 «
»»K
signaali sekvenssit ovat kirjallisuudesta hyvin tunnettuja.
* * « »« 4 « * * « * 44 X 4 32
Rekombinanttmen vektori voi edelleen käsittää sekvenssejä, jotka helpottavat vektorin sisällyttämistä isännän, kromosomaaiiseen DNAthan stabiilin ilmentämisen aikaansaamiseksi.
5 Keksinnön Fe RF6318-proteaasi ilmennettiin sen oman signaalisekvenssin kanssa T. teesein cbhl ieel7Ä} -promoottorista, kuten on kuvattu esimerkissä 4, Hmentämiskonstrukti, jota käytettiin T. reesei -isännän transformoimiseksi, sisälsi myös cMi «temtinaattorin ja omdS-m&tkk&rm transformanttien valitsemiseksi traosformoimattomista soluista.
10
Esillä oleva keksintö koskee myös isäntäsoluja. jotka käsittävät edellä kuvatun kaltaisen rekombinantitsen ekspressiovektorin. Soveltuvia isäntiä sieniperäisen seriiaiproteaasientsyytnin tuottamista varten ovat homologiset tai heterologiset isännät kuten mikrobi-isännät, mukaan lukien bakteerit, hiivat ja sienet. Mahdollisia ovat myös 15 tuotantojärjestelmät kasvi- tai nisäkässoluissa.
Rihmasienet kuten Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humieola, Chrysosporium
Neurospora, Rhizopus, Perdcillnm ja MoriirisUa, ovat edullisia vaimistusisäniiä johtuen jatkokäsittelyn ja entsyymi tuotteen talteen ottamisen helppoudesta. Soveltuviin Γ%, 20 ilmentämis- ja tuotantoisäntäjärjestelmim sisältyvät esimerkiksi tuotantojärjestelmä, joka :T: on kehitetty rihmasieni-isännähe Trichoderma reesei (EP 244234), tai Aspergillus-
*j1 tuotantojärjestelmät, kuten A. oryzae tai ,4. niger <WO 9708325, US 5,843,745, US
l 5,770,418), A. awamori. A. sajae ja A. japonicus -tyyppiset kannat, tai ίΤϊ tuotantojärjestelmät, jotka on kehitetty Fusameu-iajeiile kuten F. oxysporum (Malardier :***: 25 vm„ 1989) tai F. venenatum, sekä lajeille Neurospora erossa, Rhizopus miehet, ***
Mortiriella aipinis. H. lanuginosa tai H. insoiem tai lajille Chrysosporium lucknowense '•j**: (US 6.573,086). Soveltuviin hiivoille kehitettyihin tuotantojärjestelmiin sisältyvät *:**! järjestelmät, jotka on kehitetty seuraaville; Soccharomyces, Schisosaecharomyces tai
Pichia pastor is. Soveltuviin bakteereille kehitettyihin tuotantojärjestelmiin sisältyvät .♦1·. 30 tuotantojärjestelmät, jotka on kehitetty suvulle Bacillus, esimerkiksi lajeille B. subtiili, B.
* x *** liehmiformis, 8. amyloliquefaciens, tai F,, eo/ille tai sädesienille Sireptomyees.
« « ” Edullisesti keksinnön seriiniproteaasi valmistetaan suvun Trichoderma tai Aspergillus « 1 « ** rihmasieni-isännässä, kuten I teeseissä tai A. niger, A oryzae, A. sojae, A. awamori tai 33 A. japonmis -tyyppisissä kannoissa. Keksinnön edullisimman suoritusmuodon mukaan sieniperäinen proteaasienisyymi valmistetaan 7. meseissä.
Tuotantoisäntä voi olla homologinen tai heterologinen keksinnön seriiniproteaasln 5 kanssa. Isännältä voivat puuttua homologiset proteaasit johtuen proteaasien poistamisesta joko maktivoimalla tai poistamalla yksi tai useampi isännän proteaaseista, esim. tällaisia homogeenisiä tai homologisia proteaaseja koodaavan yhden tai useamman geenin deleetion vuoksi.
10 Esillä oleva keksintö koskee myös valmistusmenetelmää poiypeptidifie, jolla on seriiniprotsaasiaktiivisuutta, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet keksinnön luonnollisen tai rekombinantin, keksinnön seriiniproteaasin rekombinanttista ekspressiovektoria kantavan isäntäsolon viljelemiseksi soveltuvissa olosuhteissa ja polypeptidin talteen ottamiseksi. Tuotantoelatusaine voi olla elatusaine, joka soveltuu IS isäntäorganismln kasvattamiseen sekä sisältää tehokkaan ilmentämisen vaatimat indusorit. Tällaiset ektusaineet ovat kirjallisuudesta hyvin tunnettuja.
Keksintö koskee poiypepfctdiä, jolla on seriiniproteaaslaktiivisuutta, jota polypeptidiä koodaa keksinnön nukleiinihappomokkyyll ja joka on saatavissa edellä kuvatulla 20 menetelmällä..
»»e V * ·> » # ♦ »j* Keksintö koskee edelleen menetelmää sellaisen entsyymi valmisteen aikaansaamiseksi, « * * « * ·'; jolla on serimiproteaasiaktiivisuutta, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet joissa j***· viljellään keksinnön ekpressiovefctoria kantavaa isäntasoiua ja joko otetaan polypeptidi ·***« 25 taiteen soluista tai erotetaan solut eiatusaineesta ja otetaan talteen supernaiantti, jolla on serimiproteaasiaktiivisuutta.
» o * x * * ♦ « •j··; Esillä oleva keksintö koskee myös entsyymivalmistetta, joka käsittää edellä luonnehditun seriiniproteaasientsyyrnin, Entsyymivalmisteeila tai koostumuksella on x * * * * y ’ ' * ' « « 30 seriiniproteaasiakuivisuuita ja se on saatavissa keksinnön mukaisella menetelmällä.
* * «9 * * * *’ Keksintö kattaa entsyymi valmisteen, joka käsittää keksinnön sieniperäisen # x x « * *. seriiniproteaasin.
34
Mainittu entsyymivaimiste voi Lisäksi käsittää erityyppisiä entsyymejä tämän keksinnön seriimproteaasin lisäksi, esimerkiksi toisen proteaasin, amylaasin, lipaasin. seliulaasln, kutinaasiin, pektinaasin, mannaasi», ksylanaasin ja/tai oksidaasin kuten lakkaasin tai peroksidaasln mediaattorin kanssa tai ilman sitä. Näiden entsyymien odotetaan 5 tehostavan keksinnön seriiniproteaasien vaikutusta poistamalla käsiteltävässä materiaalissa olevia hiilihydraatteja ja öljyjä tai rasvoja. Mainitut entsyymit, voivat olla luonnollisia tai rekombinanttlsia entsyymejä, jotka isämäkanta on tuottanut, tai ne voidaan Lisätä viljelmän superaatanttiin valmistusprosessin jälkeen.
10 Mainittu entsyymivaimiste voi lisäksi käsittää soveltuvan lisäaineen, joka on valittu tyhmästä, johon sisältyvät pinta-aktiiviset aineet, puskurointiaineet, korroosionestoaineet, stabilointiaineet, valkaisuaineet, mediaattorit, vedenpehmentäjät, syövyttävät aineet, hankausaineet ja säilöntäaineet, optiset kirkasteet, uudelleen tarttumista estävät aineet, väriaineet, pigmentit jne.
15
Pinta-aktiiviset aineet ovat käyttökelpoisia rasvan emuloinnissa ja pintojen kostuttamisessa. Pinta-aktiivinen aine voi olla ioniton, mukaan lukien semi-polaarinen, ja/tai anioninen ja/tai katuminen ja/tai kahtaisioninen.
20 Entsyymivalmisieeseen voidaan lisätä puskuroiutiaineita pH:n säätämiseksi tai muiden «1♦1: aineiden tehokkuuteen tai stabiiliuteen vaikuttamiseksi.
« * * ««« • Soveltuviin stabilointiaineisiin sisältyvät polyolit kuten propyleeniglykoii tai glyseroli, »1x « # ^ ;T: sokeri tai sokerialkoh.oLi, maitohappo, boorihappo tai boorihappojohdannaisei, peptidit % t ^ί> ine, * 1 1 ♦:»1: Valkaisuainetta käytetään orgaanisien yhdisteiden hapettamiseksi ja hajottamiseksi.
·;♦1· Esimerkkejä soveltuvista kemiallisista valkaisujärjestelmistä ovat HaO>:n lähteet, kuten perhoraattl tai perkarbonaatti perhappoa muodostavien vaikaisuaktivaattorien kuten tetra- s 1 .«·♦. 30 asetwlietylernudiarniinin kanssa tai ilman, tai vaihtoehtoisesti peroksihapoi kuten amidi-, ψ < ««» imidi- tai sulfonityyppiset Kemiallisia hapettimia voidaan korvata osittain tai kokonaan « 1 \ “ käyttämällä hapettavia entsyymejä, kuten lakkaaseja tai peroksidaaseja. Monet lakkaasit * 1 ♦ 1 eivät toimi tehokkaasti mediaattorien puuttuessa.
35
Vedenpehmentäjiin tai kompleksointiaineisiin sisältyvät sellaiset aineet kuten zeoliliti, difosfaatti, trifosiaatti, karbonaatti, sitraani jne. Entsyymivalmiste voi lisäksi käsittää yhtä tai useampaa polymeeriä, kuten karhoksimetyyiiseiluloosaa, pölytetyleeniglykoiia), poly(vinyylialkohoiia), po)y(vinyylipyrrolidonia), jne. Voidaan lisätä myös pehmentimiä, 5 syövyttäviä aineita ja säilöntäaineita muiden aineosien pilaantumisen estämiseksi, hanfcausaineitaja vaahtoamis- ja vlskositeettiominaisuttkssa muuttavia aineita.
Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti mainittu entsyymivalmiste on nesteen, jauheen tai rakeiden muodossa.
10
Esillä olevan keksinnön sieniperäistä proteaasia voidaan muiden proteaasien, erityisesti emäksisten proteaasien. tapaan käyttää pesuaine”, proteiini*, panimo-, liha-, valokuvaus-, nahka-, meijeri- ja lääkeaineteoliisuudessa (Kalisz, 1988; Rao ym., 1998). Sitä voidaan esimerkiksi käyttää vaihtoehtona kemikaaleille, joita käytetään kuituisen proteiinijäiteen 15 (esim. sarvi, höyhenet, kynnet, karvat) muuntamisessa käyttökelpoiseksi biomassaksi, proteiimkonsentraatiksi tai aminohapoiksi (Anwar ja Saleemuddin, 1998). Esilläolevan keksinnön sieniperäisen seriiniprotcaasm käyttö voi muiden entsyymien tapaan osoittautua hyväksi nahan laadun parantamisessa sekä ympäristön saastumisen vähentämisessä ja energian säästämisessä, ja se voi emäksisten proteaasien tapaan olla 20 käyttökelpoinen peptidien synteesissä ja IXL-aminohappojen seoksen erottamisessa.
« ;*·*« Subtllisiini käytettynä yhdessä yhdessä laaja-alaisten antibioottien kanssa palovammojen •j. ja haavojen hoidossa on esimerkki serliniproteaasien käytöstä lääketeollisuudessa, ja nain « ;*♦ ollen esillä olevan keksinnön sieniperäisellä seriiniproteaasilla voi myös olla tällaista *«» x ♦*;*j käyttöä, ja sitä voidaan emäksisten proteaasien tapaan käyttää myös veren poistamisessa s !1♦ 25 kirurgisista laitteista sekä piilolinssien tai tehohampaiden puhdistuksessa. Kuten lajista »*<
Comdiobolus coronatus saatavaa emäksistä proteaasia, esillä olevan keksinnön »*♦♦» sieniperäistä seriiniproteaasia voidaan käyttää korvaaman trypsiim elämsoiuviljelmiäsä.
»»♦♦* Keksinnön proteaaseja voidaan myös käyttää kaivojen puhdistuksessa sekä biofilmien * . tuhoamisessa. Leivonnassa proteaaseja voidaan käyttää gluteeniverkon hajottamisessa ja ♦ * ... 30 muissa elintarvikesovelluksissa ruoan proteiinien, esim. maidon proteiinien, * « hydrolyysissa. Niitä voidaan käyttää myös esimerkiksi hiivan käsittelyssä, renderoinnissa * x * »» « » * *’ (suuremman proteiinimäMn erottamisessa eläinten luista), uusien makujen * a x *· tuottamisessa, kitkeryyden vähentämisessä, emulgointiominaisuuksien muuttamisessa, 36 bioaktiivisten peptidien tuottamisessa sekä proteiinien allergiaa aiheuttavien ominaisuuksien vähentämisessä. Substraatteihin sisältyvät eläin-, kasvi- ja mikrobiperäiset proteiinit.
5 Pesuaineteollisuus, erityisesti pyykinpesuaineteoSlisuos, on osoittautunut suurimmaksi yksittäiseksi käyttäjäksi proteaaseille, jotka ovat aktiivisia korkealla pH~aiueel!a (Anwar ja Saieemuddin, 1998). Ihanteellisella proteaasilla tulisi olla laaja substraahispesiilsyys lukuisten erilaisten tahrojen poistamisen helpottamiseksi, jotka syntyvät ruoasta, ruohosta, verestä ja muista mumiineritteistä. Sen täytyy olla aktiivinen pesuaineliuoksen 10 pH:ssa ja ionivahvuudessa, pesussa käytetyissä lämpötilassa ja pEkssa ja sen on kestettävä mekaanisia käsittelyä samein kuin pesuaineisiin lisättäviä kelaatinmuodostajia ja hapetusaineita, Proteaasin pi:n on oltava lähellä pesuaineiiuoksen pfctiL Nykyisestä energiakriisistä ja energian säästämiseen kohdistuvista pyrkimyksistä johtuen on toivottavaa käyttää proteaasia alhaisemmissa lämpötiloissa.
