JPH06100593A - 自然産生ｇ−ｃｓｆの誘導体及びその製造方法、及び、自然産生ｇ−ｃｓｆ誘導体のアミノ酸配列をエンコードするｄｎａ塩基配列 - Google Patents

自然産生ｇ−ｃｓｆの誘導体及びその製造方法、及び、自然産生ｇ−ｃｓｆ誘導体のアミノ酸配列をエンコードするｄｎａ塩基配列

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JPH06100593A
JPH06100593A JP3228192A JP22819291A JPH06100593A JP H06100593 A JPH06100593 A JP H06100593A JP 3228192 A JP3228192 A JP 3228192A JP 22819291 A JP22819291 A JP 22819291A JP H06100593 A JPH06100593 A JP H06100593A
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Heather Carr
カー，ヒーター
David Timms
テイムス，デービツド
Anthony J Wilkinson
ウイルキンソン，アントニー・ジエームス
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】安定性を有するコロニー刺激因子の製造。 【構成】自然産生Ｇ−ＣＳＦの生物学的活性の少なくと
も１つと５ｍｇ／ｍｌにおいて少なくとも３５％の溶液
安定度とを有する自然産生Ｇ−ＣＳＦの誘導体であっ
て、自然配列の少なくともＣｙｓ17がＳｅｒ17残基によ
って置換されており、また自然配列のＡｓｐ27がＳｅｒ
27残基によって置換されていることを特徴とする自然産
生Ｇ−ＣＳＦの誘導体。本発明のＧ−ＣＳＦ誘導体のア
ミノ酸配列の一部又は全部をエンコードするヌクレオチ
ド配列を、自律的に複製するプラスミド又はウイルスバ
クターに挿入することにより、バクテリア、酵母又は植
物細胞のごとき適当な原核又は真核宿主細胞をトランス
フォーム又はトランスフェクトすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は良好な溶液安定性を有す
る顆粒球（顆粒白血球）コロニー刺激因子(granulocyte
colony stimulating factor) （Ｇ−ＣＳＦ）の誘導
体、その製造法及びこれを含有する医薬組成物に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】コロニー刺激因子(colony stimulating
factor) は、顆粒球のごとき特定の種類の血液細胞型の
増殖と機能を刺激するタンパク質ホルモンの１種であ
る。顆粒球は微生物の侵入物(microbial invaders)と細
胞破壊物片(cell debris) を飲み込み(engulf)かつ貧食
し(devour)、かくして、感染に応答して生体因子(vital
factor) の役割を果す。この作用に関係して、顆粒球は
偽足(pseudopod) を伸長させ、層状内皮細胞(lining en
dotherial cell) の間の血管系(vascular tree)から脱
出する(slip out)ことができる。ついで中好性顆粒球(n
eutrophilic granulocyte)は微生物と直接、接触しそし
て独特な酵素系例えば超酸化物(superoxide)アニオンを
生成する酵素系を使用して微生物を破壊することができ
る。顆粒球は循環系内で極めて短い寿命期間(life spa
n) （約６〜１２時間）しか有しておらずかつその機能
を果す間に破壊されるので、骨髄の幹細胞は毎日、赤血
球と同様の多数の顆粒球を生成することが必要である。
更に、感染防止についての要求を満足させるためには、
この顆粒球の生成速度を極端に増大させることが必要で
ある。顆粒球の交替(turnover)が急速であることの結果
として、骨髄が例えば癌の化学療法、放射線、ＡＩＤＳ
又は血液病(haemotological disorder) によって損傷さ
れた場合には顆粒球数が急速に低下し、患者は著しく微
生物に感染され易い状態になる。実際に、敗血症は、放
射線療法、化学療法又は新生細胞性の疾患(neoplastic
disease)により骨髄の機能が抑圧されている癌患が死亡
する場合の一般的な原因である。
【０００３】顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は
Wallet K等による文献“Natl. Acad. Sci. U.S.A. ”、
第８２巻、第１５２６〜１５３０頁に記載されており、
また、欧州特許公開第１６９，５６５号公報及びＰＣＴ
特許公開第ＷＯ８７／０１１３２号公報に記載されてい
る。Ｇ−ＣＳＦは生体内で顆粒球の生成を刺激しかつ最
少量の副作用しか伴わずに作用することが知られてい
る。その結果、ヒトＧ−ＣＳＦは化学療法、放射線治
療、放射線事故又は自己骨髄移植に伴う好中球減少症
（白血球減少症）の管理において潜在的な利用性を有す
ることが知られている。更に、Ｇ−ＣＳＦはＡＩＤＳに
伴う骨髄抑制(bone marrow suppression) の刺激及び顆
粒球機能異常(granulocyte functional abnormalite)を
特徴とする脊髄異形成症候群(myelodysplastic syndrom
es) の処理において及び甚だしい感染の処置における補
助薬としての利用性を有し得る。
【０００４】上記したものの他に、Ｇ−ＣＳＦのある種
の同族体がＰＣＴ特許公開第ＷＯ８７／０１１３２号公
報、欧州特許公開第２４３，１５３号公報、欧州特許公
開第２５６，８４３号公報、欧州特許公開第２７２，７
０３号公報及びKuga等、“Biochemical and Biophysica
l Communication ”(1989)、第１５９巻、第１号、第１
０３〜１１１頁に記載されている。更に、Ｇ−ＣＳＦ及
び〔Ｓｅｒ17〕Ｇ−ＣＳＦの修飾(modification)が位置
１７のシステイン及びセリン残基を置換することにより
行われているが、かかる変化により所望の効果を得るこ
とは成功していない（“Protein Engineering ”，第３
巻、第４号、第３６０頁(1990)参照）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記したＧ−ＣＳＦ及
びその同族体はその溶液が不安定であり、放置した場
合、これらが溶液から沈澱する傾向があり、その結果、
溶液の保存寿命が短かくかつ高い濃度で貯蔵する場合に
問題が生ずるという欠点を有する。更に、Ｇ−ＣＳＦと
ある種のその同族体は貯蔵中に共有結合凝集(covalent
aggregation)を生ずる傾向を有する。
【０００６】本発明は自然に産生する（天然に存在す
る）Ｇ−ＣＳＦ、例えば自然に産生するヒトＧ−ＣＳＦ
のアミノ酸配列の一部又は全部を有するかつその生物学
的性質の少なくとも一つを有するＧ−ＣＳＦ又はその誘
導体に対して行うことによって溶液の安定性を改善する
ことのできる修飾法(modification)を発見したことに基
づくものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】従って、本発明の一つの
要旨によれば、自然産生(naturally occuring)Ｇ−ＣＳ
Ｆの生物学的活性の少なくとも１つと５ｍｇ／ｍｌにお
いて少なくとも３５％の溶液安定度（後に定義されてい
る）とを有する自然産生Ｇ−ＣＳＦの誘導体であって、
自然配列の少なくともＣｙｓ17がＳｅｒ17残基によって
置換されておりまた自然配列のＡｓｐ27がＳｅｒ27残基
によって置換されていることを特徴とする自然産生Ｇ−
ＣＳＦの誘導体が提供される。
【０００８】本発明のＧ−ＣＳＦ誘導体は、下記のもの
から選ばれた追加の修飾の少なくとも１つを有すること
が好都合であり得る： ａ）自然配列(native sequence) のＧｌｕ11の、Ａｒｇ
11残基による置換； ｂ）自然配列のＬｅｕ15の、Ｇｌｕ15残基による置換； ｃ）自然配列のＬｙｓ23の、Ａｒｇ23残基による置換； ｄ）自然配列のＧｌｙ26の、Ａｌａ26残基による置換； ｅ）自然配列のＧｌｙ28の、Ａｌａ28残基による置換； ｆ）自然配列のＡｌａ30の、Ｌｙｓ30又はＡｒｇ30残基
による置換； ｇ）自然配列のＬｙｓ34の、Ａｒｇ34残基による置換； ｈ）自然配列のＬｙｓ40の、Ａｒｇ40残基による置換； ｉ）自然配列のＰｒｏ44の、Ａｌａ44残基による置換； ｊ）自然配列のＬｅｕ49の、Ｌｙｓ49残基による置換； ｋ）自然配列のＧｌｙ51の、Ａｌａ51残基による置換； ｌ）自然配列のＧｌｙ55の、Ａｌａ55残基による置換； ｍ）自然配列のＴｒｐ58の、Ｌｙｓ58残基による置換； ｎ）自然配列のＰｒｏ60の、Ｓｅｒ60残基による置換； ｏ）自然配列のＰｒｏ65の、Ｓｅｒ65残基による置換； ｐ）自然配列のＰｒｏ111 の、Ｇｌｕ111 残基による置
換； ｑ）自然配列のＴｈｒ115 の、Ｓｅｒ115 残基による置
換； ｒ）自然配列のＴｈｒ116 の、Ｓｅｒ116 残基による置
換；及び ｓ）自然配列のＴｙｒ165 の、Ａｒｇ165 残基による置
換。 ｂ）〜ｓ）から選ばれた追加の修飾の少なくとも１つを
存在させることが好ましいが、ｂ），ｄ），ｅ），
ｆ），ｎ）及びｏ）から選ばれた追加の修飾を存在させ
ることが特に好ましく、これらの内、修飾ｏ）が特に好
ましい。
【０００９】追加の修飾は下記のものの少なくとも１種
からなることがより好ましい： ｉ）自然配列のＧｌｎ11，Ｐｒｏ60,65 の、Ａｒｇ11，
Ｓｅｒ60,65 による置換； ii）自然配列のＡｌａ111 ，Ｔｈｒ115,116 の、Ｇｌｕ
11，Ｓｅｒ115,116 による置換； iii）自然配列のＧｌｎ11，Ｔｒｐ58，Ｔｙｒ165 の、
Ａｒｇ11,165，Ｌｙｓ58による置換； iv）自然配列のＬｅｕ15，Ｇｌｙ26,28 ，Ａｌａ30の、
Ｇｌｕ15，Ａｌａ26, 28，Ｌｙｓ30による置換； ｖ）自然配列のＰｒｏ44，Ｌｅｕ49，Ｇｌｙ51,55 ，Ｔ
ｒｐ58の、Ｌｙｓ49, 58，Ａｌａ41,51,55による置換； vi）自然配列のＬｅｕ15，Ｇｌｙ26,28 ，Ａｌａ30の、
Ｇｌｕ15，Ａｌａ26, 28，Ａｒｇ30による置換； vii）自然配列のＰｒｏ65の、Ｓｅｒ65による置換; viii）自然配列のＰｒｏ60,65 の、Ｓｅｒ60,65 による
置換；又は ix）自然配列のＧｌｕ11，Ｐｒｏ65の、Ａｒｇ11，Ｓｅ
ｒ65による置換。
【００１０】従って、所望ならば、上記の修飾を、天然
に産生するＧ−ＣＳＦの生物学的性質の少なくとも一つ
を有する任意のポリペプチド中に導入して、ポリペプチ
ド分子の溶液安定度を改善することができる。例えば、
本発明の修飾は１つ又はそれ以上の残基の同一性又は位
置（例えば置換、末端及び内部付加及び削除）の点で、
天然に産生するＧ−ＣＳＦS について本明細書中で規定
したものとアミノ酸配列の異る、上記ポリペプチドに適
用し得る。例えばかかるポリペプチドは例えば削除（欠
失）(deletion)により前方短縮された(foreshortened)
もの；又は加水分解に対してより安定なもの（及び、従
って、天然に産生するものに比べて、より顕著な又はよ
り長い持続効果を有するもの）；又はＯ−グリコシル化
(Ｏ−glycosylation)のための１個又はそれ以上の潜在
的部位を削除するために（その結果、酵母産生生成物に
対するより高い活性が得られる）変更したもの；１個又
はそれ以上のシステイン残基が削除されているか又は例
えばアラニン又はセリン残基によって置換されておりそ
して微生物系から活性な形でより容易に単離されるも
の；又はフェニルアラニンによって１個又はそれ以上の
トリシン残基が置換されているかつターゲット細胞上の
ヒトＧ−ＣＳＦリセプターに多かれ少なかれ容易に結合
し得るもの；が挙げられる。従って、本発明によって提
案されている修飾（ａ）〜（ｓ）、好ましくは（ｉ）〜
（ix) は、例えば、自然配列のＣｙｓ17がＳｅｒ17によ
って置換されている自然産生Ｇ−ＣＳＦ又は前記文献に
記載されているもののごとき、天然に産生するＧ−ＣＳ
Ｆの生物学的性質の少なくとも１つを有することが知ら
れている、上記自主Ｇ−ＣＳＦの対立遺伝子的(alleli
c)変種及び同族体に適用し得る。
【００１１】本発明のポリペプチドは対応する非修飾ポ
リペプチドに比べて改善された溶液安定度を有ししかも
重要な生物学的活性を保持しておりかつ改善された生物
学的活性を有する場合さえあることが認められた。
【００１２】上記のことから、溶液安定度(solution st
ability)という性質は、溶解度(solubility)という性質
とは別異のものであることが理解されるであろう。溶液
安定度はある物質がｐＨ、温度及びイオン濃度等の物理
的条件下で溶液から沈澱する傾向が少ないという性質で
ある。
【００１３】溶液安定度は１ｍｇ／ｍｌ，５ｍｇ／ｍｌ
及び／又は１０ｍｇ／ｍｌの初期濃度を有する、Ｇ−Ｃ
ＳＦの燐酸緩衝溶液(phosphate buffered saline) 中の
溶液を３７℃で１４日間放置した後に溶液中に溶解して
いるＧ−ＣＳＦの％を測定することにより決定される。
溶液安定度の測定法は後記参考例４に詳細に記載されて
いる。本発明のポリペプチドは初期濃度５ｍｇ／ｍｌの
溶液においては少なくとも３５％の溶液安定度を有する
ことが好都合であり、少なくとも５０％の溶液安定度を
有することが有利であり、少なくとも７５％の溶液安定
度を有することが好ましいであろう。本発明のポリペプ
チドは初期濃度１０ｍｇ／ｍｌの溶液においては少なく
とも７５％、特に、少なくとも８５％の溶液安定度を有
することが好ましいであろう。
【００１４】本明細書中で使用されている“自然産生
（又は天然に産生する）Ｇ−ＣＳＦ”（“naturally oc
curing Ｇ−ＣＳＦ”）と云う用語は、天然に存在する
ことが知られているＧ−ＣＳＦを意味しそしてＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．３０に記載されているアミノ酸配列を有す
る２種のポリペプチドを包含する。これらの２種のポリ
ペプチドは、トリペプチドインサート(tripeptide inse
rt) Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕが一方のポリペプチドにお
いては３５と３６の位置の間に存在するが、他方のポリ
ペプチドにおいては存在しないことおいて相違するに過
ぎない。本明細書中で使用される位置番号系(numbering
system)はＶａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕインサートを含有し
ていない、天然に産生するポリペプチドに基づくもので
あり、従って、本明細書中で使用される“自然”（“na
tive”）という用語はＶａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕインサー
トを含有していないこのポリペプチドを意味する。本発
明は前記したごとき天然に産生する形のＧ−ＣＳＦ及び
その同族体の全てに適用可能であること及び修飾のため
に選択された、天然に産生するＧ−ＣＳＦの形に応じ
て、ポリペプチドの位置番号の修正(revision)が必然的
に必要であることは理解されるであろう。
【００１５】本発明の更に別の要旨によれば、前記した
ごとき天然に産生するＧ−ＣＳＦの誘導体のアミノ酸配
列の全部又は一部をエンコードするＤＮＡ塩基配列が提
供される。かかる塩基配列として、例えば、１）選択さ
れた非哺乳動物宿主による発現対して好ましいコドンの
組込み(incorporation) ；２）制限エンドヌクレアーゼ
による開裂（切断）(cleavage)のための部位の提供；及
び／又は３）容易に発現されるベクターの構成を促進す
る、追加の開始部(initial) 、末端又は中間ＤＮＡ塩基
配列が挙げられる。本発明のＤＮＡ塩基配列としては原
核及び真核宿主細胞における発現を確実にするのに有用
なものが挙げられ、本発明のＤＮＡ塩基配列の誘導体
は、選択された宿主細胞に応じて、グリコシル化された
(glycosylated)形のものであるか又はグリコシル化され
ていない形のものであり得る。本発明の誘導体がグリコ
シル化されていない形で得られる場合、例えば、原核宿
主細胞中で発現させた後に、この誘導体は、所望なら
ば、哺乳動物又は他の真核生物の(eucaryotic)炭水化物
により化学的にグリコシル化し得る。
【００１６】本発明の更に別の要旨によれば、前記した
ごときＤＮＡ塩基配列を含有する組換え体ベクターが提
供される。この組換え体ベクターは例えば生物学的に機
能性の(biologically functional) プラスミド又はウイ
ルスＤＮＡベクターであり得る。
【００１７】本発明の更に別の要旨によれば、前記した
ごときＤＮＡ塩基配列をベクター中に挿入することから
なる、前記組換え体ベクターの製造方法が提供される。
【００１８】本発明の更に別の要旨によれば、前記した
ごとき組換え体ベクターによりトランスフォームされた
(transformed) 又はトランスフェクトされた(transfect
ed)安定な原核又は真核宿主細胞が提供される。
【００１９】本発明の更に別の要旨によれば、原核又は
真核細胞を前記したごとき組換え体ベクターによりトラ
ンスフォームする(tranform)か、又はトランスフェクト
し(transfect) 、それによって、安定にトランスフォー
ム又はトランスフェクトされた原核又は真核宿主を得る
ことからなる、前記したごとき原核又は真核宿主細胞の
製造方法が提供される。
【００２０】本発明の更に別の要旨によれば、本発明の
原核又は真核宿主細胞を培養し(culture) それによって
本発明の、天然に産生するＧ−ＣＳＦの誘導体を得るこ
とからなる、上記Ｇ−ＣＳＦの誘導体の製造方法が提供
される。この方法は、本発明の組換え体ベクター中の、
本発明のＤＮＡ塩基配列を発現させることにより製造さ
れた、上記Ｇ−ＣＳＦの誘導体を単離する工程を更に包
含することが有利であろう。
【００２１】本発明の方法で使用する宿主細胞は大腸菌
(E.coli)のごとき原核細胞であることが好ましいが、サ
ッカロミセス セレビシアエ (Saccharomyces cerevisi
ae)のごとき酵母細胞又はＣＨＯ細胞（チャイニースハ
ムスター卵巣細胞）のごとき哺乳動物細胞であり得る。
【００２２】本発明の更に別の要旨によれば、活性成分
としての、本発明の天然に産生するＧ−ＣＳＦの誘導体
の少なくとも１種と、薬学的に許容される担体又は賦形
剤とからなる医薬組成物が提供される。
【００２３】本発明の更に別の要旨によれば、本発明の
誘導体の有効量を投与することからなる、哺乳動物に対
する造血素療法(haematopoietic therapy)を提供するた
めの方法が提供される。
【００２４】本発明の別の要旨によれば、更に、本発明
の誘導体の有効量を投与することからなる、白血病細胞
(leukaemic cell)の増殖の阻止法が提供される。
【００２５】本発明の誘導体は、前記したごとき追加の
修飾（ｉ），（ii) ，(iii) ，（iv），（ｖ），（v
i），(vii) ，(viii)又は（ｘ）の１つ、好ましくは追
加の修飾（ｉ），（ii），（iv），（vi），(vii) ，(v
iii)又は（ix）の１つ、特に追加の修飾（ii），（i
v），（vi），(vii) ，(viii)又は（ix）を有するよう
に選択することが有利である。良好な溶液安定度を有す
るという点から、特に好ましい本発明の誘導体としては
下記のものが挙げられる： [Arg11,Ser17,27,60,65 ]G-CSF; [Glu15,Ser17, 27,Ala26, 28,Lys30]G-CSF [Arg11,Glu15,Ser17,27,60,65 ,Ala26, 28,Lys30]G-CSF [Arg11, 23,Ser17,27,60,65 ]G-CSF [Arg11, 34,Ser17,27,60,65 ]G-CSF [Arg11, 40,Ser17,27,60,65 ]G-CSF [Ala1 ,Thr3 ,Tyr4 ,Arg5,11,Ser17,27,60,65 ]G-CSF [Arg11,Glu15,111,Ser17,27,60,65,115,116 ,Al
a26, 28,Lys30]G-CSF [Arg11,165,Glu15,Ser17,27,60,65 ,Ala26, 28,Lys
30,58 ]G-CSF [Arg11,Glu15,Ser17,27,60,65 ,Ala26,28,44,51,55,Lys
30,49,58 ]G-CSF [Arg11,165,Glu15,111,Ser17,27,60,65,115,116 ,Ala
26,28,44,51,55,Lys30,49,58 ]G-CSF すぐれた溶液安定度と良好な比活性(specific activit
y) を有するという点から特に好ましい本発明の誘導体
としては下記のものが挙げられる： ｉ）[Arg11,Ser17,27,60,65 ]G-CSF, ii）[Glu15,Ser17, 27,Ala26, 28,Lys30]G-CSF, iii）[Arg11,Glu15,Ser17,27,60,65 ,Ala26, 28,Lys30]
G-CSF, iv）[Arg11, 40,Ser17,27,60,65 ]G-CSF, ｖ）[Arg11, 23,Ser17,27,60,65 ]G-CSF, vi）[Arg11,165,Glu15,Ser17,27,60,65 ,Ala26, 28,Lys
30, 58]hu G-CSF, vii）[Arg11,Glu15,111,Ser17,27,60,65,115,116 ,Ala
26, 28,Lys30]hu G-CSF, viii）[Glu15,Ser17, 27,Ala26, 28,Arg30]hu G-CSF, ix）[Ala1 ,Thr3 ,Tyr4 ,Arg5,11,Ser17,27,60,65 ]G-C
SF ｘ）[Ser17,27,60,65 ]hu G-CSF, xi）[Arg11,Ser17,27,65]hu G-CSF,及び xii）[Ser17,27,65]hu G-CSF. これらの中、（ｉ），（ii），(iii) ，（vi），(vii)
，(viii)，（ｘ），（xi）及び(xii) が最も好まし
い。
【００２６】後者のヒトＧ−ＣＳＦはすぐれた溶液安定
度を示すばかりでなしに、天然に産生するＧ−ＣＳＦに
比べて改善された比活性を有する。
【００２７】本発明のポリペプチド中にプリシークエン
ス(presequence) メチオニンを存在させても、存在させ
なくてもよいが、存在させることが好ましい。
【００２８】下記のｉ）〜viii）からなるｐＡＴ１５
３、すなわち、 ｉ）プロモーター及び適当である場合にはこのプロモー
ターに対するオペレーター、例えばｔｒｐプロモーター
又はＴ７Ａ３プロモーター。Ｔ７Ａ３プロモータはバク
テリオファージＴ７のＡ３プロモーターである〔Dunn
J.J. 及びStudier F.W., “J. Mol. Biol. ”166 ,477
〜535(1983) 参照〕。バクテリオファージＴ７ ＤＮＡ
の完全なヌクレオチド塩基配列及びＴ７遺伝要素(genet
ic element) の位置は上記文献に記載されている； ii）リボソーム結合部位配列、例えばｔｒｐリーダーリ
ボソーム結合部位配列； iii）発現させるべき遺伝子に
対するクローニング部位； iv）ａＴ４転写終結配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５１及
び図４参照）； ｖ）ｃｅｒ配列 (Summer D等、MGG,201 , p334−338,19
85参照）； vi）テトラサイクリン リプレッサー遺伝子（Ｔｅｔ
Ｒ）； vii）テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔ Ａ）； viii）多重制限酵素配列(multiple restriction enzyme
sequence)； からなる、ｐＡＴ１５３に基づく産生ベクター(product
ion vector) を使用することが有利であることが認めら
れた。
【００２９】ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５０にはＥｃｏＲＩ
制限エンドヌクレアーゼ部位（ヌクレオチド１−６）、
Ａ３プロモーター配列（ヌクレオチド７〜５２）、ｔｒ
ｐリーダーリボソーム結合部位配列（ヌクレオチド５３
−７８）及び翻訳開始コドン（ヌチレオチド７９−８
１）を包含する塩基配列が記載されている。
【００３０】本発明の誘導体を発現することのできる宿
