PT100796B

PT100796B - Processo para a preparacao fermentativa de cefalosporina c com acremonium chrysogenum

Info

Publication number: PT100796B
Application number: PT100796A
Authority: PT
Inventors: Thomas Bayer; Schramm Dr Wilhelm; Rathscheck Dr Wolfgang
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1991-08-21
Filing date: 1992-08-20
Publication date: 1999-07-30
Also published as: FI103988B1; AU2402492A; HUT69767A; ATE130038T1; JPH07501207A; RU2094463C1; ZA926271B; CN1071953A; SK279794B6; NO940565D0; DE4127648C1; FI103988B; CZ281698B6; AU663519B2; WO1993004188A1; EP0599891A1; HU213570B; HU9400463D0; FI940778A; EP0599891B1

Description

DESCRIÇÃO tratamento final de caldos de cultura contendo antibióticos ocorre em geral apôs a fase em que se atinge o teor máximo. Na maior parte dos casos o primeiro passo consiste numa separação de células e corpos sólidos por filtração ou centrifugação. Depois, pode seguir-se um enriquecimento no composto desejado por extracção e aãsorpção. 0 produto purificado é normal_ mente recristolizaão e pode ser transformado em antibióticos semi-sintêticos.

Este método passo a passo é desvantajoso devido ã instabilidade ãe muitas moléculas de antibióticos, como por exemplo a cefalosporina C (CPC) Logo na fase de fermentação ocorre uma degradação da CPC. Esta pode ocorrer tanto por via puramente química, por ataque da água ao anel ãe 0-lactama, como por via enzimática, por exemplo por esterases ( konechy et al,, 1973, J. of Ãntib. 26, 3, 135-141 ). Além disso, formam-se durante a fermentação uma série ãe produtos secundários, como a ãesacetoxicefálosforina C (DOCPC) e a ãesacetilcefalosforina C (DCPC), que têm de ser removidos na purificação da CPC. Este processo leva a perdas ãe rendimento consideráveis.

Os sistemas de filtração em fluxo cruzado (^,f cross-flom ) com membranas ãe polímero ou da cerâmica têm já sião utilizados no tratamento final ãe calãos ãe cultura ãe antibióticos Charris et al., I. Chem. Techn. Biotechnol., 1988, 42, 19-30). Não tinha até agora sião demonstrado que com estes processos se consegue diminuir a degradação da cefalosforina C.

objectivo da presente invenção é um processo segundo o qual • se consiga diminuir a degradação da cefalosporina C e a formação de produtos

secundários, de modo a aumentar o rendimento era relação ã quantidade de subs trato utilizada.

Descobriu-se então surpreendentemente que através da utilização de um módulo de filtração em fluxo cruzado, durante a fermentação de Acremonium Chrysogenum, o rendimento em CPG aumenta, a formação de DCPC ãimi nui e o tempo de produção é mais prolongado. Além disso, devido à filtração e ã menor formação de DCPG, o acabamento final da cefalosporina G torna-se efectivamente mais fácil.

á invenção refere-se por isso a um processo para a preparação de CPG, caracterizado por se filtrar a solução de fermentação, durante a fer mentação, através de um sistema de filtração em fluxo cruzado ( cross-flou) e se poder restituir ao fermentaãor a quantidade filtrada.

Acremonium Chrysogenum (Cephalosporium acremonium), bem como os seus mutantes e selectantes, desde que produzam derivados ã.e CPC, são aãe. quados para a utilização no processo de acordo com a invenção.

A solução nutriente contém fontes de carbono como sacarose, amido de milho, dextrose ou melaço e fontes ãe azoto como farinha de soja, farinha de amendoim, extracto de malte ou acetato de amónio. 0 meio nutriente contêm ainda sais inorgânicos como hidrogenofosfato ãe sódio, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, sulfato ãe cálcio, carbonato de cálcio, sulfato ãe magnésio ou hidrogenofosfato ãe potássio. Podem ainda adicionar-se ao meio nutriente gorduras como oleato ãe metilo ou óleo d.e soja. Além disso, adicionam-se ainda oligoelementos como ferro, manganês, cobre, zinco, cobalto ou outros metais, na forma dos respectivos sais.

A cultura ãe Acremonium Chrysogenum (cephalosporium acremonium, ãe preferência a estripe DSM 6475, efectua-se a temperaturas entre 20 c e 50 c, de preferência a 25 c e a um valor de ph entre 5 e 8, ãe preferência a ph?. A cultura decorre primeiro em ambiente aeróbico em balões com agitação e depois no fermentaãor sob agitação e arejamento com ar ou oxigénio puro. A cultura dos microorganismos nos ferrnentadores efectua-se durante um tempo ãe 120 a 240 horas, ãe preferência ãe 150 a 170 horas.

Como sistemas ãe filtração cross-floit podem utilizar-se mõãu los ãe placas, tubos, capilares, rolos ou membranas de fibra porosa, de poli. . meros, carbono ou cerâmica, com limites ãe separação desde a ultrafiltração * até à filtração estéril. Utilizam-se ãe preferência módulos ãe filtração com

um tamanho ãe poros ãe 0,2 pm ou 4nm. Como materiais d.e membrana poãem utilizar-se polissulfona, poliamiãa, acetato ãe celulose, ôxid.o de alumínio ou ôxi_ do ãe zircónio. A filtração pode efectuar-se ãe forma continua, ou descontínua, 'fila inicia-se cerca de 2-3 dias apôs a inoculação do fermentador e pode conti. nuar-se até ao fim da fermentação. A velocidade do fluxo da solução ãe fermen tação através da superfície ãe filtração é de 0,5 a 20 m/s, ãe preferência ãe 1 a 10 m/s.

filtraãor, que durante a fermentação ê retirado ao fermentaãor, pode ser substituído por uma quantidade equivalente ãe líquido ou, após separação ão produto pretendido, p. ex. por absorção, pode restituir-se o filtrado ao fermentador. Para estes fins pode bombear-se água, enriquecida com sais adequados ou outros constituintes do meio nutriente.

volume ds líquido não permeado através da. membrana volta nova iiente para o fermentador.

fermentador e o sistema ãe filtração em fluxo cruzado encontram-se ligados por meio ãe tubos ou mangueiras apropriados e são esterilizados antes da fermentação. Para um fermentador de 100 l é necessária uma super fície fãe filtração de cerca de 0,2 m². Poãem contudo ainãa utilizar-se super fícies ãe filtração maiores ou menores.

Exemplo 1:

Fermentação de Acremonium chrysogenum OSU 6473

Ã fermentação efectuou-se na seguinte solução nutriente:

MEIO DE PRE-CULIURÃg/l

Farinha ãe milho11,75

Acetato ãe amónio4,5

Sacarose20,0

CaSO₄.2H₂00,5

UgSO₄. 7H₂O0,5 pH 7,0(ajustaão com NaOH a 15% em peso)

MEIO DE PERMEEIAÇAOg/l

Farinha ãe amendoim isenta ãe gordura.100,0

Acetato ãe amónio6,0

Mono-hiârato de glucose5,0

Oleato ãe metilo§

D,L-Metionina	3,0
CaSÕ₄.2H₂0	5,0
MgSO_â. JU-gO	5,0
CaCO_s	5,0
Agente anti-espuma	0,5

SOLUÇÃO DE ALIMENTAÇÃO (ⁿfed-batch”) Mono-hidrato ãe glucose

D,L-Metionina

500,0

24,75

Utilizam-se culturas era ogar para a inoculação ãe 100 ml ãe meio ãe pré-cultura (balões ãe 500 ml cora agitação e 4 tubuladuras). Incubam-se os balões durante 48 horas a 150 rotações por minuto ( rpm ) a 25-28 c. Utilizam-se estas culturas para a inoculação ãe uma nova pré-cultura (1000 ml ãe meio, balões ãe 5000 ml, 25-28 c, 120 rpm, 58-60 horas). Com a segunda pré-cultura inoculara-se 60 l ãe meio ãe fermentação num fermentaãor cora agitação. 4 fermentação efectua-se a 25 c. Controla-se o arejamento ãe modo a que a pO% na solução nutriente ãe fermentação seja superior a 20%.

Após 74 horas ãe fermentação inicia-se a filtração com um módulo ãe cerâmica em fluxo cruzado (Firma Membraflom, c£-Al%0%) com 0,2 m ãe superfície de filtro e 0,2 jim ãe tamanho de poro. Mantiveram-se os seguintes parâmetros ão processo:

velocidade ãe fluxo: velocidade de bombagem capacidade ãe filtração:

m/s

1500 l/h l/h tempo de filtração:

horas

A tabela seguinte mostra os resultados da experiência apôs 124 horas ãe uma fermentação sem (A) e com (B) filtração em fluxo cruzado:

	CPC na	DCPC/CPC t %3	PRODUTIVIDADE	PRODUTIVIDADE DCPC apôs 6 dias
mãx. [%3	apôs Jj dias ío
A	100	100	100	100	100
B	140	44	200	400	53

Exemplo 2:

A fermentaçao efectua-se como no exemplo 1. Ã tabela 2 mostra os resultados após 18? horas ãe uma fermentação com filtração em fluxo cruzado (B) em compa ração com uma fermentação paralela sem filtração, interrompida apôs 142 horas (A): ·

	CPC (%)	DCPC/CPC (%)
.4 (142 horas)	100	100
B (167 horas)	129	69

REIVINDICAÇÕES

Claims

REIVINDICAÇÕES
2«

Processo para a preparação fermentativa ãe cefalosporina C, caracterizaão por se filtrar a solução de fermentação durante a fermentação através ãe um sistema ãe filtração era fluxo cruzado (^,f cross-flom ¹¹) e se poãer repor a quantidade filtrada no fermentaãor.

2Q

Processo ãe acordo cora a reivindicação 1, caracterizado por se empregar Ãcremonium chrysogenum.

Processo ãe acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se utilizar corno sistema de filtração em fluxo cruzado um filtro ãe polímero ou de cerâmica.

4%

Processo ãe acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a S, caracterizaão por o filtro ter um tamanho de poros entre 4 e 200 nm.

- 5 5Q

Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 4, caracterizaão por a velocidade de passagem através da superfície do filtro ser ãe 1 a 10 m/s.

6%

Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 5, caracterizaão por se substituir a solução filtrada por água no fermentaãor.

Processo ãe acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a solução filtrada se substituir por uma solução nutriente.

8Q

Processo de acordo cora a reivindicação 6, caracterizado por se repor a solução filtrada no fermentaãor, apôs remoção do produto que se pretende recuperar.

Ã requerente reivindica a prioridade do peãid.o alemão apresentado em 31 de Agosto de 1991, sob o número P41 37 648.5.