15
Esillä oleva keksintö koskee myös serimiproieaasienisyymio tai entsyymivalmisteen käyttöä pesuaineissa, tekstiilikuitujen käsittelyssä, viilan käsittelyssä, hiusten käsittelyssä, nahan käsittelyssä, elintarvikkeiden tai rehun käsittelyssä tai missä tahansa sovelluksissa, joihin sisältyy proteiinimateriaalin muuntelu, hajotus tai poistaminen.
Γ\, 20 « :*;*? Keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto on näin ollen edellä määritellyn ♦ ··» seriiniproteaasientsyymm käyttö pesuaineiden lisäaineena, joka on käyttökelpoinen »x »« * :*» pyykinpesu- ja astianpesukoostumuksissa, mukaan lukien astianpesukonekoostumukset, »»« « » « * * * * ϊ***; 25 Ilmausta "pesuaine” käytetään viittaamaan sellaiseen aineeseen tai materiaaliin, joka cm x « « avuksi puhdistuksessa tai jolla on puhdistavia ominaisuuksia. Termi “puhdistuskyky" ·«♦«» viittaa puhdistavat? ominaisuuden läsnäoloon tai asteeseen. Puhdistuskyvyn astetta ····· voidaan testata erilaisilla proteiinista koostuvilla tai sitä sisältävillä substraattimateriaaleilla tai tahroilla tai tahraseoksilk, jotka ovat kiinnittyneinä kiinteään, .···, 30 veteen liukenemattomaan kantajaan, kuten tekstiilikuituihin tai lasiin. Tyypillisiin * x proteiinimateriaaleihin sisältyvät veri, maito, muste, kananmuna, ruoho ja kastikkeet.
* * * " Koetarkoituksis varten proteimitahrqjen seoksia on kaupallisesti saatavilla. Pesuaine- « « » ** ** entsyymin tehtävänä on hajottaa ja poistaa proteiinipitoisia tahroja. Testitulokset Λ-7 riippuvat tahran tyypistä, pesuaineen koostumuksesta ja pesukokeessa käytettävien tekstiilien ominaisuuksista, ja tilasta (Maurer 2004).
Tyypillisesti proieaasi tai pesutehokkuus määritetään ‘^hranpoistotehokkuufena” tai 5 “tahianpoistovaikutuksena” tai '’puhdismsomtnaisuuden asteena”, mikä tarkoittaa näkyvää ja mitattavissa olevaa vaaleutta tai värin muutosta tarrautuneessa materiaalissa, esim. keinotekoisesti liatuissa kangasnäytteissä f’swatch”) tai koekankaissa. Vaaleus tai muutokset väriarvoissa voidaan määrittää esimerkiksi mittaamalla väriä heijastusarvoma spektrofotometxillä käyttäen L*a*b*-vIriavaruuskeotdinaatteja, kuten esimerkeissä t>—10 10 on kuvattu. Froieaasin tehokkuuden (tahranpoistoiehokkuuden) osoittava proteimitahran haalistuminen, tai häviäminen lasketaan esimerkiksi arvona ΔΙΛ joka tarkoittaa emsyymikäsiteliyn kankaan vaakusarvoa L*, josta vähennetään pelkällä puskurilla: käsitellyn kankaan (entsyymin noiianäyte) vaaleusarvo L*. Pesuaineen läsnäolo voi parantaa entsyymin tehokkuutta tahrojen poistamisessa.
15
Esillä olevan keksinnön seriiniproteaasi hajottaa erityyppisiä proteiinifahroja neutraalin tai emäksisen pH:n olosuhteissa ja jopa koostumukseltaan erilaisten pesuaineiden läsnä ollessa (kuten on osoitettu esimerkeissä 6-11).
20 Kuten on esitetty esimerkissä 6, keksinnön seriiniproteaasi poisti veri/maito/muste-tahran * **♦*: 50 cC:ssa ja erityisesti 30 °C:ssa pH-arvoliaan 9 olevassa puskurissa paremmin kuin *;· kaupalliset proteaasivalmisteet Savinase® Ultra 16L ja Purafect*® 4Ö0ÖL (kuviot 5 ja 6).
s«»« * ♦*: Entsyymi valmisteet annosteltiin aktiivisuusyksikköinä.
o * x e s * * « * « * s « « :***« 2$ Fe RF631S-proteaasin tehokkuutta testattiin myös pesuainejauheessa lämpötilassa 40 °C i SO °C ja pH-arvossa 10 esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Määritettiin entsyymin ♦ kyky poistaa veri/malto/muste-tahroja. poiyesteri-puuvillamateriaaiista. Kutakin «:»*; entsyymivalmistetta annosteltiin aktiivisuusyksikköinä (pmol tyrosiiuia/min), Kuten on esitetty kuvioissa 7 ja 8, keksinnön proteaasi soveltuu myös jauhemaisiin pesuaineisiin « » 30 hyvin emäksisissä olosuhteissa, ja sen vastustuskyky valkaisuaineille oli hieman * f korkeampi kuin kaupallisen proteaasin Purafect® 4000L.
* « « x» « e * « « » » «« k * 38
Fe_ RF6318-proieaasi poisti veri/inaito/rauste-siandarditahr^ myös nestemäisessä pesuainepohjassa ja sekä Ariel Sensitiven (Procter & Gamble, UK) ollessa läsnä nestemäisenä pesuainepohjana (esimerkki 9). Tehokkuus veri/maito/muste-tahraan oh huomattavasti korkeampi kuin kaupallisilla valmisteilla Savin&se® Ultra 141, ja 5 Puraiset® 4ÖÖ0L (kuviot 10 ja li). Ertisyymiv&lmisteei annosteltiin aktiivlsuusyksikköinä, Sama vaikutus havaittiin myös silloin, kun annostus laskettiin lisätyn proteiinin määränä (kuviot lOBja 1 IB)
Veri/mako/muste-tahrojen lisäksi F e RF6318-proteaasi oli tehokas sellaisten tahrojen 10 kuten ruohon ja kaakaon poistamisessa testattuna nestemäisissä pesuaineissa 30 :‘C:ssa. Käsittelyt suoritettiin ATLAS LP-2 Launder-Onteter “laitteella. Tulokset (kuviot 12 ja 13) osoittavat, että Fe_RF6318 oli tehokas useille tahroille alhaisissa lämpötiloissa, kuten 30 °C:ssa.
15 T. reeseisss valmistetun rekombinanttisen Fe RP6318-entsyymivalmisieen tehokkuutta testattiin nestemäisen pesuainepohian läsnä ollessa täydessä mittakaavassa pesukoneessa 30 °C:ssa (esimerkki li). Kahdeksan erilaista proteaasille herkkää seurantakangasta ("tracer') haittavaikutusten testaamiseksi on esitetty taulukoissa 5 ja prosessioiosuhteet taulukossa 6. Kokeissa käytetyt entsyymiin annostukset on lasketin sekä 20 entsyymiaktiivisuuksien että entsyymin proteiinimäärän perusteella. Kuvioissa 14A---B
» esitetyt tulokset osoittavat, että erilaisilla tahroilla saatujen tulosten summa oli korkeampi *;» Fe_RF631 8:11a kuin kaupallisilla proteaasivalmisteilla Savinase® Ultra 16L ja Purafect® * » X * • 4ÖÖÖL, kun entsyymiä annosteltiin perustuen aktiivisuuden määränä tai proteiinina. ««* « ♦*;*; FeJRF6318 oli tehokkain verihnaito/muste-, suklaa/maito-, maapähkinäöljy/maito- * ;*“j 25 tahroille ja munankeltuaistahroille (kuviot iSA-E).
* * * **♦·» Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti keksinnön sieniperäinen serimiproieaasi *:♦♦» on käyttökelpoinen nestemäisissä tai jauhemaisissa pesuaineissa, kuten on osoitettu * · esimerkeissä 6-11. Keksinnön entsyymi valmisteen entsyymi voidaan formuloida * « 30 käytettäväksi käsinpesnssa tai konepesusssu tai se voidaan formuloida käytettäväksi ♦ » « kotitalouksien kovien pintojen puhdistuksessa tai edullisesti astioiden pesussa käsin tai * » * ** astianpesukoneella.
f « » » » ♦ 39 ESIMERKKI I. Fusarium equiseti RF631S -proieaasin valmistus Ja puhdistaminen (a) Fusarium equiseti RF6318:.n viljely 5 Sienikanta RF6318 oli eristetty aiemmin rihmasienenä, joka tuotti sellulaaseja. Se tunnistettiin lajiksi Fusarium cf. equiseti (Libert) Desmazieres (tunnistaja Arthur de Cock, tunnistuspalvelut, Centraibureau Voor Sehimmeleultures, P.O. Box 85167, 3508 AD Utrecht, Alankomaat). F. equiseti RF6318:n osoitettiin aikaansaava proieaasiaktiivisuuden agar-maljalla, joka sisälsi hemoglobiinia substraattina. Koska 10 viljelyt maljoilla suoritettiin noin 10 °C:ssa, tämä tulos viittasi siihen, että RF6318 tuottaa proteaasia tai proteaaseja, jotka toimivat kylmissä lämpötiloissa. Kantaa F. equiseti RF6318 kasvatettiin, ylläpidettiin ja se saatettiin tuottamaan itiöitä peruna-deksiroosl (PD) -agarissa (Difco) +4 "C:ssa. Entsyymin valmistusta varten itiöitä RF6318-vinopinnoilta siirrostettiin elatusaineeseen, joka sisälsi 30 g/1 maissijauhoa 15 (hieno jauhatus), 5 g/1 CSL-jauhetta ("corn steep powder"). 4 g/1 soijajauhoa (vähärasvainen), 2 g/1 KlEPCLra, 1 g/1 NaCka ja 1 g/i parafiiniöljyä, Elatusaineen pH säädettiin ennen sterilointia NaOHdla arvoon 8,5 ja elatusainetta käsitehän autoklaavissa 30 min ajan 121 cC:ssa. Mikrobia viljeltiin 50 mi tilavuudessa ravisHmessa (220 rpm) 28 öC:ssa 7 päivän ajan. Käytetyn viljelmän supernatantin osoitettiin sisältävän 20 emäksistä proteaasiaktiivisuutta, kun aktiivisuusmhtaukset suoritettiin (esimerkin 1c * ·*♦*« mukaisesti) eri pH-arvoissa (pH 7-10). Tämän emäksisen aktiivisuuden vuoksi kanta ♦♦♦ RF631.8 valittiin oletetuksi proteaasigeenin luovuttajakannaksl.
«»«« « * «sv
« » X
X ♦« X
;*·*; (h) Proieaasin puhdistus F. equisetiRF6318:» elatusaiaeesta ♦ **♦ ♦ ♦ /\ « « wv
Solut ja kiinteät aineet poistettiin käytetystä eiatusaineesta xentrifugeimalia 30 min ajan 50 000 g:ssa lämpötilassa +4 öC (Sorvali RC6 plus.}. Supematantista 50 ml käytettiin ♦···♦ proieaasin puhdistamiseen. Sentrifugoinnin jälkeen supematantin pH säädettiin arvoon
8,0 lisäämällä HCl:a. Sitten supernatantd suodatettiin 0,44 pm:n suodattimen (MILLEX
« x 30 HV MiHipore) läpi ja lisättiin 5 ml:n Q Sepharose FF -kolonniin (GE Healthcare), joka e »
oli tasapainotettu 20 mM Tm-HCI:ssa, pH 8, Läpivirtaustraktio otettiin talteen ja sen pH
« « • laskettiin arvoon 7.5 lisäämällä HCl:a. Kiinteää ammoniumsuifasttia lisättiin x « * « e 40 iäpivirtauslraktio suodatettiin 0,44 μηι:η suodattimen läpi ennen kuin se lisättiin fenyyli-Sepharose .HP (I ml) -kolonniin (GE Healthcare), joka oli tasapainotettu 20 roM Tris-HCkssa -· 1.M ammouiumsulfaatissa, pH 7,5. Proteiinit eiuoitiin lineaarisella laskevalla ammoniumsulfaattjgradientslla O —> 0 M). Fraktiot, joiden koko oli i ml, kerättiin ja 5 analysoitiin proteaasin aktiivisuuden suhteen resorufiini-leimatufla kaseiinilla (Boehringer Mannheim öiochemica) pH:ssa 8,0 valmistajan ohjeiden mukaisesti. Fraktiot, joissa oli proteaasiaktiivisuutta, yhdistettiin ja uitrasuodatettiin käyttäen 10 k:n kalvoa (Amkon), Konsentroitu suodos lisättiin Superdex 75 10/300 GL -kolonniin (GE Healthcare), joka oli tasapainotettu Käyttäen 20 mM Tris-HCl:a - 20Ö mM NaCha, 10 pH 7,5, Proteiinit eiuoitiin samalla puskurilla ja 0,5 ml m fraktiot otettiin taiteen. Näiden fraktioiden proteaasiaktiivisuus analysoitiin. Fraktiot, joissa oli proteaasiaktiivisuutta, analysoitiin natriumdodekyyiistdfaatti-pulyakryyHarnidigeeiiekkiroforeesilla (SDS- PAGE). Fraktioiden osoitettiin sisältävän yhden pääasiallisen proteiinikaistan,, jonka moiekyyiimassa oli noin 29 kDa, Valitut fraktiot yhdistettiin. Yhdistettyjä fraktioita IS käytettiin valmistettaessa peptideifä (esimerkki 2). Aktiivisuusmääritysten mukaan puhdistetun proteiinin pH-optimi eli arvossa pH 10. Tälle puhdistetulle F. equiseti RF6318 -proteaasille annettiin, nimi FeJRF6318.