主を増殖培地で培養しそして培養中に酵母エキスを含有
する補充液(supplement)を増殖培地に添加することが有
利である。酵母エキスを含有する補充液の添加は、培養
の開始後、所定の時期に開始することが好ましい。酵母
エキスを含有する補充液の添加速度は増殖培地が酵母エ
キスを消費した状態になることのないような速度である
ことが好ましい。このことは産生ベクターをＴ７Ａ３プ
ロモーターと共に使用した場合に特に有利である。
【００３１】本発明の誘導体についてコードする遺伝物
質(genetic material)を担持する組換え体ベクターを用
いて形質転換された宿主を、本発明の誘導体の蓄積(acc
umlation) を改善するのに十分な量のロイシン及び／又
はスレオニンの存在下で培養することも有利であり得
る。例えば、産生ベクターをｔｒｐプロモーターと共に
使用した場合には、この発酵（又は培養）(fermentatio
n)をロイシンの存在下で行うことが特に好ましい。
【００３２】天然に産生するＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列
の一部又は全部及びその生物学的性質の少なくとも１つ
を有するＧ−ＣＳＦ又はその誘導体に対して溶液安定度
を改善するために行い得る修飾の他に、本発明は、更
に、かかるＧ−ＣＳＦ又はその誘導体の精製についての
改善された方法を発見したことに基づくものである。
【００３３】すなわち、例えばＰＣＴ特許公開Ｎｏ８７
／０１１３２号公報には、この特許公開公報に記載の方
法で調製されたＧ−ＣＳＦ同族体から表面活性剤(deter
gent) 、特に、塩の形のＮ−ラウロリルサルコシン〔例
えばサルコシル(Sarkosyl)〕を除去することは開示され
ていない。従って、本発明のＧ−ＣＳＦ誘導体の溶液安
定度を高濃度で評価し得るためには、また、処法の研究
(formulation studies) を行い得るためには、表面活性
剤の除去法を検討(identify)することが必要であった。
本発明の一態様においては、表面活性剤の除去は燐酸緩
衝溶液（ｐＨ７．２〜７．５）の存在下で行われた。燐
酸緩衝溶液は等張食塩水(isotonic saline) が好都合に
調製することができ、例えば、実施例１に記載するごと
き組成を有する。この点に関して、他の緩衝液は、表面
活性剤の除去、特に、Ｎ−ラウロイルサルコシン（塩の
形）の除去が遅くかつより多量のタンパク質が沈澱する
という理由で余り好ましくないことが認められた。タン
パク質の沈澱を増大させることなしに除去効率が改善さ
れるという理由から、好ましくはこの工程でダイアフィ
ルタレーション(diafilteration)を行うことが更に好ま
しい。例えばダイアフィルタレーションは慣用の拡散透
析(diffusion dialysis)に対して好ましいことが認めら
れた。更に、表面活性剤の濃度、特に、塩の形のＮ−ラ
ウロイルサルコシン（例えばサルコシル）の濃度を、ク
ロマトグラフィー中の分解能(resolution)を保持しなが
ら、１％以下に低下させ得ることが認められた。初期表
面活性剤濃度を低下させることにより表面活性剤の除去
が促進され、従って、クロマトグラフィー中の分解能の
保持に一致する、最少の表面活性剤濃度、例えばＮ−ラ
ウロイルサルコシン（塩の形、例えばサルコシル）濃度
を使用することが好ましい。表面活性剤、例えばＮ−ラ
ウロイルサルコシン（塩の形）、例えばサルコシルの特
定の濃度は例えば０．８〜０．２％、好ましくは０．５
〜０．２％、特に、約０．３％である。
【００３４】上記したことの他に、Ｎ−ラウロイルサル
コシン（塩の形）、例えばサルコシルのごとき表面活性
剤を除去することにより、産生物の評価を複雑にする、
痕跡のタンパク分解活性(proteolytic activity)を活性
化することが認められた。更に、ダイアフィルタレーシ
ョンによる表面活性剤の除去後、好都合にはダイアフィ
ルタレーションにより、好ましくは透析により、実質的
なタンパク質の加水分解の生ずる前にｐＨを７．０以下
に低下させた場合には、上記タンパク分解活性を著しく
減少させ、排除することさえできることが認められた。
例えば本発明の別の態様においては、痕跡のタンパク分
解活性の減少又は除去は、７．０以下のｐＨであるが、
ポリペプチドの顕著な加水分解を回避するのに十分な高
さのｐＨで行い得る。このｐＨは６．０〜４．５である
ことが有利であり、好ましくは５．８〜５．０、特に、
約５．４である。本発明のこの態様の別の利点は、この
ｐＨの低下を行うことにより、大腸菌混入物及び／又は
不正確に折りたたまれた(incorrectly folded)タンパク
質を沈澱させ得ることである。精製の際にサイズ排除ク
ロマトグラフィー工程を包含させることが好ましい；そ
の理由はこれを行わない場合には、タンパク質の加水分
解による分解の問題が増大するのに対し、本発明のこの
態様においては、タンパク質の除去を困難にせしめる、
かかるタンパク質の分解が減少することにある。
【００３５】上記の方法の他に、Ｇ−ＣＳＦ又はその誘
導体の溶液安定度を向上させることにより、抽出操作が
実質的に単純化される。従って、本発明の別の要旨によ
れば、前記したごとき本発明の活性誘導体の封入体(inc
lusion body)を表面活性剤、特に塩の形のＮ−ラウロイ
ルサルコシン（例えばサルコシル）中に懸濁させ、２）
酸化し、３）表面活性剤を除去し、ついで４）表面活性
剤を除去して得られた溶液を、高められた温度例えば３
０〜４５℃、有利には３４〜４２℃に保持し、それによ
って、混入バクテリアタンパク質、生成物オリゴマー及
び／又は分解生成物を沈澱させることを特徴とする、前
記Ｇ−ＣＳＦの誘導体の、その封入体からの抽出方法が
提供される。上記の溶液は前記したごとき高められた温
度で６〜２４時間、有利には８〜１８時間、好ましくは
１０〜１４時間、特に、約１２時間、保持することが好
都合である。
【００３６】本発明の抽出法は、例えば、宿主細胞を溶
解し(lyse)ついで遠心分離を行って封入体を例えばペレ
ットの形で得ることにより行い得る。ついで封入体を表
面活性剤、例えば塩の形のＮ−ラウロイルサルコシン
（例えばサルコシル）、好ましくは、１〜３％、特に、
約２％の、塩の形のＮ−ラウロイルサルコシン（例えば
サルコシル）中に懸濁させ得る。表面活性剤中の懸濁物
をついで硫酸銅（ＣｕＳＯ4 ）の存在下で酸化しついで
遠心分離し得る。封入体を洗浄することが可能な場合に
は、例えばデオキシコール酸塩より尿素を使用すること
が好ましい。
【００３７】本発明の抽出法によれば、例えばサイズ排
除カラム(size exclusion column)を使用する必要が排
除されるため、生産方法が単純化され得る。更に、熱処
理工程からの生産物の回収率が高いことは、本発明の誘
導体の改善された溶液安定度によってもたらされる利点
の一つであると考えられる。実際に、溶液安定度が大き
ければ大きい程、タンパク質は本発明の新規な抽出法に
対してより適するものになる。従って例えば、この抽出
法を１０ｍｇ／ｍｌにおいて少なくとも８５％の溶液安
定度を有する本発明の誘導体の抽出に適用することが好
ましい。既知の同族体［Ｍｅｔ-1，Ｓｅｒ17］Ｇ−ＣＳ
Ｆを上記の抽出法により抽出した場合、ｒｐＨＰＬＣ
は、１ｍｇ／ｍｌの全タンパク質を含有する滞留物(ret
entate) を熱処理した後に、溶液中に所望の生成物が４
０％しか残留していないことを示した。３ｍｇ／ｍｌの
全タンパク質濃度においては、前記同族体は１９％しか
溶液中に残存していなかった。
【００３８】本明細書中で言及されている全てのヌクレ
オチド配列は５′〜３′センス(sense) 内で特定されて
いる。本発明の誘導体はｈｕ Ｇ−ＣＳＦとも称される
ヒト Ｇ−ＣＳＦに基づくものである。実施例で調製さ
れた誘導体は、全て、大腸菌を使用して調製されている
ので、プレシークエンスヌチオニンが、通常、存在する
であろう。下記の物質が以下の実施例及び参考例で言及
されており、その構成はつぎの通りである：“Ｎ−ラウ
ロイルサルコシン”という用語は塩の形でのこの物質の
使用を意味する。すなわち、実施例及び参考例において
はＮ−ラウロイルサルコシンはナトリウム塩の形で使用
されている。 制限酵素に対する緩衝液 安定性：２０℃で安定 緩衝液組成 緩衝液成分 最終濃度（ｍｍｏｌ／ｌ） 〔１：１０稀釈設定緩衝液(set buffer)〕 Ａ Ｂ Ｌ Ｍ Ｈ トリス−アセテ−ト 33 − − − − トリス−ＨＣｌ − 10 10 10 50 Ｍｇ−アセテート 10 − − − − ＭｇＣｌ2 − 5 10 10 10 Ｋ−アセテート 66 − − − − ＮａＣｌ − 100 − 50 100 ジチオエリスリトール(DTE) − − 1 1 1 ジチオトレイトール(DTT) 0.5 − − − − ２−メルカプトエタノール − 1 − − − ３７℃でのｐＨ 7.9 8.0 7.5 7.5 7.5 上記緩衝液はBoehringer Mankeim社から入手される。
【００３９】特定部位の突然変異誘発法において−参考
例２ 緩衝液１ １００ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．０ １００ｍＭ ＮａＣｌ ２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 緩衝液２ １０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．０ ２０ｍＭ ＮａＣｌ １ｍＭ ＥＤＴＡ 緩衝液３ １２ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ７．７ ３０ｍＭ ＮａＣｌ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ８ｍＭ ２−メルカプトエタノール 緩衝液４ ６０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．０ ９０ｍＭ ＮａＣｌ ６ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ ＤＴＴ
【００４０】ヌクレオチド混合物１：各々２５０μＭの
ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ＝Ｓ（ｄＣＴＰのホスホ
ロチオエート誘導体）、ｄＴＴＰ及び１ｍＭのＡＴＰ ヌクレオチド混合物２：各々２５０μＭのｄＡＴＰ，ｄ
ＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ及び３５０μＭのＡＴＰ
【００４１】Ｍ９最小培地 塩化アンモニウム １ｇ オルソ燐酸水素二ナトリウム ６ｇ オルソ燐酸水素カリウム ３ｇ 塩化ナトリウム ０．５ｇ 蒸留水 １ｌ補充剤／７５ｍｌ ３００μｌ ５０％グルコース ７５μｌ １Ｍ ＭｇＳＯ4 ７５μｌ ０．１Ｍ ＣａＣｌ2 ７５μｌ ４ｍｇ／ｍｌチアミン ７５μｌ ２０％カゼインアミノ酸
【００４２】微量元素溶液（ＴＥＳ） ＴＥＳは下記の組成を有しかつ０．５ｍｌ／ｌの濃度で増殖培地に添加される ：ＡｌＣｌ3 ６Ｈ2 Ｏ ０．１ｍｇ１-1 １００μｇ１-1 ＣｏＣｌ2 ６Ｈ2 Ｏ ０．０４ｍｇ１-1 ４０μｇ１-1 ＫＣｒ（ＳＯ4 ）2 １２Ｈ2 Ｏ ０．０１ｍｇ１-1 １０μｇ１-1 ＣｕＣｌ2 ２Ｈ2 Ｏ ０．０１ｍｇ１-1 １０μｇ１-1 Ｈ3 ＢＯ3 ０．００５ｍｇ１-1 ５μｇ１-1 ＫＩ ０．１ｍｇ１-1 １００μｇ１-1 ＭｎＳＯ4 Ｈ2 Ｏ ０．１ｍｇ１-1 １００μｇ１-1 ＮｉＳＯ4 ６Ｈ2 Ｏ ０．００４５ｎｇ１-1 ４．５μｇ１-1 Ｎａ2 ＭｏＯ4 ２Ｈ2 Ｏ ０．０２ｍｇ１-1 ２０μｇ１-1 ＺｎＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ ０．０２ｍｇ１-1 ２０μｇ１-1
【００４３】ジェネクリーン（Geneclean)（商標） このキット(kit) は１）６Ｍ沃化ナトリウム、２）塩化
ナトリウム／エタノール／水洗浄液を調製するための、
塩化ナトリウム、トリス及びＥＤＴＡの水溶液；３）ガ
ラスミルク（Glassmilk)（商標）−シリカマトリックス
の水中の懸濁液１．２５ｍｌを含有する１．５ｍｌビン
−；を含有している。これは、“Proceedings of the N
ational Academy of Science USA”(1979),Vol ７６,
ｐ６１５に記載されたVogelstein及びGillespie の方法
に基づくＤＮＡ精製技術である。別法として、“Molecu
lar Cloning - a laboratory Manual ”、第２版、Samb
rook, Fritsch 及びManiatis(Cold Spring Harbor Labo
ratory; 1989) に記載される任意の方法を使用し得る。ファルマシア(Pharmacia) Ｎｏ．２７−９２５０のラン
ダム ラベル キットプロダクト(Landom Labe Kit Pro
duct) この方法は“Molecular Cloning - a Laboratory Manua
l ”、第２版、Sambrook,Fritsch及びManiatis, p.p.1
0.13−10.17(Cold Spring Harbor Laboratory,1989)に
記載されている。
【００４４】シクイナーゼ(Sequenase) （商標） 化学的に修飾されたＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ。“Proc
eedings of the National Academy of Science USA”(1
987), Vol 84, pp.4767−4771に記載される Tabor及び
Richardsonの方法に基づく。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ “Molecular Cloning - a Laboratory Manual ”第２
版、Sambrook, Fritsch 及びManiatis, 5.60〜5.64(Col
d Spring Harbor Laboratory 1989)及びWeiss B.他J. B
iol. Chem.Vol 243, p4543(1968)に記載
【００４５】
【実施例】本発明の実施例を以下に示す。
【００４６】実施例１ ［Ｓｅｒ17, 27] ヒトＧ−ＣＳＦの調製 参考例１の工程ａ）及びｂ）を繰返した；但し下記のご
とき変更を行った；オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１，２，３及び４（後記参照）の代りに、それぞ
れ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２４，２５，２６及び２７
（後記参照）を使用した。
【００４７】ｃ）［Ｓｅｒ17, 27] ヒトＧ−ＣＳＦにつ
いての遺伝子の発現ベクター中へのクローニング。 前記した遺伝子（図３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４９参
照）をプラスミドベクターｐＩＣＩ００２０中にクロー
ンした。このベクターはｐＡＴ１５３ベースプラスミド
であり、６５１ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩ領域が、 （１）合成E.coliｔｒｐプロモーター及びｔｒｐリーダ
ーリボソーム結合部位 （２）翻訳開始コドン、 （３）ＫｐｎＩ，ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ，ＳａｌＩ，Ｐ
ｓｔＩ，ＳｐｈＩ及びＨｉｎｄIII についての部位を含
有する、Ｍ１３ｍｐ１８から誘導された多重制限酵素認
識配列(multiple restriction enzyme recognition seq
uence). （４）合成転写停止配列、 からなる１６７ｂｐＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．４７）によっている。この領域のＤＮＡ
塩基配列は図１に示されている。
【００４８】ｐＩＣＩ００２０発現ベクターを１０ｍＭ
トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウ
ム中でＫｐｎＩ（ＢＣＬ）を使用して完全に切断した。
このＤＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムを含有する溶液
から、エタノールを使用して−２０℃で沈澱させついで
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて３７℃で１０分間、下
記のごとく処理することにより３′−粘性末端を除去し
た： 水（１６μｌ）中のＤＮＡ（１μｇ） １０ＸＴ４ポリメラーゼ緩衝液（２μｌ） ０．３３ＭトリスアセテートｐＨ７．９ ０．１Ｍ酢酸マグネシウム ０．６６Ｍ酢酸カリウム ５ｍＭジチオトレイトール １ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ＰＥＮＴＡ
Ｘ フラクションＶ） ２ｍＭｄＮＴＰ混合物（１μｌ） Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（１μｌ；２．５単位／μｌ
ＢＣＬ）
【００４９】水（８０μｌ）を添加し、混合物をフェノ
ール／クロロホルム（１００μｌ）で抽出しついでクロ
ロホルム（１００μｌ）で抽出した。３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（１０μｌ）を添加した後、ＤＮＡをエタノール（２
５０μｌ）を用いて−２０℃で沈澱させついで１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 及び１０ｍＭトリ
スＨＣｌ（ｐＨ７．５）中でＳａｌＩ（ＢＣＬ）を用い
て完全に切断した。Ｋｐｎ−ブラント末端ＳａｌＩベク
ター(Kpn-blunt ended to Sal I vector) を０．７％ア
ガロースゲルから精製しついで製造業者（Ｂｉｏｌ ０
１ ＵＳＡ）の推奨している操作法に従ってジェネクリ
ーン（商標）を使用することにより単離した。
【００５０】合成遺伝子を下記の方法によりｐＳＴＰ１
ベクターから単離した。ベクターを１００ｍＭ ＮａＣ
ｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 及び１０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．５）中でＳｃａＩ及びＳａｌＩ（両方共ＢＣ
Ｌ製）で切断した。５３０ｂｐ断片を０．７％アガロー
スゲルから精製しついで製造業者(Biol ０１）の推奨す
る方法に従ってジェネクリーン（商標）を使用して単離
した。
【００５１】連結(ligation)を行うために、５０ｍＭト
リスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１
ｍ ＭＡＴＰ，１ｍＭＤＴＴ，５ｗ／ｖ％ ＰＥＧ８０
００及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（２単位；ＢＲＬ）を含
有する溶液２０μｌ中の、ＳｃａＩ−ＳａｌＩ遺伝子断
片（５０ｎｇ）とｐＩＣＩ００２０ベクター断片（１０
０ｎｇ）の混合物を１６℃で２０時間インキユベートし
た。得られた混合物をコンピテントE.coli ＨＢ１０１
細胞（ＢＲＬより供給）を形質転換するのに使用した。
形質転換細胞(transformant)を５０μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含有するＬ−アガープレート上での生長により
選択しそして32Ｐ標識プローブ（ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．２
４）を使用するコロニーハイブリダイゼーションによ
り、遺伝子の存在についてスクリーンした(screen)。プ
ラスミドＤＮＡを６個の正にハイブリダイドしている(p
ositively hybridising)コロニーから調製し、塩化セシ
ウム密度勾配遠心法(centrifugation in a caecium chl
oride gradient) により精製しそして塩基配列をチェチ
ンターミネーター法(dideoxy sequencing)により確認し
た。この遺伝子を含有するプラスミドをｐＩＣＩ１０８
０と命名した。
【００５２】ｄ）［Ｓｅｒ17, 27 ］Ｇ−ＣＳＦについて
の遺伝子を含有する発現カセット(e xpression cassett
e) のＭ１３ｍｐ１８中へのサブクローニング 実施例３−８に詳述されているＧ−ＣＳＦ誘導体の調製
のための開始点を提供するために、下記のサブクローニ
ングを行った。
【００５３】ｐＩＣＩ１０８０からのプラスミドＤＮＡ
（塩化セシウム密度勾配遠心分離法により精製）をＥｃ
ｏＲＩ及びＳａｌＩ（ＢＣＬ）を使用して、製造業者の
指示に従って完全に切断した。ｔｒｐプロモーターと
［Ｓｅｒ17, 27］Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を含有する小さいＥ
ｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片をジエネクリーン（商標）を使
用して０．７％アガロースゲルから単離した。この断片
をＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ切断Ｍ１３ｍｐ１８ベクター
(Amersham Internationalにより供給されるＤＮＡ；Ｂ
ＣＬからの酵素) 中にクローンした。断片をＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼ（前記したもの）を使用して５Ｘ ＢＲＬリ
ゲーションバッファー中で連結した。連結混合物を使用
してコンピテントE.coli ＴＧｌ細胞(Melecular Cloni
ng- A Laboratory Manual-Maniatis等、Cold Spring Ha
rbor に記載されるMandel及びHigaの塩化カルシウム法
に従ってコンピテントにせしめた）をトランスフェクト
した。トランスフェクトされた細胞を、ＤＭＦ中の２％
−ｘ−Ｇａｌと２００μｌのロッグフェーズ(log phas
e) E.coliＴＧｌ細胞を含有するＴＹトップアガー(top
agar)中に懸濁させ、２ｘＴＹアガープレート上に載置
した〔ＴＹトップアガー−８ｇのバクトトリプトン(Bac
totryptone) 、５ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌ、
３．７５ｇのバクト−アガー(Bacto-agar)及び５００ｍ
ｌの殺菌水）。４個の白色プラークをＴＹブロス（８ｇ
のバクトトリプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣ
ｌ及び５００ｍｌの殺菌水）のアリコート中の４×２ｍ
ｌの１％E.coliＴＧｌ細胞中に装入し、３７℃で６時
間、生長させた。２ｍｌの培養基を０．５ｍｌと１．５
ｍｌのアリコートに分割した。バクテリアエッペンドル
フ(Eppendorf) （商標）マイクロヒュージ(microfuge)
中で溶液から遠心分離し、上澄液を殺菌エッペンドルフ
（商標）チューブに移した。０．５ｍｌのアリコートを
ファージストック(pharge stock)として−２０℃で貯蔵
した。１．５ｍｌのアリコートはAmersham Internation
al M13 sequencing handbookに記載の方法（後記参照）
に従って一重鎖ＤＮＡを調製するのに使用した。これら
のＤＮＡ試料の塩基配列の決定をオリゴヌクレオチドＳ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２３及
びＭ１３ユニバーザーサルシンクエンシングプライマー
(Universal sequencing primer) を使用して行った。反
応はシクイナーゼキット(Sequenase kit) （商標）を使
用して、製造業者の指示に従って行った。４個のクロー
ンは全て、［Ｓｅｒ17, 27］Ｇ−ＣＳＦについての正し
いＤＮＡ配列を有していた。
【００５４】大規模な一重鎖ＤＮＡの調製 １ｍｌ当り２００〜５００μｇの一重鎖ＤＮＡを調製す
るために、Amersham International“Oligonucleotide
Directed Mutagenesis”に記載の方法を使用した。詳細
な手順は下記の通りである： 大規模な一重鎖ＤＮＡの調製： Ａ．１ｍｌファージストックの調製 １．グルコース／最少培地プレートから単一のＴＧｌE.