(e) Proteaasin aktisvisuusmääritys Γ, 20 i »HV Proteaasin aktiivisuus määritettiin kaseiini-Folin-Ciocalteau-menetelmällä.
« 1 « « »·· Määrityksessä käytetty kaseiini substraatti valmistettiin seuraavalia tavalla; 6 g kaseiinia, * ♦*» Hammerstein Grade, MP Biomedlcals, LLC (101289), liuotettiin 500 mkaao seuraavia; »99 « «1«*. 100 mM Tris, 20 μΜ CaClj, 7 μΜ MgC-h, 25 μΜ NaHCOj. Substraattiliuoksen pFl * ♦***♦ 25 säädettiin arvoon 9,0 käyttäen HCI:a. EtÄsyymireaktiot pysäytettiin käyttäen TCA- liuosta, joka sisälsi 0,11 M TCA;a. 0,22 M uairiumasetaattia, 0,33 M etikkahappoa ja 0,5 .j.1i M NajCöpa 1 000 mhssa tislattua vettä. Määrityksessä käytetty Folin-reagenssi **·«! valmistettiin laimentamalla 25 ml 2 N Folin-Ctocalteun fenoikeagenssia (SIGMA, * . F 9252) 100 millilitraksi käyttäen tislattua vettä. Reaktio käynnistettiin inkuboimalla * « 30 ensin 2,5 ml substraaitiliuosta 5 min ajan annetussa lämpötilassa, minkä jälkeen lisättiin t ♦ *V 0,5 mi entsyymiliuosta ja reaktiota jatkettiin 15 min tai 30 min. Kun reaktio oli jatkunut *e ♦ 1 J ** 15 min tai 30 min, 2,5 mi reaktion pysäytysliuosta lisättiin, sisällöt sekoitettiin ia niiden 99 v 1 9 9 9 i annettiin seistä 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Putkia senirifugoitiin nopeudella 4! 4 000 rpm 10 minuutin ajan (Heitich Rotania 460). Yksi mi kirkasta supernatanttia pipetoitun ja sekoitettiin 2,5 mi taan 0,5 M Na^COjta ja 0,5 mitään laimennettua Polin-reagenssia. Kun ali odotettu 5 min (värin kehittyminen), seoksen absorbanssi (väri) määritettiin aallonpituudella 660 nm entsyymin nollanäytteeseen verrattuna. Entsyymin 5 nollanäyte valmistettiin seuraavalla tavalla: 0,5 ml entsyymiliuosta sekoitettiin 2,5 mkaan pysäytysliuosta ja 2,5 mitään substraattia ja seosta inkuboitiin 15 tai 30 min annetussa lämpötilassa. Yksi entsyymiaktiivisuusyksikkO määritettiin sellaiseksi entsyymimääräksi, joka vapauttaa happoliukoisen proteiinin hydrolyysituotetta määränä, joka vastaa 1 pg tyrosiinia per yksi mi reaktioseosta minuutissa.
10 ESIMERKKI! 2. Puhdistetun F. equiseti Fe_RFtS318 >proteaasI» N-ternttnaalises ja sisäinen aminohapposekvensois ti
Sisäisten sekvenssien määrittämiseksi Coomassie Brilliant Blue -värjätty kaista leikattiin 15 Irti polyakryyliamidigeelistä ja digestoltim oleellisesti ”m-geP, kuten ovat kuvanneet Shevchenko ym. (1996). Proteiinit pelkistettiin ditiotreitolilia ja alkyloitiin. jodiasetamidilla ennen digestiota trypsiiniilä (Sequencing Grade Modified Trypsin, V5T11, Promega).
J1« 20 Sähkösuihkutusionisaatio-kvadrupoli-ientoaika-tandemmassaspeklrit de novo - .2j1. sekvensointia varten motettiin käyttäen Q-TöF-iaitetta (Mieromass, Manchester, UK), e joka oli kytketty Ultimate-nano-nestekromatografiin (LC-Paekings, Alankomaat) * s ♦ oleellisesti aiemmin kuvatulla tavalla (Poutanen ym.„ 2001), mutta käyttäen ISO pm x »e» v j2i1. 1,0 mm -eristyskoionnia (3 pm, 120 A, #'222403, SGE Ltd UK) peptidien * .3. 25 esikonsentrolntia varten, « « *»« ....i N-terminaalista sekvenssianalyysiä varten SDS-PAGE-erotellut proteiinit siirrettiin »♦♦»j elektroblottaamalia polyvinyiideenidifluoridikaivoHe (ProBIott; Perkin Elmer Applied
Biosystems Division, Foster City, Kalif,). Kun ne oli värjätty Coomassie Brilliant * » ... 30 Bluella, kiinnostavat proteiinikaistat poistettiin ja niille suoritettiin N-term maalinen V sekvenssianalyysi Edman-hajotukselia Precise 494A «proteiinisekvensserissS (Perkin e e • 2 Elmer Applied Biosystems Division, Foster City, Kalif,).
2 * 1
* 1 X
4 «« 3 * « 42
Puhdistetusta Fe_RF6318-proteaasista määritetyt N-terminaaiisei ja sisäiset peptidisekvenssit on esitetty taulukossa 1. Peptidisekvensseillä oli havaittavissa homologiaa julkaistuihin proteaasisekvensseihi» nähden, jotka olivat peräisin Fusarium oxysporum -seriiniproteaaseista, joiden EMBL-tafletusnumerot ovat Q5R2N9 ja 074236, 5
Taulukko 1. FeJRF6318-proieaasista määritetyt N-terminaaliset ja sisäiset peptidisekvenssit
Peptidi Sekvenssi Sekvenssi Kommentteja nro: #3792 ALTTQSNAPWGLAAiSRXTP Nro 1 N~terniinaai.inen sekvenssi
X voi olla C, S. T tai R
..........1246.673 TVÄÄÄBSSWR NrÖ2...................................................................................
"334L633 XTYGVÄK. ~~ Nro'3 .............................................
1503.799 fLÄ{L''i}TVGÄTTSM>ÄK Nro 4 Kolmas aminohappo ei ole
varma, voi olla L tai I
10
Esimerkki 3, FeJRF63i8~proteaasia koodaavan F. eqmsett RF631S -geenin kloonaus « «« * *«« * * * <t « x ' (a) BNÄ:a eristäminen ja käytetyt molekyylihsoiogian menetelmät ♦ **** * * » « » * * * ... 15 Tavanomaisia molekyylibiologian menetelmiä käytettiin DNA:n eristämisessä ja » * * entsyymikäsittelyissä (esim. pksmidi-DNAm eristäminen, D’NA:n digestio DNA- * * fragmenttien aikaansaamiseksi), E. coli -transformaatioissa, sekvensoinnissa jne. Näitä perusmenetelmiä käytettiin joko entsyymin, reagenssin tai pakkauksen valmistajan « « ♦ ohjeiden mukaan tai tavalla, joka on kuvattu tavanomaisissa molekyylibiologian « * « 20 oppikirjoissa, esim. teoksessa Sarobrook ja Russell (2001). Genomisen DNA:n eristäminen F. eqmseii RF63i8:sta suoritettiin tavalla, lonka ovat yksityiskohtaisesti » « "·*** kuvanneet Raeder ja Broda (1985).
* * ♦ ♦ « > ♦ * · » * 43 (b) Alukkeet koettimien valmistusta varies
Koetin Fe RF631 S-proteiisiia koodaajalle geenille syntetisoitiin PCR-menetelmähä, Degeneroituneet oligot suunniteltiin puhdistetusta Fe RF631S:sta saatujen peptidien 5 aminohapposekvenssien perusteella (taulukko 1), Alukkeiden sekvenssit on esitetty taulukossa 2 (sekvenssit nro 5-8).
Taulukko 2, P€R~alukkeina koetinfen monistuksessa käytetyt digonakleotidi? (sekvenssit nro 5-8). Oligot, sekvenssinrot oligojen pituudet ja degeneraatiot, 10 oligonokieotidit ja peptidin aminohapot, joita käytettiin oligonukleotidisekvenssin suunnittelussa.
OMgo SEKV. Pituus Degene- Sekvenssi^ Peptidi^' NRO (nukieo- raatiota __tidiä)____ PROS7 5 20 256 ^CÄItC^ (s) +#3792_ PRÖ8S '6..... 20 l2S ^ÄRAGYAAYG^CCNTGGOGtyT^#3792 PRÖSlfT .....20 4204S (5CRTCNGCNGANGTNGTNGC (as) 1503 J99 PRO90 18 Jo .........1024 “^^RTCNGQRCfNGT^G^CKil (as) 1503.799 !S N = A. f , C tai G; R:::: A tai G. Y = T tai C; “s” sulkeissa = sense-juoste, “as” sulkeissa - antisense-juoste 15 1 Peptidlseksenssit on sisällytetty taulukkoon I.
« k « * »XX * 1 1 y » » ^ (e) PCR-reaktiot ja koettimien valinta kloonausta varten * ♦ 1 1 1 % 1 t 1 » * x » **«♦1 F. equiseti RF63i8:n genomista DNA:ta käytettiin templaattina koettimien synteesille.
« « 1 ,·1·, 20 PCR-reaktioseoksen sisälsivät 10 mM Tris-HCka. pH 8,8, 50 mM KCka, 0,1 % Triton « « X-löö:aa, 1,5 mM MgCtya. 0,2 mM dNTPs:a, 1 μΜ kinakin aluketta ja 4 yksikköä ♦„.i Dynazyme H DNA-polymeraasia (Finnzymes, Suomi) sekä noin 3 pg genomista DNArta 1ÖÖ ui reaktiotilavuutta kohti. Olosuhteet PCR-reaktioilfc olivat seuraavat: 5 min * 1 f * ♦ alkudenaturaatio 96 cC:ssa, minkä jälkeen 32 sykliä seuraavaa: I min 96 °€:ssa, 30 s o 1 t».t 25 liittäminen 55,5 °C:ssa, I min pidentäminen 72 °C:ssa, sekä loppupidentäminen x » 72 °C:ssa 5 min ajan. Alukeyhäisteimä PRO88 (sekvenssi nro 6) ja PR089 (sekvenssi x ♦ \ , nro ?) tuotti spesifisen DNAAuotteen, jonka koko oli odotettu (julkaistuihin « 1 » 1 sieniperäisiin proteaasisekvensseihin pohjautuvien laskelmien perusteella}. DNA-iuote eristettiin ja puhdistettiin PCR-maktioseoksesta ja kloonattiin pCR1'2.1~T0P04' -vektoriin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen, USA), Kooltaan 866 hp:u DNA» fragmentti sekvensokiin tästä piasmidista (sekvenssi nro 9). Tälle PCR-monisieian DNA-fragmentin sisältävälle pCR®''2. l-TOPO^-piasmidille annettiin nimi pALK252L 5 Plasmidin pALK.252.1 sisältävä £ coli -kanta RF7664 talletettiin DSM-kokoelmaan talletusnumerolia DSM 22171.
PCRrfragmentin johdettu aminohapposekvenssi sisälsi sisäisten Fe_JlF6318-peptidien 1246.673 (sekvenssi nro 2} ja 3341.633 (sekvenssi nro 3) sekvenssit, (taulukko 1). Myös 10 alukkecseen sisältymätön C-ierminaaiinen osa N-terminaalisesta peptidistä #3792 (sekvenssi nro 1) löydettiin johdetusta aminohapposekvenssistä f taulukko 1). Tämä vahvistaa sen, että PCR-reaktiol!a aikaansaatu DNA-fragmentti oli osa Fe__RF63IS“ proteiinia koodaavaa geeniä, ja sitä käytettiin näin ollen koettimena täyspitkän geenin seulomisessa F. equisetm genomisesta DNAista.
15 (d) FeJRF6318«proteaasia koodaavan F, eqimeti RF63J.8 »geenin kloonaus F equisetm genommen DNA digestoitiin useilla rastriktioentsyymeiliä Southern hiot ~ analyysia varten. Hybridisaatio suoritettiin 884 kb:n FeoRl-fragmentin kanssa, joka ί1.Μ 20 sisälsi sekvenssin nro 9, katkaistu piasmidista pALK2521 koettimena (esimerkki 3e). * .1!1. Edellä mainittu koetin leimattiin käyttäen digoksigeniiniä valmistajan ohjeiden « ♦Ϊ. mukaisesti (Roche. Saksa). Hybridisaatio suoritettiin yön yli 65 °C:ssa. Hvbridis&ation * \ / v 1· v »Ui * .1« jälkeen suodattimia pestiin 2x5 min huoneenlämpötilassa käyttäen 2 x SSC:a - 0,1 % * e 1 1 **51. SDS:a. ja sitten 2x15 min 65 °€:ssa käyttäen Ö.i x SSC:a - Ö. 1 % SDS:a.
* ® 1 ' 1 1 '1) c * 1 * 1 F. equisetm digestoidosta genomisesta DNA:sta voitiin havaita useita hybridisoituvia *•21 fragmentteia. Genomiset Muni ia Fgiil -disestiot sisälsivät hvbridisoituvan fragmentin.