coliコロニーを採取する。１０ｍｌの２ｘＴＹ培地中で
３７℃で振盪しながら一夜生長させる。１０μｌ〜２０
ｍｌの新しい培地を添加し、３７℃で３時間振盪する。 ２．１０ｍｌ殺菌培養チューブ内の１ｍｌの２ｘＴＹ培
地に、工程１からの３時間培養株(culture) １００μｌ
を接種する(inoculate) 。 ３．１ｍｌの培養株(culture) に組換え体プラーク(rec
ombinant plaque)を接種する。 ４．振盪しながら３７℃でインキュベートする。マイク
ロ遠心分離チューブ(microcentrifuge tube)に移す。 ５．周囲温度で５分間遠心分離する。上澄液を新しいチ
ューブに移す。４℃で一夜貯蔵する。一夜貯蔵したＴＧ
ｌE.coliの培養株を次の工程に供給する。
【００５５】Ｂ．１００ｍｌファージ培養株(phage cul
ture) の生長 １．１００ｍｌの２ｘＴＹ培地に一夜放置したＴＧｌ培
養株（ＴＧｌ culture) を接種しついでＯ．Ｄ．500 が
０．３になるまで３７℃で振盪する。 ２．Ａ５（上記参照）からのファージ上澄液１ｍｌを１
００ｍｌ培養株(culture) に添加する。 ３．振盪しながら３７℃で５時間インキュベートする。
ついで遠心分離チューブに移す。 ４．４℃で３０分間、５００ｘｇで遠心分離する。 ５．上澄液を清浄な遠心分離チューブに移す。細胞が搬
出される(carry over)ことがないように注意する（ＲＦ
ＤＮＡの調製のためのバクテリアペレット(bacterial
pellet)を残留させる）。 ６．２．５Ｍ ＮａＣｌ中の２０ｗ／ｖ％のＰＥＧ６０
００を０．２容量、上澄液に添加する。十分に混合した
後、４℃で１時間放置する。 ７．４℃で２０分間、５０００ｘｇで遠心分離する。上
澄液を廃棄する。 ８．５０００ｘｇで５分間遠心分離し、残留するＰＥＧ
／ＮａＣｌの全てを取出用パスツールピペットを使用し
て除去する。 ９．ウイルスペレットを５００μｌの水（二段蒸留）に
再懸濁させついでマイクロ遠心チューブ（１．５ｍｌ）
に移す。 １０．マイクロ遠心分離機中で５分間遠心分離して、残
留細胞を除去する。上澄液を新しいマイクロ遠心分離チ
ューブに移す。 １１．上澄液に１２．５Ｍ ＮａＣｌ中の２０％ＰＥＧ
２００μｌを添加し、十分に混合しついで周囲温度で１
５分間放置する。 １２．５分間遠心分離し、上澄液を廃棄する。 １３．２分間遠心分離する。取出用パスツールピペット
を使用して、痕跡のＰＥＧ／ＮａＣｌを全て除去する。 １４．ウイルスペレットを二段蒸留水５００μｌ中に再
懸濁させる。 １５．１０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．０で飽和させた
フェノール２００μｌと１ｍＭのＥＤＴＡを添加。短時
間攪拌する(vortex)。 １６．室温で１５分間、放置する。 １７．３分間、遠心分離する。 １８．上澄液を新しいチューブに移す。 １９．工程１５〜１８を繰返す。 ２０．５００μｌのクロロホルムを添加し、水性相を２
回抽出する。 ２１．３Ｍ酢酸ナトリウム５０μｌと１ｍｌの無水エタ
ノールを添加し、混合する。 ２２．ドライアイス及びエタノール浴中に２０分間、置
く。 ２３．１５分間、遠心分離する。 ２４．各ペレットを１ｍｌの−２０℃のエタノールで洗
浄。注ぎ出す。 ２５．ペレットを真空乾燥しついで５０μｌの二段蒸留
水中に添加する。 この方法により１００〜２００μｇの一重鎖ＤＮＡが得
られた。
【００５６】ｅ）発酵（培養）(fermentation) ｐＩＣＩ１０８０をE.coli菌株ＭＳＤ５２２に形質転換
し、得られた組換え体を精製しそしてグリセリンストッ
ク上で−８０℃に保持した。培養株(culture) のアリコ
ートをストックから取り出し、Ｌ−アンピシリンのアガ
ープレート上にストリークし(streak)、３７℃で一夜生
長後、単一コロニーを分離した。単一の所望のコロニー
を取出しついで１０ｍｌのＬ−アンピシリンブロスに再
懸濁させ、直ちにその１００μｌを、７５ｍｌのＬ−ア
ンピシリンブロスを含有する、１０個の２５０ｍｌエル
レンマイヤーフラスコの各々に接種した。往復振盪機上
で３７℃で１６時間生長させた後、フラスコの内容物を
プールし、２０ｌＬＣＭ５０生長培地を含有する発酵器
に接種するのに使用した。
【００５７】ＬＣＭ５０の組成 蒸留水中の濃度 ｇ／ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 ３．０ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ６．０ ＮａＣｌ ０．５ カゼイン加水分解物(Oxoid L41) ２．０ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １０．００ 酵母エキス(Difco) １０．００ グリセリン ３５．００ Ｌ−ロイシン ２．５ Ｌ−スレオニン ０．９ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．０３ チアミン ０．００８ ＦｅＳＯ4 ／クエン酸 ０．９４／０．０２ 微量元素溶液（ＴＥＳ） ０．５ｍｌ ついで発酵を３７℃の温度で、かつ６Ｍ水酸化ナトリウ
ム溶液を自動的に添加することによって制御されてい
る、６．７のｐＨで行った。溶解酸素張力(dissolved o
xygen tension)（ｄＯＴ）の設定点は５０％空気飽和率
(air saturation)であり、当初、発酵器の攪拌速度を自
動調節することにより制御した。１分当り、容量当り、
１容量（ＶＶＭ）に相当する発酵器への空気流率を、当
初の２０ｌ／分から、発酵器攪拌速度がその最大値の８
０〜９０％に到達したとき、５０ｌ／分（２．５ＶＶ
Ｍ）に増大させた。発酵器の酸素移行速度(Oxygen tran
sfer rate)（ＯＴＲ）は、記載される条件下で５０のＯ
Ｄ550 に相当する細胞濃度(cell density)より大きい細
胞濃度においては、バクテリアの酸素吸収速度(oxygenu
ptake rate)（ＯＵＲ）を満足させることができないの
で、この細胞濃度より大きい細胞濃度における発酵器内
のｄＯＴは、バクテリアの酸素吸収速度を制限すること
により、５０％の空気飽和率に保持した。これは培地を
炭素が５０のＯＤ550 に制限されるように調製しついで
制限炭素源(limiting carbon source)の栄養(feed)を硫
酸アンモニウム及び酵母エキスと共に、バクテリアの生
長を制限する速度で供給することにより達成した。
【００５８】発酵は１６時間行い、この間に、光学密度
（ＯＤ550 ）、細胞の乾燥重量及び細胞内のＧ−ＣＳＦ
の蓄積を測定するためにサンプルを採取した。Ｇ−ＣＳ
Ｆの蓄積は、当業者に周知のごとく、試料バクテリアの
全細胞溶解物(lysate)のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルを走査することにより測定した。ＯＤ550
が２５に到達したとき、カゼイン加水分解物溶液（１０
０ｇ／ｌのOxozoid Ｌ４１）を１．５ｇ／ｌ／時の割合
で発酵器に注入した。
【００５９】ＯＤ550 が約５０に到達したとき、発酵バ
ッチ中の炭素源の供給物が消費され、ｄＯＴが５０％空
気飽和率から急速に上昇した。この時点で、グリセリン
（４７０ｇ／ｌ）、酵母エキス（１１８ｇ／ｌ）及び硫
酸アンモニウム（１１８ｇ／ｌ）を含有する栄養を、元
の速度で発酵器に供給しついで発酵器を最大値の約８０
％で攪拌しながら、ｄＯＴを５０％空気飽和率に保持し
た。約１３〜１４時間後、この栄養−バッチ供給を行う
代りに、グリセリン（７１５ｇ／ｌ）及び硫酸アンモニ
ウム（１４３ｇ／ｌ）だけからなる栄養を供給した。カ
ゼイン加水分解物供給率は全体を通じて１．５ｇ／ｌ／
時に保持した。約１６時間後、培養液の顕微鏡検査によ
り大部分の細胞内に大きな封入体(inclusion body)の存
在が認められたとき、バクテリアをソルバル(Sorval)Ｒ
Ｃ３Ｂ遠心分離器上で捕集し（７０００ｇ，３０分，４
℃）、−８０℃で冷凍して保存した。
【００６０】ｆ）精 製 冷凍細胞ペースト（５００ｇ）をシルバーソン(Silvers
on) ＡＸＲ型ホモジナイザーを使用して５０ｍＭトリス
ＨＣｌ、２５ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０（５ｌ）中に４
℃で再懸濁させた。懸濁液をマントン−ガウリン(Manto
n-Gaulin) ホモジナイザーを６０００ｐｓｉで３回通過
させることにより溶菌し(lyse)ついでソルバルＲＣ３Ｃ
遠心分離器内でＨ６０００Ａローターを使用して５００
０ｇで３０分間、遠心分離した。上澄液を廃棄し、ペレ
ットフラクションを更に精製する前、−２０℃で貯蔵し
た。
【００６１】ペレットフラクション（６０〜１００ｇ）
を解凍しついで５ｍＭＥＤＴＡ中の１ｗ／ｖ％のデオキ
シコール酸（ナトリウム塩）、５ｍＭのジチオトレイト
ール、１ｍｇ／ｍｌのナトリウムアジドを含有する５０
ｍＭのトリスＨＣｌ，ｐＨ９．０（１２００ｍｌ）中
に、ＰＴＡ２０プローブを有するポリトロン(Polytron)
ホモジナイザーを使用して設定速度５で再懸濁させた。
懸濁物を室温で３０分間混合しついでソルバルＲＣ５Ｃ
遠心分離器中でＧＳＡローターを使用して６５００ｇで
３０分間遠心分離した。上澄液を廃棄しついでペレット
を上記と同じ方法で２回再処理した。次にペレットを水
（１ｌ）に２回、再懸濁させ、１５０００ｇで２０分
間、遠心分離した。洗浄封入体(inclusion body)を含有
する最終ペレットを１ｍｇ／ｍｌのナトリウムアジドを
含有する５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ８．０（１５０ｍ
ｌ）中の２ｗ／ｖ％ Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリ
ウム塩（サルコシル）中で可溶化した。硫酸第２銅を２
０μＭに添加し、混合物を２０℃で１６時間攪拌しつい
でソルバルＲＣ５Ｃ遠心分離器中でＳＳ３４ローターを
使用して３０，０００ｇで３０分間遠心分離した。誘導
体を含有する上澄液を、更に、精製する前、５０ｍｌの
アリコートとして−２０℃で貯蔵した。可溶化された誘
導体（２０ｍｌ）を解凍し、５μｍフィルターを通過さ
せて粒状物質を除去した。濾液を、１ｍｇ／ｍｌのナト
リウムアジドを含有する５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ
８．０中の０．３ｗ／ｖ％ Ｎ−ラウロイルサルコシン
（Ｎａ塩）で平衡化した(equilibrate) 、ウルトロゲル
(Ultrogel)ＡｃＡ５４のカラム（５×９０ｃｍ）に４℃
で通送した。カラムを同一の緩衝液を用いて２．５ｍｌ
／分の流率で溶離し、１０ｍｌのフラクションを捕集し
た。誘導体タンパク質を含有するフラクションを捕集し
（約１００ｍｌ）、４℃で貯蔵した。数個のカラムから
捕集した誘導体含有フラクションを一緒にし（３００〜
５００ｍｌ）、ＳＩＹ１０膜（１０ｋＤカット−オフ）
を取付けたアミコン(Amicon)ＣＨ２Ａ−１Ｓスパイラル
カートリッジダイアフィルタレーション装置を使用し
て、１ｍｇ／ｍｌのナトリウムアジトを含有する１０ｍ
Ｍ燐酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムに対して
透析した。滞留物(retentate) をソルバルＲＣ５Ｃ遠心
分離器内でＳＳ３４ローターを使用して３００００ｘｇ
で３０分間遠心分離し、ついで上澄液をスペクトロポー
ル(Spectropor)６−８ｋＤカット−オフ透析チューブ内
で４０時間、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍｇ／ｍｌ
のナトリウムアジドを含有する２０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ５．４に対して、この溶液を３回交換して透析
した（上澄液３００ｍｌ当り、８ｌ）。形成された沈澱
を３０，０００ｘｇで３０分間の遠心分離により除去し
ついで上澄液を１ｍｇ／ｍｌのナトリウムアジドを含有
する水に対して２４時間透析しついで水に対して、水を
６回交換して７２時間透析した。最終滞留物を３０，０
００ｘｇで３０分間遠心分離することにより清澄化し、
−２０℃で冷凍貯蔵する（タンパク質濃度約１ｍｇ／ｍ
ｌ）か又は４℃で凍結乾燥した。
【００６２】Ｎ−ラウロイルサルコシン（Ｎａ塩）の濃
度はダイアフィルタレーションの後には０．００１ｗ／
ｖ％以下に低下しそして水に対する透析の後に使用した
ｒｐＨＰＬＣ法の検出限界値（約０．０００１％）以下
であった。
【００６３】実施例２ ［Ｓｅｒ17, 27］ヒトＧ−ＣＳＦの調製 以下に述べること以外、実施例１で述べた方法を繰返し
た。重復体(duplex)ＩをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
でホスホリン化しついでＩＸＨ緩衝液（ＢＣＬ；３０μ
ｌ）中でＭｓｔII（１０単位）を使用して３７℃で２時
間切断した。エタノールで沈澱させた後、１４３ｂｐ
ＥｃｏＲＩ−ＭｓｔII断片を７Ｍの尿素を含有する１０
％ポリアクリルアミドゲル上で精製し、電気溶離(elect
roelution)により単離しついでＤＮＡ鎖を参考例１で述
べた方法でアンニールした。
【００６４】上記した合成ＲｃｏＲＩ−ＭｓｔII断片を
参考例１に記載されるプラスミドベクターｐＡＧ８８中
にクローンした。ベクターを調製するためには、ｐＡＧ
８８（１０μｇ）をＩＸＨ緩衝液（ＢＣＬ；１００μ
ｌ）中でＭｓｔII（２単位，ＢＣＬ）を使用して３７℃
で２時間切断した。ＤＮＡをエタノールを使用して０．
３Ｍ酢酸ナトリウムから−２０℃で沈澱させついでＩＸ
Ｈ緩衝液（ＢＣＬ；１００μｌ）中でＥｃｏＲＩ（２０
単位；ＢＣＬ）を使用して３７℃で２時間切断した。エ
タノールを使用して沈澱させた後、大きなＲｃｏＲＩ−
ＭｓｔII断片を１％アガロースゲル上で、ジェネクリー
ン（商標）を使用して、製造業者（Ｂｉｏ１０１ ＵＳ
Ａ）の指示に従って精製した。合成断片を含有するコロ
ニーをオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２
４）から調製した放射性プローブを使用するスクリーニ
ングにより確認し、正しい塩基配列は参考例１に述べる
ＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。［Ｓｅ
ｒ17, 27］Ｇ−ＣＳＦについての遺伝子を含有するプラ
スミドをｐＩＣ１１１０７と命名した。遺伝子を発現ベ
クターｐＩＣＩ００２０中にクローンしついで発酵と精
製を実施例１と同様に行った。
【００６５】実施例３ ［Ａｎｇ11，Ｓｅｒ17,27,60,65 ］ヒトＧ−ＣＳＦの調
製 実施例１又は２で述べた［Ｓｅｒ17, 27］Ｇ−ＣＳＦに
ついての遺伝子を含有する突然変異鋳型(mutagenic tem
plate)を使用して、参考例２に記載した方法を繰返し
た。使用した突然変異誘発オリゴヌクレオチドはＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．２８及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９（後
記で定義）と命名されたものである。
【００６６】ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８中のトリプレッ
トＡＣＧは１１位のＧｌｎをＡｒｇに転化する作用を行
い、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９中の最初と最後のＡＧＡ
トリプレットは６５及び６０位のＰｒｏをＳｅｒに転化
する作用を行う。突然変異誘発(mutagenesis) は単一プ
ライミング突然変異誘発(single priming mutagenesis)
においてＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９を使用して参考例２
で述べる方法で行った。これによってＰｒｏ ６０ Ｓ
ｅｒ及びＰｒｏ ６５ Ｓｅｒ変異(change)を包含する
単一プラークが得られた。このプラークから比較例２に
述べる方法に従って一重鎖ＤＮＡを調製した。このＤＮ
Ａを、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８を突然変異プライマー
(mutagenic primer)として使用する単一プライミング突
然変異誘発における突然変異鋳型として使用した。これ
によって１００以上のプラークが得られ、その中の３個
を前記したごときＤＮＡ塩基配列決定法によりスクリー
ンした。３個のプラークの全てが組込まれた変異(chang
e)の完全なセットを有していた。二重鎖ＲＦ ＤＮＡを
プラークの一つから、一重項ＤＮＡを大量に製造する方
法（実施例１の工程ｄ〜工程Ｂ５）に従って調製した。
ＲＦ ＤＮＡをBirnboim及びDolyのアルカリ溶菌法
(“Nucleic Acid Research ”(1979), ７，1513〜1523)
によりバクテリアペレットから抽出しついでSambrook,
Fritsch 及びManiatisにより“Molecular Cloning - a
Laboratory Manual ”(Cold Spring Harbor Publicati
on)に記載される塩化セシウム密度勾配遠心分離により
精製した。精製したＲＦ ＤＮＡを前記したごとき緩衝
液Ｈ中でＥｃｏＲＩとＳａｌＩを使用して切断しついで
ｔｒｐプロモーター、リボソーム結合部位、翻訳開始コ
ドン及び［Ａｒｇ11，Ｓｅｒ17,27,60,65 ］Ｇ−ＣＳＦ
についての遺伝子を有する小断片を０．７％アガロース
ゲルからジェネクリーン（商標）を使用して単離した。
断片を、前記した方法と実質的に同一の方法に従って、
２：１より過剰のインサート：ベクターのモル比を使用
してかつＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）とリガーゼ緩衝
液(ligase buffer) を使用して、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ
切断ｐＩＣＩ００２０ベクター中に連結した。連結混合
物を使用して、E.coli菌株ＨＢ１０１を形質転換した。
形質転換細胞を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
るＬ−アガープレート上での生長により選択した。“Mo
lecular Cloning - a LaboratoryManual ”, Sambrook,
Fitsch及びManiatis(Cold Spring Harbor Publicatio
n)に記載のBirnboim及びDolyの方法により、コロニーを
挿入ＤＮＡの存在についてスクリーンした。所期の６１
９ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩインサートを含有するコ
ロニーからのプラスミドＤＮＡを使用して、E.coli菌株
ＭＳＤ５２２を指定の(designated)、ｐＩＣＩ１２３９
とを形質転換した。発酵と精製は実施例１と同様の方法
で行った。
【００６７】実施例４ ［Ｓｅｒ17, 27,115,116，Ｇｌｕ111 ］ヒトＧ−ＣＳＦ
の調製 実施例１又は２で述べたごとき［Ｓｅｒ17, 27］Ｇ−Ｃ
ＳＦについての遺伝子を含有する突然変異鋳型Ｍ１３ｍ
ｐ１８を使用して実施例３に述べた方法を繰返した。使
用した突然変異誘発オリゴヌクレオチドは、指定のＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．３０（後に定義）である。
【００６８】トリプレットＧＣＴは１１６位のＴｈｒを
Ｓｅｒに転化する作用を行い、トリプレットＡＧＡは１
１５位のＴｈｒをＳｅｒに転化する作用を行いそしてト
リプレットＴＴＣは１１１位のＡｌａをＧｌｕに転化す
る作用を行う。突然変異誘発法(mutagenesis) は実施例
３に述べたものと実質的に同一であり、発現カセットを
発現プラスミドに転移させて(transfer)ｐＩＣＩ１２４
３を得た。発酵と精製は実施例１に述べたものと同一の
方法で行った。
【００６９】実施例５ ［Ａｒｇ11，Ｓｅｒ17, 27，Ｌｙｓ58，Ａｒｇ165 ］ヒ
トＧ−ＣＳＦの調製 実施例１又は２で述べたごとき［Ｓｅｒ17, 27］Ｇ−Ｃ
ＳＦについての遺伝子を含有する突然変異鋳型Ｍ１３ｍ
ｐ１８を使用して実施例３に述べた方法を繰返した。使
用した突然変異誘発オリゴヌクレオチドは、指定のＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．２８，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１及び
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２（後に定義）である。
【００７０】ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１中のトリプレッ
トＴＴＴは５８位のＴｒｐをＬｙｓに転化する作用を行
いそしてＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２においては第２のＧ
ＣＧトリプレットは１６５位のＴｙｒをＡｒｇに転化す
る作用を行う。
【００７１】突然変異誘発操作は、当初、参考例２で述
べたごとき突然変異誘発オリゴヌクレオチドとしてＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．３１及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２を
使用して二重プライミング実験(double priming experi
ment) として行った。これによって２個のプラークが得
られ、その両者がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２変異（Ｔｙ
ｒ１６５Ａｒｇ）を有していたが、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．３１変異を有していなかった。一重鎖ＤＮＡを実施
例１で述べたごとき方法で３個のプラークの１つから調
製した。このＤＮＡを、突然変異誘発プライマーとして
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３
１を使用する二重プライミング突然変異誘発における突
然変異鋳型として使用した。これによって２個のプラー
クが得られ、その一つは組込まれる変異の完全なセット
を有しており、この発現カセットを発現プラスミドに転
移させてｐＩＣＩ１２４６を得た。発酵と精製は実施例
１で述べたものと同一の方法で行った。
【００７２】実施例６ ［Ｇｌｕ15，Ｓｅｒ17, 27，Ａｌａ26, 28，Ｌｙｓ30］
ヒトＧ−ＣＳＦの調製
【００７３】ａ）実施例１又は２で述べたごとき［Ｓｅ
ｒ17, 27］Ｇ−ＣＳＦについての遺伝子を含有する突然
変異鋳型Ｍ１３ｍｐ１８を使用して実施例３に述べた方
法を繰返した。使用した突然変異誘発オリゴヌクレオチ
ドは、指定のＳＥＱ ＩＤＮｏ．３３及びＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．３４（後に定義）である。