*l2i jonka koko oli 4,2 kb ja vastaavasti 3,2 kb. Julkaistuihin sieniperäisiin * « proteaasisekvensseihin perustuvien laskelmien perusteella yksittäisten hybridises tavien * « ... 30 fragmenttien koot olivat riittävän suuret sisältääkseen tävspitkän Fe RF6318-proteiinia.
* ♦ w ' ' * 1 **** koodaavan geenin. Genomiset DNA-fragmentit eristettiin RF631S:n genonsisisia Muni»
» X
* 2 ja Spill-digestioists perustuen hvbridisoituvan fragmentin kokoalueeseen (noin 4 kb * « v 2 1! Afrml-digestiolle ja noin 3 kb £g/II»digestioIie), Genomiset fragmentit eristettiin 45 agaroosigeelistä ja kloonattiin pBluescript O. KS-t· (Stratagene, USA) -vektoreihin katkaistuina £eoRI;lla ja BamHhihi, Ligaatloseokset transformoitiin Escherichia coii XLlö-Gold -soluihin (Stratagene) ja maljattiin LB (Luna-Bertani) -maljoille, jotka sisälsivät 50—100 pg/ml ampisiliiinia. E. coii -pesäkkeet seulottiin positiivisten kloonien 5 suhteen käyttäen pesäkehybridisaatioia, pALK2521:n ollessa insertoitu koettimena. RF6318:n digestolduilk genomisifle DRA-fragmenteille suoritettiin hybridisaatio kuvatulia tavalla. Maljoilta otettiin talteen neljä positiivista Bgftl- ja kahdeksan positiivista A/uuI-kloonia. Niiden osoitettiin restriktiodigestiolla sisältävät odotetun kokoiset insestit 2kxu?H!-vektori in llgatoitu insertti A/md-ffagmentista katkaistiin Pstb 10 Xöil-kaksoisdigestiolla. £coRl -vektoriin iigatoim insertti Bgill -fragmentista katkaistiin Fsfl-Aoil-kaksoisdigestioiJa. Kerättyjen kloonien insesteille suoritettiin Southern hiot (Southern hiot -hybridisaatio 68 °C:ssa ja pesu 2x5 min huoneenlämpötilassa käyttäen 2 x SSC:a ···· 0,1 % SDStaja sen jälkeen 2 x 15 min 68 eC:ssa käyttäen 0,1 x SSC:a ~ 0,1 % SDS:a). Kolme kerätyistä Fg/ll-klooneista ja kuusi kerätyistä A'/tmi-kiooneista sisälsivät 15 hybridisoituvan fragmentin Southern blot -analyysissa. Täyspitkä geeni, joka koodasi 1½ JIF63J S-proteaasia (sekvenssi nro 10} sekvensoitiio 3,2 kb:a Bgill-imestisti ja tämän insestin sisältävälle plasmidille annettiin nimi pALK2529. Plasm idin pALK2529 sisältävä E. coii -kanta RF78ÖÖ talletettiin DSM-kokoelmaan talletusnumeroila DSM 22172, Fe_RF6318-proteiinia koodaavaile geenille annettiin nimi Fe priSSÄ.
ΛΛ S * Λ.·ν * «4 « (e) Fe RF63l8-proteaasia koodaavan geenin karakterisointi ja johdettu * * * — ' * * «
* « V
* * * *4* * .T, Fe prtSSJ -sekvenssi (sekvenssi nro lö) ja johdettu aminohapposekvenssi (sekvenssi nro * 25 11) on esitetty kuvioissa 1A-B. Geenin pituus on 1303 bp (mukaan lukien ««« lopetusködoni). Löydettiin yksi oletettu introni, joka pituus oli 64 bp C5:- ja 3:-,...t rajasekvenss.it sieniperäisten intronien vastaavien mukaan, kuten ovat esittäneet Ourr ym, (198?). Johdettu proteilnisekvensss (sekvenssi nro li) koostuu 412 aminohaposta * , srsukaan lukien 20 aminohapon ennustettu signaalisekvenssi (Signal? ¥3.0; Nielsen ym., V X V' ♦ 4 „φφ 30 1997, sekä Nielsen ja Krogh, 1998). Koko N-terminaalinen peptidi #3792 · (myös *** N-terminaalinen osa. jota ei sisällytetty koetrnsekvenssiin) sisällytettiin johdettuun « * t ·* aminohapposekvenssiin. Ennustettu molekyylimassa oli 29141,09 Da kypsälle % *: polypeptidllle ja ennustettu pl 9,30. Nämä ennusteet tehtiin käyttäen Compute pI/MW - 46 työkalua ExPASy -palvelimella (öasteiger ym., 2003.}. Johdettu aminohapposekvenssi sisälsi kaksi mahdollista N-glykosy!aatiokohtaa aminohappoasemissa Asn77 ja Asn255 (kuvio I), mutta CBS-palvelimen NetNGIyc Vl.ö:n mukaan, ainoastaan kohta asemassa Asn?7 (sijaitsee prosekvenssissä) on todennäköinen.
5 (f) Homologia-, identtisyys-ja risuasfostutkimuksei
Homologioita julkaistuihin proteaasisekvensseihin nähden etsittiin käyttäen BLASTX-ohjelmaa, versio 2.2.9. NCBI:ssa (National Center for Biotechnology Information) 10 oletusasetuksilla (Altschui ym.. 1990). Suurimmat homologiat olivat hypoteettisen proteiiniin Gihherella zeaesta (Fuserium grctmimenm) (EMBL-talletusnomero XP_38349i) ja Trichotkrma harzmnmln (Hypocrea lixii) seriiriendopeptidaasiin (EMBL-tallelusnumero CAL25508). Homologiaa todettiin myös sekvenssiin nähden, joka sisältyy patenttihakemukseen US 60/818,910 (Catalyst Bioscience Inc.) sekvenssinä 15 nro 313. Fe RF6318-sekvenssi rinnastettiin edellä mainittujen homologisten sekvenssien kanssa. Taulukossa 3 on esitetty identtisyysarvot, jotka saariin käyttäen ClustalW-rinnastusta (www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw: matriisi: BLÖSIJM, aukon muodostus: lö, aukon laajennus: O.S).
». 20 Taulukko 3. Identtisyysarvot (%), Jotka saatiin proteaasis johdettujen * »1· amiuohapposekveassien OtistalW-rianastuksesta. Rinnastettiin kypsät > < > e »t1 aminohapposekvenssit pois hikien signaslipeptidit ja propepiidlt. Matriisi: BLOSIJM, * « « « x j aukon muodostus: 10, aukon laajennus: 0.5. EMBLJEBL G. zeae, XIs 383491; « » » 7 hanionum CAL25508; US 60/818,910, hakemuksen sekvenssi nro 313.
* ♦ x « » * 1 1 , ............................................, ...................................................--------------------------------------...... ...............
»«1 * e » & V *
X X
* ♦ ♦ X 1 ♦ » ♦ X ♦
» «f ♦ X
4? ESIMERKKI 4. Rekombinasttises FeJRF6318-proteaasin valmistus Trkh&derma reemism (a) Tuotanto- (isistä-) vektorin valmistus 5
Ekspressioplasmidl pALK2533 aikaansaatiin rekombinanttisen Fe_RF631S~proteaasm valmistusta varten Trichoäerma reeseissä. Fe prtSSA -geeni oman slgnaalisekvenssinsä kanssa fuusioitiin tarkasti T reesei cbhl (eeilA) -promoottoriin PCR-menetelmallä. Fe prtSSA -geenifragmentti katkaistiin sen 3'-päästä 2?«»?HI:l!a (paikka, joka luotiin 10 lopetuskodonin jälkeen PCRissä). Näin konstruktiin ei jää alkuperäistä Fe pnSSA ~ ierminaattona ennen cMi-terminaattorisekvenssiä. Konstruktiin lisättiin emdS-markkerigeeni, joka sisälsi cMi-promoottorin ja cMi-terminaatierm. Komirukti on vastaava sen kanssa, jonka ovat kuvanneet Paloheimo ym, (2003), ja 8 ,7 kb:n lineaarinen ekpressiokasetti on esitetty kuviossa 2. Ekspressiokasetti eristettiin vektorirungosta 15 EcoRI-digestion jälkeen ja sitä käytettiin T. reesein protoplastien transformoimiseen. Käytetty isäntäkanta ei tuota mitään pääasiallisista 7 reesein sellulaaseista (CBHI, CBHII, EGI, EGO), Transformaatiot suoritettiin kuten ovat esittäneet Penttilä ym, (1987) niillä muutoksilla, jotka ovat kuvanneet Karhunen ym. (1993), Transfomiantil puhdistettiin selektiivisillä maljoilla yksittäisinä kuroumaitidinä ennen niiden 20 itiöittämistä PD:llä, * ♦ « «e « x » * « * « ,·, (h) Proteaasis valmistus ravistuspulloissa ja laboratoriomittakaavan bioreaktomsa * fr * « « 4 4*4 ♦ 4« ♦ „*»♦. Transformantit siirrostettiin PD-vinopmnoiita ravistuspulioihin, jotka sisälsivät 50 ml 4 » * 4 25 kompleksista laktoosipohjaista seltuiaasia indusoivaa elatusainetta (Joutsjoki ym,, 1993), ♦ * «44 joka oli puskuroitu 5 % KHjPO^Hau pH:ssa 6.0, Tmnsformanttien proteaasin tuotanto analysoitiin viljelmästä sen jälkeen, kun niitä oli kasvatettu 7 päivää 30 "C:ssa, 250 rpm.
v * SDS-FAGE-geeleissä käytetystä viljelmän supernatantista havaittiin pääasiallinen noin e * * x 29 kDa;n proteiinikaista, joka vastasi rekombinanttista Fe__RF6318-proteaasia.
44**4 30 Proteaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen kaseiinia substraattina esimerkissä k kuvatulia * JC * ~ * * ***** tavalla. Viljelmän supematanteista mitattiin seivästi kasvaneita aktiivisuuksia isäntään «« ♦ ’«· verrattuna. Ekspressiokasetin sisällyttäminen sienigenorneihin vahvistettiin valituista 4 4 4 « 4
V A X 4 X
48 transformanteista käyttämällä Southern blot -analyysia, johon sisällytettiin useita digestoituja genomisia fragmentteja ja ilmentämiskaseitia käytettiin koettimena.
Ne T. reesem transformanrit, jotka tuottivat parhaat preteaasiakiiivisuudet 5 ravistusnulloissa, valittiin viljeltäviksi laboratoriomittakaavan bioreaktoreissa. Selluiaasia indusoivaa kompleksista elatusaineita käytettiin viljelyissä. Viljelyistä saatua käytettyä elatusaineita käytettiin lähtöaineena sovelluskokeissa (esimerkit 6-11) ja lähtöaineena rekombinanttisen FeJRF631 S-proteaasm puhdistusta ja tarkempaa karakterisointia värien.
10 ESIMERKKI S. Rekomhisanttisea Fe__RF6318»proteaasist puhdistus ja karakterisointi
Solut ja kiinteät aineet poistettiin käytetystä elatusaineesta, joka oli saatu femtentaatiosta 15 (esimerkki. 4) sentrifugoimalla 30 min ajan 50 ÖÖÖ g:ssa lämpötilassa H °€ (Sorvali RC6 plus). Supernataniista 15 ml käytettiin proteaasin puhdistamiseen, Kaikki puhdistosvaiheet suoritettiin kylmähuoneessa. Sentrifugoinnin jälkeen näyte suodatettiin 0.44 pm:n suodattimen (MIL.LEX HV Millipore) läpi ennen kuin se lisättiin HiPrep 26/10 -suolanpoistokolonniin (valmistajalta GE Healthcare), joka oli tasapainotettu „ 20 20 mM Tris-HCkssa, pH 8,8. Geelisuodatettu näyte lisättiin 20 ml:n Q Sepharose FF - ♦ x1
*♦., kolonniin (valmistajalta GE Healthcare), joka oli tasapainotettu 20 mM Tris-HCkssa, pH
y » $ 8,8. LäpivirtausfVaktio otettiin talteen ja se analysoitiin .12 % SDS PAGE -geelissä * ♦ 1 i '· ' w * !1’1 (kuvio 3). Tätä entsvvminävtetiä käytettiin pH- ia lämpötllaprofiiiien selvittämisessä.
e x « »»« 1 * ♦ 1 ♦ « 1 1 « 1 x LämpStilaprofiiiI saatiin Fe RF63.18-proteaasilie pH:ssa 9 käyttämällä esimerkissä le ** ♦ . kuvattua määritystä ia kävttäen 15 min reaktioaikaa. Tulokset on esiteilv kuviossa 4A.
»2♦1 1 * ♦ . Proteaasin optimilämpöiila on noin 60 ♦ ♦ *x1 * ♦ « 1 ««» * A «
X
* ♦ 2 X A 1 K 2
* X
49 pH-proftili
Proteaasin pH-profiili määritettiin 50 °€:ssa käyttäen kaseiinia substraattina esimerkissä le kuvatulia tavalla. Reaktion pH säädettiin arvoon pH 6—12 käyttämällä 40 mM 5 Britton™Robinson»pusk«ria. Tulokset on esitetty kuviossa 4B. Rekom.binanttisel.ia
Fe__RF631 S-proteaasilla on suhteellinen aktiivisuus, joka on yli 60 % pH:ssa 6-10, optimaalisen aktiivisuuden esiintyessä noin pH:$sa 10. Puhdistetun rekombintmitisen FeJRF631 S-proteaasin pH-ptoftili vastasi viiliiyypin Fe_RF6318-proteaasia puhdistettuna esimerkissä ia kuvatulla tuvalla.