【００７４】ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３３中のトリプレッ
トＴＴＣは１５位のＬｅｕをＧｌｕに転化する作用を行
う。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４においては、最初のＴＴ
Ｔトリプレットは３０位のＡｌａをＬｙｓに転化する作
用を行い、トリプレットＡＧＣは２８及び２６位のＧｌ
ｙをＡｌａに転化する作用を行う。
【００７５】突然変異誘発操作は二重プライミング実験
として参考例２で述べたものと実質的に同一であり、発
現カセットを発現プラスミドに転移させてｐＩＣＩ１２
６６を得た。発酵は実施例１と同一の方法で行った。
【００７６】ｂ）精 製 冷凍細胞ペーストを溶解し、粗ペレットフラクションを
実施例１に記載の方法で分離した。このタンパク質を含
有するペレット中の封入体を実施例１に記載の方法でデ
オキシコール酸（Ｎａ塩）緩衝液により可溶化した。こ
のタンパク質を下記の方法で精製した。
【００７７】粗ペレットフラクション（６０〜１００
ｇ）を解凍しついでＰＴＡ２０プローブを取付けたポリ
トロンホモジナイザーを使用して、設定速度５で２５ｍ
ＭＥＤＴＡ，５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．０（１２
００ｍｌ）に再懸濁させた。懸濁物を室温で３０分間混
合しついでＧＳＡローターを使用するソルバルＲＣ５Ｃ
遠心分離器内で６０００ｘｇで３０分間遠心分離した。
上澄液を廃棄し、ペレットを上記と同一の方法で２回処
理した。ペレットを水（１ｌ）に２回、再懸濁させつい
で実施例１と同様の方法で遠心分離した。その後、実施
例１と同様の方法で精製を行った。
【００７８】実施例７ ［Ｓｅｒ17, 27，Ｌｙｓ49, 58，Ａｌａ44,51,55］ヒト
Ｇ−ＣＳＦの調製 実施例１又は２で述べたごとき［Ｓｅｒ17, 27］Ｇ−Ｃ
ＳＦについての遺伝子を含有する突然変異鋳型Ｍ１３ｍ
ｐ１８を使用して実施例３に述べた方法を繰返した。使
用した突然変異誘発オリゴヌクレオチドは指定のＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．３５及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６（後
に定義）である。
【００７９】ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５においては、ト
リップレットＡＧＣは５１位のＧｌｙをＡｌａに、ま
た、４４位のＰｒｏをＡｌａに転化する作用を行い、ト
リプレットＴＴＴは４９位のＬｅｕをＬｙｓに転化する
作用をする。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６においては、ト
リプレットＴＴＴは５８位のＴｒｐをＬｙｓに転化する
作用を行い、第２のＡＧＣトリプレットは５５位のＧｌ
ｙをＡｌｎに転化する作用を行う。
【００８０】突然変異誘発は参考例２で述べることき二
重プライミング実験として行った。これによって１６個
のプラークが得られた。８個のプラークは実施例３で述
べたごときＤＮＡ塩基配列決定によりスクリーンした。
全てのプラークがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６変異（Ｇｙ
ｌ５５Ａｌａ，Ｔｒｐ５８Ｌｙｓ）を有していたが、い
ずれもＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５変異を有していなかっ
た。実施例１（ｄ）に記載の方法に従ってこれらのプラ
ークから一重鎖ＤＮＡを調製し、突然変異誘発プライマ
ーとしてＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５を使用する単一プラ
イミング突然変異鋳型として使用した。これによって５
０個のプラークが得られ、その中の３個をＤＮＡ塩基配
列決定によりスクリーンし、２個は変異の完全なセット
を有していた。発現カセットを発現プラスミドに転移さ
せてｐＩＣＩ１２９７を得た。発酵と精製は実施例１に
記載の方法で行った。
【００８１】実施例８ ［Ａｒｇ11，Ｇｌｕ15，Ｓｅｒ17,27,60,65 ，Ａｌａ
26, 28，Ｌｙｓ30］ヒトＧ−ＣＳＦの調製 実施例１６で述べたごとき［Ｇｌｕ15，Ｓｅｒ17, 27，
Ａｌａ26, 28，Ｌｙｓ30］ヒトＧ−ＣＳＦについての遺
伝子を含有する突然変異鋳型Ｍ１３ｍｐ１８を使用して
実施例３に述べた方法を繰返した。使用した突然変異誘
発オリゴヌクレオチドは、１１位のＧｌｎをＡｒｇに転
化させる作用を行う、指定のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８
である。修飾された遺伝子を単離し、ｐＩＣＩ００２０
ベクター（実施例１）に連結した。このベクターを使用
して実施例３で述べたこときE.co li菌株ＭＳＤ５２２及
び指定のｐＩＣＩ１３４７を形質転換した。ｐＩＣＩ１
３４７プラスミドＤＮＡをＭＳＤ５２２から単離し、塩
化カルシウム密度勾配遠心により精製し、ＢａｍＨＩで
完全に切断しついでＳａｌＩ（ＢＣＬ）プラスミドＤＮ
Ａ（５μｇ）を、ＢａｍＨＩ（４０単位）及びＳａｌＩ
（５０単位）を含有するＢＣＬ高塩緩衝液（１００μ
ｌ）（５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 ，１００ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭジチオトレイ
トール）中で３７℃で２時間インキュベートした。３Ｍ
酢酸ナトリウム（１０μｌ）と無水エタノール（２５０
μｌ）を添加しかつ−２０℃で２時間冷却することによ
りＤＮＡを沈澱させ、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，
１０分間）により捕集し、真空下で乾燥しついで水（１
０μｌ）に溶解した。試料充填緩衝液(sample loading
buffer) （２μｌ，２ｍＭトリスアセテート ｐＨ７．
８，６ｍＭ ＥＤＴＡ，２０％スクロース，０．２％キ
シレンシアノール及び０．２％ブロモフェノールブルー
を含有）を添加しついで混合物を０．７％アガロース調
製ゲル(preparativegel)〔エチジウムブロミド（０．５
μｇ／ｍｌ）を含有する４０ｍＭトリスアセテート（ｐ
Ｈ７．８）及び１ｍＭＥＤＴＡ中）上に担持させついで
１００Ｖで１時間電気泳動させた。大きなＢａｍＨＩ−
ＳａｌＩベクター断片をジェネクリーン（商標）を使用
して０．７％アガロースゲルから単離した。同様の方法
で実施例３からのｐＩＣＩ１２３９プラスミドＤＮＡを
単離し、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断した。６０及び
６５位にＳｅｒコドンを含有する小さいＢａｍＨＩ−Ｓ
ａｌＩ断片を単離しついで前記したごとき大きなＢａｍ
Ｉ−ＳａｌＩベクター断片に連結した。この混合物を使
用してE.coli菌株ＭＳＤ５２２と、プラスミド指定ｐＩ
ＣＩ１３４８を形質転換した。発酵と精製は実施例６と
同様の方法で行った。
【００８２】実施例９ 発酵工程（実施例１（ｅ）参照）でE.coli菌株ＭＳＤ５
２２の代りにE.coli菌株ＴＧｌを使用して実施例１及び
２の方法を繰返した。
【００８３】実施例１０ ヒト［Ｍｅｒ-1，Ａｒｇ11，Ｓｅｒ17,27,60,65 ］Ｇ−
ＣＳＦの別の抽出法 冷凍細胞ペースト（６４０ｇ）を１ｍｇ／ｍｌのナトリ
ウムアジドを含有する５０ｍＭトリスＨＣｌ，５ｍＭ
ＥＤＴＡ，５ｍＭジチオトレイトール及び２Ｍ尿素から
なる緩衝液（ｐＨ８．０）（５ｌ）中に、ＰＴＡ２０プ
ローブを備えたポリトロンホモジナイザーを使用して設
定速度７／８で４℃で懸濁させた。懸濁物をマントン−
ガウリン ラブ(Manton-Gaulin Lab) ６０／６０ホモジ
ナイーザーを６０００ｐｓｉで通過させることにより溶
菌しついで更に１ｌの追加の緩衝液でフラッシュした。
−２０℃のシングル パス コネイル チラー(single
pass Conair chiller)により冷却した。溶菌液(lysate)
をソルバルＲＣ３Ｃ遠心分離中で５０００ｘｇでＨ６０
００Ａローターを使用して３０分間遠心分離した。
【００８４】上澄液を廃棄しついでペレット（約４５０
ｇ）を上記と同一の緩衝液（１０ｌ）に再懸濁させた。
懸濁液を室温で３０分間混合した後、２基のソルバルＲ
Ｃ３Ｃ遠心分離器中でＨ６０００Ａローターを使用して
５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上澄液を廃棄
し、ペレットを上記と同一の方法で２回処理した。ペレ
ットを２回、水（１０ｌ）に再懸濁しついで５０００ｒ
ｐｍで３０分間遠心分離した。洗浄封入体を含有する最
終ペレットを１ｍｇ／ｍｌのナトリウムアジトを含有す
る５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ８．０（１ｌ）中の２ｗ
／ｖ％のＮ−ラウロイルサルコシンＮａ塩中にポリトロ
ンホモジナイザーを使用して設定速度７で再懸濁させ
た。水（１．５ｍｌ）中の２０ｍＭの硫酸第２銅を添加
した後、混合物を室温で一夜攪拌しついでソルバルＲＣ
３Ｃ遠心分離器中でＧＳＡローターを使用して１０，０
００ｒｐｍで３０分間、遠心分離した。
【００８５】誘導体を含有する上澄液を５μｍフィルタ
ーを通して濾過して粒状物質を除去し、１ｍｇ／ｍｌの
ナトリウムアジドを含有する５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐ
Ｈ８．０（４℃）で６倍に稀釈しついでＳ１０Ｙ１０カ
ートリッジ（１０ｋｄカット−オフ）を取付けた、アミ
コン(Amicon)ＤＣ２０限外濾過装置内で、１ｍｇ／ｍｌ
のナトリウムアジドを含有する１０ｍＭ硫酸ナトリウ
ム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる溶液ｐＨ７．４
（９０ｌ）に対して最大圧力下で限外濾過した(diafilt
er) 。限外濾過の終了が近づくにつれて沈澱が生成し
た。
【００８６】滞留物（２．１ｍｇ／ｍｌの全タンパク
質、１．７ｍｇ／ｍｌの生成物）を容量４ｌのネジブタ
(screw top) 付ポリプロピレン容器内に捕集し、３７℃
で一夜インキュベートした。生成した沈澱をソルバルＲ
Ｃ３Ｃ遠心分離器内で５０００ｒｐｍで４５分間遠心分
離することにより除去し、上澄液を４℃で貯蔵した。
【００８７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びｒｐＨＰＬＣにより
監視した結果から、最終の熱処理中に、混入E.coliタン
パク質、生成物オリゴマー及び分解生成物が選択的に沈
澱し、所望の生成物の約８５％が溶解していることが認
められた。高度に富化された、清澄化された熱処理生成
物溶液は十分に生物学的に活性であり、２０ｍｇ／ｍｌ
の濃度において３７℃で２週間に亘って安定であり、か
つタンパク質加水分解の生起している証拠は認められ
ず、沈澱の生成は２０％以下であった。この生成物は更
にクロマトグラフィー精製を行うためのすぐれた中間体
である。
【００８８】実施例１１ Ｇ−ＣＳＦ及びその誘導体の特性 ［Ｍｅｔ-1，Ｓｅｒ17］Ｇ−ＣＳＦ及びその誘導体（実
施例１〜９）の水溶液（タンパク質濃度約１ｍｇ／ｍ
ｌ）をアミコン(Amicon)ＹＭ１０膜上で４℃で少なくと
も１１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度になるまで濃縮し
た。濃縮中に沈澱が生ずることを防止するために、ｐＨ
５．５の原料溶液を、最初、水酸化アンモニウムを添加
することによりｐＨ８．５に調節して、最終濃度を約
０．２５ｍＭとした。濃縮後、溶液のｐＨは約８．０に
降下した。
【００８９】２０倍の濃燐緩衝液を添加することによ
り、濃タンパク質溶液を１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃
度（１．０のＡ280 を与える１ｍｇ／ｍｌ溶液から評
価）に調整した。１０ｍＭ燐酸ナトリウムと１５０ｍＭ
塩化ナトリウムを含有する溶液，ｐＨ７．４（ＰＢＳ）
中の誘導体の１０ｍｇ／ｍｌ溶液を、タンパク質の均質
性(homogeneity) 、同一性(identity)、生物学的性質及
び溶液安定度を決定するための共通の原液(stock solut
ion)とした。
【００９０】参考例１で述べた方法で調製したＰＢＳ中
の濃度１ｍｇ／ｍｌのヒトＧ−ＣＳＦの原液も調製し
た。
【００９１】各々のタンパク質は還元条件下及び非還元
条件下でのＰＡＧＥ−ＳＤＥ操作及び逆相ＨＰＬＣによ
り、少なくとも９５％が一成分(one component) である
ことが認められた。１１０℃の６ＮＨＣｌ中での酸加水
分解の後、アミノ酸成分の分析を繰返して、各誘導体に
ついてのアミノ酸比を測定し、原液中のタンパク質濃度
の正確な測定を行った。このタンパク質濃度と、少なく
とも６日の異る日に得られたバイオアッセイ値の平均値
とを使用して誘導体の比活性を測定した。選択された誘
導体についてのＮ−末端アミノ酸配列分析とエレクトロ
スプレイ(electrospray)質量スペクトル分析の結果から
所期のアミノ酸配列と分子量を有することが認められ
た。
【００９２】実施例１２ ｔｒｐプロモーターを含有する生産ベクター(productio
n vector) を使用する［Ａｒｇ11，Ｓｅ
ｒ17,27,60,65 ］ヒトＧ−ＣＳＦの調製 ａ）プラスミドｐＩＣＩ１２３９（実施例３に記載）を
前記したごとき方法で緩衝液Ｈ中でＥｃｏＲＩとＳａｌ
Ｉにより切断した。ｔｒｐプロモーター、リボソーム結
合部位及び［Ａｒｇ11，Ｓｅｒ17,27,60,65 ］ｈｕ Ｇ
−ＣＳＦについての遺伝子を含有する小さいＲｃｏＲＩ
−ＳａｌＩ断片をジェネクリーン（商標）を使用して
０．７％アガロースゲルから単離した。ｐＩＣＩ００８
０（比較例６参照）から緩衝液Ｈ中でＥｃｏＲＩ及びＸ
ｈｏＬで切断することによりベクター断片を、調製しつ
いで大きなＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片をジェネクリーン
を使用して０．７％アガロースゲルから単離した。小Ｅ
ｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を前記したごとく２：１よりモ
ル過剰のインサート：ベクターのモル比を使用してＥｃ
ｏＲＩ−ＸｏｈＩベクター断片に連結しついで連結混合
物を使用してE.coli菌株ＭＳＤ５２２を形質転換した。
テトラサイクリン（１５μｇ／ｍｌ）を含有するＬ−ア
ガープレート上で生長させるための形質転換細胞(trans
formant)を選択した。３個のコロニーを選択し、補充剤
(supplement)とテトラサイクリン（１５μｇ／ｍｌ）を
含有するＭ９最小培地（７５ｍｌ）中で３７℃で２０時
間往復振盪器上で生長させた。全細胞溶解物のクーマシ
ーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査することによ
り、タンパク質の蓄積(protein accumulation)を測定し
た。３つのコロニーの全てが［Ａｒｇ11，Ｓｅｒ
17,27,60,65 ］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦ〕を発現した。これら
のコロニーの一つからのプラスミドＤＮＡは指定された
ｐＩＣＩ３２７であり、プロモーターと遺伝子の配列を
前記した標準チェインターミネーター法により確認し
た。
【００９３】ｂ）発 酵 ｐＩＣＩ１３２７をE.coli菌株ＭＳＤ５２２中に転移さ
せ、得られた組換え体を精製し、グリセリンストック上
に−８０℃で保持した。培養株のアリコートをストック
から取り出し、テトラサイクリンのアガープレート上で
ストリークして、３７℃で一夜生長させた後、単一コロ
ニーを分離した。単一の所望のコロニーを取り出しつい
で１０ｍｌのテトラサイクリンに再懸濁させついで直ち
に１００μｌを７５ｍｌのテトラサイクリンブロスを含
有する容量２５０ｍｌの３個のエルレンマイヤーフラス
コの各々に接種した。３７℃で１６時間往復振盪器上で
生成させた後、フラスコの内容物をプールし、２０Ｌ増
殖培地を含有する発酵器に接種するのに使用した。増殖培地の組成 蒸留水を用いて調製 ｇ／ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 ３．０ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ６．０ ＮａＣｌ ０．５ カゼイン加水分解物(Oxoid L41) ２．０ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １０．００ 酵母エキス(Difco) １０．００ グリセリン ３５．００ Ｌ−ロイシン ０．６２５ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．０３ チアミン ０．００８ ＦｅＳＯ4 ／クエン酸 ０．０４／０．０２ 微量元素溶液（ＴＥＳ） ０．５ｍｌ ｌ-1 テトラサイクリン １０ｍｇ ｌ-1 ついで発酵を３７℃の温度でかつ６Ｍ水酸化ナトリウム
溶液を自動的に添加することによって制御されている、
６．７のｐＨで行った。溶解酸素張力(dissolved oxyge
n tension)（ｄＯＴ）の設定点は５０％空気飽和率（ai
r saturation)であり、発酵器の攪拌速度を自動調節す
ることにより当初に制御した。１分当り、容量当り、１
容量（ＶＶＭ）に相当する発酵器への空気流率を当初の
２０ｌ／分から、発酵器攪拌速度がその最大値の８０〜
９０％に到達したとき、５０ｌ／分（２．５ＶＶＭ）に
増大させた。発酵器の酸素移行速度(oxygen transfer r
ate)（ＯＴＲ）は、記載される条件下で５０のＯＤ550
に相当する細胞濃度(celldensity)より大きい細胞濃度
においては、バクテリアの酸素吸収速度(oxygen Uptake
rate)（ＯＵＲ）を満足させることができないので、こ
の細胞濃度より大きい細胞濃度における発酵器内のｄＯ
Ｔは、バクテリアの酸素吸収速度を制限することによ
り、５０％の空気飽和率に保持した。これは培地を炭素
が５０のＯＤ55 0 に制限されるように調製しついで制限
炭素源(limiting carbon source)の栄養(feed)を硫酸ア
ンモニウム及び酵母エキスと共に、バクテリアの生長を
制限する速度で供給することにより達成した。
【００９４】発酵は１８時間行い、この間に光学密度
（ＯＤ550 ）、細胞の乾燥重量及び細胞内の［Ａｒ
ｇ11，Ｓｅｒ17,27,60,65 ］ヒトＧ−ＣＳＦの蓄積を測
定するためのサンプルを採取した。［Ａｒｇ11 ，Ｓｅ
ｒ17,27,60,65 ］ヒトＧ−ＣＳＦの蓄積は、当業者に周
知のごとく、試料バクテリアの全細胞溶解物(lysate)の
クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査する
ことにより測定した。ＯＤ550 が３５に到達したとき
（８．５時間）、カゼイン加水分解物溶液（１００ｇ／
ｌのOxozoid Ｌ４１）を０．７５ｇ／ｌ／時の割合で発
酵器に注入した。
【００９５】ＯＤ550 が約５０に到達したとき、発酵バ
ッチ中の炭素源の供給物が消費され、ｄＯＴが５０％空
気飽和率から急速に上昇した。この時点で、グリセリン
（４７０ｇ／ｌ）、酵母エキス（１１８ｇ／ｌ）及び硫
酸アンモニウム（１１８ｇ／ｌ）を含有する栄養を、元
の速度で発酵器に供給しついで、発酵器を最大値の約７
０〜８０％で攪拌しながら、ｄＯＴを５０％空気飽和率
に保持した。カゼイン加水分解物供給率は全体を通じて
０．７５ｇ／ｌ／時に保持した。約１８時間後、培養液
の顕微鏡検査により大部分の細胞内に大きな封入体(inc
lusion body)の存在が認められたとき、バクテリアをソ
ルバル(Sorval)ＲＣ３Ｂ遠心分離器上で捕集し（７００
０ｇ、３０分、４℃）、−８０℃で冷凍して保存した。
【００９６】ｃ）精 製 精製は、実施例１（ｆ）に記載したごとき方法で行っ
た。
【００９７】実施例１３ Ｔ７Ａ３プロモーターを含有する生産ベクターを使用す
る［Ａｒｇ11，Ｓｅｒ17,27,60,65 ］ヒトＧ−ＣＳＦの
調製
【００９８】ａ）Ｔ７Ａ３プロモーター、ｔｒｐリーダ
ーリボソーム結合部位配列及び［Ｓｅｒ17, 27］ｈｕ
Ｇ−ＣＳＦについての遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ−Ｓ
ａｌＩ断片を、実施例１のｄ）で述べたごとくＭ１３ｍ
ｐ１８中にサブークローンした。ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ
断片の塩基配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５０及び図３に
記載されており、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５０はＥｃｏＲ
Ｉ制限部位（ヌクレオチド１〜６）、バクテリオファー
ジＴ７のＡ３プロモーター配列（ヌクレオチド７〜５
２）、ｔｒｐリーダーリボソーム結合部位配列（ヌクレ
オチド５３−７８）及び翻訳開始コドン（ヌクレオチド
７９−８１）からなる。図３にはＳａｌＩ制限部位で終
結する［Ｓｅｒ17, 27］ヒトＧ−ＣＳＦのヌクレオチド
配列が記載されている。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５０の
３′末端ＡＴＧコドンは、図３においてスレオニン（ア
ミノ酸１）をコードするＡＣＴコドンの直前にあること
は理解されるであろう。従って５′ヌクレオチド配列Ａ
ＡＴＴＣＡＧＴはＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片から欠けて
いる。ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片はｐＩＣＩ１２９５か
ら切り出し(excision)によっても調製し得る（参考例７
参照）。特定部位の突然変異誘発(site-directed mutag
enesis) を、オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤＮｏ．２
８を使用して参考例２に記載されるごとき一重鎖ＤＮＡ
について行って、１１位のＧｌｎをＡｒｇに転化した。
二重鎖ＲＦ ＤＮＡは、Ｇｌｎ11→Ａｒｇ11変異を含有
するプラークから、工程Ｂ３においてインキュベーショ
ンを５時間の代りに３時間行ったこと以外、実施例３に
記載と同一の方法で調製しついでＲｃｏＲＩ（前記した
もの）及びＳｎａ ＢＩ（参考例５に記載）で切断し
た。かく得られた、Ｔ７Ａ３プロモーター、ｔｒｐリー
ダーリボソーム結合部位配列及びＡｒｇ11コドンを有す
る遺伝子断片を含有する１４４ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｓｎａ
ＢＩ断片を単離しついでｐＩＣＩ１３２７からのＥｃｏ
ＲＩ−ＳｎａＢＩ切断ベクター（これはＳｅｒ60及びＳ
ｅｒ65についてのコドンを含有しており、実施例１２に
記載されている）に連結した。連結混合物を使用してE.
coli菌株ＭＳＤ５２２及びテトラサイクリン（１５μｇ
／ｍｌ）を含有するＬ−アガー−プレート上での生長の
ために選択された形質転換細胞を形質転換した。所期の
Ｔ７Ａ３プロモーター及び［Ａｒｇ11，Ｓｅｒ
17,27,60,65 ］ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子配列を含有するコ
ロニーからのプラスミドＤＮＡを、単離されたプラスミ
ドと指定のｐＩＣＩ１３８６からのＤＮＡの塩基配列決
定によって同定した。
【００９９】発酵は異る２種の方法（ｂ）及び（ｃ）に
従って行った。方法（ｂ）は３７℃で行い、１６時間発
酵後においては微生物バイオマス(microbial biomass)
は３５ｇ／ｌであり、［Ａｒｇ11，Ｓｅ
ｒ17,27,60,65 ］ヒトＧ−ＣＳＦは発酵ブロス(ferment
ation broth)１ｌ当り、７ｇまで蓄積されていることが
認められた。方法（ｃ）は３０℃で行い、従って、発酵
温度が低いため、発酵はより遅かった。方法（ｃ）につ
いては、２５時間、微生物バイオマスは５５ｇ／ｌであ
り、［Ａｒｇ11，Ｓｅｒ17, 27,60,65] ヒトＧ−ＣＳＦ
の収量は発酵ブロス１ｌ当り１５ｇまで蓄積されている
ことが認められた。 ｂ）E.coli Genetic Stock Center から入手されたE.co
li菌株ＣＧＣＳ６３００（遺伝子型Ｆ- ，ｘ- ，ｌａｃ
＋）をプラスミドｐＩＣＩ１３８６で形質転換した。得
られた菌株ＣＧＣＳ６３００（ｐＩＣＩ１３８６）を精
製し、グリセリンストック中に−８０℃で保持した。培
養株のアリコートをストックから取り出しついでＬ−テ
トラサイクリンのアガープレート上でストリークし、３
７℃で一夜（１６時間）生長後、単一コロニーを単離し
た。
【０１００】ＣＧＳＣ６３００（ｐＩＣＩ１３８６）の
単一コロニーを取出し、１０ｍｌのＬ−テトラサイクリ
ン中に再懸濁させ、その１００μｌを７５ｍｌのＬ−テ
トラサイクリンブロスを含有する２０個の２５０ｍｌエ
ルレンマイヤーフラスコの各々に接種した。往復振盪器
上で３７℃で１６時間生長後、フラスコの内容物をプー
ルし、２０ｌの変性ＬＣＭ５０増殖培地を含有する発酵
器に接種した。増殖培地の組成を表１に示す。
【０１０１】 表１ 増殖培地の組成 変性ＬＣＭ５０増殖培地（Ａ） 蒸留水を用いて調製 ｇ／ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 ３．０ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ６．０ ＮａＣｌ ０．５ カゼイン加水分解物(Oxoid L41) ２．０ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １０．０ 酵母エキス(Difco) ２０．０ グリセリン ３５．０ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．０３ チアミン ０．００８ ＦｅＳＯ4 ／クエン酸 ０．０４／０．０２ 微量元素溶液（ＴＥＳ） （０．５ｍｌ／ｌ） テトラサイクリン （１０ｍｇ／ｌ） ついで発酵を３７℃の温度でかつ６Ｍ水酸化ナトリウム
溶液を自動的に添加することによって制御されている、
６．７のｐＨで行った。溶解酸素張力（ｄＯＴ）の設定
点は５０％空気飽和率であり、当初、発酵器の攪拌速度
を自動調節することにより制御した。１分当り、容量当
り、１容量（ＶＶＭ）に相当する発酵器への空気流率を
当初の２０ｌ／分から、発酵器攪拌速度がその最大値
（１０００ｒｐｍ）に到達したとき、４５ｌ／分（２．
５ＶＶＭ）に増大させた。発酵は１６時間行い、その間
に培養液の光学密度（ＯＤ550 ）、バイオマス濃度、全
微生物タンパク濃度及びバクテリア細胞内の［Ａｒ
ｇ11，Ｓｅｒ17,27,60,65 ］ヒトＧ−ＣＳＦの蓄積を測
定するためのサンプルを採取した。Ｇ−ＣＳＦの蓄積の
測定は当業者に周知のごとく試料バクテリアの全細胞溶
解物のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走
査することにより行った。全微生物タンパクは Lowryの
方法で測定した。接種してから４．５時間後に、酵母エ
キス（２２５ｇ／ｌ）を１．７ｇ／ｌ／時の割合で発酵
器に注入した。
【０１０２】増殖培地中の炭素源（グリセリン）の供給
物が消費されたとき、ｄＯＴが５０％空気飽和率から急
速に上昇した。この時点で、グリセリン（７１４ｇ／
ｌ）及び硫酸アンモニウム（１４３ｇ／ｌ）を含有する
栄養(feed)を注入した。バクテリア酸素吸収速度（ＯＵ
Ｒ）は、バッチ増殖培地中の炭素源が消費される直前
に、発酵器の最大酸素移行速度（ＯＴＲ）に接近したの
で、バクテリアのＯＵＲを発酵器の最大ＯＴＲの約８０
〜９０％に制限する速度で栄養を発酵器に注入した。供
給速度を手動的に調節して元の値にもどしついでｄＯＴ
を記載された条件下で５０％空気飽和率に保持した。
【０１０３】ｃ）３０℃で３５時間、発酵を行ったこと
以外、ｂ）と同一の方法を繰返した。発酵温度を３０℃
としたこと以外、培地及び発酵条件は（ｂ）と同一であ
った。
【０１０４】精製は実施例１（ｆ）に記載の方法で行っ
た。
【０１０５】実施例１４ ［Ｇｌｕ15，Ｓｅｒ17, 27，Ａｌａ26, 28，Ａｒｇ30］
ｈｕ Ｇ−ＣＳＦの調製 ［Ｇｌｕ15，Ｓｅｒ17, 27，Ａｌａ26, 28，Ａｒｇ30］
ｈｕ Ｇ−ＣＳＦについての遺伝子を含有する突然変異
鋳型、Ｍ１３ｍｐ１８をプラスミドｐＩＣＩ１０８０の
代りにプラスミド１２６６を使用して実施例１の工程
（ｄ）に記載したごとき方法で調製した。上記の鋳型を
突然変異誘発オリゴヌクレオチドと指定されたＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．３８と共に使用して、実施例３に記載した
方法を繰返した。これは３０位のＬｙｓについてのコド
ンをＡｒｇに転化する作用をする。二重鎖ＲＦ ＤＮＡ
を所望の変異を含有する１個のファージから調製した。
ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ発現カセットを単離し、実施例１
２に記載の方法に従ってｐＩＣＩ００８０中にクローン
してｐＩＣＩ１３４３を得た。標題化合物を得るための
他の工程を実施例３に記載の方法で行いついで実施例６
に記載の方法で精製を行った。
【０１０６】実施例１５ ［Ａｒｇ11，Ｓｅｒ17,27,60,65 ］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦの
調製
【０１０７】［Ａｒｇ11，Ｓｅｒ17,27,60,65 ］ｈｕ
Ｇ−ＣＳＦについての遺伝子を含有する突然変異鋳型、
Ｍ１３ｍｐ１８を、プラスミドｐＩＣＩ１０８０の代り
にプラスミドｐＩＣＩ１２３９を使用して実施例１の工
程（ｄ）に記載の方法に従って調製した。上記の鋳型を
突然変異誘発オリゴヌクレオチドと指定されたＳＥＱＩ
Ｄ Ｎｏ．３８と共に使用して実施例３に記載の方法を
繰返した。これは２３位のＬｙｓについてのコドンをＡ
ｒｇに転化する作用を行う。二重鎖ＲＦ ＤＮＡを所望
の変異を含有する１個のファージから調製した。発現カ
セットを単離しついで実施例１４に記載の方法でクロー
ンしてｐＩＣＩ１３８８を得た。標題化合物を得るため
の他の工程及び標題化合物の精製を実施例１に記載の方
法で行った。
【０１０８】実施例１６ ［Ａｒｇ11, 34，Ｓｅｒ17,27,60,65 ］ｈｕ Ｇ−ＣＳ
Ｆの調製
【０１０９】オリゴヌクレオチドと指定されたＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．３８の代りにＳＥＱＩＤ Ｎｏ．３９（こ
れは３４位のＬｙｓについてのコドンをＡｒｇに転化す
る作用を行う）を使用して実施例１５に記載の方法を繰
返してｐＩＣＩ１３８９を得た。標題化合物を得るため
の他の工程及び標題化合物の精製は実施例１に記載の方
法で行った。
【０１１０】実施例１７ ｒｇ11,40 ，Ｓｅｒ17,27,60,65 ］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦの
調製 オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８の代りに
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０（これは４０位のＬｙｓにつ
いてのコドンをＡｒｇに転化する作用を有する）を使用
して実施例１５の方法を繰返してｐＩＣＩ１３９０を得
た。標題化合物を得るための他の工程及び標題化合物の
精製は実施例１に記載の方法で行った。
【０１１１】実施例１８ ［Ａｌａ1 ，Ｔｈｒ3 ，Ｔｙｒ4 ，Ａｒｇ5,11，Ｓｅｒ
17,27,60,65 ］ｈｕＧ−ＣＳＦの調製 オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８の代りに
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４１（これは、１，３，４及び５
位のＴｈｒ，Ｌｅｕ，Ｇｌｙ及びＰｒｏについてのコド
ンを、それぞれ、Ａｌａ，Ｔｈｒ，Ｔｒｙ及びＡｒｇに
転化する作用を有する）を使用して実施例１５の方法を
繰返して、ｐＩＣＩ１３９１を得た。
【０１１２】この実施例のポリペプチドは本発明の修飾
は既知のポリペプチドの溶液安定性を改善するために、
Ｇ−ＣＳＦ活性を有する既知のポリペプチドに適用し得
ることを示している。既知のポリペプチドは［Ａｌ
ａ1 ，Ｔｈｒ3 ，Ｔｙｒ4 ，Ａｒｇ5 ，Ｓｅｒ17］ｈｕ
Ｇ−ＣＳＦであり、これは欧州特許公開第２７２，７
０３号公報（協和発酵化学工業）に記載されている。標
題化合物を得るための他の工程及び標題化合物の精製は
実施例１に記載の方法で行った。
【０１１３】実施例１９ ［Ａｒｇ11，Ｓｅｒ17, 27］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦの調製 オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０の代りに
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８（これは１１位のＧｌｎにつ
いてのコドンをＡｒｇに転化する作用を行う）を使用し
て実施例４に記載の方法を繰返した。発現カセットを実
施例１４に記載される発現プラスミドｐＩＣＩ００２０
の代りに発現プラスミドｐＩＣＩ００８０中に転移させ
てｐＩＣＩ１４０５を得た。標題化合物を得るための他
の工程及び標題化合物の精製は実施例１に記載の方法で
行った。
【０１１４】実施例２０ ［Ｓｅｒ17,27,60,65 ］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦの調製 オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８の代りに
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９（これは６０及び６５位のＰ
ｒｏについてのコドンをＳｅｒに転化する作用を行う）
を使用して実施例１９に記載の方法を繰返してｐＩＣＩ
１４００を得た。標題化合物を得るための工程及び標題
化合物の精製は実施例１に記載の方法で行った。
【０１１５】実施例２１ ［Ａｒｇ11，Ｓｅｒ17,27,60］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦの調製 オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３３及びＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．３４の代りにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２
８及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２を使用して実施例６に
記載の方法を繰返した。これらのオリゴヌクレオチドは
１１位のＧｌｎ及び６０位のＰｒｏについてのコドン
を、それぞれ、Ａｒｇ及びＳｅｒに転化する作用を行
う。発現カセットを発現プラスミドｐＩＣＩ００２０の
代りにｐＩＣＩ００８０に移行させてｐＩＣＩ１４０１
を得た。標題化合物を得るための他の工程及び標題化合
物の精製は実施例１に記載の方法で行った。
【０１１６】実施例２２ ［Ａｒｇ11，Ｓｅｒ17,27,65］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦの調製 オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９の代り
に、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４３（これは６５位のＰｒｏ
についてのコドンをＳｅｒに転化する作用を行う）を使
用して実施例３の方法を繰返してｐＩＣＩ１４１８を得
た。標題化合物を得るための他の工程及び標題化合物の
精製は実施例１に記載の方法で行った。
【０１１７】実施例２３ ［Ｓｅｒ17,27,60］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦの調製 オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８の代りに
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２（これは６０位のＰｒｏにつ
いてのコドンをＳｅｒに転化する作用を行う）を使用し
て実施例１９に記載の方法を繰返してｐＩＣＩ１４２０
を得た。標題化合物を得るための他の工程及び標題化合
物の精製は実施例１に記載の方法で行った。
【０１１８】実施例２４ ［Ｓｅｒ17,27,65］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦの調製 オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０の代りに
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４３（これは６５位のＰｒｏにつ
いてのコドンをＳｅｒに転化する作用を有する）を使用
して実施例４の方法を繰返してｐＩＣＩ１４２０を得
た。標題化合物を得るための他の工程及び標題化合物の
精製は実施例１に記載の方法で行った。
【０１１９】実施例２５ ［Ａｒｇ11，Ｇｌｕ15,111，Ｓｅｒ
17,27,60,65,115,116 ，Ａｌａ26, 28，Ｌｙｓ30］ｈｕ
Ｇ−ＣＳＦの調製 実施例８に記載のプラスミドｐＩＣＩ１３４８を緩衝液
Ｍ中でＸｂａｌＩを用いて、ついで、緩衝液Ｈ中でＳａ
ｌＩを用いて切断しついで大きなＸｂａｌＩ−ＳａｌＩ
ベクター断片を前記した方法で０．７％アガロースゲル
から単離した。実施例４に記載のプラスミドｐＩＣＩ１
２４３を前記したごとくＸｂａｌＩ及びＳａｌＩで切断
しついで小さいＸｂａｌＩ−ＳａｌＩ断片を０．７％ア
ガロースゲルから単離しついで上記ＸｂａｌＩ−Ｓａｌ
Ｉ断片に連結した。連結混合物を使用して、E.coli菌株
ＭＳＤ５２２及びアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含
有するＬ−アガープレート上での生長のために選択され
た形質転換細胞を形質転換した。３つのコロニーを実施
例１２に記載の方法で、但し、テトラサイクリンの代り
に５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを使用して、タンパク
質の発現についてスクリーンした。正しいタンパク質を
発現するコロニーからのプラスミドＤＮＡをｐＩＣＩ１
４２１と指定した。標題化合物を得るための他の工程は
実施例３に記載の方法で行い、その精製は実施例６に記
載の方法で行った。
【０１２０】実施例２６ ［Ａｒｇ11,165，Ｇｌｕ15，Ｓｅｒ17,27,60,65 ，Ｇｌ
ｕ26, 28，Ｌｙｓ30, 58］ｈｕ −ＣＳＦの調製 ［Ａｒｇ11，Ｇｌｕ15，Ｓｅｒ17,27,60,65 ，Ａｌａ
26, 28，Ｌｙｓ30］ｈｕＧ−ＣＳＦについての遺伝子を
含有する突然変異鋳型Ｍ１３ｍｐ１８を、プラスミドｐ
ＩＣＩ１０８０の代りにプラスミド１３４８（実施例８
に記載）を使用して、実施例１（ｄ）の方法で調製し
た。上記の鋳型を使用しかつ突然変異誘発オリゴヌクレ
オチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８及びＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．２９の代りに、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４４及びＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．３２（これらは５３位のＴｒｐについ
てのコドンをＬｙｓに、１６５位のＴｒｙについてのコ
ドンをＡｒｇに転化する作用を有する）を使用して実施
例３の方法を繰返してｐＩＣＩ１４２２を得た。
【０１２１】標題化合物を得るための他の工程は実施例
３に記載の方法で行い、精製は実施例６に記載の方法で
行った。
【０１２２】実施例２７ ［Ａｒｇ11，Ｇｌｕ15，Ｓｅｒ17,27,60,65 ，Ａｌａ
26,28,44,51,55，Ｌｙｓ30,49,58］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦの
調製 突然変異鋳型を実施例２６に記載の方法で調製した。上
記鋳型を使用しかつ突然変異誘発オリゴヌクレオチドＳ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０の代りにＳＥＱ ＩＤＮｏ．４
５（これは４４位のＰｒｏ、４９位のＬｅｕ及び５１位
及び５５位のＧｌｙについてのコドンを、それぞれ、Ａ
ｌａ，Ｌｙｓ，Ａｌａ及びＡｌａに転化する作用を有す
る）を使用して実施例４に記載の方法を繰返してｐＩＣ
Ｉ１４２３を得た。標題化合物を得るための他の工程は
実施例３の方法で行い、精製は実施例６に記載の方法で
行った。
【０１２３】実施例２８ ［Ａｒｇ11,165，Ｇｌｕ15,111，Ｓｅｒ
17,27,60,65,115,116 ，Ａｌａ26,28, 44,51,55，Ｌｙｓ
30, 49,58 ］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦの調製 実施例２７に記載のｐＩＣＩ１４２３をｐＩＣＩ１０８
０の代りに使用して実施例１（ｄ）の方法で突然変異鋳
型を調製した。上記鋳型を使用してかつオリゴヌクレオ
チドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２及びＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．３０の代りにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８及びＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．２９を使用して、実施例３の方法を繰返
してｐＩＣＩ１４２４を調製した。標題化合物を得るた
めの他の工程は実施例３に記載の方法で行い、精製は実
施例６に記載の方法で行った。
【０１２４】参考例１ ヒトＧ−ＣＳＦの調製 ａ）ヒトＧ−ＣＳＦについての合成遺伝子の調製 図２のポリペプチド（ヒトＧ−ＣＳＦ）のアミノ酸配列
をエンコードするＤＮＡ塩基配列を下記の点を考慮して
設計した：
【０１２５】１）プラスミド中の適当な部位での連結を
可能にするための一重鎖粘着末端。 ２）後続の遺伝子操作を促進するための、遺伝子全体に
ついての一連の制限エンドヌクレアーゼ配列。 ３）翻訳停止コドン。 ４）コード領域の５′−末端のコドンはＡ／Ｔが豊富に
なるように選択した。他のコドンはE.coliの発現に好ま
しいコドンとして普通に選択した。遺伝子は１８個のオ
リゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１−ＳＥＱ Ｉ
ＤＮｏ．１８から集成し、これを後記する。
【０１２６】オリゴヌクレオチドの調製 後に示すオリゴヌクレオチド配列をApplied Biosystems
３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザー上で、Applied Biosys
tems Inc. のプロトコールに従って、５′−ジメトキシ
トリチル塩基−保護ヌクレオシド−２−シアノエチル−
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトと０．２ミ
クロモルスケール上で孔制御(pore-controlled) ガラス
支持体に連結された保護ヌクレオチドからApplied Bios
ystemsInc によって提供されるプロトコールに従って調
製した。
【０１２７】別法として、オリゴヌクレオチド配列は
“Oligonucleotide Synthesis, a pratical Approach”
(M.T. Gait編、IRL press, Oxford, Washington DC. 35
〜81頁) にAtkinson及び Smithによって記載されたマニ
ュアル法によって調製し得る。
【０１２８】詳しくは、Applied Biosystems３８０Ａ
ＤＮＡシンセサイザーを使用するオリゴヌクレオチド配
列の調製は下記のごとく行われる：各オリゴヌクレオチ
ドを固体支持体から剥離しついで全ての保護を除去した
後、水（１ｍｌ）に溶解した。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５．６；４０μｌ）とエタノール（１ｍｌ）の溶液を
オリゴヌクレオチド溶液（４００μｌ）に添加しついで
混合物を−７０℃で２０時間貯蔵した。得られた沈澱を
遠心分離（１３，０００ｒｐｍ，１０分間）により回収
しついでペレットをエタノール：水（７：３）（２００
μｌ）で洗浄しついで真空下で短時間乾燥した後、水
（１５μｌ）及びホルムアルデヒド／染料混合物（１０
ｍＭ ＮａＯＨ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％ブ
ロムフェノールブルー，０．０１％キシレンシアノー
ル、８０％ホルムアルデヒド）中に溶解した。
【０１２９】オリゴヌクレオチドを８．３Ｍの尿素を含
有する５０ｍＭトリス−硼酸塩（ｐＨ８．３）中の１０
％ポリアクリルアミドゲル上で精製した。正しい長さの
オリゴヌクレオチドをＵＶ射影(UV shadowing) (Narang
等, 1979, Method in Enzymology, Vol 60, 90−98) −
通常、最も顕著なバンドーにより同定し、ゲルから切り
取りついで５ｍＭトリス硼酸塩（ｐＨ８．３）中で３０
０ｍＶで３〜４時間、電気溶離した。水溶液をｎ−ブタ
ノールで処理することにより（混合、回転及び上部有機
層の除去）、約２００μｌまで濃縮した。精製オリゴヌ
クレオチドをエタノール（２．５容量）を添加すること
により０．３Ｍ酢酸ナトリウム溶液から−７０℃で２０
時間沈澱させた。
【０１３０】遺伝子の集成 オリゴヌクレオチド ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２−ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１７（各々、４００ｐＭ）（後に定義）
を、ＡＴＰ（８００ｐＭ，２５ｐＭのガンマー−32Ｐ
ＡＴＰを含有）、１００μＭのスペルミジン、２０ｍＭ
のＭｇＣｌ2 、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．
０）及び０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液２５μｌ
中で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（３．６単位）を
使用して３７℃で２時間燐酸化した。溶液を１００℃で
５分間加熱して反応を終結させついで表１に示すごとく
対にして(in pair) 混合して、重復体(duplex)Ａ〜Ｉを
得た（オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１及び
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８（２５μｌ中、４００ｍＭ）
は燐酸化しないで使用した）。０．３Ｍの酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ５．６，２００μｌ）とエタノール（８５０μ
ｌ）を添加し、重復体を−２０℃で２０時間沈澱させ
た。得られた沈澱を遠心分離により回収し、エタノー
ル：水（７：３）で洗浄しついで水（５０μｌ）に溶解
した。オリゴヌクレオチドの対を、最初、溶液を沸騰水
浴中で１００℃で２分間加熱することによりアニーリン
グした。次いで浴を４０℃までゆっくり（約４時間）冷
却させた。３対の重復体を含有する溶液を一緒にしてグ
ループＩ〜 IIIを得（表１参照）、凍結乾燥しついでＴ
４ ＤＮＡリガーゼ（１単位；ＢＲＬ）、５０ｍＭのト
リス（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５％
（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００，１ｍｍＡＴＰ、１ｍｍＤＴ
Ｔ(BRL, Focus, vol. ８， No.１, Winter 1986)を含有
する溶液３０μｌに溶解しついでＤＮＡを３０℃で５分
間ついで１６℃で２０時間連結した。３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（２０μｌ）と水（１５０μｌ）を添加しついでエタ
ノール（７５０μｌ）を添加することにより生成物を沈
澱させついで−２０℃で２０時間冷却した。沈澱を遠心
分離により捕集し、エタノール（１ｍｌ）で洗浄し、水
（１５μｌ）及びホルムアルデヒド／染料混合物（１０
μｌ）中に溶解しついで５０ｍＭトリス硼酸塩（ｐＨ
８．３）、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び８．３Ｍ尿素中の１０
％ポリアクリルアミドゲル上で精製した。適当な長さの
ストランド（１７３〜１８６塩基）についてのバンドを
オートラジオグラフィーにより同定し、ついで個々のオ
リゴヌクレオチド配列について述べたごとき方法で単一
ゲルスライスから電気溶離することにより単離した。Ｄ
ＮＡ鎖を最初、水溶液（５０μｌ）を１００℃で２分間
加熱しついで４０℃で４時間、放冷することによりアニ
ーリングした。
【０１３１】グループＩ，II及び IIIを、これらのグル
ープの調製について述べたものと本質的に同一の方法で
連結して、図２に示す遺伝子配列を生成物として得た。
沈澱後、遺伝子を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使
用して、先に個々のオリゴヌクレオチドについで述べた
と同様の方法で燐酸化しついで水（２０μｌ）に溶解し
た。 表 １ 重復体 オリゴヌクレオチド 塩基の数 トップストランド ボトムストランド Ａ SEQ ID No.１＋SEQ ID No.２ ６２ ６４ Ｂ SEQ ID No.３＋SEQ ID No.４ ６０ ６０ Ｃ SEQ ID No.５＋SEQ ID No.６ ４８ ５１ Ｄ SEQ ID No.７＋SEQ ID No.８ ６３ ６０ Ｅ SEQ ID No.９＋SEQ ID No.10 ６３ ６３ Ｆ SEQ ID No.11＋SEQ ID No.12 ６０ ６３ Ｇ SEQ ID No.13＋SEQ ID No.14 ６３ ６０ Ｈ SEQ ID No.15＋SEQ ID No.16 ６０ ６０ Ｉ SEQ ID No.17＋SEQ ID No.18 ５５ ５３ Ｉ Ａ＋Ｂ＋Ｃ １７０ １７５ II Ｄ＋Ｅ＋Ｆ １８６ １８６ III Ｇ＋Ｈ＋Ｉ １７８ １７３
【０１３２】（ｃ）ヒトＧ−ＣＳＦについての合成遺伝
子のクローニング。上記の合成遺伝子をプラスミドベク
ターｐＳＴＰ１(Windass等、Nucleic AcidResearch(198
3), Vol 10, p6639) 中にクローンした。ベクターを調
製するために、１０μｇのＳＴＰ１を水（３７．５μ
ｌ）及び１０ｘＢ制限緩衝液(restriction buffer)
（４．５μｌ）（ＢＣＬ）中に溶解した。制限エンドヌ
クレアーゼＳａｌＩ（３μｌ）（ＢＣＬ，８単位／μ
ｌ）を添加しついで混合物を３７℃で１時間、超らせん
及びニック型(supercoiled and nicked form) プラスミ
ドと比べて線状化(linearised)プラスミドが大量になる
までインキュベートした。ＤＮＡをエタノールを用いて
４℃で３０分間沈澱させ、エタノール：水（７：３）で
洗浄しついで水（３９．５μｌ）及び１０ｘＨ緩衝液
（４．５μｌ）（ＢＣＬ）中に溶解した。制限エンドヌ
クレアーゼＥｃｏＲＩ（１μｌ）（ＢＣＬ，９０単位／
μｌ）を添加しついで混合物を、大きなＥｃｏＲＩ−Ｓ
ａｌＩ断片が主体になるまで３７℃で１時間インキュベ
ートした。ＤＮＡを−２０℃で２０時間沈澱させ、エタ
ノール：水（７：３）で洗浄しついで水（２０μｌ）に
溶解した。
【０１３３】大きなＲｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を１％調
製アガロースゲル上で精製し、電気溶離し、前記したご
とき方法で沈澱させついで水（２０μｌ）に溶解させ
た。合成遺伝子を連結させるために、ベクターＤＮＡ
（ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片溶液，２μｌ）、合成遺伝
子（前記の水溶液５μｌ）、５ｘリガーゼ緩衝液（６μ
ｌ−２５０ｍＭトリス ｐＨ７．６、５０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 、２．５ｗ／ｖ％ＰＥＧ８０００，５ＭＭ ＡＴ
Ｐ，５ｍＭＤＴＴ，ＢＲＬ製）、水（１５μｌ）及びＴ
４ＤＮＡリガーゼ（２μｌ，１Ｕ／ｕｌ）の混合物を１
６℃で４時間インキュベートした。ＤＮＡ混合物（非稀
釈連結混合物１μｌ又は水で５倍に稀釈した連結混合物
２μｌ）を直接使用して、E.coli菌株ＨＢ１０１を形質
転換した。ＤＮＡ混合物（１又は２μｌ）を氷上のコン
ピテントE.coliＨＢ１０１細胞（２０μｌ，ＢＲＬ）に
添加し、混合物を氷上で４５分間インキュベートしつい
で４２℃で４５秒熱衝撃処理を行った。氷上で２分後、
１００μｌのＳＯＣ緩衝液（バクトトリプトン２％；酵
母エキス０．５％；ＮａＣｌ １０ｍＭ；ＫＣｌ ２．
５ｍｍ；ＭｇＣｌ2 ，ＭｇＳＯ4 ２０ｍｍ（各々１０ｍ
ｍ）；グルコース ２０ｍｍ）を添加しついで混合物を
３７℃で１時間インキュベートした。懸濁液のアリコー
トを５０μｌ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ−プレ
ート上に載置した。Maniatis等による“Molecular Clon
ing; A Laboratory Manual”(Cold Spring Harbor)に記
載されまた英国特許出願第８５０２６０５号に記載され
ている標準的方法を使用して、形質転換細胞をコロニー
ハイブリダイゼーション分析により、クローンされた合
成遺伝子についてスクリーニングした。全部で１００個
のコロニーをフィルター（Schleicher及びSchell) 上に
ストリークし、３７℃で２０時間生長させ、溶菌しつい
でベーキング(bake)した。オリゴヌクレオチド配列ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．１からランダム−ラベルキット(lando
m-labelkit)(Pharmacia)を使用して調製した放射性プロ
ーブを使用して、フィルターを６５℃で２０時間、ハイ
ブリダイドした。正のハイブリダイゼーションシグナル
を与える５個のコロニー１〜５を、Ｌブイヨン中で３７
℃で２０時間、小規模で（１００ｍｌ）生長させついで
プラスミドＤＮＡを、Maniatis等による“Molecular Cl
oning; A Laboratory Manual”(Cold Spring Harbor)に
記載される方法と実質的に同一の方法で塩化セシウム密
度勾配遠心により調製した。ＤＮＡの塩基配列の決定は
Sanger等により、“Proc. Nat. Acad. Sci. USA,”74，
5463−5467(1977)に記載される標準チエインターミネー
ター法により、シクイナーゼ(Sequinase) （商標）キッ
ト(United State Biochemical Corporation)を使用して
行った。オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９
〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２３（後に定義；表２参照）を
塩基配列決定プライマー(sequencingprimer) として使
用した。 表 ２ コード 開始部位(priming site) SEQ ID No.19 214 −234 トップストランド SEQ ID No.20 333 −353 トップストランド SEQ ID No.21 375 −395 ボトムストランド SEQ ID No.22 207 −227 ボトムストランド SEQ ID No.23 69 − 93 ボトムストランド
【０１３４】クローン５からのプラスミドＤＮＡは図２
に示すＤＮＡ塩基配列を含有していた。このプラスミド
（ｐＡＧ８８）を使用して標準的手順に従って下記のE.
coli菌株のコンピテント細胞を形質転換した： ＨＢ １０１ ＣＧＣＳ ６３００（以下においてはＭＳＤ５２２とも
称する）
【０１３５】E.coli菌株ＨＢ１０１及びＭＳＤ５２２
（ＣＧＳＣ６３００）は自由に入手し得る。すなわち例
えばこれらの菌株は米国、エール大学のE.coli Genetic
StockCentre から入手し得る。更に、E.coliは例えば
GIBCO Limited Unit 4, CowleyMill Trading Estate, L
ongbridge Way, Uxbridge, UB8 2YG, Middlesex, Engla
nd 又はGIBCO Laboratories, Life Technologies In
c.,3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072, USA.
により供給されるＢＲＬから入手し得る。菌株ＨＢ１０
１の遺伝子型は前記“Molecular Cloning-A Laboratory
Manual"に、Sup E44 hsd S20 (rB - m B -) rec A 13
ara-14 F- leu 6 thi-1 proA2 lac Y1 gal K2 rps L20
xyl- 5 mtl- 1 と記載されている。ＭＳＤ５２２（Ｃ
ＧＳＣ６３００）の遺伝子型は実施例１３に記載されて
いる。
【０１３６】ｃ）ヒトＧ−ＣＳＦの遺伝子の発現ベクタ
ー中へのクローニング 上記遺伝子を実施例１（ｃ）に記載の方法でプラスミド
ｐＩＣＩ中にクローンして、発現プラスミドｐＩＣＩ１
０５６を得た。
【０１３７】ｄ）発 酵 プラスミドｐＩＣＩ１０５６を実施例１（ｅ）に記載の
方法で形質転換しかつ発酵を行って、ヒトＧ−ＣＳＦを
発現させた。
【０１３８】ｅ）精 製 ＰＣＴ特許公告第ＷＯ８７／０１１３２号の第４８頁及
び第４９頁に記載されるヒトＧ−ＣＳＦを大量に生成さ
せるために開発された第２の精製法に記載の方法に従っ
て精製を行いそして最後の透析を燐酸緩衝溶液に対して
行った。
【０１３９】参考例２ 特定部位の突然変異誘発によるヒトＧ−ＣＳＦの誘導体
の遺伝子の調製 Eckstein及び共同研究者によるホスホロチオエート法を
使用した： Taylor, J W et al Nucleic Acids Research (1985) Vo
l pp 8749-8764 Taylor, J W et al Nucleic Acids Research (1985) Vo
l pp 8765-8785 Nakamaye, K et al Nucleic Acids Research (1986) Vo
l pp 9679-9698 Sayers, J R et al Nucleic Acids Research (1988) Vo
l pp 791-802
【０１４０】この方法はAmersham Internationalによっ
て提供されるキットを使用して行い得る。この方法は以
下に概略述べられておりそして２種以上の突然変異誘発
オリゴヌクレオチドを使用すること及び長さが３０塩基
より大きいオリゴヌクレチドについてのインキュベーシ
ョン温度を使用するという点で原法と異る。
【０１４１】１．突然変異体オリゴヌクレオチドの一重
鎖ＤＮＡ鋳型へのアニーリング： 一重鎖ＤＮＡ鋳型（１μｇ／μｌ） ５μｌ 燐酸化突然変異誘発オリゴヌクレオチド（１．６ｐｍｏｌ／μｌ） ２．５μｌ 緩衝液Ｉ ３．５μｌ 水 ６μｌ （２種の突然変異誘発オリゴヌクレオチドを同時に使用
した場合、各々の燐酸化オリゴヌクレオチド（１．６ｐ
ｍｏｌ／１μｌ）２．５μｌを、３．５μｌの緩衝液Ｉ
及び３．５μｌの水中の５μｌの一重鎖ＤＮＡ鋳型（１
μｇ／μｌ）に添加した。３種の突然変異誘発オリゴヌ
クレオチドを使用した場合、各々の燐酸化オリゴヌクレ
オチド（１．６ｐｍｏｌ／μｌ）２．５μｌを、５μｌ
の一重鎖ＤＮＡ（３．５μｌの緩衝液Ｉ及び１μｌの水
中の溶液１μｇ／μｌ）に添加した。上記成分をキャッ
プ付チューブに装入し、オリゴヌクレオチドが３０塩基
以下の長さである場合には、７０℃の水浴中に３時間、
また、オリゴヌクレオチドが３０塩基以上の長さの場合
には、沸騰水浴中に３時間、放置した。ついでチューブ
を３７℃の水浴中に３０分、放置した。
【０１４２】２．突然変異体ＤＮＡ鎖の合成と連結 アニーリング反応溶液に下記の成分を添加した： ＭｇＣｌ2 溶液 ５μｌ ヌクレオチド混合物１（ｄＣＴＰアルファーＳ含有） １９μｌ 水 ６μｌ クレナウ (Klenow) 断片（６単位） １．５μｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ ２μｌ 上記成分を１６℃の水浴中に装入し、一夜放置した。
【０１４３】３．使い捨て遠心分離フィルター装置を使
用する、一重鎖（非突然変異体）(non-mutant)ＤＮＡの
除去。工程２からの反応溶液に水１７０μｌ及び５Ｍ
ＮａＣｌ ３０μｌを添加した。
【０１４４】２５０μｌの試料を前記フィルター装置の
上部の半分に添加し、ソルバルＲＴ６０００Ｂベンチ
トップ(bench top) 遠心分離器内でソルバルＨ１０００
Ｂスイングアウトローターを使用して、室温で１０分
間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。試料を２枚のニト
ロセルロース膜を通過させ、これによって、一重鎖ＤＮ
Ａを結合させ、二重鎖ＤＮＡを以下に述べる捕集チュー
ブに通送した。
【０１４５】１００μｌの５０ｍＭ ＮａＣｌを添加し
てから、再び１０分間回転させて、残留ＲＦ ＤＮＡを
完全に洗浄した。
【０１４６】下記の成分を濾液に添加した： ３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０） ２８μｌ 冷エタノール（−２０℃） ７００μｌ
【０１４７】混合物をドライアイス−エタノール浴中に
２０分装入しついでエッペンドルフマイクロフュージ(E
ppendorf microfuge) 中で遠心分離した。ついでペレッ
トを１０μｌの緩衝液２に再懸濁させた。
【０１４８】ＮｃｉＩを使用する非突然変異体ＤＮＡ鎖
のニッキング。工程３からの反応混合物に６５μｌの緩
衝液３及び８単位のＮｃｉＩ（１μｌ）を添加した。混
合物を３７℃の水浴中に９０分間、放置した。
【０１４９】５．エキソヌクレアーゼIII を使用する非
突然変異体ＤＮＡ鎖の切断。
【０１５０】工程４からの反応混合物に、下記の成分を
添加した： ５００ｍＭ Ｎａｃｌ １２μｌ 緩衝液４ １０μｌ エキソヌクレアーゼIII （５０単位） ２μｌ
【０１５１】混合物を３７℃の水浴中に装入し、３７℃
で３０分間インキュベートした（５０単位のエキソヌク
レアーゼIII は３０分間で約３０００塩基を切断するで
あろう）。ついで混合物を７０℃の水浴中に１５分間装
入して酵素を不活性化した。
【０１５２】６．ギャップト(gapped)ＤＮＡの再重合及
び連結 工程５からの反応混合物に ヌクレオチド混合物２ １３μｌ ＭｇＣｌ2 溶液 ５μｌ ＤＮＡポリメラーゼＩ（４単位） １μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（２．５単位） １μｌ を添加した。混合物を１６℃の浴中に３時間、放置し
た。
【０１５３】７．上記ＤＮＡを使用するコンピテント宿
主E.coliＴＧ１細胞の形質転換。３００μｌの調製直後
のコンピテントE.coliＴＧ１細胞 (Mandel及びHigaの方
法に従って調製) を工程６からの反応混合物２０μｌを
用いて形質転換した（二回）(in duplicate)。形質転換
体をＴＹプレート上のＴＹトップアガー中のロッグ フ
ェーズ(log phase) ＴＧ１のローン(lawn)上に載せ、３
７℃で一夜インキュベートした。
【０１５４】E.coli菌株ＴＧ１は米国、エール大学、E.
coli Genetic Stock Centre 及び英国、Buckinghamshir
e HP7, 9NA, Amersham, Little Chalfont, Amersham Pl
ace,Amersham International plc から、“試験管内”
突然変異誘発システム，オリゴヌクレオチド ダイレク
テッド キッド(Oligonucleotide directed kit)（製品
コードＰＲＮ１５２３）として自由に入手し得る。
【０１５５】参考例３ Ｇ−ＣＳＦ生物学的定量法
【０１５６】英国パターソン研究所(Paterson Institut
e)から入手した因子依存性細胞ライン、パターソン(Pat
erson)−Ｇ−ＣＳＦ（ＦＤＣＰ−Ｇ）をＧ−ＣＳＦの存
在下に限界希釈法によりクローン化した。クローンＥ７
と呼ばれるＧ−ＣＳＦ応答クローンを使用してヒト組換
え体Ｇ−ＣＳＦ活性を測定した。１００μｌのＲＰＭＩ
１６４０＋１０％ＦＣＳに入れた２．５×１０3 ＦＤＣ
Ｐ−ＧクローンＥ７細胞を、Ｇ−ＣＳＦを含有する等容
量のＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳに添加した。各々
のＧ−ＣＳＦ試料は１０回の倍加希釈によって測定し
た。９６個のウエルを有する微量滴定板の各々のウエル
中のＲＰＭＩ１６４０〔Moore GE等のJAMA199 519(196
7)参照〕＋１０％ ＦＣＳ（子牛胎児の血清）の最終容
量は２００μｌであった。微量滴定板を調湿インキュベ
ーター中で４日間５％ＣＯ2 中で３７℃でインキュベー
トした。ウエル１個当りに１．０μＣｉの滴定したチミ
ジンを添加し、最後に６時間に亘ってインキュベートし
た。細胞をガラス繊維の濾紙上に採取し、放射能の濃度
は液体シンチレーション計数によって測定した。滴定し
たチミジン組込みの濃度は存在するＧ−ＣＳＦの量に正
比例することが見出された。ＦＤＣＰ−ＧクローンＥ７
の検定は蛋白質１ｍｇ当り１０8 単位の明示された比活
性を有するアメルシャム インターナショナル社(Amers
ham International)から入手される組換え体のヒトＧ−
ＣＳＦを用いて検量した。
【０１５７】Ｇ−ＣＳＦ試料の効力は既知活性の標準品
と対比することにより測定された。１ｍｌ当りのＧ−Ｃ
ＳＦ活性の単位は次式： 3Ｈ−チミジン組込み 3Ｈ−チミジン組込み Ｇ−ＣＳＦ標準 における５０％の最高 ÷ における５０％の最高 × 品の単位／ｍｌ 増大を与えるＧ−ＣＳ 増大を与える試料の希 活性 Ｆ標準品の希釈率 釈率 により算出した。
【０１５８】参考例４ Ｇ−ＣＳＦ及びその誘導体の溶液安定度
【０１５９】実施例９に記載される４℃で燐酸塩緩衝塩
水（ＰＢＳ）に溶かした、適度に希釈したＧ−ＣＳＦの
原料溶液及び誘導体を溶液安定度について試験した。Ｐ
ＢＳに溶かした１ｍｇ／ｍｌ，５ｍｇ／ｍｌ及び時とし
て１０ｍｇ／ｍｌ蛋白質のＧ−ＣＳＦを含む溶液を３７
℃で１４日間インキュベートした。溶液は沈澱の微候の
有無について一定の間隔で肉眼で検査した。１４日後に
各々の溶液を１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離
し、上澄液を傾シャにより除去し、得られたペレットを
１重量／容量％のＮ−ラウロイルサルコシンを含有する
ＰＢＳに再溶解させた。各々の上澄液及び再溶解した沈
澱物中の全蛋白質含量はＡ280 測定法により評価し、各
々の上澄液及び沈澱物中の単量体含量は逆相ＨＰＬＣに
より評価した。これらの測定値はインキュベーションの
開始時の溶液及び４℃で１４日間インキュベートした１
ｍｇ／ｍｌ溶液により与えられた対応のデータの百分率
として表わした。全蛋白質の評価値と単量体の評価値と
の間の偏差(variation) は再溶解したペレットの若干に
おいてのみ見出された。各々の当初の濃度から上澄み液
に溶解して残留する蛋白質の割合を表に要約する。
【０１６０】インキュベーション後の各々の上澄み液中
の生成物の比活性は原料溶液におけるのと同じであるこ
とが見出され、還元条件下又は非還元条件下でもＰＡＧ
Ｅ−ＳＤＳについて差異は見出されなかった。
【０１６１】次の結果を得た：
【０１６２】＊３７℃で１４日間インキュベートした後
にＰＢＳに溶解して残留した割合（ＵＶにより；入手し
うるＨＰＬＣにより確立した） ｎｄは測定しなかったことを意味する
【０１６３】［Ｍｅｔ-1，Ｓｅｒ17］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦ
は参考例５に記載される如く入手し得る。
【０１６４】上記の結果が証明する所によれば、本発明
の修飾によってＧ−ＣＳＦ活性を減損することなく溶液
安定度を向上させ、［Ｍｅｔ-1，Ｓｅｒ17］ｈｕ Ｇ−
ＣＳＦは５ｍｇ／ｍｌの濃度で３時間以内に沈降し始め
る。
【０１６５】参考例５ ［Ｓｅｒ17］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦの製造 ［Ｍｅｔ-1，Ｓｅｒ17, 27］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦの製造に
ついて実施例２に記載された方法を次の如き以外は反復
した：
【０１６６】１）燐酸化用の重複体をオリゴヌクレオチ
ド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２４，２５，３及び４から
製造し、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３及び４はそれぞれ
実施例１及び２で使用した配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２
６及び２７を置換えたものである。 ２）前記の（１）に記載した重複体をＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼで燐酸化するが、３７℃で２時間１×Ｍ緩
衝液（ＢＣＬ；３０μｌ）中のＳｎａＢＩ（１０単位）
で切断（ダイジェスト）した。 ３）エタノールでの精製に続いて７２ｂｐ ＥｃｏＲＩ
−ＳｎａＢＩ断片（フラグメント）を１４３ｂｐ Ｅｃ
ｏＲＩ−ＭｓｔII断片とは違って精製した。 ４）合成ＥｃｏＲＩ−ＳｎａＢＩ断片を参考例１に記載
の如くプラスミドベクターｐＡＧ８８中にクローン化
し、ベクター製造のためｐＡＧ８８を１×Ｈ緩衝液中の
ＭｓｔIIの代りに３７℃で２時間１×Ｍ緩衝液（ＢＣ
Ｌ；１００μｌ）中のＳｎａＢＩ（２０単位；ＢＣＬ）
で切断した。 ５）エタノールでの沈殿に続いて、大きなＥｃｏＲＩ−
ＳｎａＢＩ断片を、大きなＥｃｏＲＩ−ＭｓｔII断片と
は違って１％のアガロースゲル上で精製した。 ６）［Ｓｅｒ17］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦの遺伝子を含有する
プラスミドをｐＩＣＩ１１０５と称した。
【０１６７】参考例６ ｐＩＣＩ００８０の構成
【０１６８】ａ）ｐＴＢ３５７（こゝではｐＬＢ００４
とも記載する）の構成 天然に見られるプラスミドＲＰ４に見出される如く、プ
ラスミドｐＴＢ３５７は抑制したテトラサイクリン耐性
決定基を利用する。この抑制したプラスミド系ではテト
ラサイクリンの不在下ではｔｅｔＡ遺伝子の発現を遮断
し然るに大抵の薬剤耐性機構は構成発現を有する。
【０１６９】ｔｅｔ遺伝子座はBarth 及びGrinter(J. M
ol. Biol. 113：455 〜474, 1977)によりＲＰ４上に先
ず位置付けられた。このｔｅｔ遺伝子座は隣接遺伝子：
構造上の耐性遺伝子及びｔｅｔＲ、リプレッサー遺伝子
よりなることが示され、この領域を配列した(Klock等、
J. Bacteriol： 161： 326〜332, 1985)。これらの遺伝
子は隣接するＢｇ１II−ＳｍａＩ及びＳｍａＩ−Ｓａｍ
Ｉ断片上に配置された。Ｂｇ１IIの部位はＲＰ４で特異
であるが５個のＳｍａＩの部位(Lanka, Lurz及びFarst
e，Plasmid 10： 303〜307, 1983)がある。
【０１７０】ｉ）ｔｅｔＡ＋ｔｅｔＲ遺伝子のクローン
化 プラスミドＲＰ４は文書に十分記載されており(Datta等
のJ. Bacteriol 108：1244, 1971) 、自由に入手し得
る。更にはプラスミドＲＰ４は承認番号第５００７８及
び５０４３７号としてthe National Collection of Typ
e Cultures, 61Colindale Avenue, London, NW9 5HT に
対して寄託された。このプラスミドを含有するE.coli菌
株は選択的な培養液中で生長させ、プラスミドＤＮＡを
Holmesand Quigley法(Holmes and Quigley, Anal. Bioc
hem 114 ： 193〜197, 1981)を拡大して単離した。プ
ラスミドＤＮＡを２．５Ｍ酢酸アンモニウムでの処理に
より除蛋白を行ないイソプロパノールで再沈澱させた。
このプラスミドＤＮＡを供給者の推奨する条件により制
限酵素Ｂｇ１IIで処理し、完全に切断した。次いで希釈
した酵素及び短かいインキュベーション時間を使用する
ことによりＸｍａＩによって部分的に切断した。Ｘｍａ
ＩはＳｍａＩのイソシゾマーであるがその切断部位で４
−ヌクレオチド粘着末端を産生する。
【０１７１】ベクタープラスミドｐＵＣ８(Yanisch-Per
ron, Vieira and Messing, Gene 33：103 〜119, 1985)
は同様に調製され、ＢａｍＨＩ及びＸｍａＩで完全に切
断した。ＲＰ４断片は１２℃で１６時間Ｔ４リガーゼで
連結することによりこのベクター中にクローン化され
た。このベクターを使用して塩化カルシウム法(Maniati
s 等のCold Spring Harbor Laboratory, 1982)によりコ
ンピテントとしたE.co liＣ６００を形質転換した。次い
で培養物をテトラサイクリン耐性用に選んだ媒質上に配
置した。
【０１７２】E.coliＣ６００は承認番号第ＧＣＳＣ ３
００４号としてE.coli Genetic Stock Centre, Yale Un
iversity, 米国の如き多数のカルチュアコレクションを
含めて多数の供給源から自由に入手し得る。E.coliＣ６
００の遺伝子型はK12 thr-1leu B6 thi-1 hsdS1 lacY1
tonA21 λ- supE44である。
【０１７３】この耐性を有する若干のコロニーを予期し
た表現型について点検した（アンピシリン及びテトラサ
イクリン耐性であるがカナマイシン耐性ではなくＲＰ４
それ自体を表わす）。適当な耐性を有するコロニーをプ
ラスミドＤＮＡの単離によりクローン分析にかけた(Hol
mes and Quigley 法）。これらの調製物をＥｃｏＲＩ及
びＨｉｎｄIII で切断し、ゲル電気泳動により分析し
た。これによってクローン化挿入物の寸法が確立されこ
れはＲＰ４からのＢｇ１II−ＸｍａＩ−ＸｍａＩ断片に
ついて予測された２．４５ｋｂであることが見出され
た。ｔｅｔＡ及びｔｅｔＲ遺伝子を含有するこの断片を
担持したクローンはｐＴＢ３４４と呼ばれた。
【０１７４】ii）ｐＡＴ１５３からｔｅｔ遺伝子の取出
し ＲＰ４からｔｅｔＡ＋ｔｅｔＲカセットを挿入する前に
ベクタープラスミドｐＡＴ１５３からｔｅｔ遺伝子を取
出して、遺伝的不安定性の源となり得る遺伝子複製を防
止することが必要であった。またｔｅｔ遺伝子は非同族
ｔｅｔＲによっては有効に抑制し得ない。取出しはプラ
スミドｐＡＴ１５３ＤＮＡを単離しこれをＥｃｏＲＩ及
びＡｖａＩで切断することにより行なった。これらの部
位の間で配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５９： を有する合成オリゴヌクレオチドをクローン化した。こ
れらの合成オリゴヌクレオチドはＥｃｏＲＩ及びＡｖａ
Ｉ粘着末端に適合し且つＳｐｈＩ，ＢａｍＨＩ及びＣｌ
ａＩ部位を更に含有する。形質転換及び選択後に、コロ
ニーはテトラサイクリン耐性決定基の減損について試験
した。１つのクローンからのプラスミドＤＮＡの配列を
行なって予測した配列が正しいことを確認した。このプ
ラスミドをｐＣＨ１９と呼んだ。
【０１７５】iii)ｔｅｔＡ＋ｔｅｔＲ遺伝子の挿入 ｔｅｔＡ 及びｔｅｔＲ遺伝子はＥｃｏＲＩ乃至ＰｓｔＩ
断片上のｐＴＢ３４４から単離された。ｐＵＣ８ベクタ
ーはＳｓｐＩで処理することにより破壊された。何故な
らｐＣＨ１９と同じ選択決定基（アンピシリン耐性）を
担持するからである。プラスミドｐＣＨ１９ ＤＮＡを
ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し次いでｔｅｔ遺伝子を
担持する２．４５ｋｂ断片で連結した。このプラスミド
を使用してE.coliＣ６００を形質転換し、培養物はテト
ラサイクリン耐性コロニーについて選択しながらプレー
ト アウト(plate out) するものである。ｔｅｔ遺伝子
の挿入は、かくしてｐＣＨ１９のアンピシリン耐性決定
基を失なうべきｐＣＨ１９中のｂｌａ遺伝子の大部分を
置換するように意図された。形質転換体からのアンピシ
リン耐性の減損は確認された。次いで数個のクローンを
使用してプラスミドＤＮＡを単離し、これを制限分析に
かけた。これによって、構成したプラスミドは意図した
構造を有することを確認した。このプラスミドをｐＴＢ
３５１と呼んだ。
【０１７６】iv) ｃｅｒ配列の挿入 天然に産生するプラスミドＣｏｌＥＩはE.coli中にきわ
めて安定に維持されるが、然るにその誘導体ｐＢＲ３２
２及びｐＡＴ１５３は安定に維持されない。Summers 及
びSherratt (Cell, 36：1097〜1103, 1984) が証明した
所によればこれは親プラスミド中に存在するｃｅｒと呼
ばれる短かい（２８３ｂｐ）配列を含有しない誘導体に
よるものである。この配列は部位特異的プラスミドのマ
ルチマーレゾルーション(multimer-resolution) 系を含
有しこれによって相同的な組換えによって形成されたプ
ラスミドマルチマーの集積を防止する。かゝるマルチマ
ーは細菌細胞の分割中の娘プラスミドの安定な遺伝を普
通確保する分配処理に悪影響を有する。
【０１７７】ｃｅｒ配列(Summers；Ｄ等 MGC, 201 , p3
34〜338, 1985)を、ＢａｍＨＩ及びＴａｑＩで切り取る
ことにより２８９ｂｐ断片としてプラスミドｐＫＳ４９
２(D.Sherratt により提供された) から単離した。プラ
スミドｐＴＢ３５１をE.coliのｄａｍ菌株からＤＮＡと
して単離してそのＣｌａＩ部位がｄａｍ＋メチル化系に
よってブロックされるのを防止した。このＤＮＡをＢａ
ｍＨＩ及びＣｌａＩで切取った（これらの部位の両方共
このクローン化用の合成オリゴヌクレオチド上に導入さ
れていた）。ｃｅｒ断片を切断ベクターで連結し、次い
でこれを使用してE.coliＣ６００を形質転換し、選択は
テトラサイクリンについて成された。形質転換体コロニ
ーはＡｖａＩ制限及びゲル電気泳動によりクローン分析
を行なった。約３００ｂｐの追加のＤＮＡバンドの存在
はｃｅｒ断片の獲得を示した。別の制限分析を使用して
得られるプラスミドが適当な構造を有することを確認し
た。これらのプラスミドの１つはｐＴＢ３５７（図５）
と呼び、またｐＬＢ００４と呼んだ。
【０１７８】ｂ）プラスミドｐＣＨ１０１ プラスミドｐＣＨ１０１はｐＩＣＩ００２０（実施例１
ｃ参照）に相当するが、但しＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片
（図１参照）はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５３（図６参照）
及び Edge M.D.等のNucleic Acids Research 1983, Vol
11, p6419〜6435によって記載される如くインターフェ
ロンα2 遺伝子配列によって置換された。この点におい
て、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５３の３′−末端ＡＴＧコド
ンは、前記の Edge M.D.等のNucleic Acids Research r
eferenceのインターフェロンα2配列中のシステイン
（アミン酸１）をコードするＴＧＴコドンの直前に存在
する。かくして５′ヌクレオチド配列ＧＡＴＣＣＡＴＧ
及び相補的な３′ヌクレオチド配列ＧＴＡＣは前記文献
のヌクレオチド配列から省略される。
【０１７９】ｃ）ｐＴＢ３５７中への表現カセットの挿
入 ｔｒｐ プロモーター、リボソーム結合部位及びインター
フェロンα2 遺伝子よりなる表現カセットを、ＥｃｏＲ
Ｉ乃至ＳｐｈＩ制限断片上のプラスミドｐＣＨ１０１
（前記の（ｂ）参照）から単離した。この表現カセット
をＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩで同様に切り取った製造ベク
ター（ｐＴＢ３５７）（前記の（ａ）参照）中に連結さ
せた。このＤＮＡを使用してE.coliＣ６００のコンピテ
ント培養物を形質転換させ、テトラサイクリン耐性コロ
ニーを単離した。これらのコロニーの若干を、表現カセ
ット上に担持したＳｓｔＩ制限部位の獲得についてＤＮ
Ａクローン分析により試験した。この点に関して正のク
ローンは予期した構造が正確であるかを点検するために
制限マッピング(mapping) により更に試験した。クロー
ンはまたクーマシーブルーで染色したポリアクリルアミ
ド−ＳＤＳゲルについて分析した如くインターフェロン
α2 蛋白質を製造するための授与能力について点検され
た。１つのかゝる確認したクローンをφＬＢ００５と呼
んだ。
【０１８０】ｄ）ｐＴＢ２４４中へのＴ４転写終結体の
挿入 ＳａｌＩ 乃至ＨｉｎｄIII 断片（長さ６７個の塩基対）
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５１及び図４ａ参照）の形のＴ
４転写終結体（ターミネーター）配列を、ＳａｌＩとＨ
ｉｎｄIII との部位同志間の中間ベクターｐＴＢ２４４
（欧州特許公告第２３７，２６９号に記載）のマルチク
ローン化部位中に挿入した。クローン分析を使用してこ
の構造物（ｐＴＢ２４４ Ｔ４ｔｅｒ）の構造を確認し
た。このベクターから、マルチクローン化部位の大部分
とＴ４終結体とを含有するＳｓｔＩ乃至ＳｐｈＩ断片を
次いで単離した。この断片をＳｓｔＩ及びＳｐｈＩで同
様に切り取ったｐＬＢ００５中に挿入し、これによって
インターフェロンα2 遺伝子を置換するが、ｔｒｐプロ
モーター、マルチクローン化部位及びＴ４終結体よりな
るカセットを残しておく。この構造物はクローン分析に
よって確認され、該プラスミドをｐＬＢ０１３と呼ん
だ。
【０１８１】ｅ）マルチクローン化部位の置換 ｐＬＢ０１３中のマルチクローン化部位は若干の点でこ
のベクターには理想的ではない：ＳａｌＩ，ＢａｍＨＩ
及びＳｍａＩの部位は特異的でなくプラスミド上の他の
所にも存在する。それ故この断片はＳｓｔＩ及びＸｂａ
Ｉ（両方共独特である）で切断することにより切り出さ
れ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５４の配列： 5′ AGCTCCATATGGTACCAGATCTCTCGAGAGTACTT GGTATACCATGGTCTAGAGAGCTCTCATGAAGATC 5′ を有する合成オリゴヌクレオチドをその場に挿入した。
クローンは新しい制限部位の獲得について分析し次いで
配列決定により確認した。１つのかゝるプラスミドをｐ
ＬＢ０１４と呼んだ。この仕方で挿入した新しいクロー
ン化部位は：ＮｄｅＩ，ＫｐｎＩ，ＢｇｌII，ＸｈｏＩ
及びＳｃａＩであり、これらの部位に続いて先のＸｂａ
Ｉ及びＳａｌＩを有する。
【０１８２】ｆ）更なる修飾 ｐＬＢ０１４中の隣接ＳｓｔＩ及びＮｄｅＩ部位は、恐
らくはそれらのきわめて接近した位置の故に同時には又
は順次にはの何れかでこれら両方の制限酵素によって切
断できないことが見いだされた。それ故追加の配列をこ
れらの間に挿入した。これは、ｐＬＢ０１４をＳｓｔＩ
及びＫｐｎＩで切り取り次いでＳＥＱＩＤ Ｎｏ．５５ の合成オリゴヌクレオチドを挿入することにより行なっ
た。クローンは追加のＰｖｕII又はＰｓｔＩ部位の獲得
について分析し次いで配列化により確認した。１つのか
ゝるプラスミドをｐＬＢ０１５（ｐＩＣＩ００８０）
（図７参照）と呼んだ。このプラスミドはｐＬＢ０１４
とは異なってＳｓｔＩ及びＮｄｅＩによって有効に切り
取られる。これによって上流側のｔｒｐプロモーターに
関して且つ予期すべき遺伝子のＡＴＧ開始コドンを与え
るのに意図されるＮｄｅＩに関して正確に配置された種
々のリボソーム結合部位の配列を挿入する場所を提供す
るものである。
【０１８３】参考例７ プラスミドｐＩＣＩ１２９５（ｐＣＧ３００とも記載）
の構成
【０１８４】ａ） ｐＩＣＩ１０７９からｐＣＧ５４の
調製 ｐＩＣＩ１０７９はＥｃｏＲＩとＳｔｙｌＩとの制限部
位同志間に次の要素： （ｉ） ファージλからのＣＩ８５７； （ii） λPLプロモーター； （iii) 合成リボソーム結合部位； （iv) 合成インターフェロンα2 遺伝子配列； （ｖ) ＳａｌＩとＳｔｙＩとの制限部位の間でファー
ジＴ４から誘導された合成転写終結体配列； を収容するアンピシリン耐性のｐＡＴ１５３−誘導プラ
スミドである。この転写終結体のＤＮＡ配列を図４及び
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５６に示す。
【０１８５】ｐＩＣＩ１０７９を図８に例示する。ｐＩ
ＣＩ１０７９はブタペスト条約により英国のNational C
ollections of Industrial and Marine Bacteria Limit
ed（ＮＣＩＭＢ）に寄託されている（ＮＣＩＭＢ Ｎ
ｏ．４０３７０，寄託日１９９１年２月１９日）。ｐＣ
Ｇ５４は前記と同じプロモーター、リボソーム結合部位
及び転写終結体配列即ちλPL，ＲＢＳ７及びＴ４を含有
するが特異な蛋白質を調製するのにコードする遺伝子配
列を欠いている表現ベクターを利用し得るために構成さ
れた。かゝる構造体は、次後のクローニング操作によっ
てこのベクター中に導入し得る何れかの有用な蛋白質を
調製するために転写及びホン訳を可能とする必須成分含
有の塩基性表現ベクターの才能を提供するものである。
【０１８６】表現ベクターの構成は、それぞれのＥｃｏ
ＲＩ及びＳａｌＩ部位でｐＩＣＩ１０７９の制限エンド
ヌクレアーゼ開裂によって開始された。この開裂工程に
よって、プラスミドの複製及び抗生物質耐性機能の遺伝
子プラスＴ４転写終結体配列で完成するｐＩＣＩ１０７
９バックボーンを含有するベクター断片を放出した。該
断片を、ＤＮＡ断片の最終精製用のゼネクリーン(Genec
lean) を使用してアガロースゲル精製工程によって単離
した。
【０１８７】このベクター断片に、寸法が大体１．２ｋ
ｂのより小さな別のＤＮＡ断片を導入した。この別のＤ
ＮＡ断片は例えばＤＮＡ合成によって又は前記の如くｐ
ＩＣＩ１０７９から得られた小さなＥｃｏＲＩ−Ｓａｌ
Ｉ制限断片の特定部位の突然変異誘発又はＰＣＲ突然変
異誘発によって得ることができる。この別の断片はｐＩ
ＣＩ１０７９に当初から存在するのと正しく当量のプロ
モーターとリボソーム結合部位配列とを含有し且つ更に
はそれぞれその５′及び３′末端で利用できるＥｃｏＲ
Ｉ及びＳａｌＩ部位とを有し、こうしてｐＩＣＩ１０７
９断片に連結するための相溶性末端を提供するものであ
る。Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びそ
のそれぞれの緩衝液の存在下で連結反応を行なうと構成
物ｐＣＧ５４が形成された。
【０１８８】この構成物を含有するクローンは、或る分
量の連結反応混合物を菌株ＨＢ１０１のE.coliコンピテ
ント細胞に形質転換させるのに続いて当初から単離され
た。回収した構成物ｐＣＧ５４は寸法が３，６８２ｋｂ
であり、図９に特徴付けたマップに概説した必須要件を
含有した。
【０１８９】ｂ）ｐＣＧ５４からｐＣＧ６１の調製（ｐ
ＩＣＩ５４とも記載） 合成オリゴヌクレオチド配列は、Ｔ７Ａ３プロモーター
用の自然の配列と、これに隣接してクローン化した何れ
かのポリペプチド遺伝子配列の正確な処理を可能とする
有効なホン訳開始領域を提供する配列との両方を含有す
るように設計された。この後者領域用の適当な候補配列
はＲＢＳ１、ｔｒｐリボソーム結合配列と同定された。
それ故ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５７及びＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．５８として同定された２種の相補的なオリゴヌクレ
オチドは、Ｔ７Ａ３プロモーターとＲＢＳ１配列とを組
入れた二本鎖ＤＮＡリンカーを生成するのに合成され
た。
【０１９０】オリゴヌクレオチドはＡＢＩ遺伝子シンセ
サイザーを用いて標準の記録書によって８４量体（８４
ｍｅｒｓ）として調製された。オリゴヌクレオチドは、
二本鎖形において合成断片がそれぞれ５′及び３′末端
で制限エンドヌクレアーゼ酵素の部位ＥｃｏＲＩ及びＫ
ｐｎＩを有するように設計された。それらの長さによ
り、オリゴマーはＨＰＬＣによって精製できず、精製は
１０％アクリルアミド：７Ｍ尿素ゲルを用いてアクリル
アミドゲル電気泳動により行なった。
【０１９１】精製前に、オリゴマーはそれらが正確な寸
法を有するのみならずまた調製した試料がそれらの最大
割合として所要のオリゴマーを含有し、合成の副生物と
して生ずるより小さな二次的な汚染性オリゴヌクレオチ
ドを高割合で含有しないように確保するためにサイジン
グ ゲル(sizing gel)について先ず点検した。
【０１９２】アクリルアミドゲルはゲル重合用の触媒と
して使用した過硫酸アンモニウム及びＮ，Ｎ，Ｎ′，
Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミンを用いての標準法
により調製した。オリゴヌクレオチドのサイジングは電
気泳動後にそれらが肉眼で見えるように必要とされる。
それ故32ｐを用いて試験を放射能で識別することが必要
であった。これによって電気泳動に続いてオートラジオ
グラフィーにより試料の特性を評価することができた。
【０１９３】オリゴヌクレオチド試料は燐酸化せずに粗
製の形で供給された。酵素Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いて燐酸化により試料を５′末端で高温標識でき
る点で放射能識別の目的でこの要因を使用した。
【０１９４】オリゴマーは燐酸化しない形での合成から
提供され、こうして精製後には各々のオリゴマーは燐酸
化反応を個々に受け、そこでＡＴＰを使用してＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼの存在下に各々の分子の５′末端
を燐酸化した(Molecular Cloning: A Laboratory manua
l ２版，Sambrook, Fristch 及びManiatis, p5,68〜5,
71参照) 。燐酸化したからには、２個の相補的なオリゴ
ヌクレオチドは互いにアニーリングされてＴ７Ａ３プロ
モーターとＲＢＳ１配列とを含有する二本鎖ＤＮＡ重複
体を形成した。
【０１９５】ベクター分子ｐＣＧ５４は制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＫｐｎＩで開裂された。制限切断により、λPL
プロモーターとＲＢＳ１配列とを含有する２．３ｋｂベ
クター断片と１．１ｋｂ断片とを生成した。このクロー
ン化はλPL−ＲＢＳ１配列を、Ｔ７Ａ３−ＲＢＳ１配列
含有ＥｃｏＲＩ〜ＫｐｎＩ合成断片で置換するように計
画される。ｐＣＧ５４の切断から得られる２．３ｋｂベ
クター断片は、アガロース断片からＤＮＡを取出すため
アガロースゲル電気泳動及びゼネクリーン方法を用いて
通常の記録書により精製した。
【０１９６】８４ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ合成断片
を、前述の如く調製したベクター分子に連結させ、連結
したＤＮＡを使用してE.coliＨＢ１０１細胞を形質転換
した。正の組換え体クローンの選択はアンピシリン耐性
によるものであった。形質転換に続いて、組換えプラス
ミドを含有する多数のコロニーをスクリーニングの目的
に選択した。
【０１９７】クローニング中にベクターに組込まれた合
成フラグメントは、簡単なスクリーニング方法として組
換えプラスミドＤＮＡ試料の制限分析を不適当とさせる
ような寸法（８４量体）を有するものであった。かゝる
小さな寸法の挿入物はアガロースゲル電気泳動によって
は容易に明らかでない。断片それ自体は、その存在の診
断となり得る内部制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含
有しない。それ故組換えクローンの最初のスクリーニン
グはコロニーハイブリダイゼーション(hybridisation)
の方法によるものであった(Grunstein及びHogness Pro
c. Natl Acad,Sci 72, 3961(1957) 参照) 。組換え体
クローンからの不動化プラスミドＤＮＡを含有するニト
ロセルロースフィルターは、合成アニール化オリゴヌク
レオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５７及びＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．５８の無作為放射性標識によって調製されたプロ
ーブに対してハイブリッド化した。ＤＮＡはα32Ｐ−ｄ
ＣＴＰを用いて標識し、３７℃で２時間クレナウ(Kleno
w)ポリメラーゼを用いてインキュベーションを行なっ
た。正のハイブリダイゼーション反応を生成する組換え
体コロニーはプラスミドＤＮＡ調製のために選択され
た。プラスミドＤＮＡは純度を確保するように、ＣｓＣ
ｌ勾配密度の遠心分離を組入れた比較的大規模の方法に
よって各々の場合に調製された。“Molecular Cloning
- A laboratory manual ”第２版、Sambrook, Fritsch
及び Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)
p1,42〜1,52参照。かゝる方法によってＤＮＡを調製す
ると次後のクローン化操作及び配列分析に使用するのに
適当な高品質ＤＮＡ物質を確保する。
【０１９８】組換え体クローンから単離した全てのプラ
スミドＤＮＡを配列分析により第２のスクリーン中に包
含させて、クローン化接合部でのオリゴヌクレオチド配
列及びＴ７Ａ３−ＲＢＳ１断片それ自体のオリゴヌクレ
オチド配列は絶対に正しいように確保する。使用した配
列用の記録書（プロトコール）はセクエナーゼ(Sequena
se) の記録書であり、使用するのに選択した配列用プラ
イマーは例えばｐＢＲ３２２ＵＰ（ｐＢＲ３２２ユニバ
ーサルプライマ）であった。塩基配列決定はSangerジデ
オキシ連鎖終結配列技術を用いて行なった。適当な配列
を有するクローンは新規な表現構成物ｐＣＧ６１として
表示され、Ｔ７Ａ３プロモーターとＲＢＳ１配列とＴ４
ターミネーター配列とを含有した（図１０参照）。
【０１９９】ｃ）ｐＣＧ６１からｐＣＧ３００（ｐＩＣ
Ｉ１２９５として記載した）の調製 Ｇ−ＣＳＦ同族体［Ｓｅｒ17, 27］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦの
構成に伴なう配列工程及び合成工程は実施例１に記載さ
れる如くである（図３参照）。このＧ−ＣＳＦ同族体配
列は、遺伝子をプラスミドｐＳＴＰ１に組入れてｐＩＣ
Ｉ１１０７を得た構造物から単離された（実施例２参
照）。ｐＩＣＩ１１０７をＳｃａＩで切断し、大きな断
片はアガロースゲル電気泳動及びゼネクリーン精製に続
いて単離された。次いでこの断片を制限酵素エンドヌク
レアーゼＳａｌＩで切断して、ｐＣＧ６１にクローン化
するのに適当なＳｃａＩ〜ＳａｌＩ制限断片上に［Ｓｅ
ｒ17 ,27 ］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を生成した（図１０
参照）。
【０２００】ＳａｌＩでの制限に続いて所要の断片は再
びアガロースゲル精製技術を使用して単離した。ベクタ
ー分子ｐＣＧ６１は制限酵素Ｋｐｎ１で切断した。この
酵素を用いての開裂では３′−オーバーハング(overhan
g)を生成し次いでこれを酵素Ｔ４ポリメラーゼの使用に
よりブラントエンドとさせた“Molecular Cloning - a
Laboratory manual ”第２版、Sambrook, Fritsch 及び
Maniatis p5,44〜5,47参照。Ｔ４ポリメラーゼ活性は
７０℃で３０分間インキュベーションすることにより熱
不活性化され、ＤＮＡはエタノール沈澱により回収され
た。得られるペレットを無菌蒸留水に溶解させ、溶解し
たＤＮＡをＳａｌＩで開裂した。ＫｐｎＩ（今やブラン
トエンドとした）〜ＳａｌＩベクター断面は、エタノー
ル沈澱続いてのアガロースゲル電気泳動及び精製技術に
より回収した。
【０２０１】次いでＳｃａＩ〜ＳａｌＩ［Ｓｅ
ｒ17,27 ］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦ断片を、ブラトエンドとさ
せたＫｐｎＩ〜ＳａｌＩベクター中に連結させた。連結
したＤＮＡをE.coli菌株ＨＢ１０１中に形質転換させ
た。組換え体クローンの選択はアンピシリン耐性につい
てであった。
【０２０２】強力な組換え体クローンの最初のスクリー
ニングはハイブリダイゼーションにより行なった。放射
能標識のプローブはプラスミドｐＩＣＩ１１０７から調
製したＥｃｏＲＩ〜ＳａｌＩ断片（［Ｓｅｒ17, 27］ｈ
ｕ Ｇ−ＣＳＦ遺伝子配列を含有する）を無作為に標識
付けすることにより調製された。このプローブを、ＤＮ
Ａがニトロセルロースフィルターの表面上に固定された
コロニーに対するハイブリダイゼーションで使用した。
続いてプラスミドＤＮＡはこのスクリーンでハイブリダ
イズされた２４個のクローンから調製した。全てのＤＮ
Ａ調製は迅速なミニ調製法によるものであった。Birnbo
in及びDolyのNucleic Acids Research,７, 1513, 1979
参照。これらの組換え体ＤＮＡ調製物は制限分析により
別のスクリーンにかけた。表現カセット内で特異な部位
である、ＢａｍＨＩを有するＤＮＡの線状化(lineariza
tion) は［Ｓｅｒ17, 27］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦ配列の存在
を示すものである。
【０２０３】配列の分析を行なって［Ｓｅｒ17, 27］ｈ
ｕ Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の存在を確認し且つクローン化接
合部の塩基配列及び［Ｓｅｒ17, 27］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦ
遺伝子全体に亘っての塩基配列は正しく適当であること
を立証した。この目的のために、純度を確保するＣｓＣ
ｌ勾配密度遠心分離技術を用いて１６個の組換え体クロ
ーンから大規模プラスミドＤＮＡ試料を調製した。配列
決定工程は配列記録書により行ない、選択した配列決定
プライマーはｐＢＲ３２２ユニバーサルプライマー（Ｅ
ｃｏＲＩ）であった。組換え体クローンの２種は［Ｓｅ
ｒ17, 27］ｈｕＧ−ＣＳＦ断片のＳｃａＩ末端で且つＧ
−ＣＳＦペプチド配列それ自体に亘って正しい塩基配列
を含有した。クローンは表現構成物ｐＣＧ３００として
同定された（図１２参照）。
【０２０４】
【０２０５】
【０２０６】
【０２０７】
【０２０８】
【０２０９】
【０２１０】
【０２１１】
【０２１２】
【０２１３】
【０２１４】
【０２１５】
【０２１６】
【０２１７】
【０２１８】
【０２１９】
【０２２０】
【０２２１】
【０２２２】
【０２２３】
【０２２４】
【０２２５】
【０２２６】
【０２２７】
【０２２８】
【０２２９】
【０２３０】
【０２３１】
【０２３２】
【０２３３】
【０２３４】
【０２３５】
【０２３６】
【０２３７】
【０２３８】
【０２３９】
【０２４０】
【０２４１】
【０２４２】
【０２４３】
【０２４４】
【０２４５】
【０２４６】
【０２４７】
【０２４８】
【０２４９】
【０２５０】
【０２５１】
【０２５２】
【０２５３】
【０２５４】
【０２５５】
【０２５６】
【０２５７】
【０２５８】
【０２５９】
【０２６０】
【０２６１】
【０２６２】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で述べられている１６７ｂｐ断面のヌ
クレオチド配列を示す。
【図２】天然ヒトＧ−ＣＳＦ及び制限部位のアミノ酸配
列及び対応するヌクレオチド配列を示す。
【図３】〔Ｓｅｒ17,27 〕ｈｕＧ−ＣＳＦ及び制限部位
のアミノ酸配列及び対応するヌクレオチド配列を示す。
【図４】（ａ）末端ＳａｌＩ及びＨｉｎｄ III制限部位
及び（ｂ）末端ＳａｌＩ及びＳｔｙＩ制限部位を有す
る、Ｔ４転写ターミネーターのヌクレオチド配列を示
す。
【図５】ｐＴＢ３５７（ｐＬＢ００４とも称する）の制
限マップを示す。
【図６】参考例６（ｂ）述べられているが、インターフ
ェロンα2 遺伝子配列は省略されているＲＣＯＲＩ−Ｓ
ａｌＩ断片のヌクレオチド配列を示す。
【図７】ｐＬＢ０１５（ｐＩＣＩ００８０とも称する）
の制限マップを示す。
【図８】ｐＩＣＩ１０７９の制限マップを示す。
【図９】ｐＩＣＩ５４（ｐＣＧ５４とも称する）の制限
マップを示す。
【図１０】ｐＣＧ６１の制限マップを示す。
【図１１】ｐＩＣＩ１１０７の制限マップ（斜線部分は
〔Ｓｅｒ17,27 〕ｈｕＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子配
列を表わす）を示す。
【図１２】ｐＣＧ３００（ｐＩＣＩ１２９５とも称す
る）の制限マップを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成４年９月１７日
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図５】
【図７】
【図２】
【図６】
【図３】
【図４】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 15/14 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ９１０２７９９．５ (32)優先日 1991年２月11日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (72)発明者 カー，ヒーター イギリス国．チエシヤー・マツクレスフイ ールド．オルダーレイ・パーク（番地その 他表示なし) (72)発明者 テイムス，デービツド イギリス国．チエシヤー・マツクレスフイ ールド．オルダーレイ・パーク（番地その 他表示なし) (72)発明者 ウイルキンソン，アントニー・ジエームス イギリス国．チエシヤー・マツクレスフイ ールド．オルダーレイ・パーク（番地その 他表示なし)

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 自然に産生する（自然産生）Ｇ−ＣＳＦ
    の生物学的活性の少なくとも１つと５ｍｇ／ｍｌにおい
    て少なくとも３５％の溶液安定度（後に定義されてい
    る）とを有する自然産生Ｇ−ＣＳＦの誘導体であって、
    自然配列の少なくともＣｙｓ17がＳｅｒ17残基によって
    置換されておりまた自然配列のＡｓｐ27がＳｅｒ27残基
    によって置換されていることを特徴とする自然産生Ｇ−
    ＣＳＦの誘導体。
  2. 【請求項２】ａ）自然配列のＬｅｕ15の、Ｇｌｕ15残基
    による置換； ｂ）自然配列のＬｙｓ23の、Ａｒｇ23残基による置換； ｃ）自然配列のＧｌｙ26の、Ａｌａ26残基による置換； ｄ）自然配列のＧｌｙ28の、Ａｌａ28残基による置換； ｅ）自然配列のＡｌａ30の、Ｌｙｓ30又はＡｒｇ30残基
    による置換； ｆ）自然配列のＬｙｓ34の、Ａｒｇ34残基による置換； ｇ）自然配列のＬｙｓ40の、Ａｒｇ40残基による置換； ｈ）自然配列のＰｒｏ44の、Ａｌａ44残基による置換； ｉ）自然配列のＬｅｕ49の、Ｌｙｓ49残基による置換； ｊ）自然配列のＧｌｙ51の、Ａｌａ51残基による置換； ｋ）自然配列のＧｌｙ55の、Ａｌａ55残基による置換； ｌ）自然配列のＴｒｐ58の、Ｌｙｓ58残基による置換； ｍ）自然配列のＰｒｏ60の、Ｓｅｒ60残基による置換； ｎ）自然配列のＰｒｏ65の、Ｓｅｒ65残基による置換； ｏ）自然配列のＰｒｏ111 の、Ｇｌｕ111 残基による置
    換； ｐ）自然配列のＴｈｒ115 の、Ｓｅｒ115 残基による置
    換； ｑ）自然配列のＴｈｒ116 の、Ｓｅｒ116 残基による置
    換；及び ｒ）自然配列のＴｙｒ165 の、Ａｒｇ165 残基による置
    換； から選ばれた少なくとも１つの追加の修飾を有する請求
    項１に記載の誘導体。
  3. 【請求項３】ａ）自然配列のＧｌｎ11，Ｐｒｏ
    60,65 の、Ａｒｇ11，Ｓｅｒ60,65 による置換； ｂ）自然配列のＡｌａ111 ，Ｔｈｒ115,116 の、Ｇｌｕ
    11，Ｓｅｒ115,116 による置換； ｃ）自然配列のＧｌｎ11，Ｔｒｐ58，Ｔｙｒ165 の、Ａ
    ｒｇ11,165，Ｌｙｓ58による置換； ｄ）自然配列のＬｅｕ15，Ｇｌｙ26,28 ，Ａｌａ30の、
    Ｇｌｕ15，Ａｌａ26, 28，Ｌｙｓ30による置換； ｅ）自然配列のＰｒｏ44，Ｌｅｕ49，Ｇｌｙ51,55 ，Ｔ
    ｒｐ58の、Ｌｙｓ49, 58，Ａｌａ44,51,55による置換； ｆ）自然配列のＬｅｕ15，Ｇｌｙ26,28 ，Ａｌａ30の、
    Ｇｌｕ15，Ａｌａ26, 28，Ａｒｇ30による置換； ｇ）自然配列のＰｒｏ65の、Ｓｅｒ65による置換; ｈ）自然配列のＰｒｏ60,65 の、Ｓｅｒ60,65 による置
    換；又は ｉ）自然配列のＧｌｕ11，Ｐｒｏ65の、Ａｒｇ11，Ｓｅ
    ｒ65による置換；の少なくとも１つからなる追加の修飾
    を有する請求項１又は２に記載の誘導体。
  4. 【請求項４】[Arg11,Ser17,27,60,65 ]hu G-CSF;[Gl
    u15,Ser17, 27,Ala26, 28,Lys30]hu G-CSF;[Arg11,Glu
    15,Ser17,27,60,65 ,Ala26, 28,Lys30]hu G-CSF;[Arg
    11,165,Glu15,Ser17,27,60,65 ,Ala26, 28,Lys30, 58]h
    u G-CSF;[Arg11, 23,Ser17,27,60,65 ]hu G-CSF;[Arg
    11, 40,Ser17,27,60,65 ]hu G-CSF;[Glu15,111,Ser
    17,27,60,65,115,116 ,Ala26, 28,Lys30]hu G-CSF;[Ala
    1 ,Thr3 ,Tyr4 ,Arg5,11,Ser17,27,60,65 ]hu G-CSF;[G
    lu15,Ser17, 27,Ala26, 28,Arg30]hu G-CSF;[Arg11,Ser
    17,27,65]hu G-CSF;[Ser17,27,65]hu G-CSF;[Ser
    17,27,60,65 ]hu G-CSF;から選ばれたかつ所望に応じ、
    プレシークエンスメチオニンを有する請求項１〜３のい
    ずれかに記載の誘導体。
  5. 【請求項５】 請求項１〜４に記載の誘導体のアミノ酸
    配列の全部又は一部をエンコードするＤＮＡ塩基配列。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載のＤＮＡ塩基配列を含有
    する組換え体ベクター。
  7. 【請求項７】 請求項５に記載のＤＮＡ塩基配列をベク
    ター中に挿入することを特徴とする、請求項６に記載の
    組換え体ベクター。
  8. 【請求項８】 請求項６に記載の組換え体ベクターを使
    用して、安定にトランスフォーム又はトランスフェクト
    された原核又は真核宿主細胞。
  9. 【請求項９】 請求項６に記載の組換え体ベクターを使
    用して原核又は真核細胞をトランスフォーム又はトラン
    スフェクトし、それによって、安定にトランスフォーム
    又はトランスフェクトされた原核又は真核宿主を得るこ
    とを特徴とする、請求項８に記載の原核又は真核宿主細
    胞の調製方法。
  10. 【請求項１０】 請求項８に記載の原核又は真核宿主細
    胞を培養し、それによって、自然産生Ｇ−ＣＳＦの誘導
    体を得ることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに
    記載の自然産生Ｇ−ＣＳＦの誘導体の製造方法。
  11. 【請求項１１】 活性成分としての、請求項１〜４のい
    ずれかに記載の自然産生Ｇ−ＣＳＦの少なくとも１種
    と、薬学的に許容される担体又は賦形剤とからなる医薬
    組成物。
  12. 【請求項１２】 １）請求項１〜４のいずれかに記載の
    自然産生Ｇ−ＣＳＦの誘導体の封入体を表面活性剤中に
    懸濁させ、２）酸化し、３）表面活性剤を除去し、つい
    で４）表面活性剤を除去して得られた溶液を、高められ
    た温度に保持し、それによって、バクテリアタンパク
    質、生成物オリゴマー及び／又は分解生成物を沈澱さ
    せ、一方、前記誘導体を活性の形で溶解した状態で保持
    することを特徴とする、前記Ｇ−ＣＳＦの誘導体の、そ
    の封入体からの抽出方法。
  13. 【請求項１３】 抽出されるべき誘導体が１０ｍｇ／ｍ
    ｌにおいて少なくとも８５％の溶液安定度を有する請求
    項１２に記載の方法。
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