10 ESIMERKKI 6« Rekona bin asmisen FeJRF6318~proteaasm tehokkuus pH 9 -puskurissa erilaisissa lämpötiloissa
Testattiin rekombmanitisen Fe RF631S-proteiiniva!misteen, joka oli valmistettu 15 Trichoderma$s& (kuten esimerkissä 4 on kuvattu), kyky poistaa standardeja veri/maito/muste-tahroja (Art. 116, 100 % potuilla, EMPA Testmaterialen AG, Sveitsi) lämpötiloissa 30 °C ja 50 *C. Kaupallisia proteaasivalmisteita Savinase® Ultra 16 L (Novozymes) ja Puraiset® 40001, (Genencor International) sekä käsittelyä ilman entsyymiä (verrokki) käytettiin vertailua varten. Tahrakangas leikattiin susin. 1,5 cm x **♦ 20 1,5 cm kangasnäytteiksi ja paloja pyöristettiin leikkaamalla kulmat. Palat sijoitettiin ♦ *·*. mikrotiltterilevyjen (Nunc 150200) kuoppiin. Jokaiseen kuoppaan, jonka halkaisija oli 2 *♦» cm, lisättiin kankaan päälle 1,5 ml entsyymiin laimennosta Glysiinl-NaOH-pusfcurissa, <«*« t *% pH 9. Kutakin entsvvmiä annosteltiin 0. 0.2. 0.4. Ö.8. 1.6. 4 ia 8 aktiivisotssvksikkoä * e * f vv ···'···'-·- -
X K« X
fumol tvrosiinia/min) kohti 1.5 mi puskuria. Aktiivisuus määritettiin käyttäen 30 min S « X vf" -'*··» f * .***. 25 reaktinalkaa esimerkissä 1c kuvatulia tavalla, paitsi että käytettiin pH:ta 8,5 ja X X * pysäytvsliuosta, joka sisälsi ainoastaan 0,11 M TCA:a. Mikrotiitterilevydä näytteiden kanssa inkuboitiin vaakaravistimessa 30 °C:s$a ja 50 °C:ssa 60 min nopeudella 12S rpm.
» « Tämän jälkeen kangasnäytfceet huuhdeltiin huolellisesti juoksevan veden alla (noin 45 ‘C) * « * ^ ja niitä kuivattiin yön yli sisäilmassa säleikössä päivänvalolta suojattuina »«*x * * * 30 x x ***** Tahranpoistovalkutus arvioitiin mittamaalla väri reilektanssiarvoina Minolta CM 2500 - « « ϊ *** spektrototometrillä käyttäen L*a*b*-väriavaniuskoordinaatteja (valonlähde 065/2°).
*.**» Väri molemmilta kangasnäytteen puolilta määriteltiin käsittelyn jälkeen. Kukin arvo oli 50 keskiarvo ainakin kahdesta rinnakkaisesta kangasnäyiteestä mitattuna kankaan molemmilta puolilta. Veri/maito/muste-tahran haalistuminen, joka osoitti proteaasin tehokkuuden (tahranpoistotehon), laskettiin arvona AL*, joka tarkoittaa emsyymikäsiieliyn kankaan vaaleosarvoa L*> josta on vähennetty pelkällä puskurilla 5 käsitellyn kankaan vaaleusarvo L* (entsyymin nolianäyte, verrokki).
Tulokset on esitetty kuvioissa 5 ja 6. Fe_RF6318-proteaasi valmiste osoitti huomattavasti korkeampaa tahranpoistokykyä 50 *C:ssa ja erityisesti 30 °C:ssa pH 9 -puskurissa verrattuna kaupallisiin proteaasivalmisteisim Savinase® Ultra 16L ja Purafect® 4Ö00L.
10 ESIMERKKI 7, Rekombinanttisea proteiinin Fe_RF6318 tehokkuus pesnainejashees kanssa lämpötilassa 4Ö *C / 50 *C ja pHtssa iö
Testattiin rekombinanttisen Fe_RF631 S-proteiinivalmisteen. joka oli valmistettu 15 Trkhodermm$& (kuten esimerkissä 4 on kuvattu), kyky poistaa standardeja veri/maito/muste-iahroja fostäattipitoisen vertai! upesuaineen kanssa ilman valkaisuainetta ja sen kanssa 40 °C:ssa ja 50 °C:ssa (pH noin 10). Standarditahraa
Alt, 117 (veri/mako/muste, polyesteri + puuvilla, EMPA) käytettiin koem&teriaalina.
Kaupallista proteaasia Purafect® 4000L ja käsittelyä ilman entsyymiä (verrokki) „ 20 käytettiin vertailua varten. Kutakin entsyymiä annosteltiin Ö, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 4 ja 8 * * ' « *9 aktiivisuusvksikköä (»mol tyrosiinia/ntint per ml pesunestettä. Aktiivisuus määritettiin * 9 X * β * * esimerkissä 6 esitetyllä tavalla.
* 9 * ·’ 9 *S»9 * 9 * 9 * 9*9 Määrä, joka käsitti 3,3 g fosfaattia, sisältäen ECE-vertailupesuainetia 77 ilman optista 9*9 ,«·, 25 kirkastetta (Art. 601, EMPA), liuotettiin 1 litraan vesijohtovettä (vesi, dH < 4), 9 « sekoitettiin hyvin magneettisekoittimella ja temperoitiin lämpötilaan 40 °C / 50 °C. Tahrakangas leikattiin paloiksi esimerkissä 6 kuvatulla tavalla. Kangasnäytteet sijoitettiin mikrotiitterilevyjen (Nunc 150200) kuoppiin ja 1.5 ml pesunestettä, joku sisälsi * # pesuainetta ja entsyymin laimennosta vedessä (alle 60 μ 1) lisättiin kankaan päälle. Levyjä **999 « * 30 näytteiden kanssa inkuboitiin 60 min vaakaravistimessa lämpötilassa 40 °C / 50 %: 9 9 9 9 nopeudella 125 rpm. Tämän jälkeen kangasnäytteet huuhdeltiin huolellisesti juoksevan 9 * i *· veden alla (noin. 45 °C) ja niitä kuivattiin yön yli sisäilmassa säietkossä suojattuina « 9 9 x 9 , f f te *5 päivänvalolta. Toinen koesarja suoritettiin samaan tapaan, paitsi että pesuaineen hsäkst $! lisättiin 0,81 g namumpeiboraattitetrahyraattia (Art. 604, EMPA) ja 0,16 g valkaisuaktivaattoria TAED, tetra-aset>7li«ty!eenidiamnni ('Art, 606, EMPA).
Kangasnäyiteiden väri käsittelyn jälkeen määritettiin Minolta CM 2500 - 5 spektroibtometriUä käyttäen L^a*b*-väriavaruuskoordinaatteja ja tahmnpoistovaikutusta, joka laskettiin arvona AL* esimerkissä 6 kuvatulla tavalla.
Kuvioissa ?A, 78, 8A ja 8B esitetyt tulokset osoittivat, että proieaasi Pe_RF6318 soveltuu myös jauhemaisiin pesuaineisiin hyvin emäksisissä olosuhteissa, ja sen 10 vastustuskyky valkaisuaineille oli hieman korkeampi kuin kaupallisen proteaasin Puraiect® 4000L, ESIMERKKI 8, Rekombinanttisen proteiini» Fe_RF6318 tehokkuus nesteiuäisen pesuaineen kanssa 40 *€:ssa 15
Testattiin rekombmanttisen Fe JRF6318-proteönivalmisteen, joka oli valmistettu
Trichodema$&& (kuten esimerkissä 4 on kuvattu), kyky poistaa standardeja veri/maito/muste-tahroja nestemäisen pesuaineen Ariel Sensitive (Procter & Gamble,
Englanti) läsnä ollessa ilman entsyymiä lämpötilassa 46 aC ja pH:s$a, joka oli noin 7,9.
r, 20 Standarditahraa, keinotekoisesti liattua koekangasta Art. 117 (veri/maito/moste, » polyesteri 4· puuvilla, EMPA) käytettiin koemateriaalina. Kaupallisia proteaasi valmisteita * .i, Purafect® 4Ö0ÖL, Savinase® Ultra 16 L ja käsittelyä ilman entsyymiä (verrokki) ♦ ««* : »*. käytettiin vertailua varten. Kutakin entsyymiä annosteltiin 0, 0,2, 0,4, 0,8. 1,6, 4 ja 8 « **J*. aktiivisaasyksikköä (pmol tyrosHnia/mln) kohti ml pesunestettä. Aktiivisuus määritettiin .***, 25 esimerkissä 6 esitetyllä tavalla.
*** Määrä, joka käsitti 3,3 g of Ariel Sensitiveä, liuotettiin 1 litraan vesijohtovettä (dB < 4), «»«*: sekoitettiin hyvin magneettisekoittimelia ja temperoitiin lämpötilaan 40 °C. Tahrakangas * . leikattiin paloiksi esimerkissä 6 kuvatulla tavalla. Kangasnäytteet sijoitettiin « * ... 30 mikrotiitterilevyjen (Nune 150200) kuoppiin ja 1,5 mi pesunestettä, joka sisälsi t » * * *Γ pesuainetta ja entsyymin laimennosta vedessä {'alle 60 μ!) lisättiin kankaan päälle. Levyjä ♦ * J " näytteiden kanssa mkubckän vaakaravistimessa 40 *C:ssa 60 min nopeudella 125 rpm.
fr ♦
9 fr fr X fr X fr X
52 Tämän jälkeen kangasnä siteet huuhdeltiin huolellisesti juoksevan veden alla (noin 45 °C) ja niitä kuivattiin yön yli sisäilmassa säleikössä suolattuina päivänvalolta,
Kangasnäytteiden väri käsittelyn jälkeen määritettiin Minolta CM 2500 -5 spektrofotometriilä käyttäen L!*a*!b*-väriavaruuskoordinaatteja ja tahranpoistovaikuiusta, joka laskettiin aivona AL* esimerkissä 6 kuvatulla tavalla.
Kuviossa 9 esitettyjen tulosten perusteella FeJRF6318>proteaasi!ia on erinomainen tehokkuus nestemäisen pesuaineen kanssa 40 cC:ssa. Fe_RF6318:n tehokkuus 10 veri/maito/muste-tehralle (polyesteri ·?· puuvilla) oli huomattavasti korkeampi verrattuna kaupallistin valmisteisiin Purafect® 4ÖÖÖL ja Savinase® Ultra 14 L, kun annosteltiin sama määrä proteaasiaktiivisuutta. Kaupallisten entsyymien annostus, joka oli 4-8 yksikköä kaupallisia entsyymejä per ml pesunestettä, vastasi annostusta, joka olin noin 0.2-43,5 % entsyymivalmistetta pesuaineen painoa kohden, mikä on tyypillinen 15 käyttömäärä pesuaine-entsyymeille, ESIMERKKI 9. Rekombinanttise» proteiini» Fe_RF6318 tehokkuus erilaisten nestemäisen pesuaineen koosentraatkuden kanssa 30 ®C:ssa ;% 20 Testattiin rekombinanttisen Fe_RF6318~proieiinivaimisteen, joka oli valmistettu * .·;** Triehoäermmsä (kuten esimerkissä 4 on kuvattu), kyky poistaa standardeja « * ♦ <· « * veri/maito/muste-tahroja nestemäisen pesuaineen kanssa pitoisuuksina 1-5 g/i * s*»* : ,% lämpötilassa 30 °C. Pesuaineina käytettiin Ariel Sensitiveä (Procter & Gamble, Englanti), s * * * * * * „*r. joka ei sisältänyt entsyymejä, sekä nestemäistä, värillisille kankaille tarkoitettua * « * ,·♦·, 25 pesuainepohjaa, joka sisälsi 25 % pesuakinvisia aineita, polyolia ja polymeerejä * * n * (taulukko 4), ja siandardiiahraa Art. 117 (veri/maito/muste, puuvilla + polyesteri, EM.PA) ♦,„,i käytettiin koemateriaalina. Kaupallisia proteaasivalmisteita Purafect® 4ÖÖÖL, Savmase® * * ...,i Oltra 16 L ja käsittelyä ilman entsyymiä (verrokki} käytettiin vertailua varten. Kutakin " , entsyymiä annosteltiin 0, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 4 ja S aktiivisuusyksikköä « Ä 30 (pmol tyrosiinia/min) kohti mi pesunestettä. Aktiivisuus määritettiin esimerkissä 6 « * T esitetyllä tavalla, »« e « * »4 « » * * * 4 44 a * 53
Taulukko 4. Värilliselle kankaalle tarkoitetun nestemäisen pesuaine-pohjan koostumus
Valmistusaineet %
NaL.ES (natriumlauiyylieeöerisuifaatti) 4,9
Ionitta? €12-15 7EÖ (etyleenioksidi) 15
Na-saippua (palmunydin-FA) 4,4
Kookosglukosldi 1 <Pintä~aktih’iset aineet yhteensä> <25,30>
Polyoii (giyseriini) 5
Fosfcnaafti 02 %) (ThermPhos) 2 'PVP-Sokaian HP 53 (BASF) ............................................1 'Sokaisi? PA i5 (BASF) 1,56
Sorez-100(iSP)........................................... ÖÄ
Vettä kunnes 100 % 5 Määrät, jotka käsittivät Ϊ, 3,3 ja 5 g nestemäistä pesuaineita, liuotettiin 1 litraan vesijohtovettä (dii < 4), sekoitetuin hyvin magneettisekoittimeila ja temperoihin lämpötilaan 30 °C. Pesuliuosten pi i oli noin 7,3-7,5 pesuainepohjan kanssa tai noin 7,6- 8,0 Arielin kanssa pesuainepitoisuudesia riippuen. Tahrakangas leikattiin paloiksi Γ\. esimerkissä 6 kuvatulla tavalla, Kangasnäytteet sijoitettiin miki-otiitterilevyjen (Nune :T: 10 150200) kuoppiin ja 1,5 ml pesunestettä, joka sisälsi pesuainetta ja entsyymin ·;1 laimennosta vedessä (alle 60 ui) lisättiin kankaan päälle. Levyjä näytteiden kanssa : inkuboitiin vaakaravistintessa 30 ^Cissa 60 min nopeudella 125 rpm. Tämän jälkeen *** » ί1Γ: kangasnäytteet huuhdeltiin huolellisesti juoksevan veden alla (noin 45 °C) ja niitä kuivattiin yön yli sisäilmassa säleikössä päivänvalolta suojattuina.
15
Kangasnäytteiden väri käsittelyn jälkeen määritettiin Minolta CM 2500 - :·1: spektnototometrillä käyttäen L1a1b1-väriav5u^uskoordmaatteja ja tahranpoistovaikutusta, * joka laskettiin arvona AL1 esimerkissä 6 kuvatulla tavalla, * 1 « 1 ♦ « 20 Värillisille kankaille tarkoitetulla pesuainepohjalia saadut tulokset on esitetty kuvioissa ♦ 1 \ t 10A-D ja Ariel Sensitiven kasissa saadut tulokset on esitetty kuvioissa llA-D.
♦ 1 1 " Fe_RF6318:n tehokkuus veri/maito/muste-tahroille oli huomattavasti korkeampi 54 verrattuna kaupallisiin valmisteisiin Purafect® 4000L ja Savinase® Ultra 14 L molemmilla pesuaineella ja kaikilla pesuainepitoisutiksilla, kun annosteltiin sama aktiivisuusmäärä. Myös silloin, kun annostus laskettiin lisätyn proteiinin määränä (kuviot IÖB ja HB, tahranpoistotebokkuus oli suurin Fe_RF6318:11a. Entsyymnvalmisteiden 5 proteiinimäärä määritettiin Bio-Rad-proidinintääritykseilä (Bio-Rad Laboratories* Hercules, CA) käyttäen naudan gammaglobuliinia (Bio-Rad) standardina. Näiden kokeiden tulokset osoittavat, että Fe_RF6318-proteaasilia on erinomainen tehokkuus nestemäisten pesuaineiden kanssa aikaisissa lämpötiloissa, kuten 30 °€:ssa.
10 ESIMERKKI M. Reknmbmaattiseit proteiinin Fe_RF6318 tehokkuus erilaisilla tahroille nestemäisten pesuaineiden kanssa 30 eC:ssa (Launder Ometer)
Testattiin rekombinanttisen Fe_RF63 i S-proteiinivalmisteen, joka oli valmistettu Trichodermas&a (kuten esimerkissä 4 on kuvattu), kyky poistaa erilaisia tahroja 15 nestemäisen pesuaineen kanssa 30 Tessa, ja sitä verrattiin kaupallisiin proteaasivaimisteisiin Puraiset® 4QQQL ja/tai Savinase® Ultra 16 L, Käytettiin seuraavia keinotekoisesti liattuja EMPA:n koekankaita: veri/maito/muste (Art. 117, polyesteri * puuvilla), veri/maito/muste (Art. 116, puuvilla), ruoho (Ari. 164* puuvilla) ja kaakao (Art. 112, puuvilla). Kangas leikattiin kooltaan 9 cm x 12 cm oleviksi kangasnäytteiksi ja ;% 20 reunat siistittiin siksak-ompeieeila. Suoritettiin kaksi koesarjaa: ensimmäinen Ariel * ί* * .♦j% Sensitive» kanssa ilman entsyymejä ja toinen myöhemmin nestemäisen, värillisille * ♦ x ' v * kankaille tarkoitetun pesuainepohjan kanssa (esimerkki 8). Edellä mainituissa kahdessa e »««« Ϊ .·, kokeessa käytettiin eri tahraeriä.
« » « ««« « 4»f <· * « i * 4 „·**, 25 Tabranpoistokäsittelyt suoritettiin LP-2 Launder-Ometer -laitteella seuraavalk tavalla.
x * sv*
Launder Ometer esikuumennetrim ensin 36 öC:seen. Säiliöihin, jotka sisälsivät tahrat
Art. 116 ja Art. 117 tai tahrat Art. 164 ja Ari. 112, lisättiin 450 mi temperoitua pesunestettä* joka sisälsi 5 g pesuainetta kohti litraa vesijohtovettä (öH < 4) ja entsyymin * * laimennosta. Kutakin entsyymiä annosteltiin 0,2, 5 ja 1.0 sekä joissain kokeissa 20 tai 30 « « „** 30 aktiivisimsyksikköä (pmol tyrosiinia/min) kohti mi pesunestettä. Aktiivisuus määritettiin * * » » T esimerkissä 6 esitetyllä tavalla. Launder Ometer -laitetta käytettiin 30 °C:ssa 60 min <« Ϊ pH:n ollessa noin 7,5 {pestiamepohja} tai 8 (Ariel). Tämän jälkeen kangasnäylteet » « ♦ x ♦ ♦ «» o * 55 huuhdeltiin huolellisesti juoksevan veden alla (noin 20 °C) ja niitä kuivattiin yön yli sisäilmassa säleikössä päivänvalolta suojattuina.
Kangasnäytteiden väri käsittelyn jälkeen määritettiin Minolta CM 2500 - 5 spektroiotometriliä käyttäen L*a*b*-väriavaruuskoordinaatteja ja tahranpoisiovaikuinsia, joka laskettiin arvona AL* esimerkissä 6 kuvatulia tavalla. Väri molemmilta kangasnäytteen puolilta määritettiin käsittelyn jälkeen. Kukin arvo oli keskiarvo vähintään 20 mittaukselle kangasnäytettä kohti. Mittausten suorittamista vältettiin sellaisilta aluilta, joille oli muodostunut rasvajälkiä käsittelyn aikana kankaan taittumisen 10 seurauksena (puuviliatahroissa Ari. 116 ja Art. 112).
Ariel® Sensitive! käyttäen saadut tulokset (kuviot 12A-C) osoittavat, että tehokkuus veri/maito/musie- ja ruohotahroille oh huomattavasti korkeampi Fe_RF631S:n kanssa verrattuna kaupalliseen valmisteeseen Savinase® Ohra I6L lämpötilassa 30 öC> kun 15 annosteltiin sama määrä proteaasiaktiivisuutta. Myös kaakaotahralie saadut tulokset olivat paremmat FeJRF63i8:n kanssa (tietoja ei esitetty).
Myös värillisille kankaille tarkoitettua pesuainepohjaa (5 g/l) käyttäen saadut tulokset (kuviot 13A-D) osoittivat, että tehokkuus veri/maito/muste-, ruoho- ja kaakaotahroilk *·, 20 oli huomattavasti korkeampi Fe_RF63i8:n kanssa verrattuna kaupallisiin valmisteisiin « t»l*t Savinase® Ultra 16L ja Puraiset® 4ÖÖ0L lämpötilassa 30 °C, kun annosteltiin sama « li « määrä proteaasiaktiivisuutta. Annostus» joka oli 10 yksikköä kaupallisia entsyymejä per « ♦ .% ml pesunestettä, vastasi annostusta, joka olin noin 0.4 % entssyreivalmisvetta pesuaineen » « « st« * » t ,··% painos kohden, mikä on tyypillinen käyttömäärä pesuaine-entsyymeille. Näiden kokeioen * * s ,♦·*, 25 tulokset osoittavat, että Fe JRF6318-proteaasi on tehokas useille tahroille alhaisissa « e lämpötiloissa, kuten 30 °C:ssa.
* ««««« » « ESIMERKKI 11, Rekombiuanthsen proteiinin Fe_RP63IS tehokkuuden arviointi e * * t nestemäisessä pyykinpesuaineessa täyden mittakaavan kokeissa 39 “Ctssa.
30 o* x
K V
***** Testattiin rekombinanttista Fe_RF6318-proteiiniv&!misteita, joka oli valmistettu «e ί '** Trickodermass& (esimerkki 4), nestemäisessä pesuaineessa pyykinpesukoneessa 30 « « '/·; °C:ssa, ja sitä verrattiin kaupallisiin proteaasivalmisteisiin Purafect® 4Ö0ÖL ja 56
Savinase® Ultra 16L sekä käsittelyyn ilman entsyymiä. Käytettiin nestemäistä värillisille kankaille tarkoitettua pesuainepohjaa, kuten esimerkissä 9 on kuvattu, sekä kahdeksaa erilaista proieaasille herkkää seurantakangasta (taulukko 5). Lisäksi kaksi kappaletta Hkakuorautuskangasta ('’ballast soil”, CFT-SBL) pesua kohti sijoitettiin pesuverkkoon, 5 jotta muihin kangasnäytteisiin syntyvän kontaktin aiheuttama likaantuminen voitaisiin välttää, Seutantakankaat olivat valmistajalta CPT (Center For Tesunaierials BV. Alankomaat). Kooltaan 10 cm x 10 cm olevat tahrakangasnäytteet ommeltiin keittiöpyyhkeisiin. Prosessiparametrit ja olosuhteet on kuvattu taulukossa 6. Entsyymin annostukset kokeissa laskettiin sekä entsyymiaktiivisuuksina (noin 0-14 10 aktimsuusyksikköä per yksi ml pesuliuosta) sekä proteiinin määränä (noin 0-2.2 mg per litra pesuliuosta). Valmisteiden proteaasiaktimsuodet ja proteiinipitoisuudet määritetlim esimerkeissä 6 ja 9 kuvatulla tavalla.
Taulukko 5, Kokeessa käytetyt proteaasiiie herkät seurantakankaat 15
Nro Seurantamenetelmä/kaagasaäyte Substraatti .......Ϊ................C¥T!CS~ÖYaQ6 Veri (vanha) / Puuvilla 2 CFT/C-03-Ö3Ö Maitokaakao/pigmentti/Pouviila 3 CFT/€-05-059b Veri/mako/mqste/iHumiia ♦· 4 CFT/PC-Ö5-014 Veri/maito/snuste/PE-Piiuvilla « «· » »< ^ _ _ , ,_ ______ .............5.............CFT/CS-0K069 Ruoho/Puuvilia > 9 9 **Y 6 CFT/C-i"ö-186b..............................................MäSpähktaäöljy/maito/Puuvilla 99* I**! 1 CFT/CS-25-016 Pinaatti/Punvilla 9*9 __ ’**/ 8 CFT/CS-3S~0iÖ Munankehuainen/pigmentti/PuuviHa 9 9 9 . _ X ♦ * -’ ................................................. ............ ....................................
*9* » 9 9 9 »«« 9 ♦ 99 * * 9 λ ♦ 9 9 9 9 ««««» «· « ♦ 99 9 9 9 9 *9» 9 9 * * * ♦ »9 ♦ 9 ♦ ♦ · * ♦ 9 * * * 57
Taulukko 6» Prosessiparametrit Ja olosuhteet:
Kone Miete N-Tromc Frootstar
Ohjelma 30 °€, lyhyt ohjelma
Veden kovuus noin 11,2 MH sisäänotolla 13 Ihraa
Kuormitus 2,5 kg lakanoita/kylpypyyhkeitä ja keittiöpyyhkeitä
Pesuaineen annostus 80 g / konetäyttö
Kunkin seurantakankaau määrä 2 tahrakaistaieifa lö cm x 10 cm per kone
Pesujen määrä 2 5 Tahranpoistovaikutuksen arviointi perustui reflekianssin mittaukseen (R 457 nm) Datacolor-spektrofotometriUä UV-suodattlmelia, ja se laskettiin prosentuaalisena tahranpoistovaikutuksena (% SR).
% SR ” Reflektanssi pesun jälkeen - Reflektanssi ennen pesua x 100 % 10 Tahraamattoman kankaan reflektanssi - Reflektanssi ennen pesua
Tulokset laskettiin arvona Δ% SR (delta%SR), joka tarkoittaa entsyymillä käsitellyn * « x φ f '* kankaan arvoa %SR miinus ilman entsyymiä tapahtuneen käsittelyn (pelkkä pesuaine) e « <· V * %SR.
x «Sf
* ξ S
S f « » > v.‘ * 4
X « X
ί·ϊ i Suoritettiin kaksi pesua, jotka sisälsivät kaksi kangasnäytetta kustakin tahrasta jokaiselta ««e ** « x « **“ * entsyymin annostuksella, ja jokaisesta tahranäytekankaasta mitattiin kolme mittausta, * * * * * *·♦♦" joten arvot perustuvat 12 mittaukseen per tahra per tuote.
s 20 Tulokset kokonaistahranpoistotehokkuuksista (delta%SR) on esitetty·' kuvioissa 14A-B ja * kuvioissa 15A—E, Kokonaisiahranpoistovaikutus, joka perustui tulosten summaan, jotka saatiin kahdeksalla erilaisella proteaasiherkällä tahralla (tahrat 1-8, taulukko 5) oli «««
t'Hl korkeampi Fe RF6318:11a verrattuna kaupallisiin proteaasivatoisteisUn Puratect# 4Ö0ÖL
4 ja Savinase® Ultra 161,, kun proteeseja annosteltiin aktiivisuuden määrään perustuen * : 25 sekä proteiinina kohti pesuliuoksen tilavuutta (kuviot 14A--B). Fe RP63.18 oli tehokas * ** * — 4 « 58 erityisesti veri/maito/muste-, suklaa/maito-. maapähkinäöljy/maito- ja raunankeltuaistahroiile (kuviot 15A---E).
Ykistä puhdistuskyvyn määrittelemisessä käytettyä seurantakangasta (pigmentii/öljy) 5 käytettiin verrokkina toistokckeissa eri koneilla. Eri kokeiden välillä ei havaittu eroja, V v * <· * ψ * * « X « « * «
X
Φ49 > »»«« t » X i « S «xt » »es * « « ««« s * * * »».1 « «! * ♦ X *
« X
ΐ x««» « x * *
X V O * X
» 6 * > «»« * X « & Φ » «* * 9 X » « » * « Φ « ί 59
VIITTEET
AltsehuI SF, W Gish, W Miller. EW Myers ja DJ Lipman. 1990. Basie local alignment search tool. J'J Mol J Biol. 215: 403-410.
5 AMFEP, 2007. Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme products, kaupallisten entsyymien luettelo osoitteessa http:/Avww.amfep.org/ilst.htmi (päivitetty 30.11.2007).
Anwar. Ä ja M Sakemuddin. 1998. Alkaline proteases: A review. Bioresource Technology 64: 175-183.
10 Bolton, ET ja BJ McCarthy. 1962. A general method for the isolation of RNA complementary to DNA. Proc·. Nat. Acad. Sci. USA 48: 1390-1397,
Chen, Y~J, ja M Inouye, 2008. The intramolecular chaperone-mediated protein folding, Curr. Opin. Struct. Biol 18: 765-770.
Cherry, J. R„ ja Fidantsef, A. L. 2003. Directed evolution of industrial enzymes: an 15 update. Curr. Opin. Biotechnol. 14: 438-443.
Edman P ja G Begg. 1967. A protein sequenaior. Eur. J. Bioehem. 1: 80-91.
Gasteiger, E, A Gattiker, C Hoogland. I Ivsnyi, RD Appel ja A Bairoeh. 2003. ExPASy: the proteomics server tor in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31:3784-3788.
t*. 20 Geremia RA. Goldman GH, Ardiles W, Vila SB, Van Montagu M. Herrera-Estrella A.
* »* *- « 414 1993) Molecular characterization of the proteinase-encoding gene, prbL related to 4» mvconarashism bv Trichoderma harzianum. Mol. Microbiol. 8(3): 6Ö3-613.
ψ < * .
«« »« j Gupta, R, QR Beg, S Khan ja B Chaohan. 2002. An overview on fermentation, «»x * ♦*«*; downstream processing and properties of microbial alkaline prestease. Appi. Microbiol, « ·*”« 25 Biotechnol. 60:381-395.
* * «« «.
Gurr, SJ, Uncles, SE. ja Kinghorn JR. 1987. The structure and organization of nuclear «... genes in filamentous fungi. S. 93-139. Teoksessa (JR Kinghorn, toim.) Gene Structure in ♦»»·♦ Eukaryotic Microbes. 1RL Press, Oxford.
Joutsioki. VV. TK Torkfeeli ja KMH Nevalainen. 1993. Transformation of Trichoderma *&««« *’ 4 a « ... 30 reesei with the Hormoconis resinm glucoamylase P (gmnP) gene: production of a * « *** heterologous glucoamylase bv Trichoderma reesei. Curr. Genet. 24: 223--228.
« * * - Kalisz, HM. 1988. Microbial proteinases. Adv, Bioehem. Eng, Biotechnol. 36: 1-65, 9 * t
* A V 9 X
60
Karhunen T, A Mäntylä, KMH Nevalainen ja PL Suominen. 1993, High frequency one-step gene replacement In Trichoderma reesei, I, Endoglucanase I ovetprodnctlon. Mol. Gen. Genet. 241: 515-522.
Laemmli. UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of 5 bacteriophage 14, Nature 227: 680-685.
Malardier L, MJ Daboussi, J Julien, F Roussel, C Scazzocehio ja V Brygoo. 1989. Cloning of the nitrate reductase gene (niaD) of Aspergillus nidtilam and its use for transformation of Fusarium oxysporum. Gene 78: 147-156,
Maurer, K-H. 2004. Detergent proteases, Curr. Opin. Bioieehnol. 15: 330-334.
10 Nielsen H, J Engelbrecht, S Brunak ja G von Heijne, 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10: 1-6.
Nielsen H ja A Krogh. 1998. Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model. Julkaisussa: Proceedings of the Sixth International Conference on 15 Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, Kalifornia, s. 122-130.
Paloheimo M, A Mäntylä, J Kallio ja P Suominen. 2003. High-yield production of a bacterial xylanase in the filamentous fungus Trichoderma reesei requires a carrier polypeptide with an intact domain structure. Appi Env. Microbiol. 69: 7073-7082.
Γ\, 20 Penttilä M, H Nevalainen, M Rättö, E Salminen ja j Knowles. 1987. A versatile « iVi transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61:155-164, »1»1 : t1i Poutanen, M, L Salusjärvi, L Ruohonen, M Penttilä ia N Kalkkinen, 2001, Use of matrix- t«« » ί1Γ: assisted laser desotpiion/ioniz^tion time-of-flight mass mapping and nanospray : “ϊ 25 liquidcln-omatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry sequence tag analysis for high sensitivity·' identification of yeast proteins separated by two-dimensional •t'1i gel electrophoresis. Rapid Common, Mass Spaetrom. 15: 1685-1692 h**; Raeder U ja P Broda. 198S. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett.
♦1l.j Appi. Microbiol, I; 17-20.
* 1 ,···, 30 Rao, MB, AM Tanksaie, MS Ghatge ja VV Deshpande. 1998. Molecular- and ,/ biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 62: 597-635, « 1 *, „ Sambrook J ja DW Russell. 2001. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring * 1 1 1 Harbor Laboratory, New York, US, 61
Shevchenko. A, M Wilm. O. Vorm. M Mann. 1996. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels. Anal Cham. 68: 850--858.
Shimogaki, H, K Takenchi, T. Nishino, M. Ohderau T. Kudo. K. Ohba. MV iwama ja M ifie. 1991. Purification and properties of a novel surface active agent and alkaline-5 resistant protease from Bcittus sp. Y. Agric. Biol. Ghent. 55: 2251-2258.
Suarez MB. Vizcaino JA. Lobeli A, ja Monte E. 2007. Characterization of genes encoding novel peptidases in the biocontrol Trichoderma harzianum CEO 2413 using the TriehoEST functional genomics approach. Curr. Genet. M(5): aal-a42.
«» x « v a x x * * *
XXX S X X X
»
XXX
X
«»it X « » » «
« X X ««X X
X X *
XXX
* * X X
««« * «
X X
XX «
X
X X XX X
» X
X
««»XX X X
X
« »4»««
« X
* X *
X X X X
XX»
X X
X XX X
« X XXX X »X X V

Claims (38)

  1. 62
  2. 1. Sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitulla entsyymillä on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja se käsittää sekvenssissä nro 15 määritellyn kypsän Fe_RF6318-entsyymin aminohapposekvenssin tai aminohapposekvenssin, joka on ainakin 86-prosenttisesti identtinen sekvenssissä 15 määritellyn kypsän Fe_RF6318-entsyymin aminohapposekvenssin kanssa.
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on saatavissa lajista Fusarium equiseti, edullisemmin talletetusta kannasta CBS 119568.
  4. 3. Patenttivaatimusten 1 tai 2 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitulla entsyymillä on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja se käsittää sekvenssin nro 15 mukaisen aminohapposekvenssin.
  5. 4. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitun entsyymin kypsän muodon molekyylimassa on 20-35 kDa, edullisesti 25-33 kDa, edullisemmin 28-30 kDa, edullisimmin 29 kDa.
  6. 5. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-4 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitun entsyymin optimilämpötila pH:ssa 9 käyttäen 15 min reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina on 30-70 °C, edullisesti 40-60 °C ja edullisemmin 50-60 °C, edullisimmin 60 °C.
  7. 6. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasi, tunnettu siitä, että mainitun entsyymin pH-optimi 50 °C:ssa käyttäen 15 min reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina on pH-alueella, joka on vähintään pH 6-11, edullisesti pH-alueella, joka on välillä pH 6-10, ja edullisemmin välillä pH 9-10, edullisimmin pH:ssa 10. 63
  8. 7. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-6 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi kykenee hajottamaan tai poistamaan proteiinitahroja pesuaineen läsnäollessa lämpötilassa, joka on 10-60°C, edullisesti 50 °C tai alle.
  9. 8. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-7 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittua entsyymiä koodaa eristetty polynukleotidisekvenssi, joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa polynukleotidisekvenssiin, joka sisältyy plasmidiin pALK2521, joka käsittää sekvenssin nro 9 nukleotidisekvenssin ja joka on talletettu Escherichia colissa RF 7664 talletusnumerolla DSM 22171.
  10. 9. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1—8 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittua entsyymiä koodaa eristetty polynukleotidisekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, joka käsittää sekvenssissä nro 15 määritellyn kypsän Fe_RF6318-entsyymin aminohapposekvenssin tai aminohapposekvenssin, joka on ainakin 86-prosenttisesti identtinen sekvenssissä 15 määritellyn kypsän Fe_RF6318:n aminohapposekvenssin kanssa.
  11. 10. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-9 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittua entsyymiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, joka käsittää sekvenssissä nro 15 esitetyn aminohapposekvenssin.
  12. 11. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-10 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittua entsyymiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 14 esitetyn nukleotidisekvenssin.
  13. 12. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-11 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittua entsyymiä koodaava 64 polynukleotidisekvenssi sisältyy plasmidiin pALK2529, joka on talletettu Escherichia colissa RF7800 talletusnumerolla DSM 22172.
  14. 13. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-12 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi valmistetaan rekombinanttisesta ekspressiovektorista, joka käsittää nukleiinihappomolekyylin, joka koodaa minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-12 mukaista keksinnön sieniperäistä seriiniproteaasia, toiminnallisesti liitettynä säätelysekvensseihin, jotka kykenevät ohjaamaan seriiniproteaasientsyymiä koodaavan geenin ilmentymistä soveltuvassa isännässä.
  15. 14. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-13 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi tuotetaan heterologisessa isännässä.
  16. 15. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-14 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi tuotetaan mikrobi- isännässä.
  17. 16. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-15 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi tuotetaan isännässä, joka kuuluu johonkin suvuista Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium ja Mortiriella. Π. Patenttivaatimuksen 16 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi tuotetaan suvussa Trichoderma tai Aspergillus.
  18. 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi tuotetaan lajissa T. reesei. 65
  19. 19. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat: (a) nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja joka käsittää sekvenssissä nro 15 esitetyn aminohapposekvenssin; (b) nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja joka on ainakin 86-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 15 aminohapposekvenssin kanssa; (c) nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 10 kuvatun nukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin; (d) nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää DSM 22171:n tai DSM 22172:n sisältämän polynukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin; (e) nukleiinihappomolekyyli, jonka koodaava sekvenssi eroaa minkä tahansa kohdista (c)—(d) nukleiinihappomolekyylin koodaavasta sekvenssistä geneettisen koodin degeneraation vuoksi; ja (f) nukleiinihappomolekyyli, joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa DSM 22171 :n sisältämään nukleiinihappomolekyyliin ja joka koodaa polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja aminohapposekvenssi, joka on ainakin 86-prosenttisesti identtinen sekvenssissä nro 15 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa.
  20. 20. Rekombinanttinen ekspressiovektori, joka käsittää patenttivaatimuksen 19 mukaisen nukleotidisekvenssin, joka on toiminnallisesti liitetty säätelysekvensseihin, jotka kykenevät ohjaamaan mainittua seriiniproteaasientsyymiä koodaavan geenin ilmentymistä soveltuvassa isännässä.
  21. 21. Isäntäsolu, joka käsittää patenttivaatimuksen 20 mukaisen rekombinanttisen ilmentämisvektorin.
  22. 22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on mikrobi-isäntä. 66
  23. 23. Patenttivaatimuksen 21 tai 22 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on rihmasieni.
  24. 24. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 21-23 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että isäntä kuuluu johonkin suvuista Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium ja Mortiriella.
  25. 25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on Trichoderma tai Aspergillus.
  26. 26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on T. reesei.
  27. 27. Valmistusmenetelmä polypeptidille, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet minkä tahansa patenttivaatimuksista 21-26 mukaisen keksinnön isäntäsolun viljelemiseksi ja polypeptidin talteen ottamiseksi.
  28. 28. Patenttivaatimuksen 19 mukaisen nukleiinihapposekvenssin koodaama polypeptidi, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja joka on saatavissa patenttivaatimuksen 27 mukaisella menetelmällä.
  29. 29. Menetelmä entsyymivalmisteen aikaansaamiseksi, menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa viljellään minkä tahansa patenttivaatimuksista 21-26 mukaista isäntäsolua ja joko otetaan polypeptidi talteen soluista tai erotetaan solut elatusaineesta ja kerätään supematantti.
  30. 30. Entsyymivalmiste, joka on saatavissa patenttivaatimuksen 29 mukaisella menetelmällä. 67
  31. 31. Entsyymivalmiste, joka käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-18 mukaista seriiniproteaasientsyymiä.
  32. 32. Patenttivaatimuksen 30 tai 31 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että mainittu valmiste käsittää muita entsyymejä, jotka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät proteaasi, amylaasi, sellulaasi, lipaasi, ksylanaasi, mannanaasi, kutinaasi, pektinaasi tai oksidaasi, mediaattorin kanssa tai ilman.
  33. 33. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 30-32 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että mainittu valmiste käsittää soveltuvan lisäaineen, joka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät stabilointiaineet, puskurointiaineet, pinta-aktiiviset aineet, vedenpehmentäjät, valkaisuaineet, mediaattorit, korroosionestoaineet, uudelleen tarttumista estävät aineet, syövyttävät aineet, hankausaineet, optiset kirkasteet, väriaineet, pigmentit ja säilöntäaineet.
  34. 34. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 30-33 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että mainittu entsyymivalmiste on nesteen, jauheen tai rakeiden muodossa.
  35. 35. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-18 mukaisen seriiniproteaasientsyymin tai minkä tahansa patenttivaatimuksista 30-34 mukaisen entsyymivalmisteen käyttö pesuaineissa, kuitujen käsittelyssä, villan käsittelyssä, hiusten käsittelyssä, nahan käsittelyssä, elintarvikkeiden tai rehun käsittelyssä tai missä tahansa sovelluksissa, joihin liittyy proteiinimateriaalin muuntelu, hajotus tai poistaminen.
  36. 36. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-18 mukaisen seriiniproteaasientsyymin tai minkä tahansa patenttivaatimuksista 30-34 mukaisen entsyymivalmisteen käyttö pesuaineen lisäaineena.
  37. 37. Patenttivaatimuksen 36 mukainen käyttö nestemäisissä pesuaineissa.
  38. 38. Patenttivaatimuksen 36 mukainen käyttö jauhemaisissa pesuaineissa. 68
FI20095497A 2009-04-30 2009-04-30 Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö FI121712B (fi)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20095497A FI121712B (fi) 2009-04-30 2009-04-30 Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
US12/799,639 US8603795B2 (en) 2009-04-30 2010-04-28 Fungal protease and use thereof
EP10717135A EP2424992B1 (en) 2009-04-30 2010-04-30 A novel fungal protease and use thereof
MX2011011528A MX2011011528A (es) 2009-04-30 2010-04-30 Proteasa fungica novedosa y uso de la misma.
KR1020117028611A KR101739770B1 (ko) 2009-04-30 2010-04-30 신규 진균 프로테아제 및 이의 용도
BRPI1014959-7A BRPI1014959B1 (pt) 2009-04-30 2010-04-30 preparação de enzima, seu uso, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira, processo para produzir um polipeptídeo tendo atividade de protease de serina, processo para obter uma preparação de enzima compreendendo um polipeptídeo tendo atividade de protease de serina e uso da enzima
PCT/EP2010/055893 WO2010125174A1 (en) 2009-04-30 2010-04-30 A novel fungal protease and use thereof
DK10717135.7T DK2424992T3 (da) 2009-04-30 2010-04-30 Ny svampeprotease og anvendelse deraf
CN201080030241.0A CN102625843B (zh) 2009-04-30 2010-04-30 一种新型真菌蛋白酶及其用途
RU2011145540/10A RU2566549C2 (ru) 2009-04-30 2010-04-30 Новая протеаза грибов и ее применение
JP2012507777A JP5698217B2 (ja) 2009-04-30 2010-04-30 新規真菌プロテアーゼおよびその使用
MYPI2011004819 MY152952A (en) 2009-04-30 2010-04-30 A novel fungal protease and use thereof
ES10717135T ES2409890T3 (es) 2009-04-30 2010-04-30 Nueva proteasa fúngica y utilización de la misma
US14/066,110 US8937170B2 (en) 2009-04-30 2013-10-29 Nucleic acids encoding fungal protease

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20095497 2009-04-30
FI20095497A FI121712B (fi) 2009-04-30 2009-04-30 Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20095497A0 FI20095497A0 (fi) 2009-04-30
FI20095497A FI20095497A (fi) 2010-10-31
FI121712B true FI121712B (fi) 2011-03-15

Family

ID=40590374

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20095497A FI121712B (fi) 2009-04-30 2009-04-30 Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö

Country Status (13)

Country Link
US (2) US8603795B2 (fi)
EP (1) EP2424992B1 (fi)
JP (1) JP5698217B2 (fi)
KR (1) KR101739770B1 (fi)
CN (1) CN102625843B (fi)
BR (1) BRPI1014959B1 (fi)
DK (1) DK2424992T3 (fi)
ES (1) ES2409890T3 (fi)
FI (1) FI121712B (fi)
MX (1) MX2011011528A (fi)
MY (1) MY152952A (fi)
RU (1) RU2566549C2 (fi)
WO (1) WO2010125174A1 (fi)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI121712B (fi) 2009-04-30 2011-03-15 Ab Enzymes Oy Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
FI121711B (fi) * 2009-04-30 2011-03-15 Ab Enzymes Oy Sieniperäinen seriiniproteaasi ja sen käyttö
FI121851B (fi) * 2009-07-08 2011-05-13 Ab Enzymes Oy Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
US20120108488A1 (en) * 2010-10-29 2012-05-03 Neil Joseph Lant Cleaning And/Or Treatment Compositions
FI123942B (fi) 2010-10-29 2013-12-31 Ab Enzymes Oy Sieniperäisen seriiniproteaasin variantteja
FI123425B (fi) 2011-03-31 2013-04-30 Ab Enzymes Oy Proteaasientsyymi ja sen käytöt
MD4186C1 (ro) * 2012-02-20 2013-06-30 Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы Tulpină de fungi Fusarium gibbosum - producătoare de proteaze acide şi neutre, xilanaze şi b-glucozidaze
MD4285C1 (ro) * 2013-02-28 2014-12-31 Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы Tulpină de fungi Trichoderma koningii Oudemans - producătoare de proteaze acide, neutre şi alcaline
CN103556475B (zh) * 2013-10-23 2015-06-17 浙江省纺织测试研究院 一种废旧纺织品中的蛋白质纤维酶处理回收法
CN104195058B (zh) * 2014-05-22 2017-01-25 广东省生物资源应用研究所 一种能提高蛹虫草感染寄主昆虫能力的蛹虫草工程菌
CN104130994B (zh) * 2014-06-30 2017-01-04 浙江工业大学 来自冬虫夏草的丝氨酸蛋白酶、编码基因及其应用
RU2771261C2 (ru) * 2016-12-21 2022-04-29 ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС Способы применения термостабильных сериновых протеаз
EP3636735B1 (en) 2018-10-12 2024-03-27 AB Enzymes Oy Protease enzyme variants and uses thereof

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3652399A (en) 1969-04-30 1972-03-28 Takeda Chemical Industries Ltd Alkali protease
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
DK563986A (da) 1986-11-25 1988-06-17 Novo Industri As Fremstilling af en lav-temperatur-aktiv protease
DK564086A (da) 1986-11-25 1988-06-17 Novo Industri As Enzymatisk detergent-additiv
JP2731407B2 (ja) 1987-04-03 1998-03-25 アムジエン・インコーポレーテツド 新規なプロテアーゼ酵素
DK571587D0 (da) 1987-11-02 1987-11-02 Novo Industri As Enzymatisk detergentsammensaetning
ATE129523T1 (de) 1988-01-07 1995-11-15 Novo Nordisk As Spezifische protease.
US5288627A (en) 1988-01-07 1994-02-22 Novo Nordisk A/S Endoprotease from Fusarium oxysporumDSM 2672 for use in detergents
JPH0241398A (ja) 1988-07-20 1990-02-09 Novo Ind As 安定化酵素液体洗剤組成物
DK316989D0 (da) 1989-06-26 1989-06-26 Novo Nordisk As Enzymer
DK204290D0 (da) 1990-08-24 1990-08-24 Novo Nordisk As Enzymatisk detergentkomposition og fremgangsmaade til enzymstabilisering
DK223790D0 (da) 1990-09-18 1990-09-18 Novo Nordisk As Proteaseholdig detergentkomposition
DK73791D0 (da) 1991-04-22 1991-04-22 Novo Nordisk As Detergentadditiv
CA2069147A1 (en) 1991-05-22 1992-11-23 Kazuaki Kitano Dna and its use
US5962765A (en) 1991-08-08 1999-10-05 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Molecular cloning of a complimentary DNA sequence encoding a cuticle degrading protease produced by entomopathogenic fungi
DK52393D0 (fi) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
US5674728A (en) * 1993-11-03 1997-10-07 Novartis Corporation Aspergillus niger vacuolar aspartyl protease
ES2153037T3 (es) 1994-06-03 2001-02-16 Novo Nordisk Biotech Inc Lacasas purificadas de scytalidium y acidos nucleicos que las codifican.
US5770418A (en) 1994-06-24 1998-06-23 Novo Nordisk A/S Purified polyporus laccases and nucleic acids encoding same
IL116275A0 (en) 1994-12-08 1996-03-31 Invest Y De Estudios Avanzados Methods for obtaining strains of trichoderma spp. and strains obtained thereby
US6682924B1 (en) 1995-05-05 2004-01-27 Novozymes A/S Protease variants and compositions
AU695776B2 (en) 1995-07-12 1998-08-20 Novozymes A/S Cleaning-in-place with a solution containing a protease and a lipase
US6008029A (en) 1995-08-25 1999-12-28 Novo Nordisk Biotech Inc. Purified coprinus laccases and nucleic acids encoding the same
DK0882123T3 (da) 1996-01-29 2005-01-31 Novozymes As Fremgangsmåde til fjernelse eller blegning af tilsmudsning eller pletter fra cellulose-stof
US6300116B1 (en) 1996-11-04 2001-10-09 Novozymes A/S Modified protease having improved autoproteolytic stability
AU8798198A (en) 1997-08-29 1999-03-22 Novo Nordisk A/S Protease variants and compositions
AU771539C (en) 1998-10-06 2005-01-13 Dyadic International (Usa), Inc. Transformation system in the field of filamentous fungal hosts
DE60139999D1 (de) 2000-07-22 2009-11-05 Genencor Int Enzymstabilisierung
ES2171136B1 (es) 2000-12-01 2003-10-16 Newbiotechnic Sa Enzima con actividad proteolitica construccion de adn que comprende una secuencia de adn que codifica dicha enzima y sus aplicaciones.
FR2852949B1 (fr) 2003-03-28 2008-08-29 Biovitis Procede de reduction de la matiere organique contenue dans des effluents agroalimentaires et industriels comportant une phase de biodigestion par des champignons filamenteux
CN1187443C (zh) * 2003-05-21 2005-02-02 云南大学 真菌碱性丝氨酸蛋白酶及其制备方法和应用
JP5087407B2 (ja) 2004-12-30 2012-12-05 ジェネンコー・インターナショナル・インク 酸性真菌プロテアーゼ
CN101146908B (zh) 2005-03-22 2012-06-13 素出药株式会社 新型蛋白酶、生产该蛋白酶的微生物及其利用
WO2007145963A2 (en) 2006-06-05 2007-12-21 The Procter & Gamble Company Enzyme stabilization
TWI369402B (en) 2006-07-05 2012-08-01 Catalyst Biosciences Inc Protease screening methods and proteases identified thereby
CN101646760B (zh) 2007-03-27 2014-11-26 诺维信公司 稳定的酶溶液和制造方法
MX2010007811A (es) 2008-01-29 2011-06-16 Danisco Inc Expresion de proteinas inhibidoras de subtilisina de streptomyces (ssi) en bacillus y streptomyces sp.
ES2538790T3 (es) 2008-09-30 2015-06-24 Novozymes Inc. Métodos para la producción de polipéptidos en mutantes de Fusarium venenatum deficientes en enzimas
FI121711B (fi) 2009-04-30 2011-03-15 Ab Enzymes Oy Sieniperäinen seriiniproteaasi ja sen käyttö
FI121712B (fi) 2009-04-30 2011-03-15 Ab Enzymes Oy Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
FI121851B (fi) 2009-07-08 2011-05-13 Ab Enzymes Oy Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
FI123942B (fi) 2010-10-29 2013-12-31 Ab Enzymes Oy Sieniperäisen seriiniproteaasin variantteja
IT1404171B1 (it) 2011-02-10 2013-11-15 Paladin Pharma S P A Composizione per l'uso nel trattamento dei problemi/disturbi della menopausa e nel trattamento dell'invecchiamento generale dell'organismo

Also Published As

Publication number Publication date
CN102625843B (zh) 2014-09-17
ES2409890T3 (es) 2013-06-28
KR20120096872A (ko) 2012-08-31
EP2424992A1 (en) 2012-03-07
US20110003729A1 (en) 2011-01-06
JP2012525130A (ja) 2012-10-22
DK2424992T3 (da) 2013-06-10
MY152952A (en) 2014-12-15
US20130065810A2 (en) 2013-03-14
BRPI1014959A2 (pt) 2015-09-01
FI20095497A (fi) 2010-10-31
MX2011011528A (es) 2012-05-29
KR101739770B1 (ko) 2017-05-25
US8937170B2 (en) 2015-01-20
FI20095497A0 (fi) 2009-04-30
CN102625843A (zh) 2012-08-01
EP2424992B1 (en) 2013-03-13
JP5698217B2 (ja) 2015-04-08
WO2010125174A1 (en) 2010-11-04
RU2566549C2 (ru) 2015-10-27
US20140134706A1 (en) 2014-05-15
US8603795B2 (en) 2013-12-10
RU2011145540A (ru) 2013-06-10
BRPI1014959B1 (pt) 2020-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI121712B (fi) Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
FI121851B (fi) Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
EP2424993B1 (en) A fungal serine protease and use thereof
US10221377B2 (en) Protease enzyme and uses thereof
EP2633041B1 (en) Variants of fungal serine protease
CN113166747A (zh) 蛋白酶变体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 121712

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed