CS125091A3 - Polypeptides - Google Patents

Description

.'i \ J*». ·*·

ŠPOLYPEPTIDY

Λ Oblast techniky

!- í- I- l·'· týká derivátů ; G-CSF (faktor :sě — vyznačuj í— dobrou—-stabilitou — -procesů pro jejich přípravu i > . Následující -vynález sestimulu jí cí— granulocyty),— j ež ™roztoku, a dále obsahuje’ popis popis . složení farmaceutických preparátů, jež tyto deriváty obsahují.

Dosavadní stav techniky

Skupina stimulačních faktorů patří mezi hormony bílkovinnépovahy, které stimulují proliferaci. a funkci specifických typůkrevních buněk jako jsou grariulocyty. Granulocyty pohlcují a ničíškodlivé mikroorganismy a buněčné zbytky, a tak představujívitální faktor v reakci na infekci. Z tohoto pohledu mohougranulocyty tvořit určité, pseudo-shluky a mohou se uvolnit zcévního systému endotheliálních buněk. Neutrofilní granulocytyposléze mohou přejít do přímého kontaktu s mikroorganismy a ničitje, pomocí specifických enzymových systémů, jako jsou např. ty,které generují ·. superoxidové anionty. Protože . granulocyty . majípouze krátkou životnost v oběhu (přibližně 6-12 hod. ) a jsouničeny v průběhu své funkce, je pro kmenové buňky kostní dřeněnezbytné, aby vznikalo, každý den takové množství granulocytů,jako červených krvinek. Míra produkce granulocytů dále enormněstoupá, jestliže dojde k infekci. Naopak jestliže je kostní dřeňponičena, počet granulocytů rychle klesá, např. následkemaplikace chemoterapie v případě rakqviny, radiace, AIDS, nebohematologických poruch; výsledkem·1'této rychlé změny je náchylnostpacientů k nepřekonatelné infekci. Skutečná sepse je všeobecnoupříčinou smrti u pacientů, postižených rakovinou, jejichž dřeň jeponičena ozařováním, chemoterapií nebo poruchou, neoplasticity.

Existenci G-CSF popsal v literatuře Wallet K. a kol.. : /XJ*- ý'±lsÉří'w. ΛΖ ______ r.P r z- ~ 'ΛϊΤ'ϊί^ΐβ^ίΛγ " Á -a < '·< ¢^3^4- f tí^-v* V* 'tík:»4r ‘ '? /< -· - ' ' ' - '·... . ' <f|M^ProcíNatl. Acad. Sci. USA vol. 82, str. 1526.-1530, dále byl popsán -.' ' '*-' .. .' , 1 -< ' '' 'v - Λ· patentu: European' Patent Publication- č. 169, 566 a PCT Patent

Publication č.WO 87/01132. Bylo prokázáno, že G-CSF stimuluje' produkci, granulocytů in vivo, a to s minimálními vedlejšími .... účinky. Zdá se, že ^lidský G-CSF může^nájít^poťehčiálKi^využitípři vedení neutropaenie spojené s chemoterapií, při terapiiozařováním, při nemocech z ozáření, nebo transplantaci kostnídřeně. Mimoto ho lze využít při stimulaci suprese kostní dřeně,spojené s onemocněním AIDS, při léčbě myelodisplastickýchsyndromů, jež jsou charakterizovány abnormalitami ve funkcigranulocytů, a jako pomocného prostředku při léčbě vážnýchinfekcí. Dále byly určité, výše uvedené analogy G-CSF popsány v PCTPatent Publication č.WO 87/01132, v European Patent Publicationč. 243,153, v European Patent Publication č. 256,843, v EuropeanPatent Publication č. 272,703 a časopise Biochemical andBiophysical Research Communicatioh (1989),i roč. 159, čil, str. 103-111, autor

kol. Modifikace G-CSF

Kuga 17 t [Ser ]G-CSF byla ovlivněna substitucí cysteinových a serinovýchresiduí v. pozici 17, avšak tyto. změny neměly předpokládaný efekt (Protein. Engineering, roč. 3, č.4, str. 360 (1990)) G-CSF a jeho analoga jsou v roztoku nestabilní, při stánímají tendenci srážet se z roztoku, což má za následek jejichkrátkodobou stabilitu a problémy při uchovávání ve vysokýchkoncentracích. Mimoto G-CSF a určitá analoga, mají přiskladování sklon ke kovalentní agregaci.

Podstata vynálezu

Tento vynález je založen na objevu modifikací, jimž můžebýt podroben G-CSF, nebo derivát, který má část nebo celouaminokyselinovou sekvenci, a alespoň jednu z biologickýchvlastnosti přirozeně se vyskytujícího G-CSF,

- 3 - ^inapř^-přirozeně.ijsé ,. vyskytujícího lidského- -G-CSF.-- Τέ&amp;< ;ο.....- modifikacemi '“může', být zlepšena stabilita roztoku, V předkládaném vynálezu, je popisován derivát přirozeně se vyskytujícího. G-CSF,. který- má alespoň jednu z . biologických vlastností přirozeně se vyskytujícího G-CSF s alespoň 35¾ stabilitou, při koncentraci 5mg/ml. Uvedený derivát obsahuje alespoň změnu, kdy. Cys nativní sekvence — ' J je nahrazen 'Ser^'7" á"’Asp^ nativní sekvence je nahrazena 27 residuem Ser

Deriváty vynálezu preferují alespoň jednu z dáleuvedených modifikací vybraných z; " a) Glu11 nativní sekvence je nahrazen Arg11 residuem1-5- _h~). Leu15 _nátxvní„sekv.ence—je—na-h-r-azen—residuem-Giu^nativní sekvence je nahrazen residuem Arg C) T i □ Lys d) Gly26 e) Gly28 f) Ala30 g) - 34Lys .h). Tt 40 i) Pro44 j) Leu49 k) Gly51 1) Gly55 m) _ 58Trp n) Pro60 : ?) Pro65 : P) Pto111 q) Thr115 *).. Thr116 s) Tyr165 nativní sekvence je nahrazen residuem Alanativní, sekvence je nahrazen residuem Ala 23 26 28 30 nativní sekvence je nahrazen residui Lys nebo Argnativní sekvence je nahrazen residuem"Argnativní sekvence je nahrazen residuem Argnativní sekvence je nahrazen- residuem Alanativní -sekvence je nahrazen residuem Lysnativní sekvence je nahrazen residuem Alanativní sekvence je nahrazen residuem Alanativní sekvence je nahrazen-residuem Lysnativní sekvence je nahrazen residuem Sernativní sekvence je nahrazen residuem Sernativní sekvence je nahrazen residuem Glu^"nativní sekvence je nahrazen residuem Sernativní sekvence je nahrazen residuem Sernativní sekvence je nahrazen residuem Arg 30 34 40 44 49 55 58 60 65 115 116165 - 4 - -ΐΚΪ'ώΐί '« ·Λ iífci-i.?'· ··* -’.. ·**«»?»·'. áfeT-: : .- - w-·- --. <"A·· ff . / . Přítomnost, alespoň jedné z dalších . modifikací,vybraných1 z'příkladů a), b), d), e), f), n) a o) je částečnépreferována.

Mnohem více žádanější jsou další modifikace, obsahujícíalespoň jednu z dále uvedených změn: ’ 11 i) Gin-14·, ΡΓ08θ'85 nativní sekvence jsou nahrazeny Arg ,ser60'65 ii) Ala^l, Thr115, nativní sekvence jsou nahrazeny

Glu111, Ser115'116 iii) Gin11, Trp58, Tyr165 nativní sekvence jsou nahrazeny . 11,165 _ 58

Arg ' , Lys 1 c 9 9 ft o λ iv) Leu , Gly ' , Ala nativní sekvence jsou nahrazeny 15 26,28 T 30

Glu , Ala ' , Lys v) Asp2\ Pro4\ Leu^, Gly51,55, Trp58 nativní sekvence í· Z*1; . . : v T 49,58 ,, 44,51,55 jsou nahrazeny Lys . , Ala . Výše definované modifikace mohou být, pokud je topožadováno, zavedeny do jakéhokoli polypeptidového řetězce,který . má alespoň jednu z biologických vlastností přirozeněse vyskytyjícího .se G-CSF tak, aby se zlepšila stabilitamolekuly v roztoku. Modifikace, uvedené v tomto vynálezu,mohou být použity u takových polypeptidů, které se liší vaminokyselinovém složení od toho složení, jež je zde popsánopro přirozeně se vyskytující G-CSF, a to ve složení,neboumístění jednoho, nebo více residuí (např. vzniksubstitucemi,. terminálními či vnitřními adicemi a delecemi): Příkladem takových polypeptidů mohou být ty,. jež byly . ι ,, zkráceny, napřdelecí,_ takové,, které. .. se projevuji- -v -resistenčí k hydrolýze (a: tudíž se déle projevuje jefekt, než u přirozeně se vyskytujících); dále ty,byly pozměněny tak, aby bylo odstraněno místo jpotencionální O-glykosylaci (což může vyústit ve v;;; íaktivitu pro látky produkované kvasinkami) nebo takové, ejeden, či více cysteinových residuí bylo odstraněno n·.. ;o - -nahrazeno např. alahihovymi nebo serinovými residui a jsou snadněji izolovatelné v aktivní formě z mikrobiálních systémů. Dále sem patří polypepťidý, které mají jeden, či více tyrosinových residuí nahrazeny fenylalaninem a mohou být více či méně vázány k lidským G-CSF buněčným receptorúm.

Navržené, modifikace.a)-s), a přednostně i)—v) mohou tak být -a-p-l-i-kovány—napriZ.vZZnrípaďěT^kd-v-—na-t-i-vn-í—G^es-F=má=G-vá— : . 17 nativní sekvence nahrazen Ser , nebo jde-li o alelickévarianty a jejich analoga, u nichž je prokázána alespoňjedna z biologických vlastností přirozeně se vyskytujícíhose G-CSF, stejně jako mají ty jež býly popsány v literatuře,uvedené výše.

Bylo zjištěno., že testované polypeptidy, uvedené v,tomto vynálezu,': mají větší stabilitu v roztoku .přizachované, nebo lepší biologické aktivitě, ve srovnání snemodifikovanými polypeptidy, r Uváděná veličina, stabilita roztoku, je odlišná veličina ve srovnání s rozpustností. Stabilita v roztoku jedefinována jako klesající schopnost látky srážet se z.roztoku vlivem fyziologických podmínek pH, teploty a iontové,síly.

Stabilita roztoku je zde měřena stanovením. procentuálního množství G-CSF derivátu, který zůstane yroztoku (borátový pufr) po 14 dnech při 37°C při počátečníkoncentraci Img/ml, 5mg/ml, lOmg/ml. Stanovení této veličiny - 6 - Η· — ; *·?ν ·· »;ϊύ»ΛΛτ)5ζ-Λ(,<Λ«α':ί-1·η-*,“Γ/ ·'-»· δ^&amp;^Ζ&amp;Ζί^'φ? '»<· ' yA-iE^ '*^'ί'0'<γ^." ' ΐ' &amp;·:·^>: :! - - -Jt -i- ,ν-„ . ·.- ·. .,' ř* J_ť ' ' ’ . ’ detailně popsáno v Příkladu č.4. Polypeptidy tv '*35^JS,-;Ar*asLe-·^·‘-·ί«Λΐ.·^· ' 'f * i j. ‘ ' ' ' , H^M;y?^výnálézU'budou mít-stabilitu roztoku při koncentraci 5n<53,;·.,·· ( .· . alespoň 35%, případně 50% , či spíše 75%, při končen v, ·: o ml . ci lOmg/ml alespoň 75%, obzvláště 85%. . '—^--'-Výraž^přirozeně" se* vyskytující "G-CSF", ~ktěřy’jé~ zde'používán, je připisován těm G-C3 faktorům, u nichž bylo. objeveno, . že se nalézají v přírodě a obsahují dvapolypeptidy, které mají aminokyselinovou sekvenci uvedenou vSEQ ID č.37. Tyto dva polypeptidy se liší pouze tím, žejeden polypeptid obsahuje mezi pozicemi 35 a 36 vloženýtripeptid Val-Ser-Glu, zatímco druhý polypeptid, tentotripeptid neobsahuje. Systém užívaného číslování je odvozen.,od přirozeně se vyskytujícího polypeptidu bez vložené.“7sekvence Val-Ser-Glu, a výraz "nativní", zde uváděný, se;týká polypeptidu bez sekvence Val-Ser-Glu. Je významné, žetento vynález je použitelný ve všech případech přirozeně sevyskytujících forem G-CSF a jejich analogů, jak je popsáno-výše, a tudíž vyplývající revize čísel pozic polypeptidumusí' být nezbytně závislá -na formě přirozeně sevyskytujícího se polypeptidu, vybraného pro modifikaci.

Tento vynález dále poskytuje DNA sekvenci, kódujícícelou, či část aminokyselinové sekvence, derivátu přirozeněse vyskytujícího, dříve definovaného G-CSF. Tytosekvencemohou např. zahrnovat 1) inkorporováné kodóny, jež jsoupreferovány pro expresi vyselektováným hostitelem, kterýnení savčího původu; 2) místa pro štěpení restrikčnímiendonukleasami; 3) další počáteční, terminální, nebointermediální sekvence DNA, které usnadňují konstrukcisnadno exprimovatelných vektorů. Sekvence DNA, uváděné vtomto vynálezu, zahrnují ty, které jsou použitelné kzaručené expresi v prokaryotických, nebo eukaryotickýchbuňkách, přičemž deriváty zde uváděné, mohou být buď v • * ’ · 4 glykosylované, nebo neglykosylované formě, podle druhuvybrané hostitelské buňky.

Tam, kde je derivát získán v neglykosylované formě,např. při následující expresi v prokaryotických. buňkách,derivát může, jestliže je to zapotřebí, být glykosylovánchemicky, např. s pomocí savčích nebo jiných eukaryotickýchuhlovodíku. -- - - -Předkládaný......vynález------- -dále---------;poskytuje' popis rekombinantního vektoru, .jež obsahuje sekvenci DNA, která ""zde“byla~ji.z“ďř“íve definována. Rekombinantním vektorem pakmůže být např. biologicky funkční plasmid, nebo virální DNAvektor. V předkládaném vynálezu je dále uveden návod pro-přípravu—rekomb-i-na-n-t-n-í-ho—vektoru^—zde—definovaného~ který prokaryotických. transformovaných, uvnitř obsahuje vloženou sekvenci DNA. Předkládaný vynález dále poskytuje . i popisa eukaryotických buněk, stabilněči ťransfektovaných rekombinantním již dříve popsaným .vektorem. Předkládaný vynález dále uvádí návod pro přípravuprokaryotickě, nebo eukaryotické hostitelské buňky,obsahující rekombinantní vektor, již zde definovaný,· tak abybyla získána stabilně transformovaná, či transfektovanáprokaryotická nebo eukaryotická hostitelská buňka. Předkládaný vynález dále uvádí návod na přípravuderivátu přirozeně se vyskytujícího se G-CSF, který zahrnujepopis přípravy (kultivace) prokaryotických neboeukaryotických buněk, pomocí nichž by byl získán jižzmiňovaný derivát. Návod obsahuje i popis isolacezmiňovaného derivátu, vzniklého expresi DNA, , jejížcharakteristika je uvedena ve vynálezu, v rekombinantním téžjiž definovaném vektoru. • <?

'3' - 8 -

Pro-použití v procesech, popisovaných, ve vynálezu jsou preferovány hostitelské prokáryotické buňky, jako *£V>^např. E.coli, ale mohou to být i buňky Saccharomyces ' cerevisiae nebo buňky savčí (např. buňky vaječníků získaných z křečka). , ;___:__„ ,/ .' ._____ -

ř. Předkládaný vynález dále uvádí popis farmaceutickéhosložení, obsahujícího jako aktivní složku alespoň jedenderivát přírodně se vyskytujícího se G-CSF, ve spojení sfarmaceuticky přijatelným nosičem, nebo plnidlem.. Předkládaný vynález dále popisuje metodu pro léčeníkrvetvorby u’ savců, v níž jsou uvedeny účinné dávkypopisovaného derivátu. Předkládaný vynález dále uvádí metodu, uvádějící popisípodávání účinného množství derivátu, pomocí níž lze zabránit·1proliferaci leukemických buněk.

Krátký popis obrázků i ; ν·ϋ£:

Obr. 1 ukazuje nukleotidovou sekvenci fragmentu 167 bp,odkaz je uveden v Příkladu č.1

Obr. 2 uvádí aminokyselinovou sekvenci a odpovídající j nukleotidovou sekvenci natiyního lidského (hu) G-CSF | a restrikční místa

Obr. 3 uvádí aminokyselinovou sekvenci a odpovídající17 27 nukleotidovou sekvenci [Ser 1 ]' nativního lidského G-CSF a restrikční místa Ϊ

Obr. 4 uvádí nukleotidovou sekvenci T4 transkripčního zakončení, které obsahuje a) koncová (terminální)restrikční místa pro Sáli a. HindlII a b) koncová . restrikční místa pro Sáli a Styl 9 - > ί! Ž

Obr. 5 uvádí restrikční napu pTB357 (zde uváděného také jako _· — plboo4): / ........... ’ ·

Obr. 6 ukazuje nukleotidovou sekvenci fragmentu EcoRI-SalI,uvedenou v odkazu Příkladu fi(b), avšak bez genovésekvenceinterferonu

Obr. 7 uvádí restrikční mapu pLB015 (zde uváděného také jakoplCI 0080) ..............Obr... δ .ukazuje, .restrikční-mapu pI-C-I--10-79-------------'·------------ -.....-

Obr. 9 uvádí restrikční mapu pICI 54 .(zde uváděného také..... -:—-—--jako pCG54-“—'—--: '

Obr. 10 ukazuje restrikční mapu pCG61 ......

Obr. 11 uvádí restrikční mapu picí 1107, kde vystínovaná plocha, představuje genovou sekvenci kódující__[Ser17,2Z.]_lidského-G=CS-F—- _--;- ==Obr;—Γ2 uvádí restrikční mapu pCG300 (zde uváděného též jakopicí 1295)?

Podrobný popis Přednostně jsou vybrány ty deriváty vynálezu, kterébyly modifikovány jedním z dříve uvedených zpúsobů-(i), (ii), (iii), (iv) nebo (v), preferují se pak modifikaceuvedené jako (i), (ii) nebo (iv), především pak (ii) nebo(iv).

Obzvláště jsou pak preferovány, ty deriváty, které majídobrou stabilitu roztoku a obsahují: ' ' ΐ

[Arg11, Ser17/27'6Q'65]G~CSF

[Glu1?; Ser1/'27, Ala26'28 *, Lys30]G-CSF t r . - 10 -

' .ίβΤψί'-λ'*!.-/- ··.-»:-- . --ý ; í .· '.V’!. , -» <*.. ·» ,*>. ,<-Ζ· .JMvr-p· ·'»..

[Arg11, Glu15, Ser17'27'60'65, Ala26, 28, Lys30]G-C>r[Arg11'23, Ser17'27'60'65]G-CSF lArg^^Seri^Z^SjG.CSE^ [Arg11'40, Ser17'27'60'65]G-CSF '

[Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5,11, Ser17'27'60'65]G-CSF

[Arg11, Glu15'111, Ser17' 21' 60/ 65,115'116, Ala26'28',Lys ]G-CSF

[Arg11'165, Glu15, Ser17'27'60'65, Ala26'28,

Lys30'58]G-CSF

[Arg11, Glu15, Ser17' 21 > 60' 65, ^, 28, 44, 51,55,

Lys30'49'58]G-CSF . [Arg11'165, Glu15'111, Ser17'27'60'65'115'116, .

.Ala26'28í;44'51'55, Lys30'49'58]G-CSF

[Glu15, Ser17'2/ Ala26'28, Arg30} nativního lidskéhoG-GSF

Zvláště préferované deriváty vynálezu, vyznačující sevýjimečnou stabilitou roztoku a současně dobrou specifickouaktivitou, obsahují; i) [Arg , Ser 11 „ 17, 27, 60, 65

JG-CSF

ii) [Glu15, Šer17'27, Ala26'28, Lys30]G-CSF '· i . l 11 - -±ř±^--[Arg^* 1 *7-Glu1\ Ser17' 27'"60' $5,.-^26,.28^ :£,γ33° ]G_CSF------

IV

) [Arg11'40, Ser17'27'60'65]G-CSF rs 11,23 _ 17,27,60,65,- PCT,

/) [Arg ’ , Ser JG-CSF

vi.._[ Ar 511/165c-Glu15, Ser17/276O'_65, _Ala26' 28·, Lys30' 58j_lidského G-CSF

Vii) [Arg11, Glu15'111, SerH,27,60,65,115, 116, Ala26, 25,Lys30] lidského G-CSF

viii) [Glu15, Ser17'27, Ala26'28, Arg30] lidského G-CSF ix) [Ala1, Thr3 *,. Tyr\ Arg5'11, Ser17,27' 60' 65]G-CSF, z nichž nejvýhodnější.jsou.varianty (i), (ii),. (iii), (vi), (vii), (viii).

Tyto dále ..uváděné deriváty lidského G-CSF vykazujínejen výjimečnou stabilitu roztoku, ale také mají vesrovnání s přirozeně se vyskytujícím lidským G-CSF lepšíspecifickou aktivitu.

Presekvenče methioninu může, nebo nemusí být vpolypeptidech přítomna.

Bylo zjištěno, že je výhodné použití vektoru,odvozeného od pAT153, obsahujícího: i) promotor a k němu operátor, např. trp promotor, nebo T7A3 promotor. T7A3 je A3 promotor bakteriofágu T7 .. (viz.Dunn J.J. a Studier F.W.: J.Mol. Biol. 166,

. 477-535 (1983). Úplná nukleotidová sekvence DNA

12 - ii) bakteriofágu T7 a umístění genetických částí T7 jepopsáno ve výše uvedeném odkazu. sekvenci pro vazebné místo ribosomu, např. vazebnémí sto-p r o- v e doučí—tr p -r i-bo s om--------------------- iii) klonovací místo pro, gen, jež má být exprimován __ _ iv) T4 transkripční terminální sekvenci (viz. SEQ ID č.51 a obr. 4) ' - v) cer sekvenci (Summers D. a kol. MGG, 201, str. 334-338, 1985}

vi) teracyklinový represorový gen (gen pro represitetracyklinem) Tet R

vii) gen odpovědný za resistenci k tetracyklinu Tet A » viii) mnohačetné rozpoznávací sekvence restrikčních enzymu SEQ ID č. 50 uvádí sekvenci, která obsahuje místo proštěpení restrikční endonukleasou EcoRI (nukleotidy 1-6),sekvenci promotoru A3 (nukleotidy 7-52), vedoucí sekvencipro vazebné místo trp na ribosomu (nukleotidy 53-78) atranslační iniciační kodon (nukleotidy 79-81). Výhodná může být kultivace hostitelských buněk,schopných exprimovat daný - derivát, v růstovém mediu sobohacením kultivačního media. přídavkem, obsahujícímkvasničný extrakt; Je výhodné, aby k. přídavku, látek skvasničným extraktem došlo po začátku kultivace, ale v době 13 - před. počátkem sledování produkce. Dávkování musí- přizpůsobeno .tak, -aby--nedošlo--během kultivace k výčěřpT . kvasničného extraktu v mediu. Dále je obzvláště výhc·; ípoužití produkčního vektoru s promotorem T7A3.

Současně výhodná. může' být kultivace hostitel··;,transformovaného rekombinantním vektorem, jež nese genetickýmateriál pro daný derivát, v přítomnosti leucinu a/nebothreoninu v množství dostatečném^ pro_ zlepšení,„akumulace —derivátu. Obzvláště výhodné je pak ovlivnění fermentace přítomností leucinu, kdýpoužitý..:...produkční-vektor—obsahuje- trp promotor.

Vedle objevu modifikací G-CSF či jeho derivátu, kterýobsahuje část nebo celou aminokyselinovou sekvenci a alespoňjednu z vlastností přirozeně se vyskytujícího G-CSF._což_ .__j/e7deTZke—z-lensen-í—s-tab-i-l-i-t-v^^rozťokŤrr^pfehkrádaný vynálezdále spočívá v objevu modifikovaných technik pro purifikacitakových G-CS faktoru a jejich derivátů.

Tak např. neexistuje . žádný objev v PCT PatentPublication č.WO 87/01132, popisující způsob odstranění.detergentu, obzvláště pak N-lauroylsarkosinu, vyskytujícíhose ve formě soli (Sarkosyl), z G^CSF analogů, připravených vtéto publikaci. V souvislosti s tím bylo proto nezbytnéurčit takový způsob, aby stabilita G-CSF derivátů tohotovynálezu v roztoku mohla být určena při vysokýchkoncentracích, a aby mohly být provedeny žádané formulačnístudie (návrhy).

Např. ve vynálezu je uvedeno, že odstranění detergentulze ovlivnit fosfátovým pufrem (pH 7,2-7,5). Fosfátový pufrmůže být připraven z isotonických solí a může mít složenípopsané v Příkladu 1. Méně použitelné jsou v tomto ohledujiné . pufry,— vzhledem k " tomu, ; že bud’ dochází k menšímuodstranění detergentu, obzvláště se to pak týká -i. ·;?* J^^íSC^^řS^ť3'·’ίΛ.Λ**' . :.'i?'·---· r . ’ ί^'νΒ C# á·^ * , 1— -«-+-*J *' 1 :wí>..: ,·. 14 -

Ir’ '4,vř> ., ·*·Α·1 V.-J - -

U. *Nrlauroylsarkosinu, nebo se zvyšuje vysrážené množství., Λ,. . . ' -, bílkovin z-roztoku. V tomto stupni se dále s výhodou využíváúčinku diafiltrace, protože bylo zjištěno, že dochází kezvýšení účinnosti bez vyvolání zvýšené precipitace proteinu. —D ia f ±11 r a c iř”š ě~~ nap'ř?~ dává pře dnost ""př e d ”"b ěžnou 'di f ΰζηϊ’*dialýzou. Dále bylo objeveno, že koncentraci detergentu,obzvláště N-lauroylsarkosinu ve formě soli,, lze snížit- pod1¾ koncentraci, jestliže dochází k jeho rozkladu běhemchromatografie. Vzhledem k tomu, že lze zvýšit možnostodstranění detergentu lze snížením jeho počátečníkoncentrace, detergent se používá již v minimální původníkoncentraci, např. u N-lauroylsarkosinu, je to stejná;koncentrace, která se rozkládá během chromatografie.

Jednotlivé koncentrace detergentu se pohybují od .0,8%do 0,2%, lépe pak od 0,5% do 0,2%, v nejlepším případě jekoncentrace 0,3%. K výše uvedeným poznatkům je třeba dodat, že bylo*zjištěno, že odstranění detergentu jako je N-lauroylsarkosin.ve formě soli např. Sarkosyl, aktivuje stopy proteolytickéaktivity, která může. komplikovat vznik produktu.· .Dále bylo;zjištěno, že tato proteolytická aktivita může být výrazněsnížena či odstraněna, jestliže po odstranění detergentudiafiltrací dojde ke snížení pH pod hodnotu pH 7,0, a todiafiltrací či lépe dialýzou. Další část tohoto vynálezuuvádí, že snížení nebo odstranění proteolytické aktivitymůže být dosaženo při pH, jež je nižší než pH 7,0, ale jenaopak dostatečně vysoké, aby se vyloučila určitá možnáhydrolýza polypeptidu. Vhodné pH se pohybuje v rozmezí od6,0 do 4> 5, lepší je pak pH. od 5,8 do 5,0, obzvláště pakpH 5,4. Výhodou je též to, že kontaminanty, produkovanéE.coli a nebo vzniklé přítomností degradovaného či nesprávněsyntetizovaného proteinu, mohou být při působení nižšího ·<··"· -Α·-;ί' .' ' - ' ';ί ' 15 - ρΗ vyloučeny vysrážením. Je výhodné, jestliže.při purifikaci—- je použitá’chřdmaťogřafié" založená riá principu dělení podlevelikosti {gelová chromatografie), vzhledem k tomu, že jinakse zvyšuje nebezpečí proteolytické degradace a zatímcopředešlé opatření (snížení pH) snižuje možnost takové degradace, bez použití chromatografie je těžké ji vyloučit. Dále je nutné uvést, že již zmiňovaná stabilita G-CSF a. . jeho;, derivátu. y. _roztoku umožňuje.zjednodušit..proces, .xtrakce..- V předkládaném vynálezu je popsána metoda pro extrakci-—:—aktivního,-zde'—jí-ž—dříve—definovaného—derivátu?-která- spočívá v : 1) suspendaci uvedených inkluzních' částic v detergentu,_zvláště N-lauroylsarkosinu ve formě soli_(.Sarko.s.y.l.)_ 2j oxidaci 3) odstranění detergentu dříve popsaným způsobem 4) zachování roztoku získaného následným odstraněnímdetergentu při zvýšené teplotě např. 30-45°C,výhodnější je teplota 34-42°C, čímž dojde k vysráženíkontaminujících bakteriálních proteinů, oligomerníchproduktů, nebo produktů, vzniklých degradací. Uvedenýroztok je udržován při této teplotě 6-24 hodin, lépe8-18, či 10-14, především však 12 hodin.

Extrakční proces může např. začínat lysý hostitelskýchbuněk s následným odstředěním, kdy je získána, inklusníčástice např. ve formě pelet. Inklusní částice pak může býtsuspendována v detergentu jako je např. N-lauroylsarkosin veformě soli (Sarkosyl), v koncentraci 1-3%, především všakzhruba 2% N-lauroylsarkosinu ve formě soli. Následujeoxidace suspense v detergentu, např v přítomnosti síranuměďnatého, po níž může následovat další odstřeďování. V případě, že je to možné, lze inklusní částici

<. ·> ·:·· ťi *».· : ·

£ &amp;

i'-’.

íí-iV 16 - λ. promývat, přičemž močovině se dává přednost např. p i. · deoxycholátem.

Extrakce umožňuje zjednodušení celého produkčr. .o procesu, např vyloučením vysokých nároků na chromatografi<dé kolonv.__Mimoto^dV.vsoká —výtěžnost-—produkt-u—po—-proce^UT- uvedeném v bodě 4) (působení zvýšené teploty), je jedním z důsledků zvýšené stability derivátů v roztoku. Samozřejmě platí, čím větší je stabilita derivátu v roztoku, tím lépe je daná bílkovina připravena k nové extrakci. Výhodnější je použití extrakce u derivátů, u nichž je stabilita v roztoku alespoň 85¾ při koncentraci lOmg/ml. Např. když byl známý-1 17 analog [Met , Ser ]G-CSF extrahován podle výše uvedeného.,postupu, ukázalo se po provedení rpHPLC, že pouze 40¾požadovaného produktu, zůstalo v róztoku po tepelnémošetření eluátu, který obsahoval pouze lmg/mlbílkovin. Přikoncentraci bílkovin 3mg/ml, zůstalo v roztoku pouze 19¾analogu. Všechny nukleotidové sekvence jsou ve vynálezu podle-konvence uvedeny od 5'-3' konci. Všěčhny deriváty jsou odvozeny od lidského G-CSF, kterýmůže být vyjádřen jako hu G-CSF.

Obecně ve všech popisovaných příkladech byla přítomnapresekvence Met, vzhledem k tomu, že všechny deriváty bylypřipraveny použitím buněk E.coli. Následující materiály jsou uvedeny v odkazech kPříkladům a Příkladech,·jejich popis je následující. Výraz "N-lauroylsarkosin" odpovídá vždy této látce,vyskytující se ve formě soli. V Příkladech je. to pak sodnásůlN-lauroylsarkosinu. 17 - ř'

PUFRY PRO RESTRIKČNl ENZYMY

Stabilita: stabilní při -20°CSložení pufrů: složky výsledná koncentrace [mmol/1] ———'— -—:—------z ř- eďě n í-1-: -10-—- ---

A B L Μ H

Tris acetát 33

Tris-HCl- 10 - 10 10 50

Mg-acetát 10 MgCl2 5 10 10 10 K-acetát 66 NaCl 100 - 50 100 Dithiperýthritol:(DTE) 1 1 1 Dithiothreitol. (DTT) . 0,5 - · - , ... - Mercaptoethanol 1 — — — pH při 37°C 7, 9 8,0 7/5 7,5 7/5 Výše uvedené pufry jsou dostupné u firmy Boehringer Mannheim

Postup procesu mutageneze řízené v určitém místě - viz odkazk Příkladu 2

Pufr 1 lOOmM Tris-HCl pH 8,0lOOmM NaCl ’ 20mM MgCl2

í, ť , '.i-j

Pufr;· 2

lOmMTris-HCl pH 8,020mM NaCllmM EDTA

Pufe 3 12mM Tris-HCl pH 7,7 30mM NaCllOmM MgCl2 8mM 2-merkaptoethanol

Pufr 4 60mM Tris-HCl pH 8,0 90mM NaCl

6mM MgCl^lOmM DTT

Nukleotidová směs 1 : 250μΜ dATP, dGTP, dCTP=S

{fosfothionátový derivát dCTP), dTTP a lmM ATP

Nukleotidová směs 2: 250μΜ dATP, dGTP, dCTP, dTTP a350μΜ ATP M9 minimální medium chlorid amonný lgHydrogen fosforečnan disodný 6gDihydrogen fosforečnan draselný 3g j Chlorid sodný 0,5gDestilovaná voda 1 1 - 19 —

Další složky / 75ml 300μ1 50¾ glukosy 75μ1 1Μ MgSO4 75μί 0,1M CaCl2 75μ1 4mg/ml thiaminu 75μ1 20¾ aminokyselin kaseinu Zásobní roztok stopových prvků (TES) ^TES^á^násTedující^s Tožení*:^

AlClg.6H20CoC12-6H2OKCr.(-SOy).?..-1.2H7.0CuCl„.2H-0H3BO3KI

MnSO^.HO..

NiSO,4 6H2O„ ...

Na2Mo042H20

ZnS04.7H20 0,1 mg Γ1 100 μg 1 1 0,04 mg l“1 40 μg l’1 0-,-0-1 mg 1_1 --1-0—ug- -J-1 0,01 mg 1 1 0,005 mg l“1 10 ug l“15 ug Γ1 0,1 mg . 1 1 100 ug, l“1 0,1 mg 1 1 100 μg l"1 0, 0045. ng. l-1 4,5 ng. l"1 0, 02 mg l“1 20 pg l"1 0,02 mg 1 1 20 pg Γ1 a je přidán do růstového media v koncentraci 0,5 ml/1 Čištění genu (TM)

Souprava obsahuje: 1) 6M jodid sodný 2) koncentrovaný roztok chloridu sodného, Tris a EDTA propřípravu promývacího roztoku chloridu sodného /ethanol/voda

,.. « tUlÉ·' f · ,*""1, '.·.· , J ' “ · f ’ ' . . · · , . " -20 - 3) ampulku z mléčného skla ο objemu l,5ml, obsahující 1, 25mlsuspenze křemičité matrice ve vodě

Tato technika purifikace DNA je založena na metodě.—popsané-.· Voge-l-s-teihem—á—Gillešpiem,-publikované--v „časopise-------

Proceedings,of the National Academy of Sciences USA (1979).roč. 76, str. 615. Může být však použita jakákoli jiná metoda popsaná vpublikaci "Molecular Cloning - a Laboratory Manual" druhévydání, Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring HarborLaboratory, 1989). Náhodně značená souprava - Produkt firmy Pharmacia č. 27-9250

Postup je popsán v publikaci "Molecular Cloning -a Laboratory Manual" Druhé vydání, Sambrook, Fritsch andManiatis, str. 10.13-10.17 (Vydáno nakladatelstvím ColdSpring Harbor Laboratory, 1989).

Sekvenasa (TM)

Chemicky modifikovaná T7 DNA polymerasa « Modifikace je založena na postupu popsaném Táborem a

Richardsonem publikovaném v časopise "Proceedings of theř National Academy of Sciences USA", (1987), roč. 84, str. 4767-4771 - 21 - Τ4 DNA ligasa

Popsáno v publikaci "Molecular Cloning - a LaboratoryManual" druhé vydání, Sambrook, . Fritsch . and Maniatis5.60-5.64 (Publikováno nakladatelstvím Cold Spring HarborLaboratory 1989) a dále v článku: Weiss B. a kol,,. J. Biol.Chem., roč. 243, str. 4543 (1968) ...... Následující Příklady. jsou -uvedeny -pouze-formou-Obrázků".' — Příklad 1

Příprava [Ser17,27] lidského G-CSF

Postup kroků a) a b), jsou uvedeny v odkazu kPříkladu 1, byl opakován s následujícími modifikacemi:

Oligonukleotidy SEQ ID č.24,25, 26 a 27 (které jsou dále definovány) nahrazují SEQ ID Nos 1, 2, 3, a 4 (kteréjsou.dále definovány). c) Klonování genu pro [Ser17,27] lidský G-CSF doexpresního vektoru Výše popsaný gen (viz Obr. 3 a SEQ ID č. 49) bylklonován do plasmidového vektoru pICI0020. Tento vektor jeodvozen od plasmidu pAT153, ve kterém oblast 651 bpEcoRI-AccI je nahrazena fragmentem 167 bp EcoRI - Clal (SEQID č. 47) skládající se z : 1) syntetického E.coli trp-promotoru a vedoucí sekvence provazebné místo trp na ribosomu

22 - .,·> .. ΐ · *· ” ·· . ,·. ’·*.·_*.’* · -;Λ1 α'<·- ; 2) >translačního iniciačního kodonu ίγϊ- ··' ·'. · : · ·' .······. 3) mnohonásobné rozpoznávací sekvence restrikčních enzymů

' o^V0Ížené od Ml3mpl8>_pbs.ahuj.l.cí _mís.ta_pro_KpnI,~ BamH-I,----Sáli, Pstl, Sphl a HindlII 4) syntetické transkripční terminační sekvence DNA sekvence této oblasti je uvedena na Obrázku 1.

Expresní vektor pICI0020 byl pro následné doplnění. Λ naštěpen KpnI (BCL) v lOmM Tris-HCl (pH 7,5), lOmM chloriduhorečnatém. DNA byla srážena ethanolem při -20°C z roztoku,obsahujícím 0, 3M acetát sodný a dále 3'- kohezní konce bylyodstraněny po působení T4 DNA polymerasou po dobu 10-timinut při 37°C v následující reakční směsi: DNA (l£ig) ve vodě (16μ1) pufr pro 10X T4 polymerasu (2μ1) 0, 33M Tris-acetát pH 7,90,1M acetát horečnatý 0,66M acetát draselný5mM dithiothreitol lmg/ml hovězí sérový albumin (BSA PENTAX frakce V)2mM směs dNTP (ΐμΐ) T4 DNA polymerasa (Ιμΐ; 2, 5jednotek^l BCL)a

Byla přidána voda (80μ1) a směs byla extrahována 100μ1směsi fenol/chloroform a dále chloroformem (100μ1). DNA sesrážela ethanolem (250μ1) při teplotě -20°C po přídavkuacetátu sodného (10μ1) a dále byla štěpena s Sáli (BCL) ve150mM NaCl, lOmM Tris-HCl (pH7,5). Vektor Kpn-tupý kóneč 23 byl purifikován na 0,7¾ agarosovém gelu a izolován metodou % Čištění genu (trademark) podle postupu doporučovaného ’ § výrobcem (BiolOl, USA). 5

Syntetický gen byl izolován z pSTPl vektorů, jak je i; uvedeno dále. Vektory byly štěpeny Seal a Sáli (oba * pocházejí z BCL) ve lOOmM NaCl, lOmM MgCl2 a lOmM Tris-HCl —(pH -7-,..5).....Eragment-530-bp-byl-purlfikov.án_v_0,-7_%._agaros.ového ........... gelu a izolován metodou Čištění genu (trademark) podle

—postupu-doporučovanéhovýrobcem-(-Biol01j;-S Před působením ligasami, byla směs genového fragmentuScal-Sall (50ng) a fragmentu vektoru pICI0020 (lOOng) ve _2.0μ1_roztoku,_obsahujícím_5_0mM_T.r.is-HC.L_(p.H_7_,_lOmM_j;

MgCl2, lmM ATP, lmM DTT, 5¾ w/v PEG 8θΊΧΤΤ^Τ4—DNA^Tgasu ('2— 1 jedn.; BRL) inkubována 20 hodin při 16°C. Výsledná směs byla ? použita k transformaci, příslušných buněk. E. coli HB101.

Transformované buňky byly selektovány, růstem na. L-agaru, í obsahujícím ampicilin., a dále testovány , na přítomnost genu32 hybridizací kolonií se značeným . P (SEQ ID č. 24). DNAplasmid byl připraven ze 6 pozitivně hybridizujících ·γ kolonií, purifikován odstřeďováním v gradientu chloridu | česného a sekvence byla určena dideoxy sekvenací. I- - Plasmid, který obsahoval tento gen, byl označen jakopICI 1080. í? d) Subklonování expresivního souboru genů, 17 27 obsahujícím gen pro [Ser ’ ]G-CSF, do H13mpl8. Následující subklonování bylo provedeno proto, aby byl — 24 - poskytnut startovní materiál pro přípravu derivátů G-CSF'podrobně popsaných v Příkladech 3-8.

Plasmid DNA, odvozený z pICI1080 (purifikovaný odstřeďováním v hustotním gradientu chloridu česného), byl ™_našťěpen_ _res.tr iktašami___EcoRI_a_Salí___(BCL)__podle. ...návodu výrobce. Malý fragment EcoRI-SalI, obsahující trp promotor a[Ser ' ]G-CSF gen, byl izolován.z 0,7% agarosového gelu spoužitím metody Čištění genu (trademark). Tento fragment bylvčleněn do vektoru M13mpX8 (DNA dodána firmou AmershamInternational), po jeho předchozím naštěpení EcoRI-SalI(dodané BCL). Fragmenty byly ligovány v 5x BRL pufru za použití dříve popsané BRL T4 DNA ligasy. Směs byla použita k.transfekci příslušných TG1 buněk E.coli (tyto buňky bylyvybrány na základě kalcium-chloridové metody popsané •Λ

Mandelem a Higem v publikaci Molecular Cloning- A LaboratoryManual - Maniatis a kol., Cold Spring Harbor).Transfektované buňky byly.suspendovány ve vrchní vrstvě TY1agaru (trypton-yeast agar), obsahujícím 2% X-Gal v DMF a: • · v 200μ1 TG1 buněk E. coli, odebraných v logaritmické fázi:,růstu, a dále byly transfektované buňky zaočkovány na miskys TY agarem (obsahujícím 8g tryptonu, 5g kvasničnéhoextraktu, 5g NaCl, 3,75g baktoagaru v 500ml'sterilní H^O,misky s TY agarem o složení - 8g baktotryptonu, 5gkvasničného extraktu, 5g NaCl, 7,5g baktoagaru v 500mlsterilní H20). Čtyři bílé plaky byly odebrány a smíchány se4x 2ml 1% suspenze TG1 buněk E.coli v TY kultivační půdě (8gtryptonu, 5g kvasničného extraktu, 5g NaCl v 500ml sterilníH20) a ponechány růst 6hod. při 37°C. 2ml části pak bylyrozděleny na dva díly o objemech 0,5ml a 1,5ml. Bakteriálníbuňky byly posléze odstředěny v mikrokyvetách zn. Eppendorfa supernatanťy byly po odstředění převedeny do sterilníchmikr©zkumavek. Alikvoty o objemu 0,. 5ml byly zmrazený na - 25 - '.~2Q C a ponechány jako fágová zásoba, Alikvoty- o objemu ; byly-použitý" k přípravě jednovláknové DNA podle metody popsané v publikaci Amersham International M13 sequencinghandbook (viz dále). Tyto vzorky DNA byly dále sekvenoványzá použití óligonukleotidů SEQ ID č.22, SEQ ID č.23 a M13universálního sekvenačního primeru. Reakce. byly provedenypodle návodu výrobce se Sequenase soupravou (trademark).Všechny čtyři „klony ... obsahovaly—správnou—DNA—sekvenci—"pro [Ser17'27]G-CSF. Příprava jednovláknové DNA ve velkém měřítku _K přípravě iednovláknov-é-DNA-v množstvi- -2O0-5O0ug_DNA7ml byía použita metoda uvedená v AmershamInternational "Oligonukleotide Diredted Mutagenesis".Detailní postup práce je dále popsán: POSTUP PŘÍPRAVY JEDNOVLÁKNOVÉ.,DNA: - A. Příprava lml fágového materiálu (zásoby) 1. Vemte.jednotlivou kolonii TG1 E.coli, narostlou naminimálním glukosovém mediu a nechte růst přes noc v lOml2x TY mediu při 37°C, za stálého třepání. Přidejte 10μ1do 20ml čerstvého media a třepejte 3 hodiny:při teplotě37°C. 2. Zaočkujte lml 2x TY media v lOml.sterilních kultivačníchzkumavkách se ΙΟΟμΙ kultury připravené podle bodu 1,staré 3hod. 3. Zaočkujte lml kultury s rekombinantním plakem. 4. Inkůbújte za stálého třepání při 37°C. 4'ΐ^«;νν>ΐ·: -ΐ· 7 .-/ jrl··»/*· L?Í* .J?'*'1 *' Ή ’ . _ r ·. J W > *1—- - ' - 26 - 5, Odstřeďujte 5min. při laboratorní teplotě. Slijte supernatant do čisté.zkumavky a ponechte přes noc při ' 4°C. Připravte kulturu TG1 E,coli kultivovanou přes nocpro následující stupeň. B. Růst lOOml fágové kultury. 1. Zaočkujtě lOOml 2x TY media lml kultury TG1 a nechtetřepat do té doby, než absorbance zákalu kultivačníhomedia dosáhne hodnoty 0,3 při vlnové délce 500nm. 2. Přidejte lml fágového supernatantu připraveného podlenávodu A (viz A5) do lOOml kultury 3. Inkubujte 5 hodin za stálého třepání při teplotě 37°C. 4. Odstřeďte při 5000g za teploty 4°C 30 min. 5. Převeďte supernatant do čisté zkumavky. Buňky ponechtepro přípravu RF DNA. 6. Přidejte 0,2% objemu 20% w/v PEG 6000 v 2, 5M NaCl dosupernatantu, dobře promíchejte a ponechte stát při 4°Clhod. 7. Odstřeďte při 5000g při teplotě 4°C 20min. Slijtesupernatant. 8. Odstřeďte při 5000g 5min. a odstraňte všechen zbývajícíPEG/dextran. 9. Resuspendujte virální pelety v 500μ1 redestilované vody apřeveďte do mikrocentrifugační zkumavky (l,5ml). 10. Odstřeďujte 5min., oddělte supernatant od zbylých buněka převeďte jej do čisté zkumavky. 11. Přidejte 200μ1 20% PEG 12,5M NaCl do supernatantu, dobřepromíchejte a nechte stát při laboratorní teplotě 15min. 12. Odstřeďujte 5min. a slijte supernatant. 13. Odstřeďujte 2min. a pečlivě odstraňte všechny zbytky PEG/NaCl. ' 27 - "200pl’“fenolu^saturovaného- 10mM- Tris-HCl pH -l. Krátce intentzivně promíchejte,stát obsah zkumavky 15min. při laboratorní 14. Resuspendujte virální pelety v 500μ1 redestilované< 15. Přidejte

lmM EDTA 16. Ponechteteplotě. 17. Odstřeďujte 3min. 18. Převeďte supernatant do čisté zkumavky. _______19. Opakujte kroky označené čísly 15-18. _________ _ _ 20. Přidejte 500μ1 chloroformu a dvakrát extrahujte vodnou :--'···—-fázi. ---—.-:-:----:_ 21. Přidejte 50μ1 3M acetátu sodného a líni čistého ethanolu.Zamíchejte. 22. Dejte do suchého ledu a ethanolové lázně na 20min. 23. 15min. odstřeďujte._ 2~4~r=Promyj'te~ka~žď~ou~péi~e'tu~l:ml~ěťhaho-lu—o~ tep-lOte^^ZO—Οπ— ~ 25. Pelety vakuově vysušte a rozpusťte v 50μ1 destilované vody. Tímto způsobem lze připravit 100-200ug jednovláknové DNA. e) Fermentace pICI 1080 byl transformován do buněk E.coli kmene MSD 522. Rekombinantní buňky byly purifikovány a uchováványv glycerolu při -80°C. Část kultury byla odebrána a naočkována roztěrem naagar s L-ampicilinem s cílem oddělit jednotlivé kolonie přirůstu přes noc při 37°C. Narostlá kolonie, vyskytující sesamostatně na agarové půdě byla odebrána a resuspendována vlÓmi půdy s -L-ampicilinem a ΙΟΟμΙ bylo ihned naočkováno do10 Errenmayerových baněk o objemu 250ml, obsahujících 75ml 28 x ···<», kultivačního media s L-ampicilinem. Po 16-ti hodinovém růstupři. 37°C na reciproční třepačce byl obsah, baněk spojen á použit jako inokulum pro fermentor,’ kterýobsahoval 201\ kultivačního media. \ - · ·'·' 'Složení kultivačního media LCM50 rozpuštěno v destilované voděg/i kh2po4 3,0 Na2HPO4 6, 0 NaCl 0,5 hydrolyzát kaseinu (Oxoid L41) 2, 0 (nh4)2s°4 10,0 kvasničný extrakt (Difco) 10, 0 glycerol 35,0 L-leucin 2,5 L-threonin 0,9 MgSO^.7H2O 0,5 · CaCl2.2H2O 0, 03 thiamin 0,008 FeSO^/kyselina citrónová 0,94/0,02 roztok stopových prvků (TES) 0,5ml*

Fermentace byly prováděny při teplotě 37°C a pH 6,7. pHbylo kontrolováno a automaticky regulováno přídavky 6Mhydroxidu sodného. Parciální tlak kyslíku (dOT) byl nastavenna 50% vzdušné . saturace a zpočátku byl regulovánautomatickým zvyšováním otáček míchadla fermentoru. Průtok - 29 - 29 V· '«EftM? Tri· ir- - . • · ?. . - •λ vzduchu byl zpočátku 201/min, což odpovídá průtoku 1 objemu vzduchu vztaženého na objem media za minutu (WM), a bylzvýšen na průtok 501/min (2,5 WM), ve chvíli kdy serychlost otáček míchadla přiblížila 80-90¾ svého maxima.Vzhledem k tomu, že rychlost přenosu kyslíku (OTR) vefermentorech nebyla schopná uspokojit spotřebu kyslíku (OUR)bakterií při hustotě buněk v mediu vyšší než je ta, které -— - - odpovídá absorbance rovná 50- při--vlnové" délce- ~55Onm· za-----"..... popsaných. podmínek,., byl. parciální tlak . kyslíku. (dOT) ve : f e rměnťórú údřžbván při vy s š í ch "hus to tach buněk na hodno tě odpovídající 50¾ vzdušné saturace. Toho bylo dosaženo přikultivaci buněk, jejichž hustota odpovídala hodnotě I absorbance 50 při vlnové délce 550nm v mediu, s limitovaným množ-s-tv-i-m—zd-r-oje—uhl-í-ku;——s—následným—dodáním—stopového-- množství zdroje uhlíku spolu se síranem amonným a kvasničnýmextraktem v množství/ omezující rychlost růstu bakterií.

Fermentace trvaly 16 hodin, během této doby bylyodebírány vzorky pro měření - absorbance zákalu při vlnovédélce. 550 nm, sušiny buněk a' množství G-CSF v buňkách. . Množství vznikajícího ;·· G-CSF bylo sledováno SDS-PAGEelektroforézóu celých buněčných lysátů, po obarvení gelůCoomassie blue. V době, kdy absorbance zákalu dosáhla při vlnové délce550nm hodnoty 25, . byl ‘do fermentoru přidán roztok I hydrolyzátu kaseinu (100g/l Oxoid £41) v množství l,5g/l za hodinu. *-

Když absorbance při Vlnové délce 550nra dosáhla * přibližně hodnoty . .50, došlo k vyčerpání zdroje uhlíku,vedoucí k rychlému vzrůstu parciálního tlaku kyslíku (dOT) zhodnoty 50¾ vzdušné saturace. V tomto okamžiku byly do media saw· . Λ· • ·» · i , :. "ť. -tr -, ·, 1. V.·/ , r >í. Λ' - · ·' r ‘ ·. . . v.·.· ;.-'·> í- . r.... · «přidány, glycerol (470g/l), kvasničný extrakt (113g·. r <- 1 *'* ' ’’ ,. -.·>. -.4-^ (síran··*,amonný (118g/l) rychlostí, .která způsobila ob! . :, a :.”i“ · · ? . ... y . 'návrat k zpětnému· udržování dOT na hodnotě 50¾ vz .‘udné saturace , při míchání, dosahujícím přibližně 80¾ maxim.. Po13-14 _hodinách^byl.™.opakován — přídavek'-některýčh’""íátek’.”^Do’media byl přidán pouze glycerol (715g/l) a síran amonný143g/l. Rychlost přídavku hydrolyzátu kaseinu byla udržovánana hodnotě l,5g/l/h. Přibližně po 16 hodinách, když bylamikroskopicky identifikována přítomnost velkého množstvíinkluzních částic u většiny buněk, byly buňky odstředěny vodstředivce Sorval RC3B (7000g, 30min., 4°C) a zmrazený na-80°C. f) Purifíkace

Zmražené buňky (500g) byly resuspendovány " v 50mM

Tris-HCl pufru, 25mM EDTA, pH 8,0 (51itrů) při 4°C v*·. homógenizátoru typu Silverson model AXR. Lýze buněk vsuspenzi byla provedena .v .homogenizátoru Maňton-Gaulin· při6000psi trojnásobným protlačením suspenze. Následovaloodstředění 30min. při 5000g na odstředivce Šorvall RC3C srotorem H6000A. Supernatant byl po odstředění slit a peletabyla zmražena před další purifikaci na -20°C. 60-100g pelet bylo po rozmražení resuspendováno vroztoku 1¾ w/v deoxycholové kyseliny (sodná sůl) v 5mM EDTA,á s 5mM dithiothreitolem, 50mM. Tris-HCl, pH 9,0 (1200ml) obsahujícím lmg/ml azidu sodného, v homogenizátoruzn. POlytron, s čidlem PTA 20, při rychlosti nastavené nahodnotu 5. Suspenze byla promíchávána 30 min za laboratorníteploty a odstředěna při 6500g 30min. v odstředivcezn. Sorvall RC 5C s GSA rotorem. Supernatant byl opět 1&amp; 31 j>- Λ.Ο SSřW·*·’??*-·**·*· ·’-í·w™w.-<.sa. ·. ?.· ?< ·... . . s ' ’ ' . >»·: - ·.·· . - ’ :< -.odstraněn a pelety byly zpracovány stejným, . dvakrát $ uvedeným způsobem. Dále byly pelety dvakrát resuspendov^;.: / v11 vody a odstředěny při 15000g 20min. Výsledná sraženina, * obsahující inklusní částice byla dále solubilisována v 2% / w/v sodné soli N-lauroylsarkosinu v 50mM Tris-HCl pufrupH 8, 0 (150ml). s lmg/ml azidu . sodného. Síran sodný byl £ přidán tak, aby jeho výsledná koncentrace byla 20μΜ, a směs ......-"byla-- poté-- odstředěna- -při—3G000g -30min;—na—odst-řed-i-vce ·>---· - ------- —§

Sorvall RC5C; s. SS34 rotorem. Supernatant, obsahujícípožadóvahýderiváť, byl p ród~d a Γέi.púř i f iká č i zrní až eri v 5 0 rn 1“ < alikvotech.

Solubilisovaný derivát (20ml) byl rozmražen a —pre-f-i-l-ť-rován—přes—f-i-l-ťr—s—pór-y—o—ve-l-i-k-os-t-i—5um7—a-by— doš-l-o—k — odstranění všech pevných částeček. Filtrát byl aplikován nakolonu o velikosti 5x90cm (Ultrogel AcA54), ekvilibrovanou 0,3¾ w/v N-lauroylsarkosinem (sodnou solí) v Tris-HCl pufruo koncentraci 50mM a. pH8,0, obsahujícím . lmg/ml azidusodného. Celý postup byl. prováděn.: při teplotě 4°C...Následovala eluce stejným;pufrem o průtoku 2,5ml/min. Eluát , byl jímán v . lOml.. frakcích. Frakce, obsahující derivát, bylyspojeny (přibližně lOOml) a uchovávány při 4°C. Frakce spožadovaným derivátem, eluované z několika kolon, bylyspojeny a dialyzovány proti lOmM fosfátovému pufru se 150mMchloridu sodného pH7,4 (3-51), obsahujícím lmg/ml azidu sodného v diafiltračním zařízení Amicon CH2A-1S, vybavenéhomembránou S1Y10 (s mezí propustnosti lOkD). Retentát byl oodstředěn při 30000g 30min v odstředivce zn. Sorvall RC5C sSS34 rotorem a supernatant po odstředění byl 24hod. ídialyzován .proti vodě, obsahující lmg/ml azidu sodného. . Následovala další 72. hodinová dialýza s šestinásobnouobměnou vody. Výsledný retentát byl odstředěn 3Ó minutovou

'5 - 32 centrifugací při 30000g a zmražen na -20°C, při končenbílkovin lmg/ml,· nebo podroben mrazové sublimaci. '

aci

Koncentrace N-lauroylsarkosinu se po diafiltraci snížila pod .hranici Q, 001¾ w/v,_,*'· po. dialýze proti vodě koncentrace této. látky, klesla pod hranici stanovitelnoumetodou rpHPLC (0,0001¾). Příklad 2

Příprava [Ser17,27lidského G-CSP

Postup popsaný v Příkladu 1 byl opakován s dále uvedenýmivýjimkami:

Dvojšroubovice I byla fosforylována pomocí T4polynukleotidkinasy a štěpena Mstil (lOjedn.) v. lx H pufru(BCL, 30μ1) po dobu 2hod. při 37°C.

Po precipitaci ethanolem, . byl fragment 143 bp'EcoRI-MstlI dále přečištěn v 10¾ polyakrylamidovém. gelu,obsahujícím 7M močovinu a eluován elektroelučí z gelovématrice. Vlákna DNA byla spojena způsobem popsaným v odkazuk Příkladu 1.

Syntetický fragment EcoRI-MstlI, výše popsaný, bylklonován do plasmidového vektoru pAG88, jež je popsán vodkazu k Příkladu 1. Pro přípravu vektoru pAG88, bylonejdřívenezbytné jej naštěpit, (10ug) pomocí Mstil (20jedni, BCL) v lx H pufru (ΐΟΟμΙ), a to po dobu 2hód při37°C. DNA byla srážena ethanolem z 0, 3M acetátu sodného při-20°C a dále štěpena enzymem EcoRI (20jedn. ) v lx H pufru(BCCCL, 100μ1) po dobu 2hod. při 37°C. Po následujícíprecipitaci ethanolem, byl velký EcoRI-MstlI fragment : ^-".· t>t ;7 ·'-.- ·ί - · . - 33 - ? purifikován nejdříve na 1¾ agarosovém gelu a dále za použití i* metody ' Čištěrií- genu 7 (trademark), tak, " jak" ji " popisuje £ výrobce (Bio 101, USA). U kolonií byl proveden screening na y obsah syntetického fragmentu pomocí radioaktivně značené’ sekvence připraveně " z oligoriukleotidu (SEQ ID č.24) a požadovaná sekvence byla. upravena sekvenováním DNA, jak jeuvedeno v odkazu k Příkladu 1. Plasmid, obsahující gen pro [Ser ] _.G-_CSF__byl_ označen..j.akojpI.C.I1.1.0.7...__G.en_b.y_l._klono_v_án_____--______i. do expresního vektoru pICI0020, fermentace a purifikace < :—--------b í 1 ko v i ny— by1a—p r o v e d en a- - - p o dle —-p o s t upu-p opsaného —v---7 Příkladu 1. ' Přiklad 3

Příprava [Arg* 11 * * * * * Ser17'27'60,65] lidského G-CSF

Postup popsaný v odkazu k Příkladu 2 byl, opakován se zmut ováným- templátem M13mpl8, obsahujícím gen pro 17 27 [Ser.. ' ]G.-CSF, popsaný v Příkladech 1 nebo 2. Používanézmutované oiigonukleotidy byly označeny jako SEQ ID č.28 aSEQ ID č.29 (jak je dále uvedeno).

Triplet ACG v SEQ ID č.28 slouží k přeměně Gin v pozici 11 na Arg, první a poslední AGA triplety v SEQ ID č.29 kódují přeměnu Pro v pozicích 65 a 60 na Ser. Mutageneze byla provedena způsobem, popsaným v odkazu k Příkladu 2, s použitím SEQ ID č. 29, jako mutagenního primeru. Byl získán samostatný plak, který obsahoval Pro 60 Ser, a Pro 65 Ser

změny. Jednovláknová DNA byla připravena z tohoto materiálu V postupem, popsaným v odkazu k Příkladu 2. Tato DNA bylapoužita jako templát pro jednorázovou mutagenezi, 'š.i-Z - - 34 - V*· . '"i •^τχ··' Ί§®^'.ί /^využívající SEQ ID č.28 jako mutačního primeru. Tento postup

^4^S^vedl->k výtěžku plakú >100. U 3 byl proveden screěning DNA ylí- .i.·'"·; sekveňováním tak, . jak bylo dříve popsáno. U všech 3 byly

zcela inkorporovány všechny změny. Dvoušroubovicová RF DNA byla připravená z jednoho z plakúpostupem^pr.o přípravu__— jednovláknové DNA ve velkém měřítku (krok d v Příkladu'1) ažpo krok B5. RF DNA byla extrahována z bakteriálních peletalkalickou lýzí podle Birnboima a Dolyho (Nucleic AcidsResearch (1979) 7, 1513-1523) a purifikována odstřeďováním vhustotním gradientu, chloridu česného, popsaným v publikaci"Molecular cloning-a Laboratory Manual", autorů Sambrooka,

Fritsche a Maniatise (Cold Spring Barbor Publication).Purifikovaná RF DNA byla štěpena EcoRI a Sáli v pufru H,dříve popsaným postupem, a malý fragment, obsahující trppromotor, vazebné místo pro ribosom, translační iniciačníkodon a gen pro [Arg11, Ser1?' 6θ' ]g-CSF byl izolován z0,7¾ agarosového gelu užitím metody Čištěni genu (TM).

Fragment byl ligováh T4 DNA ligasou (BRL) v příslušném pufruna pICI0020. vektor, štěpitelný restrikčnímí enzymy

EcoRI-SalI, za použití 2:1 molárního. přebytku insertní částivůči vektoru; v podstatě tak, jak bylo již dříve popsáno.Ligační směs byla použita k transformaci buněk kmene E.coliHB1O1. Transformované buňky byly selektovány růstem na

I miskách s L-agarem, obsahujícím 50ug/ml ampicilinu. Ukolonií byl posléze proveden screeninginsertní DNA metodou restrikční analýzy připraveného metodou podle Birnboima a Dolyho jak je popsánav publikaci "Molecular Cloning-a Laboratoy Manual" autorůSambrooka,. Fritsche. A Maniatise (Cold Spring HarborPublication). Plasmid DNA, pocházející z kolonii, obsahujícíočekávanou 619bp EcoRI-SalI insertní část, byl použit protrnsformaci kmene MSD522 E.coli a vektoru pICI1239. na přítomnostplasmidu DNA, ·>·<**: ν· WJJ/C·' «*,•T'·!·'- -· '

Vtfí.. i·.·.·; ’· *,^;4S:r·'-' íh*·.^' í*. ‘<.*Λ '>'·'' · »· -·»-··.. 35 —

. iS \'Í’^£.Fermentace a purifikace byly provedeny způsobem popsaným"Tr‘‘dříve v Příkladu 1. ' . Příklad 4

Příprava [Ser17,27,115,116, Glu111] lidského G-CSF

Postup; popsaný v Příkladu 3 byl opakován za použitímutagenního templátu M13mpl8, obsahujícího gen pro[Ser ' ]G-CSF popsaného v Příkladu 1 nebo 2. Použitýmutagenní oligonukleotid je označen jako SEQ ID 30 (je dáledefinován.

Triplet GCT zavádí změnu Thr v pozici 116 na Ser,triplet AGA zavádí změnu Thr v pozici 115 na Ser a tripletTTC změnu Ala v pozici 111 na Glu. Postup mutageneze je vpodstatě popsán v Příkladu 3, expresivní soubor- genů. bylpřeměněn na. expresivní plasmid, který poskytl- pICI.. 1243.Fermentace'a purifikace byly provedeny postupem popsaným vPříkladu 1. Příklad 5

Příprava [Arg^, Ser^7' 27, Lys^®, - Arg^^^] lidského G-CSF

Postup popsaný v Příkladu 3 byl opakován s použitím mutagenního templátu M13mpl8, “ obsahujícího gen pro17 27 [Ser. /. ]G-CSF popsaného . v Příkladech 1 nebo 2.Oligonukleotidy, použité k mutagenezi, byly označeny jakoSEQ ID č.28, SEQ ID č.31 a SEQ ID č.32.

“-V ' '. ' i; •C.·' Triplet TTT v sekvenci SEQ ID č. 31 zavádí změnu Trp v ΐ f .T's ’ , ’ · i . pozici 58 na Lys a druhý triplet GCG v sekvenci SEQ ID č.32 | poskytuje změnu Tyr v pozici 165 na Arg. Mutační pokus ΐ "double priming" byl nejdříve proveden za použití dvou mutag.enni.ch_priměrů„j--.sekvencí;.SEQ ID č.31 a SEQ : ID č.32,...../ _'i jak je popsáno v odkazu k Příkladu 2. Tento postup poskytuje 2 plaky, kdy oba obsahují v sekvenci SEQ ID č.32 změnu (TYR J. 165 za Arg), ale neobsahují změnu v sekvenci SEQ ID č. 31.

Jednovláknová DNA byla připravena z jednoho z plakú způsobem ’ popsaným v Příkladu 1. Tato DNA byla použita jako templát ,

při další "double priming" mutagenezi zapoužití sekvencí SEQ ID č.28 a SEQ ID č.31 jako mutagenních primerů. Tento postup - , poskytl 2 plaky, z nichž jeden plně obsahoval inkorporovanél· změny. Expresivní soubor genů byl přeměněn ria expresivní plasmid, který poskytl pICI 1246. Fermentace a purifikace byly provedeny způsobem, popsaným v Příkladu 1. .Příklad 6 Příprava [Glu^^, Ster^'2?, 'Ala2®'^®, Lys^®] lidského G-CSF . a) Postup popsaný v Příkladu 3 byl opakován za použití mutagenního templátu M13mpl8, obsahujícího gen pro 17 27 [Ser ' ]G-CSF popsaného v Příkladech 1 nebo 2.Oligonukleotidy, použité k mutagenezi, byly označeny jakoSEQ ID č.33 a SEQ ID č.34.

Triplet TTC v SEQ ID č.33 poskytuje změnu Leů v pozici15 na Glu. V sekvenci SEQ ID č.34 první TTT triplet zavádízměnu Ala v pozici 30 za Lys a triplety AGC poskytují změnyGly v pozicích .28 a 26 na Ala. Proces mutageneze .bylproveden v podstatě tak, jak je popsáno v odkazu k

37 Příkladu-2. {jako "double priraing" postup) a expresivníλ?'.' · soubor ” genů"“ byl ’ přeměněn na expresivní plasmid, kterýposkytl pICI 1266. Fermentace byla provedena způsobem, popsaným v Příkladu 1. b) Purifikace

Zmrazené buňky byly podrobeny lýzy. a surové frakce—:—pe 1 et- by ly - separovány - s tej ným—způsobem,—kter ý“jb""uve*derT7v“ Příkladu-1. Inklusní částice, přítomné v peletách aobsahující žádaný protein, byly solubilisovány v pufrupřipraveném ze sodné soli deoxycholové kyseliny tak, jak jepopsáno v Příkladu 1, Pro izolaci_p.r.oteinu—pak-byla—použ-i-ta— : náaieduJTc í—modTf iko v an á me ťoděř

Surové frakce pelet (60-100g) byly rozmraženy a ·resuspendovány v 25mM EDTA, 50mM Tris-HCl, pH 8,0 (1200ml) vhomogenizátoru Polytron s PTA 20 sondou s rychlostí otáčeknastavené na hodnotu 5. Suspenze byla míchána 30min. přilaboratorní teplotě a odstřeďována při 6500xg po dobu 30-timinut v odstředivce zn.Sorvall RC5C s použitím GSA rotoru..Po slití supernatantu byly pelety ještě dvakrát zpracoványstejným, výše uvedeným způsobem. Dále byly pelety dvakrátresuspendovány ve vodě (llitr) a odstředěny - tak, jak jeuvedeno v Příkladu 1. Následující purifikace byla provedenatéž stejným způsobem jako v Příkladu 1.

<!··> -:4

- v ' ··"' W Λ ' ; í -- r. -»íBřjž'>V'· · <'.- . · ·. B. ·. - 38- \, .; i- ŤÍ ! Příklad 7 ' 1 ’ . j . .'i" ; - ' .'" ' ‘ .

Příprava [Ser17,27, Lys49,58, Ala44,51,55] lidského G-CSF

Postup popsaný_y_ Príkladu_.3„byl„opakován..' za , použití- „— — mutagenního, templátu M13mpl8, který obsahoval gen' pro17 27 [Ser ' )G-CSF popsaném v Příkladech 1 nebo 2.

Oligonukleotidy, použité pro mutageneži jsou označeny jako SEQ ID č.35 a SEQ ID č.36 (jak je později uvedeno). V sekvenci SEQ ID č.35 zavádí triplet AGC změnu Gly v

pozici 51 za Ala a v pozici 44 Pro za Ala, a triplet TTT

poskytuje změnu Leu v pozici 49 za Lys. V sekvenci SEQ ID č.36 triplet TTT poskytuje změnu Trp y pozici 58 za Lys a druhý triplet AGC zavádí v pozici 55 Ala místo Gly.

Mutageneze byla provedena jako "double priming" pokus, který je popsán v odkazu k Příkladu 2. Tímto "postupem vzniklo 16 plakú. U 8 plakú byl proveden screening sekvenací DNA, popsané v Příkladu 3. Všechny plaky obsahovaly v sekvenci SEQ ID.č.36 změny (Gly 55 Ala, Trp 58 Lys), ale žádný neobsahoval pozměněnou sekvenci SEQ ID č. 35,, tak jak je výše uvedeno. Jednovláknová DNA byla připravena z jednoho z plakú, jak popisuje Příklad l(d), a byla použita jako templát pro mutageneži při "single priming" mutageneži s použitím SEQ ID 35 jako primeru. Bylo získáno 50 plakú, z nichž 3 byly testovány DNA sekvenací, 2 obsahovaly všechny změny. Expresní soubor genů byl přeměněn na expresní plasmid, který poskytl picí 1297. Fermentace a purifikace byly provedeny podle Příkladu 1.

• · ?*' !'· \ 'τ - 39 - “Příklad 8 ; · ............... "" ’ ’ -.-..- Příprava [Arg11, Glu15, Ser17'27'60'65, Ala26'28 *, Lys30]

I $

,-A ffl) ’-’ί j.* fel - —gs M'&amp;

lidského G-CSF

Postup, uvedený v Příkladu 3, byl opakován s templátemη r 1797 M13mpl8, obsahujícím gen pro [Glu1 , Ser ' , Ala ' , q a

Lys lidského GtCSF,. ...který.. .je^...popsán __ v _P_říkladu.Oligonukleotid, použitý pro mutagenezi je označen SEQ IDě.28,—který—poskytuje—změnu—Gin—v—pozici—14—za—Arg-.-Modifikovaný gen byl izolován a ligován na pICI0020 vektor(Př.l). Tento vektor byl dále použit k transformaci kmeneE.coli MSD522, jak je uvedeno v Příkladu 3 a označen jakoPICI1347, PICI1347 plasmid DNA byl izolován z MSD522,

puritíkováň odstřeď ováním v hustotním gradientu chloridu“česného a štěpen enzymy BamHI a Sall (BCL). Plasmid DNA (5pg) byl inkubován při 37°C 2 hodiny ve ΙΟΟμΙ BCL pufru svysokou, koncentrací, .soli. (50mM. Tris-HCl pH7,5, lOmM MgCl^,

lOOmM Naď, lmM dithioerythritol), obsahující BamHI (40jedn.) a Sall (50jedn.). DNA byla srážena přídavkem 3M ačetátu sodného (10μ1) a čistého ethanolu (250μ1), ochlazenana -20°C na 2 hodiny, odstředěním shromážděna (lOmin, 10000ot/min), vakuově usušena a rozpuštěna v 10μ1 vody. K vzorkubyly přidány 2μ1 pufru o složení 240mM Tris-acetátu pH7,8,6mM EDTA, 20¾ sacharosa, 0,2¾ xylen cyanol a .0,2¾bromfenolová modř a směs byla aplikována na 0,7¾ agarosovýpreparativní gel (v Tris-acetátu pH7,8 a lmM EDTA),obsahujícím ethidiumbromid (0,5pg/ml) a podrobenelektrofořéze při napětí 100 volt 1 hodinu. Velký BamHI-SalIfragment vektoru byl izolován z 0,7¾ agarosového gelumetodou Čištění genu (trademark). Podobným způsobem bylizolován plasmid pICI1239, z Příkladu 3, a dále štěpen i

- 40 - enzymy BámHI . a Sáli. Malý fragment BamHI-SalI, obsahujícít .kodóny, pro. Ser v pozicích 60 a 65, byl izolován a .ligován dovelkého výše popsaného vektorového fragmentu BamHI-SalI.

Směs byla použita k transformaci buněk kmene MSD522 E.coli a. plásinidl· byl označen j_ako„pI.CI 1.34.8 ._Fermenta.ce,,a:, purif.ika.ce~, probíhaly způsobem popsaným v Příkladu 6. Příklad 9

Postup uvedený v Příkladech 1 a 2 byl opakován s použitím buněk kmene TG1 E.coli při fermen-taci {viz Příklad le) místo:kmene MŠD 522 E.coli. Příklad 10

Alternativní extrakční postup, lidského [Met 1, Arg11/Seri7,27,60,65]G.CSF

Zmražené buňky (640g) byly resuspendovány při teplotě4°C v 50mM Tris-HCl, 5mM EDTA, 5mM dithiothreitol, 2Mmočovině, pH 8, 0 (5 litrů).,, obsahujícím lmg/ml azidu sodnéhov homogenizátoru Polytron s.· PTA20 sondou při rychlostiotáček nastavené na hodnotu 7/8.. Buňky byly v suspenzipodrobeny lýzy trojnásobným protlačením v Manton-Gaulin Lab ·60/60- homogenizátoru při· óOOOp.si a promyty 1 litrem pufru.Ochlazení bylo provedeno v Conair chladiči při -20°C.Lysované buňky byly dále odstředěny při 5000xg 30min. vodstředivce zn.Sorvall RC3C s rotorem H6000A. . Po sliti supernatantu. byly pelety (asi 450g)resuspendovány ve stejném, výše popsaném pufru (10 litrů).

- 41 - .... Po^následném 30- minutovém - míchání -při - laboratorní- teplotě, '-"- bylá suspenze odstřeďována 30 min. při 5000ot/min naodstředivce Sorvall RC3C s H6000A rotorem. Supernetant bylopět slit a pelety byly ošetřený dvakrát stejným, výšepopsaným způsobem. Dále byly pelety dvakrát suspendovány vevodě (10 litrů) a.odstřeďovány 30min. při 5000ot/min. Taktozpracované pelety, obsahující-promyté inklusní částice, bylyresuspendovány v Tris-HCl pufru pH 8,0 (llitr) s 2% w/v “ " sodnou solí N-lauroylsarkosinu, obsahujícím lmg/ml azidu sodného, v homogenizátoru Polytron s rychlostí otáčeknastavenou na hodnotu 7. Byl přidán roztok 20mM síranusodného v.e vodě (l,5ml) a směs byla míchána při laboratorníteplotě přes noc. Poté následovalo odstředění při =======1.0.0.0.0.o.fc/mi-n7=-3 Omin==na=ods -tře d-iv-ce=S o tv-al4=RG SG=s=G-SA::

rotorem.

Supernatant, který obsahoval žádaný derivát, bylfiltrován přes filtr s velikostí pórů 5pm, aby bylyodstraněny případné nečistoty a tuhé částice, dále byl 6xzředěn 50mM Tris-HCl; pufrem pH8,0, obsahujícím lmg/ml azidusodného (při 4°C). Dále byla provedena diafiltrace naultrafiltračním zařízení Amicon DC20, vybaveném S10Y10filtrem s mezí propustnosti lOkD, při maximálním tlaku,proti roztoku obsahujícím lOmM fosforečnan sodný, 150mMchlorid sodný pH 7,4 (90 litrů) s lmg/ml azidu sodného. Kekonci diafiltrace se vytvořila sraženina. «

Retentát. (celkový obsah bílkovin 2,lmg/ml, obsahproduktu 1,7mg/ml) byl shromážděn v polypropylenovýchnádobách se šroubovacím uzávěrem o objemu 41 a inkubovánpřes noc při 37°C. Vzniklá sraženina byla odstraněnaodstředěním při 5000 ot/min 45min na odstředivce Sorvall - 42 -

X

X

* '-i-. Λ-J.;. ./'"ÍJ . v '-*-' '··' ;··.··. . . “ýsí ·, ><: * - f .•>/•,7··-^'*^* ---1 . \4'·λ ·’-- '.' ;'- ‘2 . ;<&amp;·<;· 4.·. /,»..··... ’:XV’'j;XRC3CXa^supernatant byl uchováván při 4°C. / Provedením SDS-PAGE a rpHPLC bylo prokázáno, že během závěrečného postupu, zahrnujícího působení vyšší teploty,byly selektivně vysráženy kontaminující bílkovinymikroorganismu E.coli, oligomerní produkty a produktydegradace, s určitou částí 'žádaného produktu,' ž nějž 85¾zůstalo v roztoku. Vysoce obohacený, přečištěný roztokproduktu po tepelném ošetření, byl plně biologicky aktivní astabilní v koncentraci 20mg/ml při teplotě 37°C více než dvatýdny bez jakéhokoli náznaku možnosti proteolytickédegradace. Během této doby se vysráželo méně než 20Vproduktu. Tak byl- získán vynikající meziprodukt pro dalšíchromatografickou purifikaci. Příklad 11 .

Charakterizace G-CSF a jeho derivátů — 1 17

Roztok [Met , Ser ]G-CSF a jeho derivátů ve vodě(Příklady 1-9) (konc. bílkoviny Img/ml), byl zakoncentrovánna hodnotu llmg/ml bílkovin s použitím membrány Amicon YM10,při 4°C. Vzhledem k prevenci jakéhokoli možného sráženíběhem zakoncentrování, bylo pH výchozího roztoku upraveno zhodnoty. pH 5,5 na hodnotu 8,5 přídavkem hydroxidu amonného svýslednou koncentrací 0,25mM, Po zakoncentrování bylo pHsníženo na hodnotu přibližně 8,0.·

Koncentrace bílkovin v roztoku zakoncentrovanébílkoviny (derivátů)· byla upravena na hodnotu lOmg/mlbílkovin přidáním 20x koncentrovaného fosfátového pufru. .7. . . ‘ ’ 7?< ' *Λ - 43 - .,.T.ento. ..koncentrovaný- roztok-derivátu v lOmM -fosfátu sodném,15ÓmM chloridu sodném, pH 7,4 (PBS) poskytl běžný zásobníroztok, u něhož byla stanovena homogenita, identita,biologická aktivita a stabilita proteinu v roztoku. Zásobní roztok lidského G-CSF v PBS (zásaditý fosfátovýpufr) o koncentraci lmg/ml, popsaný v odkazu k Příkladu 1,byiT též připraven. PAGE-SDS (SDS elektroforéza v polyakrylamidovém gelu)za redukujících i neredukujícich podmínek, a rpHPLC {HPLC sreversní fází) bylo prokázáno, že každá bílkovina je alespoňz 95¾ jediný protein (složka). Opakovaná analýza zam-i-n.o.k-y-s.e.l·i-no.v-ého=siožen-í=po=k-γse-l'é=hydrΌΐýz'e—6N—ΗΟΊ^ρϊΐ 110°C poskytla údaje o množství aminokyselin v každémderivátu a současně o přesné koncentraci bílkoviny vzásobním roztoku. Tato koncentrace bílkoviny spolu spoužitím výsledků bioanalytických titrací, získaných běhemalespoň šesti dní, byly "použity ke stanovení specifickéaktivity derivátu. N-terminální sekvenační analýza aelektronová hmotnostní špektrometrická analýza selektovanýchderivátů poskytly očekávané sekvence a jejich molekulovéhmotnosti. Příklad 12 Příprava [Arg11, Ser17'27'60 * * * *'65] lidského G-CSF s použitím produkčního vektoru včetně trp promotoru. a) Plasmid pICI1239.(uvedený v Příkladu 3) byl štěpen enzymyEcoRI a Sáli v H pufru jak bylo dříve popsáno. Malý fragment ' *^’1^ ^/1. ť * ' ," " " '’·£'·< - ’-'τ1!':» >'“ ·*·.- . ''AjfJr-ji'· · J* ·'",' ; · ^ * 1 /- .' ->'>’- .i·:·'.·· ^- - 44 -

EcoRI-SalI, *. »dr<í~A· ", . obsahující trp promotor, místo pro vazburibosomu a gen.pro [Árg11, Ser17,27'60/65] lidský G-CSF/ bylizolován z 0,7% agarosového gelu metodou Čištění genu (TM).Vektorový .fragment byl připraven z plasmidu piCI 0080 (viz odkaz Příkladu 6), štěpeníinTenzymy'ΈσοΚΙ’a"XhoT 'V-H-pufru- avelký EcoRI-Xhol fragment byl izolován z 0,7°í agarosovéhogelu metodou' Čištění genu (trademark). Malý fragmentEcoRI-SalI byl ligován do vektorového fragmentu EcoRI-Xhol,přičemž byl použit 2:1 molární přebytek insertní částioproti vektoru tak, jak byl dříve popsáno, a ligační směsbyla poté použita k transformaci buněk kmene E.coli MSD 522.Transformované buňky byly selektovány růstem na miskách sL-agarem, obsahujícím tetracyklin (15ug/ml). Tři koloniebyly vybrány a ponechány růst v minimálním mediu M9 (75ml),které obsahovalo příslušné složky a tetracyklin (15ug/ml),20 hodin při 37°C na třepačce. Akumulace bílkoviny bylasledována vyhodnocováním výsledků po SDS-PAGE, kdy gel bylbarven Coomassie blue. Pro SDS-PAGE byly používány vzorkycelých buněčných, lysátů. Všechny tři klony obsahovaly .17, 27, 60, 65- exprimovaný [Arg11, SeřA'' Λ'' Ol^'OJ] lidský G-CSF.DNA jedné z kolonií byl označen jako pICI1327 apromotoru a genu byly ověřeny standardnídideoxysekvénace, popsané již dříve.

Plasmid sekvence metodou b) Fermentace

Plasmid piCI 1237 byl transformován do buněk kmeneE.coli MSD 522 a výsledně rekombinantní buňky bylypurifikovány a udržovány v glycerolu při -80°C. Část kultury byla odebrána ze zásobní směsi a rozetřenana misky s agarem,. obsahujícím tetracyklin, aby došlo přes

3Z°?-1L,Á3íýTs.t^-íg-dhotliyý.ch_kolonií. Po nárůstu--bylaodebrána samostatně narostlá kolonie, resuspendováha v lOmlkultivačního media s tetracyklinem a ΙΟΟμΙ bylo ihnedpoužito k inokulaci 3 Erlenmayerových baněk (250ml),obsahujících 75ml kultivačního media s tetracyklinem. Po16-ti hodinovém růstu na třepačce při 37°C byl obsah baněk snarostlými buňkami použit k inokulaci fermentoru,-obsahujícím' 201 "ZuTtivaČníhó-media

Složení kultivačního media g/i KH2PO4 3,0

Na2HPO4 6,0

NaCl 0,5 hydrolyzát kaseinu (Oxoid L41) 2,0' (nh4)2so4. 10,0

kvasničný extrakt (Difco) 10, P glycerol 35,0 L-leucin 0,625

MgSO4.7H2O 0,5

CaCl2.2H2O 0,03 thiamin ' 0,008

FeSO^/kys.citrónová 0,04/0,02 roztok stopových prvků (TES) 0,5ml 1_1 tetracyklin . ..... lOmg l”1 rozpuštěno v destilované vodě - 46 - v '·. T.~.“J.'·.·*1 ·* ^•^srřjG*,>*Λ»Τ -' -·. ·' ./v. *’·££ ' ... · r ň .< · ' , v,.; , ' . . 'i sí;r Fermentace probíhaly- při?-teplotě 37OC a pH 6,7, které .. V - ' '' *T.‘ ;/ '.' * * ' . - -‘I-,' ~' .Ή. ' : Ϊ J . 1 \ ' “ťbýlo^ automaticky: regulováno- přídavky ? roztoků 6M hydroxidu sodného. Parciální tlak kyslíku (dOT) byla nastavena nahodnotu 50% vzdušné :saturace a zpočátku byla automaticky ^rěgurováná^^úpravou^rychíosti^táček^míchadla?’ PFu tok "vzduchubyl zpočátku 201/min, což odpovídá průtoku 1 objemu vzduchu,vztaženého na objem media za minutu (Wtí), a byl zvýšen nahodnotu 501/min (2,5 WM), v okamžiku, kdy rychlost otáčekmíchadla dosáhla 80-90% svého maxima. Vzhledem k tomu, žerychlost přenosu kyslíku (OTR) ve fermentorech nebylaschopna uspokojit spotřebu kyslíku bakterií, při hustotěbuněk v mediu vyšší než jeta, které odpovídá absorbance 50při vlnové délce 550nm za popsaných podmínek, byl přírůstek Λ rychlosti přenosu kyslíku (dOT) ve fermentoru při vyššíchhustotách buněk, udržován na hodnotě 50% vzdušné saturace.Tohoto . efektu byl dosaženo při kultivaci buněk, jejichžhustota v mediu odpovídala hodnotě 50 absorbance zákalu,měřeném při vlnové délce 550nm, v mediu s limitovanýmmnožstvím zdroje uhlíku s následným dodáním stopového .množství zdroje uhlíku spolu se síranem amonným a kvasničnámextraktem rychlostí, která omezovala rychlost růstubakterií.

Fermentace probíhaly 18 hodin, v průběhu kultivace bylyodebírány vzorky, byla měřena absorbance zákalu při vlnovédélce 550nm, sušina buněk a množství [Arg11, Ser17,27,60,65] ” lidského G-CSF uvnitř buněk. Množství [Arg11,Ser^7,27/65] lidského G-CSF byla sledována po zbarvení ·' gelů Coomassie modří po SDS-FAGE (elektroforéza vpolyakrylamidovém gelu s SDS), která byla provedená vždy scelými buněčnými lysáty vzorků bakterií.

____ ,V_ .okamžiku,..kdy.:, _absorbance_~zákalu~ .při vlnové ~ délce 550nm dosáhla hodnoty 35 (8,5 hod.), byl7 do férméntoru přidáván roztok hydrolyzátu' kaseinu (100g/l Oxoid Lál) vmnožství. 0,75g/l za hodinu. V průběhu kultivace, kdy absorbance zákalu při vlnovédélce 550nm dosáhla přibližně hodnoty 50, došlo k vyčerpánízdroje uhlíku, což vedlo k rychlému vzrůstu parciálníhotlaku kyslíku. (dOT) z hodnoty 50% vzdušné' saturace. V tomtookamžiku byly do media přidány glycerol (470g/l), kvasničnýextrakt (118g/l) a síran amonný (118g/l) množství, kterézpůsobilo obrat a návrat k zpětnému udržování dOT na hodnotě50% vzdušné saturace .při míchání, dosahujícím přibližně'17-0=80%—max-i-ma-.—R-ych-l-osít—pÉrídav.-k-u—hydr.o 1-y.z át-u =kas e inu—byia- stále udržována na hodnotě 0,75g/l/h. Přibližně po 18hodinách, když byla mikroskopicky identifikována přítomnostvelkého množství inkluzních . částic u většiny; buněk, bylybuňky bakterií odstředěny na odstředivce: Sorvai RC3B při7000xg, 30min a teplotě 4°C a zmraženy na -80°C. c) Furifikace

Purifikace byla provedena způsobem popsaným v Příkladu Příklad 13

] lidského G-CSF s použitím produkčního vektoru včetně promotoru T7A3 sšBířJK’·

·’ ' 4. 5,4 .? -í’/-;·„?;·£>-f• ‘t * J··*-í ·*· ^-- ‘Š -.48 - íí tťť. ;a):fFrágment^E§)ŘIrSalI, , obsahující T7A3.'. promotor , a vedoucíi·sekvericiKipřd λvazebné místo ná ribosomu a gen pro‘[Ser ' ]

lidského G-CSF byl· klonován do plasmidu M13 mpl8, jak jepopsáno v části. d)‘, Příkladu I. Sekvence EcoRI-SalI fragmentu je vyjádřena v SEQ ÍĎ č. 50 á™ uvedená’"‘na~Obr. 3,* SEQ ID č. 50 obsahuje EcoRI restrikční místo (nukleotidy 1-6), sekvencí pro A3 promotor bakteriofágu T7 (nukleotidy .7-52), vedoucí sekvenci pro vazebné místo trp na ribosomu {nukleotidy 53-78) a translační iniciační kodon (nukleotidy17 27 79-81). Obr. 3 vyjadřuje nukleotidovou sekvenci [Ser ' ] lidského G-CSF, která končí v Sáli restrikčním místě. Budevýhodné, když 3' terminální ATG kodon sekvence SEQ ID č. 50<i,ihned následuje za ACT kodonem, který kóduje threonin&amp;(aminokyselina 1) na Obr. 3. Z toho pak vyplývá, že 5'-nukleotidová sekvence AATTCAGT není přítomná ve fragmentuEcoRI-SalI. Fragment EcoRI-SalI může být také připravensestřihem z plasmidu pICI 1295 (viz odkaz k Příkladu 7)JBodová mutageneze' byla provedena na jednovláknové DNA, jak·'·'je popsáno v odkazu k Příkladu 2, s použitím oligonukleotidůSEQ ID č.28, s cílen změnit kodon pro Gin v pozici 11 na.kodon pro Arg. Dvouvláknová RF DNA byla připravena z plaku, který obsahoval změnu Gln^ -> Arg^, popsanou v Příkladu 3, s výjimkou kroku B3, inkubace probíhala 3 hodiny místo5-ti hodin, dále byla DNA štěpena EcoRI (jak bylo dřívepopsáno) a SnaBI (jak bylo popsáno v odkazu k Příkladu 5).Výsledný 144 bp EcoRI-SnaBI fragment, obsahující T7A3promotor, vedoucí sekvenci pro vazebné místo trp na ribosomua genový fragment s Arg^1 kodonem byl isolován a ligován sEcoRI-SnaBI vektorem, vyštěpeným z pICI 1327 (kterýobsahoval kodony pro Ser**0 a Ser^ a je popsán v Příkladu12. Ligačnx směs byla použita k transformaci buněk E.colikmene MSD522, transformované buňky byly selektovány růstem i, V·: ·. o* '·'< . 4 v .-Λ·»1 λΆ

, /»· ' "

- 49 ..na, - miskách s_ Jcagaremkterý^—obsahoval—tetracyklih' (15gg/ml). PÍasmid DNA, pocházející z kolonie, obsahující , předpokládaný T7A3 promotor a genová sekvence [Arg^,Ser17'27'60'65] lidského , G-CSF, byly identifikoványsekvenováním DNA izolovaného plasmidu a označeny jako picí1386.

Fermentacě' byla provedena na základě dvou alternativních procesů b) a c) viz níže.'- Postup .b) ....probíhal-—11--- “prT”370C a po 16-ti hodinách fermentace, jak bylo uvedeno, bylo získáno 35g/l mikrobiální biomasy a množství vzniklého[ArgU, Ser^7'27,6θ'65} lidského G-CSF bylo stanoveno na7g/l kultivačního media. Proces c) byl prováděn při teplotě___ —30-C—a—fe_rmentace.,-^-v—sou-l-aduz=s=použi-tím—ni-žs~í—kuitiva^čhíteploty, probíhala pomaleji. Při této kultivaci označené c)bylo po 35 hodinách získáno 55g/l mikrobiální biomasy avýtěžek [Arg11, Ser17'27'60'65] lidského G-CSF byl 15g/l kultivační půdy. b) Kmen É. coli CGSC 6300 (genotyp F , λ , lac+), získaný zbakterií E.coli sbírky Genetic Stock Centre,, byltransformován plasmidem pICI 1386. Výsledný kmen CGSC 6300(pICX 1386) byl purifikován a uchováván v glycerolu přiteplotě -80°C. Část kultury byla odebrána ze zásobní směsia vyočkována na misky s agarem, obsahujícím L-tetracyklin,aby mohly být po nárůstu, (přes noc cca 16hod. při 37°C)izolovány jednotlivé kolonie.

Samostatně narostlá kolonie byla odebrána aresuspendována v lOml kultivačního media, které obsahovaloL-tetracvklin a bezprostředně - potom bylo ΙΟ,ΟμΙ tohotoroztoku použito k inokulaci každé z dvaceti Erlenmayerovýchbaněk (250ml), obsahujících 75ml růstového media s - 50 - SS.-· '' '* ' ' "-Z^Ý -/ ,-' ? .· · ' .L-ťétracyklinem.

Po ./. 16-ti hodinovém růstu při

37°C na íX^’ř7Xtřěpačce; - byl obsah-všech baněk spojen a použit k inokulaci<-> ií* ; ' . · > * - fermentoru, který obsahoval 20 litrů modifikovaného - kultivačního media' LCM50.je uvedeno v Tabulce 1.

Složení kultivačního media LCM50 TABULKA 1: Složení kultivačního media

Modifikované kultivační medium LCM50 (A) látky jsou rozpuštěny v destilované voděg/i kh2po4 3,0 Na2HPO4 6,0’ NaCl 0,5 hydrolyzát kaséinu (Oxoid Lál) 2,0. (nh4)2so4 ··.·/..- 10,0 kvasničný extrakt (Difco) 20,0 glycerol 35, 0 MgSO4.7H2O 0,5 CaCl2-2H2O 0,03 thiamin 0, 008' FeS04/kys.citrónová 0,04/0, 02 Roztok stopových prvků (TES) (0,5ml/l) Tetracyklin (lOmg/l) 51

tťí·. .«i -! * '-.' .-·,· ' > . 2Ů .Fermentace probíhala- při teplotě-37¾ a- při pH 6, 7,............. ^^^^•které:. bylo' automaticky regulováno přídavkem 6M roztoku hydroxidu sodného. Parciální tlak kyslíku (dOT) byl ustálen . na 50% vzdušné saturace a zpočátku byl automaticky regulovánúpravou rychlosti otáček míchadla. Průtok vzduchu bylzpočátku 201/min, což odpovídá průtoku 1 objemu vzduchuvztaženého na objem media za minutu (WM) a bylručně zvýšenna hodnotu 451/min, v okamžiku, kdy rychlost otáček míchadla dosáhla svého maxima (1000 rpm). Fermentace probíhala_16____ hodin a během této doby byly odebírány vzorky na měřeníabsorbance zákalu kultury koncentraci biomasy, koncentraci celkové mikrobiální bílkoviny a množstvíakumulovaného [Arg11, Ser17'27'60/65] lidského. G-CSF v ____________~-y-t ....... .bak-ter-i-á-l-nl-Ch^^=buňkáchΐ=Množs-t-v-í==a-k-l·]ml·l-1-a-ce;=[¾-rg^-y-

Ser17'27'6θ'65] lidského G-CSF bylo sledováno po zbarvenígelů Coomassie blue po SDS-PAGE elektroforese, která bylaprovedena vždy s celými lysáty vzorků* bakterií,. jak ‘ bylo?popsáno',, Celkový obsah mikrobiálních bílkovin'byl stanovenLowryho· metodou;· Roztok kvasničného extraktu' (225g/.l) bylpřidáván . do fermentoru 4,5 hodiny po začátku inokulacerychlostí l,7g/l/h.

Když byl v; růstovém mediu vyčerpán zdroj uhlíku(glycerol), dOT rychle poklesl z 50¾ vzdušné saturace. Vtéto fázi byly přidány, živiny, obsahující glycerol (714 g/1)a síran amonný (143g/l). Protože rychlost spotřeby kyslíku(OUR) dosáhla maximální rychlosti spotřeby kyslíku vefermentoru (OTR), těsně před tím, než byl vyčerpán zdroj ťuhlíku, byly do fementoru přidány živiny v množství, kteréovlivnilo růst bakterií do té míry, že rychlost spotřebykyslíku (OUR) dosahovala přibližně 80-90¾ maximálnírychlosti spotřeby kyslíku ve fermentoru (OTR). Rychlostpřidávání živin byla ručně upravena na původní rychlost a

i: íí’/ Λ' /•j v '·'.· τ·?·^?ς? "Cl·'" Άί\ *sr — .. ». ^-V>t

- 52 - 52 ' poťóWbyloΪ udržováno dOT při, maximálně 50¾ vzdušnění za j iž."'výše/popsaných· podmínek. / . ; . .· c) Fermentační proces popsaný v (b) byl opakován, avšak"při'"’teplo tě ~ ’ ·3Ό°ϋ” ‘-pO'' dobu '“*"35 Rodin?” Kromě "^ferméiitáčňíteploty, 30°C, bylo medium a fermentační podmínky stejné jako v bodě (b). ... d) Purifikace byla prováděna jak bylo popsáno vPříkladu l(f). · ‘ Příklad 14

Příprava [Glu15, Ser17'27, Ala26'28, Arg30]hu G-CSF

Mutagenní templát, M13mpl8, obsahující gen pro[Glu , Ser ,Ala ' , Lys ]hu G-CSF, byl připraven jak bylo popsáno v části (d) Příkladu 1, kdy plasmid pICI1266byl nahrazen pICI1080. Postup popsaný v Příkladu 3 bylopakován za použití výšezmíněného templátu s mutagennímoligonukleotidem označenýcm SEQ ID č;37. Tím došlo kezměněkodonu pro Lys v pozici 30 za kodon pro Arg.Dvoušroubovicová RF DNA byla připravena z jednoho fágu,který obsahoval požadované změny. Expresivni soubor genu,EcoRI-SalI byl isolován a klonován do pICI 0080, jak bylopopsáno v Příkladu 12, čímž byl získán pICI 1343.

Další postup k získání látky uvedené v názvu příkladu,byl prováděn jak je popsáno v Příkladu 6.

Vií'· V · -i· ·. *-· .1 v· ' 'y ' · ··. . P1 > "- .·' "

2“ř- ,í Příklad. 15______ ________ ________J____________________i

Příprava [Arg11'23,Ser17,21' 60'65] lidského G-CSF •1 Fí 3 S*i

Mutagenní templář, M13mpl8, obsahující gen pro [Arg11,Ser17'27'60/63]hu G-CSF, byl připraven jak bylo S; popsáno v části (d) Příkladu 1, s plasmidem pICI 1239 nahrazeným pICI 1080, Postup popsaný v Příkladu 3 byl £ -opakován zapoužití výše uvedeného templářů s mutagenním č -----------------------— — - -...........................—·’ ··—............................-- -----------:;-[s oligonukleotidem nazvaným SEQ ID č.38. Tento postup způsobil il 1 ίϊ změnu kodonu pro Lys v pozici 23, za kodon pro Arg.

Dvoušroubovícová RE DNA byla připravena z jednoho fágu, $ I * /· I obsahujícího žádanou změnu a expresivní soubor genů byl £ _ ^„„^_irs;o.~l;oy.án~a~Klonov-ána.,—-j^ak^bylo—popsáno—v—Prř-í-k-l-adu—1-4-,—čí-mž.............— byl získán pICI 1388. · . . £

Další postup používaný k získání látky uvedené v názvu £ příkladu.a její purifikace byla provedena jak bylo popsáno v < Příkladu.. 1. * . . ’ | Příklad 16 j Příprava [Arg11,34, Ser17'27'60'65] lidského G-CSF j <

Postup popsaný v Příkladu 15 byl opakován s | oligonukleotidem označeným jako SEQ ID č.38 nahrazeným SEQ „ | ID č. 39 (to slouží pro změnu kodonu pro Lys, na pozici 34, £ za kodon pro Arg), za vzniku pICI 1389. ř r

Další.postup,;sloužící k získání látky, uvedené v názvupříkladu a její purifikace byly provedeny jak je popsáno v «**§?££;· *sSS^fe3wa.’ix j "•Γ'.·* » &amp;>&amp;?'. ^ja··7-'· .„ II1. í-SÍJu' « ’ * ' . 1 ^=-A .ř':,· 54 - Ί .:.¾¼½¾½^1 j ?*·· .4 * Z- - /?ír ,?>.,.'·*>' ’ · ♦ -7· <'.’ í. *>♦· ťiMjjJL.·<. «*í·ί<\ Př íkiadů·. 1. Příklad 17 · ·

Příprava [Arg11,40,Ser17,27, 60'65] lidského G-CSF

Postup popsaný v Příkladu 15 byl opakován : soligonukleotidem SEQ ID č.38, nahrazeným oliginukleotidémSEQ ID č.40 {to slouží pro záměnu kodonu pro Lys v pozici 40za kodon pro Arg), za vzniku pICI 1390.

Další postup používaný k získání látky uvedené v názvu1'příkladu a její purifikace, bylá provedena jak je popsáno vPříkladu 1. i. Příklad 18

Příprava [Ala1,Thr3,Tyr4,Arg5'1X, Ser17:'27' 60' 65 j . . lidskéhoG-CSF

Postup popsaný v Příkladu 15 byl opakován soligonukleotidem SEQ ID č.38, nahrazeným oligonukleotidemSEQ ID č.41 (to slouží ke změně kodonů pro Thr, Leu, Gly aPro na pozicích 1,3,4 a 5 za kodony pro Ala, Thr, Tyr a Arg,za vzniku pICI 1391.

Polypeptid tohoto příkladu ukazuje, že modifikacepředkládaného vynálezu může být aplikovaná na polypeptidy, okterých je známo, že mají G-CSF aktivitu, za účelem zvýšenístability roztoku polypeptidu. Známý polypeptid je

•ύ ' . Čó. Ltd.

Další postup sloužící k získání látky uvedené v názvupříkladu a její purifikaci,byl proveden jak bylo popsáno v'Příkladu 1. Příklad 19

Příprava [Arg11, Ser17,27] lidského G-CSF .........-P-osZtupv—uveděny-^—v-—Př-íkl-adu-—4-,——by-1 opakován-—s—— oligonukleotidem SEQ ID č.30, nahrazeným SEQ ID č.28 (toslouží k změně kodonu pro Gin v pozici 11 za kodon pro Arg).Soubor genů; byl přenesen, do, expresního,.-.plasmidu.řpICI...0080,.místo picí- 0020, jak bylo. popsáno v Příkladu 14, za vzniku.pICI 1405.

Další postup, sloužící k získání látky, uvedené v názvupříkladu a její purifikace, byla provedena tak jak bylopopsáno v Příkladu 1. I I. Příklad 20 Příprava-[Ser 17,27,60,65

] lidského G-CSF

oligonukleotidem SEQ ID ,28 nahrazeným oligonukleotidem SEQID č.29 (to slouží k změně kodonu pro Pro v pozici 60 a 65

f 7 * 56 - -,.·,. . . \.-¾ Γ' ., xza kodony pro Ser), za vzniku pICI 1400. íi- Xi ' · . · ' ... ' ' .· ·'·"'· -" ' . ; · ϊ ~ ' ' ; . - Další postup sloužící k získání látky, uvedené v názvu . příkladu a její puřifikace, byla provedena jak bylo popsáno Příklad 21

Příprava [Arg11, Ser17,27,60] lidského G-CSF

Postup popsaný v Příkladu 6 byl opakován soligonukleotidy SEQ ID č.33 a SEQ ID č.34 nahrazenýcholigonukleotidy SEQ ID č.28 a SEQ ID č.42. Tyto slouží kzměně kodonů pro Gin v pozici 11 a pro Pro v pozici 60 zaArg resp. Ser. Expresivní soubor genů byl přenesen doexpresivního plasmidu pICI 0080 místo pICI 0020, za vznikupICI 1401. í

Další postup sloužící k získání látky, uvedené v názvupříkladu a její puřifikace, byla provedena jak bylo popsánov Příkladu 1. Příklad 22

Příprava [Arg11, Ser17'27'65] lidského G-CSF

Postup popsaný v Příkladu 3 byl opakován soligonukleotidem označeným jako SEQ ID .29, nahrazeným SEQID č.43 (to slouží k změně kodonu pro Pro v pozici 65, nakodon proSer), za vzniku pICI 1418.

57 - 'Další příkladu av Příkladu postup*sloužící k získání látky, uvedené v názvujejí purifikace, byla provedena jak bylo popsáno i. , . /··..· '' ' f .·· ·' Příklad 23 Příprava [Ser.17, 27, 60] lidského G-CSF_

Postup popsaný v Příkladu 19 byl opakován soligonukletidem označeným jako SEQ ID č.28, . nahrazenýmoligonukleotidem SEQ ID č.42 (to slouží k změně kodonu pro ..... —Pro—v—pozici—i&amp;_0.-,=na—kOdon=pr.o=S:er-)^=za—vzn-i:k-u=p'IG!-=;-l-4O2=::=

Další postup sloužící k získání látky, uvedené v názvupříkladu a její purifikace, byla provedena jak bylo popsánov Příkladu 1. Příklad 24

Příprava [Ser17,27,65] lidského G-CSF

Postup uvedený v Příkladu 4 byl opakován soligonukleotidem označeným jako SEQ ID č.30,nahrazenýmoligonukleotidem SEQ ID č.43 (to slouží k změně kodonu proPro v pozici 65, na kodon pro Ser), za vzniku pICI 1420.

Další postup sloužící k získání1 látky, uvedené v názvupříkladu a její purifikace, byla provedena jak bylo popsánov Přikladu 1. v'\ .v-·· ;.· - 58 - . ·..? ·. :'· . i'.i', -·· -•Ϊ ' ·..**· 'ΑΛ·* / ,. <· ' ’ 1 -'' ” ·*

s "i -<* 3’ Iv A ·*♦?· - ÍS1 ·ί 4?* < -/ j? Λ*. r'*·-/, "-/Sk ?rj ' «' •>*lU Ά*Β»* <Ι·,ϊ\ι. ,^,·..· - ·' Ά^Τ”*' x“.?· —>.· .;·^»«·^γτ.%>·.ί. ;-·*2 i”-ζ’*’· í'“"íf ’1 · ‘ r* . : - ’ -. · · . ; Příklad 25 .,26,28 T 30Ala , Lys

lidského G-CSF

Plasmid picí 1348, popsaný v- Příkladu 8, byl štěpenXbal v pufru M a potom Sáli v pufru H, a poté byl isolovánvelký vektorový fragment Xbal-Sall z 0,7¾ agarosového gelu,jak bylo popsáno již dříve. Plasmid pICI 1243, popsaný vPříkladu 4, byl štěpen s Xbal a Sáli, jak bylo výše popsáno·*a malý fragment Xbal-Sall byl isolován z 0,7% agarosového?gelu a dále ligován s vektorovým fragmentem Xbal-Salluvedeným výše. Ligační směs byla použita k transformacibuněk E.coli kmene MSD 522 a transformované buňky bylyselektovány růstem na miskách s L-agarem, obsahujícím"ampicilin (50pg/ml). Tři kolonie byly testovány na expresi'bílkovin, jak bylo popsáno v Příkladu 12, ale s tímrozdílem, že tetracyklin byl nahrazen ampicilinem (50/ig/ml).PlasmidováDNA z kolonie, exprimující žádanou bílkovinu bylaoznačena jako pICI 1421.

Další postup sloužící k získání látky, uvedené v názvupříkladu, byl proveden, jak bylo popsáno v Příkladu 3 a jejípurifikace, byla provedena jak bylo popsáno v Příkladu 6. Příklad 26 Příprává [Arg11/165, Glu15, Ser17, 27'60' 65, Glu26'28,

Lys30,58] lidského G-CSF ν'ί^.ήΓ:?Λ"Ύ"\>Τ'.·» ' -". 'Ίγ\·7- Í. . -J '·-··?’ . :^«jhr.V'H55S· · A*·“* ·

,iK *.*.··.*>'/' Λ. ’λ · ‘-?Λ ·, · >

I ij" .'· ·. ΜΓ ··?-- -•ν^*'·> · . , · ί · ' viíí?4' ^-.-,.^..7/-.^7^- '· kí $ > ·» m, · . n -" ,‘ .. /. ,;č«;' ^. · ’- · · '·

Mutagenní ťempíáť,· M13mpl8, obsahující geri‘ pro[Arg11,Glu15,Ser17/ 27,60/ 65,Ala26, 28,Lys30]hu G-CSF, bylpřipraven jak bylo popsáno v části (d) Příkladu 1 splasmidem pICI 1348 (popsáno v Příkladu 8), nahrazeným pICI1080. Postup popsaný v Příkladu 3 byl opakován, za použitívýše uvedeného templátu s mutagenními oligonukleotidyoznačenými jako SEQ ID č. 28 a SEQ ID č. 29, nahrazenýmioligonukleotidy. SEQ ID č.44 a SEQ ID č. 32 (tyto slouží k změně kodonů pro Trp v pozici 53, za kodon pro Lys a kodonpro Tyr v pozici 165, za kodon proArg), za vzniku pICI1422. $ £ $ $ á

"V tí

‘/A 5¾ $ t-i =±=====^aI-ái-^os±up^i-ouží-cí-xrkc^í-skáni=^-tícy7=ťuvedené=ťM=3iáz5aa: 5 « příkladu, byl proveden, jak bylo popsáno v Příkladu 3 a jejípurifikace, byla provedena jak bylo popsáno v Příkladu 6. Příklad 27 Příprava [Arg11,.. Ser

Lys30,49'58] lidského G-CSF 17,27, 60, 65 t

Ala26,28, 44,51,55,

Mutagenní templát byl připraven jak bylo popsáno vPříkladu 26. Postup popsaný v Příkladu 4 byl opakován zapoužití výše uvedeného templátu s mutagennímoligonukleotidem označeným jako SEQ ID č.30, nahrazeným SEQID č.45 (to slouží k změně kodonů pro Pro v pozici 44, Leu vpozici 49 a Gly v pozici 51 a 55, za Ala,Lys,Ala a Ala), zavzniku pICT 1423.

Další postup sloužící k získání látky, uvedené v názvu tfí· £

I b

I $ !£

I $

- 60 - .-/Λ* >r,· příkladu, fbyl proveden, jak bylo popsáno v Příkladu 3 a jejípurifikacé, byla provedena jak bylo popsáno v Příkladu 6. Příklad 28 Příprava [Arg1-1'165^26,28,44,55, Lys

Glú15,lllf ^17,27,60,115,11630,49,58j lidského g-CSF

Mutagenní teraplát byl připraven, jak bylo popsáno včásti (d) Příkladu 1 s picí 1080, nahrazeným pICI 1423,popsaného v Příkladu 27. Způsob přípravy z Příkladu 3 bylzopakován za použití výše uvedeného templátu aoligonukleotidů označených SEQ ID č.28 a SEQ ID č.29,nahrazených SEQ ID č.32 a SEQ ID č, 30, za účelem přípravypICI 1424.

Další postup k získání látky uvedené v názvu příkladubyl proveden tak,jak bylo popsáno v Příkladu 3 a purifikacébyla provedena tak,jak bylo popsáno v Příkladu 6.

Odkaz k Příkladu 1

Příprava lidského G-CSF

a) Příprava syntetického genu pro lidský G-CSF DMA sekvence (obr.2) kódující aminokyselinovou sekvencipolypeptidu z Obr.2 (lidský G-CSF), byla navržena podlenásledujících požadavků : 3 ri' 1 j ) a í ! Ϊ i: i íí ΐ ?. Á :- ίί

Z ·' ϊ· jĚ^ii -.____' . ··* •Xf - *r-Ép*.\.· i

F-J tí f/ř &amp; ••»;w·^· SS-VJíTe“^· ν*Λ* ·· “ i jassasjaty. - ).;-,- _ Jednovláknpyý,„kQhezivní._konecí._který dovoluje _ligacivhodných-místech plasmidu ř ř;’Ť"·?*,'1' ,: · . 'i'?./.' 2) Řadu míst v genu pro restrikční endonukleasy, pro ; usnadnění následující genetické manipulace. 3) Překlad terminačního kodonu. 4) Kodony na 5'konci kódovací oblasti,vybrané tak, abyměly hodně A/T. Další kodony,vybrané podle jejich schopnosti .........preference exprese v E.čóli.’ ...........

Gen byl sestaven z 18 nukleotidů označených jako SEQ ID č.1- SEQ ID č.18, jak bylo popsáno již dříve. ....... —^Příprava-oligonukleotidů............- ................. ·' Oligonukleotidová sekvence popsaná již dříve, byla připravena pomocí Applied Biosystems 380Á DNA syntetizátoruz nukleosid-2-kyanoethyl-N,N-diisopropylfosforamidu s bažíchráněnou 5'-dimethoxytritylem, kdy chráněné nukleosidybylyvázané na kontrolní nosič z porézního skla o rozsahů 0,2mikromolu, podle metodiky uváděné Applied Biosystem lne.

Alternativně mohou být oligonukleotidové sekvencepřipraveny metodou popsanou Atkinsonem a Smithem v |"01igonucleotide Synthesis, a Practical Approach" (Μ. T.

Gait, Editor, IRL Press, Oxford, Washington DC, pages -35-81).

Příprava oligonukleotidových sekvencí byla následnězefektivněna použitím Applied Biosystem 380A DNA .. . .syntetizátoru- .....

Každý oligonukleotid, po vyštěpení z pevného nosiče a &amp; <-;·

&amp;

--.v.

,\V; iř KČ

ίΛ,. Λ -. -- *> ^--. '··'· -....·· ..7:- ·" ' V. /·'---·" <·:.; -··.:.-·. : : \ r:; ?'·:., ;ί· .- IV., η ť 1 j’'w'v' ' >’. - 62 - vodě ..'* .•f

3M « TŠa*.·: r.·’'/;·:·?·?'' J · ' *

roztok octanu sodného {pH 5,6; 40ul)a ethanol (lml) a směsbylávÁ.uchováyaná·. při ,-ΪΟθΟ po dobu 20 hodin. Vzniklásraženina byla odstředěna (13 000 rpm, lOmin. ) a pelety promyty směsí ethánol:voda (7:3) (200μ1) a potom rychle usušena ve, vakuu á""rozpuštěný ve ' vodě ' (15μ1) a v ΙΟμΙ směsiformamid-barvivo (lOmM NaOH, 0,5mMEDTA, 0,01¾ bromfenolovámodř, 0,01¾ xylen kyanol, 80¾ formamidu).

Oligonukleotidy byly purifikovány na 10¾polyakrylamidovéra gelu v 50mM Tris-boratu (pH 8,3),obsahujícím 8, 3M močoviny.

Oligonukleotidy požadované délky byly identifikovány UVv záření (Narang a kól., 1979 in Methods in Enzymology, Vol. "68, . 90-98). Nejžádanější pruh byl vyříznut z gelu,elektroeluován v 5mM Tris-borátu (pH 8,3) při 300 mV po 3-4hodiny. Vodné roztoky byly zakoncentrovány na 200μ1působením n-butanolu (zamíchat, rozvířit a odstranit horní . organickou vrstvu). Purifikované nukleotidy byly sráženy při.-70°C po dobu 20 hodin v 3M roztoku octanu sodného, přidáním ; ethanolu (2,5 objemu).

Sestavování genu

Oligonukleotidy SEQ ID Č.2-SEQ ID č.17 (400 pM každého)[podle dříve uvedené definice], byly fOsforylovány T4polynukleotidkinasou (3,6 jednotek), po dobu 2 hodin, při37°C v 25μ1 roztoku, který obsahoval ATP (800 pMobsahujících 25 pM y32P AT?),- 100 μΜ spermidinu, 20mM MgCl^,50mM Tris-HCl (pH 9;0) a 0,lmM EDTA. Roztoky byly zahřívány

63 ΙΟ·'·' ·-;· ί 7* : ? ν’ '· tr^ňa’100°C poř dobu 5min-;,' za účelem ukončení' reakce, pak“ byly/^smíchány páry tak, jak je. ukázáno v Tab.l, tak, aby tvořily ’

.dvoušroubovice (duplexy) od A do I. Oligonukleotidy SEQ ID č.l a SEQ ID č. 18 (400mM . v 25μ1) byly používány nefosforylované. Dále byl přidán 0,3M roztok octanu. sodného* (pH 5,6, 200μ1) a ethanolu (850μ1) a duplexy byly sráženy při -20°C po dobu 20 hodin. Získané__sraženiny_b.yly_ nahromaděny centrifugací a promyty směsí ethanol-.voda (7:3) a_potom_rozpuštěny_v.e_:vodě — (50μ1),—Páry—nukleotidů · byly spojeny dohromady, prvním zahřátím roztoků na 100°C po dobu2min. v lázni s vařící se vodou. Lázeň byla potom pozvolnachlazena.na. 40°C.(asi.4 hodiny). Roztoky obsahující 3 párydvoušroubovic. byly spojeny tak, jak je uvedeno' v Tab.l, -vytvbtehe^^kupioý^I^Iii^byiy^iyof ilizoyáriy^. rozpuštěny v" 30μ1 roztoku pbsahujícího T4 DNA ligasu (1 jednotku, BRL),50mM Tris (pH 7,6), lOmM MgCl2, 5¾ (w/v).PEG 8000, lmM ATP.,lmM DT.T. (BRL,Focus, Vol. 8 no 1 Wintér, 1986) a DNA bylaligována při 30°C, po dobu 5min.. a dále 20 hodin, při 16°C.Poté byl přidán 3M roztok octanu sodného" (20μ1) a voda(150μ1) a produkt byl srážen přidáním ethanolu (750μ1) achlazen na -20°C po dobu 20 hodin. Sraženina bylanahromaděna centrifugací promyta ethaholem (lml), potomrozpuštěna ve vodě (15μ1) a směsi formamidu a barviva ačištěna na 10¾ polyakrylamidovém gelu v 50mM Tris-borátu(pH 8,3), lmM EDTÁ a 8, 3M močovině. Proužky, odpovídajícívláknům o přibližné délce (173-186 baží), bylyidentifikovány autoradiografickou metodou a společněisolovány elektroelucí z jednotlivých proužků gelu, jak jižbylo dříve popsáno pro jednotlivé oligonukleotidovésekvence. Vlákna DNA byly spojeny prvním zahřátím vodnéhoroztoku (50μ1) na 1QO°C po dobu 2min. a potom následujícímchlazením na 40°C po dobu 4 hodin.

P’ 64 - •'.•<45' · š>W*3v~-^vy,^·. - ♦..y».lM.· ’ £+¾ &amp;' 1 r^-ťťrřŤ-jť:·· : ,Τϊίΐί £&amp;i<fc>frř ς· ;’ J“’1· .ύ·-?" /. Skupiny^ I; II a ΙΙΓ byly spojeny dohromady, jak, bylojiž 'popsáno, genová sekvence je ukázána" na obr.2. Povysrážení byl gen fosforylován T4 polynukleotidkinasou, jakjižpbylo dříve popsáno pro jednotlivé oligonukleotidy,. apotom rozpuštěn ve vodě (20μ1). TABLE 1 DUPLEX OLIGONUKLEOTID POČET BAŽÍ V ŘETĚZCI VRCHNÍM SPODNÍM A SEQ ID č.l+SEQ ID č . 2 62 64 B SEQ ID č.3+SEQ ID č .4 60 60 C SEQ ID Č.5+SEQ ID č . 6 48 51 D SEQ ID č.7+SEQ ID č . 8 63 . 60 E SEQ ID Č.9+SEQ ID č . 10 63 63 F SEQ ID Č.11+SEQ ID č. 12 60 63 G SEQ ID Č.13+SEQ ID č. 14 63 60 H ' SEQ ID č.15+SEQ ID č. 16 60 60 I SEQ ID Č.l7+SEQ ID č. 18 55 53 I A + B + C 170 175 II D + E + F 186 186 III G + Η + I 178 173 b) Klonování cizího genu pro lidský G-CSF ]i

Syntetický . gen popsaný výše, byl klonován do plasmidového vektoru Research (1983), Vol. pSTPl (Windass a kol.,10, p. 6639). Nucleic Acid

<τ ;·ο - 65 í,~i Pro,připraví!, vektoru-bylo -lópg- pSTPl rozpuštěno ve vodě ’ <· 'j (37, 5μ1): a. 10 x B restrikčním pufru (4,5μ1) (BCL). Dále byla | přidána restrikční endonukleasa Sáli (3μ1) (BCL, 8 | J , Λ jednotek/μΐ) a směs byla inkubována 1 hodinu při 37 C, kdý . § ,γ převládal ve směsi linearizovaný plasmid nad ξ nadšroubovicovou a rozštěpenou kruhovou formou plasmidu. DNA | byly srážena ethanolem při 4°C po dobu 3Omjji.,. promyta směsí --------| ěthánolu a vody (7:3) a potom rozpuštěna ve vodě (39,5μ1), . 10X H pufru (4,5μ1) (BCL), Ke směsi byla. přidána restrikční---—-1 endonukleasa EcoRI (2μ1) (BCL, 90 jednotek/μΐ), inkubace £

probíhala 1 hodinu při 37°C, kdy převládal velký EcoRI-SalI fragment. DNA byla srážena při .-20°C po dobu 20 hodin, ΐ promyta směsí ethanol :voda (7:3) a.potom rozpuštěna vé vodě__'% . —(:2ΌμΏ---- -· ------- ~

Velký EcoRI-SalI fragment byl přečištěn na 1% ;ΐ

preparativním. agarosovém gelu a poté elektroeluován a S srážen, jak bylo popsáno již dříve, a nakonec rozpuštěn ve . | vodě /20μ1),. Pro ligaci syntetického genu, byla následující . 3 směsrn inkubována 4 hodina při 16°C: vektor DNA (2μ1 roztoku ’fragmentu EcoRI-SalI), syntetický gen (5μ1 vodného roztoku $ dříve popsaného), 5X ligasový pufr (6μ1-250πιΜ Tris pH7,6, | 50mM MgCl2 25¾ W/V PEG 800 0, 5mM DTT exBRL), voda (15μ1) a | T4 DNA ligasa (2μ1, 1 U/μΙ). Směs DNA (nebo Ιμΐ upravené $ v? ligační směsi nebo 2μ1 ligační směsi 5X ředěné vodou),byla íj použita přímo k transformaci buněk E.coli kmen HB101. Směs ? e- DNA (1 nebo 2μ1) byla přidána ke kompetentním buňkám kmene ií E. coli HB101 (20pl,BRL) v ledu a směs byla inkubována v ·, ledové lázni po dobu 45min. a potom podrobena tepelnému šoku £ zahřátímna 42°C po dobu 45 sec. Po dalších 2min v ledu bylo . í přidáno 100μ1 SOC pufru (Bactotryptonu 2%, kvasničného . extraktu 0,5%, NaCl lOmM, KC1 2,5mM, MgCl2 lOmM, MgSO^ lOmM, 66

I

- r ··" Λ .<· T^^^^-glůkosá·; 20mMl· „ -,- , v ... .a směs .byla. inkubována při. 37°C po dobu 1 ‘ΐ5^ίΚΓ^ΰάίηγ;’>Α1ϊλνο€γ súspense byly vy očkovány na misky s„ „ L-ágárem. 50yl/ml ampicilinu. Transformované buňky bylyťeštoyány na ; přítomnost. klonovaného syntetického genu zapoužití standardní hybridizační metody popsané v "MolecularCloning : A Laboratory Manual", Maniatis a kol. (Cold SpringHarbor) a v aplikačním anglickém patentu č. 8502605.’ Celkembylo 100 kolonií přeneseno na filtry (Schleicher a Schuell),kultivováno při 37°C po dobu 20 hodin, lysováno a zahřáto.Hybridizace probíhala při 65°C po dobu 20 hodin, kdy filtrbyl- v kontaktu s radioaktivním testem připraveným značením-oligonukleotidové sekvence SEQ ID č. 1 setem pro náhodnémznačení (Pharmacia). Pět kolonií, označených 1-5, které*'dávaly pozitivní hybridizační signál, bylo kultivováno v Lmediu (lOOml) při 37°C po dobu 20 hodin a poté*byl připravenDNA plasmid centrifugací v hustotním gradientu chloriducésného, jak bylo popsáno v "Molecular Cloning: A LaboratoryManuál" Maniatas a kol. {Cold Spring Harbor). * jAi DNA byla sekvenována standardní metodou. Sangera a kol., . popsanou v Proč. Nat, Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977), - založenou, na terminaci řetězců pomocí dideoxy derivátů nukleotidů, za použití Sequenase (Trade Mark) setu {UnitedStates Biochemical Corporation). Oligonukleotidy od SEQ ID19 do SEQ ID Č. 23 (definované již dříve, viz Tab.2) bylypoužívaný jako sekvenovací primerý.

Plasmidová DNA z klonu 5 obsahuje DNA sekvence, uvedenév Obr.2. Plasmid (pAG88) byl použit k transformacikompetentních buněk následujícího kmene E.coli, za použitístandardního postupu : HB101 CGSC 6300 (dále také uváděna jako MSD 522) μ i ?

I 'li

Z

KÓD SEQ ID č. 19SEQ ID Č. 20SEQ_ID ě.21SEQ ID č.22.S.ÉQ_ID_č.,_2J_ TABLE-2T -· . - ..'-Z·-".... ..

MlSTO VAZBY PRIMERU 214-234 vrchní vlákno333-353 vrchní vlákno375-395 spodní vlákno207-227 spodní vlákno 69- 93 spodní vlákno

Kmeny E.coli. HB101 a MSD522. (CGSC. 6300) jsou volnědostupné. Například mohou být získány z. E. coli Genetic Stock-ΘβηΖΓΖτ^-ΥΖ-Γβ^υη-ίνεΓ-ε-ίΖγ^^^υΰΑ^^ϋίίβ—Ε=σο1-ί=ΗΒ-10-1=πιύζε—bý-t=následně získaná například z BRL podporovaný GIBCOO LimitedUnit 4, Cowley Milí Trading Estate, Longbridge Wax,Uxbridge, UB8 2ZG, Middlesex, England nebo GIBCO laborátories, Life. Technologies. Inc., 3175 Staley Road,Grand Island, NY 14072, USA. Genotyp kmene HB101 je popsánv již dříve zmíněné příručcé "Molecular Cloning-A LaboratoryManual"jako Sup E44 hsd S20 (rn mn }rec A 13 ara-14 F leu 6thi-1 proA2 lac Y1 gal K2 rps L20 xyl 5 mtl 1. Genotyp MSD522 (CGSC 6300) je uveden v Příkladu 13. c) Klonování genu pro lidský G-CSF do expresního vektoru

Gen popsaný výše byl klonován do plasmidu pICI 0020 jakje popsáno v Příkladu l(c), zá účelem·-získání expresníhoplasmidu pICI 1056.

- 68 - •v^·.·· '·

<d) «.Fermentače '

Plasmid pICI 1056 byl transformován a byla provedenafermentače jak bylo· popsáno v Příkladu 1(e)/ aby byl získánlidský G-ČSF. '""T' ‘ ..... ' ' e) Purifikace

Purifikace byla provedena tak, jak je popsáno v druhémpurifikačním postupu, umožňujícím získání větších množstvíchHu-G-CSF, který byl popsán na stránkách 48 a 49 PCT Patent;.Publication č.WO 87/01132, který končí dialýzou proti',fosfátovému pufru

Odkaz k Příkladu 2

I . t Příprava genů pro deriváty lidského G-CSF za použití,bodových mutací .

Byla používaná fosfothionátová metoda Ecksteina a kol.:

Taylor, J .W. a kol., Nucleic Acids Research (1985) Vol., .str. 8749-8764

Taylor, J. W. a kol., Nucleic Acids Research (1985) Vol.,str. 8765-8785

Nakamaye, K. a kol., Nucleic Acids Research (1986) Vol.,str. 9679-9698

Sayers,.J. R. a kol., Nucleic Acids Research (1988) Vol.,str. 791-802

^gišlžSifiÍsjíí ?’ * W;'/ ......«£!«»,/.£·. . . ,

Wi?. · ' if... .-7.. 1 £ f S” *'4' e. n ^T" ‘ 1 r':· <· . ^Postup byl ^ proveden . zai^ použití^ -setu poskytnutého ; <Amer shám ’ International. Metoda je uvedena dále a zahrnujezměny původní metody s ohledem na použití více než jednoho «-mutagenního, oligonukleotidu a na inkubační teplotu prooligonukleotidy delší než 30 baží. * 1. Spojení mutantniho oligonukleotidu s templátem— jednovláknové “DNA":.....

Templát jednovláknové DNA (lpg/μΐ) 5,0μ1Fosforylovaný mutantní oligonukleotid (1,6pmol/lpl) 2, 5μ1Pufr 1 3,5μ1Voda · 6, Ομί

Když byly používány najednou dva mutagenníoligonukleotidy, bylo 2,5μ1 (1,6ριηο1/μ1) každého fosforylovaného oligonukleotidu přidáno k 5μ1 templátujednovláknové DNA (lpg/μΐ} v 3,5μ1 pufru 1 a 3,5μ1 vody.Když . byly použity 3 mutagenní oligonukleotidy, 2,5μ1(1,6ρπιο1/μ1) každého fosforylovaného oligonukleotidu bylopřidáno k 5μ1 jednovláknové DNA (1μς/μ1 v pufru 1 a Ιμΐvody). V případě, že se jednalo o oligonukleotidy kratší než30 baží, byly výše uvedené složky dány do uzavřené zkumavkya zahřívány ve vodní lázni o teplotě 70°C po dobu 3min.Oligonukleotidy delší než 30 baží byly ponořeny do vařícívodní lázně na dobu 3min. Poté byly zkumavky přeneseny dovodní lázně o teplotě 37°C na dobu 30min. KW* . , , .· ,4 . · · - ‘.,r -r , , r ·' '"••atftÁ&amp;ťfcV?..... ’..\- ?-·/<··· .λ’· ” ,:··'ί·ν? 70··- -- ^''j-r. i* ' ‘ . A -J v ·*,·..... -- ,.. k ,.£ ..' ' ' „ ' . , ·' '^í§'f^j2-.^*Sýptéza*ajligače( mutahtních vláken DNA :

Spojení vláken DNA probíhalo v následující reakční směsiMgCl2 (roztok) 5μ1 . 'Směs'‘nukleotidu 1 ™ ~~~ 19μ1 (obsahující dCTP a S) voda - 6μ1

Klenowův fragment (6 jednotek)- 1,5μ1 T4 DNA ligasu (5 jednotek) 2μ1 Výše uvedené složky byly ponechány přes noc v 16°C vodnílázni. 3. Odstranění nezmutované jednovláknové DNA za použitíodstředivých filtračních jednotek K reakční směsi uvedené v bodu 2 bylo přidáno: voďá ' ' ' 170μ1 ··.·’ 5M NaCl 30μ1 250μ1 vzorků bylo přidáno do horní poloviny filtračníjednotky a centrifugováno při 1500 rpm po dobu lOmin. připokojové teplotě v SORVALL RT6000B odstředivce za použitíSORVALL H1000B swing out rotoru. Vzorky, procházejí přes dvěnitrocelulosové membrány, na kterých se zachytíjednovláknová DNA ' a dvouvláknová DNA je po průchodumembránou zachycena ve sběrné zkumavce.

Za účelem odstraněni zbývající ŘF DNA bylo ΙΟΟμΙ 500mMNaCl přidáno ke vzorku a ponecháno lOmin. 'O?· •ť^íf' - ti i -' K~ filtrátu byly -přidány následující složky::.................... * . 3M octan sodný (pH 6,0) 28μ1 ledový ethanol (-20°C) 700μ1

Směs byla ponechána 20rain. v lázni ze suchého ledu aethanolua poté odstředěna v Eppendorfových mikrozkumavkách(15min.). Sraženina byla resuspendována v 10μϊ pufru 2. 1 i í£j b. $

J Ί -3 !'S| $

4. Štěpení nezinutovaných vláken pomocí Nci I. K reakční směsi uvedené v bodě 3 bylo přidáno 65μ1 < pufru—3~a—S^jOÚnoťek—TJ<=á=T=(=1=fi-l~)^=:Smě:s^zbyl-a-=idána—na—gOmin.—,------ do vodní lázně o teplotě 37 C. < 5. Štěpení nezmutovaných vláken pomocí exonukleasy III. 500mM NaCl 12μ1pufr 4 . . 10μ1exonukleasa III (50 jednotek) 2μ1

Směs byla přenesena- do vodní lázně o teplotě 37°C ainkubována 30min., 50 jednotek exonukleasy III rozložilopřibližně 3 000 baží za 30min, Směs byla potom přenesena dovodní lázně 70°C na dobu 15min. za účelem inaktivace enzymu. 6. Repolymerace a lígace DNA s mezerami ("gapped")

$ í> l·'· r. řj, i. J*ř !

V v i' n

72

r

V r; ϊ·;

I j,-. Κ:· reakční směsi uvedené v bodě 5 bylo přidáno:

Nukleotidová směs 2 13μ1MgCl2(foztok) . ' 5μ1DNA poiyměřasa í (4 jednotky)" ’ ΙμϊT4 DNA liogasa- (2,5 jednotek) Ιμϊ

Směs byla přenesena na 3 hodiny do vodní lázně 16°C

7. Transformace kompetentních hostitelských buněk E.coli TG1DNA 300μ1 čerstvě připravené buněčné suspenze kompetentních :,ψ buněk E.coli TG1 (připravených následující metodou podleHandela a Higa) bylo transformováno 20μ1 reakční směsipopsané v bodě 6 (dvakrát).

Transformované buňky v’ pozdní logaritmické fázi bylý > Ϊ; I? přeneseny na TY Top agar a inkubace probíhala pres noc při 37°C. . ·' í:

Kmen E.coli TG1 je volně dostupný riapř. z Genetic StockCentre, Yale University, USA a Amersham International plc,Amersham Plače, Little Chalfont, Amersham, BuckinghamshireH07 9NA, England, je dodavetelem jejich "in vitro"mutagenního systému, oligonukleotidového setu (Kód výrobkuje RPN 1523).

’· -· ' r

ž;'.Odkaz k Příkladu 3___

Bio-stanovení G-CSF

Faktor závislosti buněčné linie, Paterson-G-CSF(FDCP-G), získaný z Patersonova Ústavu v Manchesteru,Anglie, byl klonován limitujícím ředěním v přítomnosti -q_-csf .g-CSF citlivý "kloň",’ ^ňTcený^jako-kloh" Ě77 Wl použitke stanovení aktivity lidského rekombinovaného G-CSF. 2,5 xicf3buněk FDCP-Gklonu E7, v ΙΟΟμΙ RPMI 1640 +10% FCS,bylo přidáno ke stejnému objemu RPMI 1640 + 10% FCS, obsahujícímG-CSF. Každý vzorek G-CSF byl měřen dvakrát ve více než 10ředění. Konečný objem RPMI 1640 (viz Moore,- G.E. a ~kp;l~77;(;i;9;6.?:).,-H_JAMA,___Γ93.7=5Γ91).—+~ro%~FCS~(Jžarodě?čňe—te-l-ec-í- serum) v každé jamce mikrotitrační destičky (96 jamek), byl 200μ1. Mikrotitrační destička byla inkubována při 37°C v 5% CO2 ve vlhčeném inkubátoru, 4 dny. 1,0 uCi t i tr ováného thimidinu bylo přidáno do každé jamky a inkubováno 6 hodin.

Buňky byly zachyceny na filtr ze skleněných vláken a hladina radioaktivity byla stanovena ve scintilátoru. Bylo zjištěno, že hladina inkorporovaného triciovaného thymidinu je

přímoúměrná množství přítomného G-CSF. Stanovení FDCP-G klonu E7 bylo kalibrováno za použití rekombinovaného lidského G-CSF, získaného od firmy Amersham International,so deklarovanou specifickou aktivitou 10 jednotek/mg bílkovin.

Aktivita G-CSF vzorků byla stanovena srovnáním seznámou standardní aktivitou. .- Jednotky..G-CSF aktivity · na ml byly vypočítány- podle·následujícího vzorce: 74

·. <'W ’ iii· v-· ^fevří· ·γφ<&amp;&amp;'6«.» S-“ ?<>'» ’γ,^ς,'-< ..'_*"··. '

Xrrt.· Š . ' " «· . ^Ředěhí^stanďardu1G-CSF ".""'A: ' • í'· , > Mává j í čí 50¾ nejvyšší-ho přírůstku inkorpo- Ředění vzorku dávající 50¾nejvyššího pří- * Jednotky/mlaktivity .. G-CSF . ’rovaného ^H-thymidinu růstku inkorpo- standardu 2 rovaného H-thymidinu

Odkaz k Příkladu 4

Stabilita roztoků G-CSF a jeho derivátů

Vhodná ředění základního roztoku G-CSF a derivátů valkalickém fosfátovém pufru (PBS) při 4°C, popsaných v“Příkladu 9, bylo testováno na stabilitu roztoku. Roztokyobsahující lmg bílkovin/ml, 5mg bílkovin/ml a někdy lOmgbílkovin/inl PBS byly inkubovány při 37°C po dobu 14 dnů.Roztoky byly visuálně kontrolovány v pravidelných časových/intervalech s ohledem na tvorbu sraženiny. Po 14 dnech byl*každý roztok odstřeďován při 14 000 rpm po 'dobu 20min.,’supernatant byl odstraněn dekantací a sraženina byla ' znovurozpuštěna v PBS obsahujícím 1% v/v N-lauroyl-sarkosinu.Celkový obsah bílkovin v každém supernatantu a znovurozpuštěné sraženině byl stanoven proměřením absorbanceroztoků při 280 nm, a obsah monomerů v každém vzorku bylstanoven chromatografií s reverzní fází na HPLC. Výsledkybyly vyjádřeny jako procenta odpovídajících, údajů,získanýchpro roztoky na začátku inkubace a proroztok lmg/mlinkubovaný při 4°C po dobu 14 dnů. Rozdíly mezi celkovoubílkovinou a stanoveným monomerem, byly pozorovány pouze uněkterých znovu' rozpuštěných sraženin. Procenta zbytkovýchbílkovin v supernatantu, pro každou počáteční koncentraci,jsou .uvedeny v Tabulce. S': ΐ ;£·<.>- .: .ς.*α- ·.·’···' r - 75 -

Byly získány nášlédújící výsledky: G-CSF deriváty Spec.akt.(U/mgxlÓ9) Stabilita r< · (mg/ml. 1 5 * a .0 •*4 '.J [Met-1]hu G-CSF 0,4 23 nd nd (Met 1,Ser17]hu G-CSF 1,0 80 20 nd _ _ [Met-1,Ser17,27]hu G-CSF 1,5 80 40 nd [Meť1, Arg11, Ser17-27'60·65]hu G-CSF 1,2 98 94 92 -Y· [Met 1, Ser1 ^“Vciu1117Ser115-ř-hu G-CSF ' · *«: 2,7 100 72 50 ;>1 [Met-1,Ser17'27,Arg11'165,LyS58Jhu.G-CSF 1,2 92 77 47 i: Λ [Met-1,Glu15,Ser17,27,Ala26, 28•on LysJ ]hu G-CSF t 1,0 100 100 94 í- í 1 t [Met-1,Ser17'27,Lys49,58,Ala44'51,55]hu G-CSF 1,0 84 69 44 [Meť'1,Arg11,Glu15,Ser17'27'60Ala26,28,Lys30]hu G-CSF <65 Z 2,6 100 103 93 [Met'1,Glu15,Ser17'27,Ala26'28nn Arg ]hu G-CSF f 0, 85 100 100 . ίσο ·. [Meť1, Arg11'23, Ser17'27'60’65hu G-CSF ' ' ] / 2,5 100 98 88

76

'V pokračování: , G-CSF deriváty

Spec.akt. Stabilita rc? Au(U/mgxlO9) · . (mg/ml) 15 10 1,4 105 1,3 108 1,5 106 0, 5 100

[Met 1,Arg11'34,Ser17'27' 60,65]hu.G-CSF

[Meť1, Arg11' 40, Ser17' 27'60' 55] .

hu G-CSF

[Meť-1, Ala1, Thr3, Tyr\Arg5'11,

Ser17'27'60'65]hu G-CSF

[Met’1,Arg11,Glu15'111,Ser17'27'60'65115'116,Ala26'28,Lys3O]hu G-CSF

[Met’1,Arg11'165,Glu15,Ser17'27'60'65,Ala26' 28,Lys30' 58 ]hu G-CSF

[Met“1,Arg11,Glu15,Ser17'27'60'65,.Ala26'28' 44, 51, 55,^30,49,58}hu G-CSF

[Met-1, Arg11, 165,G1u15/ U1,

Ser17,27,60,65,115,116Ala26, 28,44,51,55,Lys30, 49, 58hu G-CSF 0,65 100 92 80 100 100 100 100 0,20 100 100 87 89 100 100. 95 0,05 100 100 100 procenta stanovená v roztoku v PBS po 14 dnech při37°C(stanoveno UV, možno i HPLC) nd = nebylo stanoveno [Met ,Ser ]hu G-CSF může být získáno podle popisu v Odkazůna příklad 5. 77

•i* 3 "Specifická'“aktivita* produktu; v každém -supernataninkubaci je stejná, jako aktivita v počátečním roztokuinkubací a nebyly pozorovány rozdíly na PAGE-SD:redukujících a neredukujících podmínek. Výše uvedené výsledky ukazují, že modifi; cepředkládaného vynálezu zlepšují stabilitu roztoku bez ztrátyG-CSF aktivity, [Met-1,Ser17]hu G-CSF v koncentraci 5mg/ml s-e—za-číná-srážet—během—3-hodin.

Odkaz k Příkladu. 5 =::^Přlp^~ava~[~SeT1:^ ' ~

Postup popsaný v příkladu 2 pro přípravu [Met-1, Ser17,27]hu G-CSF byl zopakován s následujícímivýjimkami : - 1) Dvoušroubovicová DNA pro fósforylaci byla připravena zoligónukleotidových sekvencí SEQ ID č.24, 25, 3 a 4,přičemž SEQ ID č. 3 a 4 mohou být nahrazeny sekvencemiSEQ ID č.26 a 27, které byly použity v Příkladech 1 a 2. 2) Dvoušroubovicová DNA popsaná v (1) byla fosforylovaná T4polynukleotidkinasou, ale byla štěpena pomocí SnaBI. (10jednotek) v 1 x M pufr(BCL, 30μ1), při 37°C po dobu 2hodin. 3) -Následovala purifikace ethanolěm, kdy 72 bp fragmentEcoRI-SnaBI byl purifikován místo 143 bp fragmentu"EcoRI-MstlI. . i·# % 'Μ -I ' ·;. ····· >- ,- - 78 -

v,.--.’ f 5Ϊ <·?»>.;· - «í-~;í.·^ «. _k T . ' * '-y/ , 4). Syntetický.fragment EcoRI-SnaBI byl klonován do plasmidového vektoru pAG88 jak bylo popsáno v odkazu k Příkladu 1 a pro přípravu vektoru byl pAG88 štěpen· .pomocíSnaBI (20 jednotek,BCL) v 1 x M pufru (BCL, ΙΟΟμΙ) při37°C po dobu 2 hodin místo Mstil v 1 x H pufru. 5) Následovalo srážení ethanolem, kdy velký fragmentEcoRI-SnaBI byl purifikován na 1% agarosovém gelu místovelkého fragmentu EcoRI-MstlI. Ϊ7 6) Plasmid, obsahující gen pro [Ser ]hu G-CSF byl označenpICI 1105.

Odkaz k Příkladu 6

Konstrukce pICI 0080 a) Konstrukce pTB357 (také uváděný jako pLB 004)

Plasmid pTB357 využívá reprimovaný faktor, určujícíresistenči k tetracyklinu. Tento faktor se nachází naplasmidu RP4, který se vyskytuje v přírodě. Tento systémreprese zastavuje expresi tetA genu v nepřítomnostitetracyklinu, na rozdíl od většiny mechanismů resistenceproti lékům, které mají konstitutivní expresi. . ..

Tet lokus byl poprvé zmapován na RP4, Barthem aGrinterem (J.Mol.Biol. 113, 455-474, 1977). Bylo zjištěno, že se skládá ze sousedních genů : tetA, strukturální genresistence a tetR, 'represorový gen a tato oblast byla

79 - I............................................ , \>.sekvenována (Klock a kol., J. Bactěriol., 161, 32::.- 1985). Tyto geny jsou umístěny na sousedních fragmen*BglII-Smal a Smal-Snmal. RP4 má jediné místo pro BglII,má pět míst pro štěpení Smál (Lanka, Lurz a Furste, Plas;10, 303-307, 1983). ?· i) Klonování tetA + tetR genu

Plasmid RP4 je dobře popsán (Datta a kol.,J.Bactěriol., 108, 1244, 1971) a je volně dostupný. Dále jeplasmid RP4 uchováván v National Collection of Type

Gu-l-t-ur-es-,—6-1—Colindale—Avenue.,_London, NW9 5HT pod čísly 50078 a 50437. Kmeny E. coli, obšafiujičí-ťěňto~pfasmiřřrrostly na selektivních kultivačních mediích a plasmidová DNAbyla isolovaná ve větším měřítku (scale up) podle metodyHolmese a Quigleyho (Holmes a Quigley, Anal. Biochem. 114,193-197, 1981). Byla zbavena bílkovin působením 2, 5M octanuamonného a znovu vysrážena isopropanolem, Tato plasmidová ' DNA byla ošetřena, na základě doporučení výrobce, restrikčníendonukleasou BglII. Dále byla částečně naštěpena Xmal zapoužití naředěného enzymu a krátké ínkubační doby. Xmal jeisoschizomer Smál, který produkuje 4-nukleotidové kohezivníkonce v místě štěpení. i" ! t,· íí

Vektorový plasmid pUC8 (Yanisch-Perron, Vieira aMessing, Gene, 33,- 103-119, 1985) byl připraven obdobnýmzpůsobem, konečná forma byla získána štěpením BamHI a Xmal.RP4 fragmenty byly klonovány do tohoto vektoru ligací s T4ligasou při. 12°C po dobu 16 hodin. Rekombinovaný vektor bylpoužit k transformaci kompetentních buněk E.coli C600upravených chloridem vápenatým (Maniatis a kol., Cold Spring 80 ;-ife?':;5··" · ' •v^w* ;$» £ · > · * · .Λ3Γ&amp;, <i<.· ?·· ^ř£-tf.’»í<V-Λ -'<7 bL λ Q 'f? ' ‘ .'.fr-rr. ·";<"...' ΛΚ·· ' Τί^. -MK',1 ‘ Tr-r, / ' iHářbór Laboratořy, 1982). Kultury buněk byly poté vyoč-’4·' ’ na medium selektivní na resistenci vůči tetracyklinu. ’ii) * * v E.coli C600 je volně dostupná z mnoha z· : zahrnující několik sbírek mikroroganismů jako je r .. i ......' Genetic Stóck’ Ceňtřé, Yálé Uhidver’šity7’U‘SÁ pod číslem" "Č 3004. Genotyp E.coli C600 je K12 thr-1 leuB6 thi-1 h, 31lacYl tonA21 λ"ϋΥΠθ44. ....... " Několik kolonií s touto resistenci bylo testováno napředpokládaný fenotyp (ampicilin a tetracyklin resistence,ale ne kanamycin resistence, která je vlastní RP4samotnému). Kolonie se správnou resistenci byly podrobeny;·;klonovací analyse isolovanou plasmidovou DNA’ (Holmes aQuigley). Tyto .preparáty byly štěpeny EcoRI a HindlII aanalysovány gélovou .elektroforesou. Velikost klonovanýchinsertů byla stanovena 2,45 kb, což ukazuje na fragmentBglII - Xmal - Xmal z RP4. Klon nesoucí tento fragment,obsahující tetA a tetR geny byl označen pTB344. ii) Odstranění tet genu z pAT153

Byló nezbytné odstranit tet gen z vektorového plasmidupAT153, před vložením tetA + tetR souboru genů z RP4 dopřevládající genové duplikace, která by mohla být zdrojem genetické nestability. Tedy tet gen nemůže být účinněpotlačen ne příbuzným etR. Odstranění bylo provedeno isolacíplasmidové DNA pAT153 a jejím štěpením pomocí EcoRI a Aval.Mezi tato místa byl klonován syntetický oligonukleotid se sekvencí SEQ ID č.59 :

/¾ v/ ’Λ — - .. . - »1 - -5--- AATTCGCATGCGGATCCATCGATC -3Í 3' GCGTACGCCTAGGTAGCTAGAGCC 5'

Tyto kohezivní konce jsou komplementární s EcoRI a Avalkohezivními konci a obsahují dále Sphl, BamHI a Clal místa.

Po transformaci a selekci, byly kolonie testovány na ztrátu faktoru -určujícího resistenci vůči tetracyklinu. Plasmidová ·_; DNA z jednoho klonu byla sekvenována, aby se potvrdilo, žeobsahuje předpokládanou správnou sekvenci. Tento plasmid byloznačen pCH19. iii) Vložení tetA + tetR genů

TetA a TetR geny byly isolovány z pTB34A na fragmentuEcoRI-Pstl. Vektor pUC8 byl rozložen působením SspI, protoženese stejný selekční faktor (ampicilin resistence) jakopCHl9. Plasmidová DNA pCHl9 byla štěpena EcoRI a Pstl a poté ligována s, 2>45 kb fragmentem, nesoucím tet geny. Vzniklýrekombinovaný plasmid pak byl použit pro transformaci buněkE. coli C600, a kultura transformovaných buněk pak " bylaselektována na resistenci vůči tetracyklinu. Inserce tetgenů byla určena jako náhrada většiny bia genů v pCH19, cožby mohlo způsobit ztrátu jeho faktoru ampicilinovéresistence. Tato ztráta ampicilinové resistence ztransformovaných buněk byla potvrzena. Několik klonů bylopoté použito k isolaci plasmidové DNA, která byla podrobenarestrikční analyse. To potvrdilo, _ze· konstruovaný plasmidměl požadovanou strukturu. Plasmid byl označen pTB351.

82

iv) Vložení cer sekvence

V přírodě se vyskytující ’ plasmid ColEI ' jé vstabilní v E.coli, zatímco jeho deriváty pBR322 a pA7 3stabilní v E.coli nejsou. Summers a Sherratt (Cell, , 1097-1103, 1984) zjistili, že to je způsobeno tím, i;e ί deriváty neobsahují krátkou (283 bp) sekvenci zvanou cer, ; která je přítomna v rodičovském plasmidu. Tato sekvenceobsahuje specické .místo zodpovědné za rozklad plasmidovýchmultimerů, které zabraňuje akumulaci těchto multimerůvznikajících homologních rekombinací. Tyto multimery mají" ; zhoubný vliv na proces dělení, který normálně zajišťujestabilní vlastnosti dceřinných plasmidú během bakteriálníhodělení.

Cer sekvence (Summers, D. a kol., MGG, 201, 334-338, 1985) hýla isolovaná z plasmidu pKS492 (umožněnoD.Shérrattem) jako 289 bp fragment štěpením BamHI a Taql.

Plasmid pTB351 byl. isolován jako DNA z dam kmene E.coli, abyse zabránilo blokování jeho Clal místa dam+ methylačnímsystémem. Tato DNA byla štěpena BamHI a Člal (obě tato místa • I» byla zavedena do syntetického oligonukleotidu pro toto š klonování). Cer fragment byl ligován s roštěpeným vektorem a ' j potom použit k transformaci buněk E.coli C600. Selekce byla provedena na resistenci vůči tetracyklinu. Transformované ? buňky byly podrobeny klonovací analyse pomocí restrikčni í endonukleasy Aval a gelové elektroforesy. Přítomnost dalších i zon DNA znamená přírůstek cer fragmentu.' Pro potvrzení správné struktury vznikajících plasmidu byly prováděny další

restrikčni analysy. Jeden z těchto plasmidú byl označen J

pTB357 (Obrázek 5) a také byl označen pLBOO4. J

OJ - b) Plasmid pCHlOl

Plasmid pCHlOl odpovídá plasmidu pICI 0020 (viz pří?: ,dlc), kromě toho, že fragment EcoRI-SalI (viz obrázek 1) jenahrazen fragmentem, který se skládá z SEQ ID č.53 (viz takéobrázek 6) a genové sekvence interferonu a^i jak" bylo _ popsáno Edgem M.D. a kol,, Nucleic Acids Research 1983, Vol. 11, 6419-6435. Z tohoto pohledu 3'-koncový kodon ATG SEQ IDč.53 ihned následuje TGT kodon, který' kóduje cystein(aminokyselinu 1) v sekvenci interferonu jak bylo popsánov dříve zmíněné referenci Edge, M.D. a kol.: Nucleic Acids -—..... -==:1Res:ea-r:ch:·--—5==nuk-l-eot-i-dová.-sekvence--GÁTCCATG---a ' komplementární 3' nukleotidové sekvence GTAC jsou poté vypuštěny z nukleotidové sekvence podlé dříve zmíněné reference. 1 ,;· c) Vložení expresivního souboru genů do pTB357

Expresivní soubor genů skládající se z trp promotoru,‘vazebného místa pro ribosom a genu pro. interferon bylisolován z plasmidu pCHlOl (viz předcházející bod b)’, narestrikčním fragmentu EcoRI-SphI. Poté byl ligován doprodukčního vektoru (pTB357) (viz předcházející bod a)štěpeného také EcoRI a SphI. Tato DNA byla použita kkompetentních buněk E.coli C600 a po byly isolovány buňky resistentní vůči transformaci transformaci v’ "Š r? Ϊ. í y íi tetracyklinu. Několik z nich bylo podrobeno analyseklonované DNA, ‘za účelem zjistit, zda přibylo" restrikčnímísto pro Sstl, které byloobsaženo na expresivním souboru í* c i;'

84

-¾- genů. Klony, které z tohoto hlediska vykazovaly ppsvýsledek hlediska, byly podrobeny restrikční analy.'..účelem zjistit, zda předpokládané složení konstruo. „genu. j.e správné. „Dále byly:úklony --testovány -na — sch·.- produkovat bílkovinu interferonu cc^, za po; eíelektroforézy na polyakrylamid-SDS gelu obarveném Cooma: iemodří. Jeden z klonů byl označen pLB005. d) Vložení T4 terminátoru transkripce do pTB244

Sekvence T4 terminátoru transkripce, ve formě fragmentuod Sáli do HindlII (67 bp)(viz SEQ ID č. 51 a Obrázek 4a),byla vložena do multiklonovacího místa intermediatu vektorupTB244 mezi místa Sáli a HindlII. Na potvrzení složenítohoto konstruovaného genu (pTB244.T4 ter.) byla použitaklónovací analysa. Z tohoto vektoru byl isolován fragmentSstl-Sphl, obsahující většinu multiklonovacího místa a T4terminátor. Ty . pak byly. vloženy do pLB005, štěpeného, takéSstl a Sphl, čímž nahradily gen pro interferon a2, aleponechaly soubor genů zahrnující trp promotor. Tentokonstruovaný gen byl podroben klonovací analyse a plasmidbyl označen pLB013. e) Substituce multiklonovacího místa Přítomnost multiklonovacího místa není v plasmidupBL013 ideální z několika důvodů : Sáli, BamHI a Smál místanejsou ne plasmidu jediná, ale vyskytuje se. jich tamněkolik: Tento fragment byl tedy vyštípnut pomoci Ssl a Xbal(obě místa jsou na vektoru pouze v jedné kopii) a nahrazen ' - 'í ·;Λ’^· λ—’·- ‘ '- - ···.·· ··<. -'í - 85 - — ;-“\Z r ;' :" -3 í-' .syntetickým oligoňukléótideri sé 'šekvenmcí SEQ ID č. 54 :·.··. !»·. š &amp;

I

I

;5' AGCTCCATATGGTAČCAGATCTCTCGAGAGTACTT GGTATACCATGGTCTAGAGAGCTCTCATGAAGATC5' -Kiony—byly—analys ovány—z -hlediska—přítomnosti—nových---- restrikčních míst a potom byly podrobeny sekvenování. Jedenz takových plasmidů byl označen pLB014. Nová vloženáklonovací místa jsou : Ndel, KpnI, BglII., Whol. a Seal, dálepak Xbal a Sáli, která je následují.__ f) Další, modifikace..

Bylo zjištěno, že sousední místa Ssl a Ndel v pLB014nemohou být,, pro svoji blízkost, štěpena oběma příslušnýmirestrikčními endoňukleasami, ani najednou ani postupně.Protobyla vložena mezi ně další sekvence. To bylo provedenoštěpením pLB014 pomocí Sstl a KpnI a potom vloženímsyntetického oligonukleotidu SEQ ID č. 55.

5' AGCTCAGCTGCAGCATATGGTAC GTCGACGTCGTATAC 5'

Klony byly testovány na přítomnost nových míst PvuIInebo Pstl a byly podrobeny sekvenování. Jeden z těchto •MSSKSaíjt <4. Λ=.’ ../<· < žíS^i-í ' -. - 86 - plasmidú byl označen jako pLBOIS.(= pICI 0080) (viz Ob-7). Tento plasmid je, oproti plasmidu pLB014, účinně έpomocí Sstl a Ndel. Tím se získalo místo pro vložení rúsekvencí, pro vazebná místa . ribósomů, správně umístěohledem na polohu trp promotoru po směru replikace adále zajišťuje to, že ATG iniciační kodon genuexprimovári.

Odkaz k Příkladu 7 1

Konstrukce plasmidu pICI 1295 (také označeného jako pCG300 a) Produkce pCG54 z pICI1079 pIcI1079 je resistentní vůči ampicilinu, odvozenýplasmid pAT153 obsahuje následující prvky mezi restrikčnímimísty EcoRI a StylI : (i) CI857 z fágu λ (ii) λΡ^ promotor (iii) syntetické místo pro vazbu-ribosomů (iv) syntetickou genovou sekvenci pro interferon a2

(v) syntetickou sekvenci pro terminátor transkripce,odvozený z fágu T4, mezi restrikčními místy Sália StylI. DNA sekvence pro tento terminátortranskripce je uveden na Obrázku 4 a. SEQ ID č. 56. pICI1079 je znázorněn na Obrázku 8. pICI1079 je na základě Budapešťstké smlouvy v NationalCollection of Industrial and Marině Bacteria Limited(NCIMB), 23, St.Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RZ, Scotland,

- 8/ - -ν' r"' {NGIMB—č. -40370·,· datum -uložení 19.2.1991}. „pCGÍ---------------------- konstruován tak, aby byl vhodným expresním vek’ &amp; obsahujícím stejný promotor, sekvence pro vazebné > £ ribosomu: a sekvence pro terminátor transkripce, jak i uvedeno již dříve, to jest : λρ^, RBS7 a Ť4, ~e postrádající genovou sekvenci kódující produkci specifi io ·:< proteinu. Takto zkonstruévaný plasmid by mohl zajistí, ,at činnost základního expresního vektoru, obsahujícího nezbytné žs .. ~ .prvky, umožňující - transkripci a translaci pro' produkci požadované bílkoviny,. které by mohly být zavedeny do tohoto jí vektoru následujícími klonovacími postupy. “

Konstrukce vektoru byla iniciována .štěpením pICI1079 restrikčními endonukleasami na místech pro EcoRI. a Sáli., Při :¾ ------ ---_.;1 -tom^o=^í^pen3^=byÍ=:=uV:OTnén==ťr^igment=vektoru7=^=obs:ahujíol·----------_=&amp; základ genového vybavení plasmidu pICI1079 s geny proreplikaci plasmidu a geny s resistencí proti antibiotikům anavíc T4 sekvenci pro terminátor transkripce. Fragment byl i isolován na agarosovém gelu, purifikačním. krokem, í·: používajícím metodu'Čištění genu pro závěrečné- vyčištění DNA ;.· • fragmentu. P* *

Do tohoto vektorového fragmentu byl zaveden druhý malý s fragment DNA o přibližné velikosti 1,2 kb. Tento druhýfragment může být získán například syntézou DNA nebo bodovou £ Či PCR mutagenesí malého restrikčního fragmentu EcoRI-SalI,získaného z pICI1079 popsaného výše. Tento druhý fragment £ · Λ , obsahuje stejnýpromotor a sekvence pro ribozomální vazebnémísto, jako původní plasmid pICI1079 a navíc má EcoRI a Sálimísta dostupná na 5' a 3' koncích resp., takže tím zajišťuje £ kompatibilní konce pro ligaci fragmentu pICIl079. Výsledkem , ligační reakce, za přítomnosti Gibco-BRL T4 DNA ligasy apříslušného pufru, je konstruovaný plasmid pCG54.

88

Klony, obsahující tento konstruovaný plasmidisolovány transformací části ligační reakční smě:.... o • kompetentních buněk Eí coli, kmene , HB1Q1. _

Konstruovaný plasmid pCG54 měl velikost 3,682 kb aobsahoval nezbytné znaky, tak jak jsou uvedeny na mapě naobrázku 9. b) Produkce pCG61 z pCG54 (také uváděného jako pICI54)

Syntetické oligonukleotidové sekvnce byly navrženy tak,aby zahrnovaly jak přírodní sekvence pro T7A3 promotor, taki sekvence, které by mohly zajišťovat účinnou translaciiniciační oblasti, což umožňuje bezchybné klonováníjakéhokoli polypetidového genu v jejich sousedství. Jakovhodná sekvence, pro oblast jmenovanou na druhém místě, byla .vybrána RBS1, trp sekvence pro vazbu ribozomu. Proto bylysyntetisovány dva komplementární oligonukíeotidy, označenéjako SEQ ID č.57 a SEQ ID č. 58, k vytvoření linkerudvouvláknové DNA, inkorporujícího sekvence pro T7A3 promotora pro.RBSl.

Oligonukíeotidy byly připraveny jako 84-mery,standardní metodou, používající ABI genový syntetizátor. (· Byly navrženy tak, aby v dvouvláknové .formě měly syntetickéfragmenty restrikční místa pro endonukleasy EcoRI’a KpnI na5' a 3' koncích. Vzhledem k jejich délce, oligomery bynemohly být purifikovány pomocí HPLC a na jekjich purifikacibyla využita elektroforesa v akrylamidovém geluobsahujícímlO% akrylamid a 7M močovinu. •,'fi í

8 .e u, ce ;;ou - 89 - r,· . .... j *λ>. ί· Při purifikaci byly oligomery nejdříve podrobenychromatografi nejen kvůli zjištění zda mají správnou \ale také proto, - aby se zjistilo zda purifikovaná ?obsahuje převážně požadované oligomery s požadovanou c.~ a zda nemá vysoký obsah kontaminujících oligonukleotidú xalé ú ...... .velikosti,... které. . vznikají. ...jako. vedlejší ..produkty . joři .. ... ......./i syntéze. % ....... ......................................... .......'J·................................. ......... ~ “ £·. •Λ*

Akrylamidové gely byly připraveny standardní metodou s i: persíranem ammoným a N, N,Ν',N'-tetramethylendiaminem,používaným jako katalyzátor pro polymeraci’ gelu. t

Velikost požadovaných nuklědfidů vyžaduje jejich^ vizualizaci po proběhnutí elektroforesy. Bylo proto nutné j 32 radioaktivní, značení vzorků pomocí P. To umožňuje í odhadnout kvalitu, vzorku po ukončení elektroforesyautoradiografií.

Vzorky oligonukleotidú byly dostupné v surové forměnefosforylované. Ty. pak byly používané pro radioaktivní í značení, tak, že vzorky byly značené na 5'konci fosforylací / za použití enzymu T4 polynukleotidkinasy. j

Oligomery byly získány po synteze v nefosforylovanéformě a po purifikaci byl každý oligomer individuálně <- podroben fosforylační reakci za účasti ATP na fosforylací 5'koncekaždémolekulyvpřitomnosti T4 polynukleotidkinasy (viz *

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition,

Sambrook, Fristch and Maniatis, p.5,68-5,71). Po fosforylacíbyly spojeny dva komplementární oligonukleotidy dohromadytak, že vytvořily dvoušroutíicovou DNA, obsahující T7A3 \,

90 t :-^;-:- -'· '

promotor ή RBS1 sekvence?

Vektorová molekula pCG54 byla štěpena restrikč. iiendónúkleasami EcoRI á ŘpnI.._Tim.se ^uvolnil fragment_vek;· ju.o velikosti 2,3 kb, fragment o velikosti 1,1 kb, obsahu;.cíλρτ-promotor a RBS1 sekvenci. Tento klonovací krok oylnaplánován proto, aby odstranil λρ^-RBSl sekvencesyntetickým fragmentem EcoRI-KpnI, obsahující T7A3-RBS1sekvenci. Fragment vektoru o velikosti 2,3 kb, získaný přištěpení pCG54 byl purifikován obvyklým postupem za použitígelové elektroforesy a metody Čištění gelu pro odstraněníDNA z agarosových fragmentů.

Syntetický fragment EcoRI-KpnI o velikosti 84 bp, bylligován do vektorové molekuly připravené výše a ligovaná DNAbyla použita pro transformaci buněk E.coli HB101. Selekčnímmarkrem pro rekombinované klony byla resistence kampicilinu. Po transformaci bylo vybrána řada kolonií!,obsahující rekombinantní plasmid, pro další testování.

Syntetický fragment o velikosti 84 mer, vložený dovektoru během klonování, byl jako takový nevhodný projednoduché testovací metody restrikční analysy vzorkůrekombinovaných plasmidových DNA. Inserty malých velikostinejsou viditelné na agarosovém gelu po elektroforese. -) Fragment sám o sobě neobsahuje žádné restrikční místo proendpnukleasy, které by. mohlo být vhodným diagnostickým ' důkazem jeho přítomnosti. Testování rekombinantriích klonůbylo proto prováděno metodou hybridizace kolonií (vizGrunstein a Hognes, proč. Nati. Acad. Sci. , 72, 3961, 1975).Nitrocelúlosové filtry obsahující imóbilizovanou plasmidovouDNA z rekombinantních klonů byly hybridizovány proti setu,

- 91 - 7/ připraveném' náhodným'? 'radioaktivním značením ’ spc ’ syntetických oligonukleotidů SEQ ID č.57 a SEQ ID č.5? 32 byly značena za pomocí a P-dCTP a inkubací s Klen=. i polymerasou-při 37°C po dobu 2 hodin. Rekómbinantňí ko? , které vykazovaly positivní hybridizační reakci, byly vy? γpro přípravu plasmidové DNA.Plasmidová DNA byla přípravě v ..každém z . . případů . v poměrně velkém množství metcěoucentrifugace v hustotnímgradientu Csď, aby byla. zajištěna -——:~—p o z ad ov a n á čistot a—(Viz—^Mo 1 e cul a r-Cl on ing-A.L ab o ra t o

Manual", 2nd Edition, Sambrook, Fritsch a Maniais, ColdSpring Harbor Laboratory, 1989, p. 1,42-1,52. Příprava DNAtouto metodou, zajišťuje vysokou kvalitu materiálu, .vhodného,potom pro další klonováni a sekvenční analysu. Všechna plasmidová DNA, isolovaná z rekombinantíchklonů, byla zařazena do druhého výběrového stupně sekvenčníanalysy, aby se potvrdilo, že oligonukleotidová sekvenceklonovaného spojení samotného fragmentu T7A3-RBS1 jeabsolutně správná. Sekvenovací postup používal Sequenasu ajako sekvenovací přiměř byl vybrán například pBR322 UP(pBR322 universální primer). Sekvenování bylo prováděnoSangerovou metodou, využívající terminaci řetězců pomocídideoxy derivátů nukleotidů.

<.··

Klony, obsahující správné sekvence, byly označeny,jakonový expresivní konstruovaný plasmid pCG61, který obsahujeT7A3 promotor, RBS1 sekvenci a T4 terminátorovou sekvenci(viz Obrázek 10). > 92

Λ’,·- -řýó ·*»*·'"··. 'Ύ ;,c)ŤProdúkce;pCG300= (také uváděný jako pICI1295) ··· · ψΐι · - . -w .μ...,, i n 4 z pCGc

Sekvenační a syntetické postupy, využité při kon; :i1-)27 ·..··. ^.— -— analoga O-C-SF7~-'[Ser.~]hu G-CSF—jsou popsány-v- Přík''--,.· , -1-.... -,r(viz Obrázek 3). Tato sekvence’ analoga G-CSF byla isolc^-naz konstruovaného plasmidu, ve kterém gen byl inkorporován doplasmidu pSTPl tak, že vznikl pICIl107 (viz Příklad 2).pICI1107 byl štěpen Seal a potom byl velký fragment isolovánnásledující elektorforesou na agarosovém gelu a metodouČištění genu. Tento fragment byl potom štěpen restrikční endonukleasou Sáli, aby byl získán gen [Ser ' ]hu G-CSF na i Ί . ‘ 4 fragmentu Scal-Sall, vhodném pro klonování do pCG61 (vizObrázek 10).

Po následné restrikci pomocí Sáli byl žádaný fragmentznovu isolován za použití purifikační techniky naagarosovém gelu.

Vektorová molekula pCG61 byla štěpena restrikčnímenzymem KpnI. Štěpení tímto enzymem dává 3'přečnívajícíkonec, který byl potom zarovnán použitím enzymu T4polymerasy (viz "Molecular Cloning- A Laboratory Manual",2nd Edition, Sambrook, Fritsch a Maniatis, p. 5.44-5.47. T4polymerasová aktivita byla tepelně inaktivována inkubací při70°C po dobu 30min. a DNA byla vysrážena ethanolem.Sraženina byla rozpuštěna ve sterilní destilované vodě arozpuštěná DNA byla štěpena Sáli. Fragment KpnI (nový tupý’konec)-SalI byl vysrážen ethanolem a poté přečištěn gelovouelektroforesou a další purifikační technikou. 17 27

Fragment Sčal-Sall [Ser ' ]hu- G-CSF byl potom ligovánna tupý konec vektoru KpnI-SalI. Ligovaná DNA byla 93

τ·.·.· - transformovaná do E. coli, kmen HB101. £·:. ·' - ; · -·* · i rekombinantních klonů byla provedena s ohledem na resisr Lk ampicilinu.

Vyhledávání potencionálních rekombinantních klonů b lo prováděno hybridizací. Radioaktivně značený test byl — „·---------- -připraven náhodným'"značením 'fragmentu EďóRI-Sári”'( obsahující“ 17 27 . . genovou sekvenci [Ser. -]hu G-CSF)?připravený z plasmidupTCI1107. To bylo použito pro hybridizací proti koloniímobsahujícím DNA, která byla imobilizovaná na . povrchunitrocelulosového filtru. Následně byla plasmidová DNApřipravena z 24 klonů, které hybridizovaly při tomto testu.

I —— ' -—Všechna—DNA—bvl-a~přlpxavejia~ry;chlo'úZníini-pr.e.p_měfodoulí(3řiž^

Birnboim a Doly, Nucleic Acid Researc, 7, 1513, 1979). Tytorekombinantní DNA byly podrobeny druhému stupni restrikčníanalysy. Linearizace DNA pomocí BamHI, která má jedinérestrikční místo na expresním souboru genů, je důkazempřítomnosti [Ser ' ]hu G-CSF sekvence.

Sekvenční analysa byla provedena na potvrzení17 27 přítomnosti [Ser ' ]hu G-CSF genu á na ověření, že sekvence bazfna klonovacím spojení a všude v [Ser. ' . ]hu G-CSF genu byla správná. Pro tyto účely větší množství vzorku plasmidové DNA bylo připraveno z 16 rekombinantních klonů, za použití techniky centrifugace v hustotním gradientu CsCl. Sekvenační postupy byly prováděny s ohledem na sekvenační postup a jako sekvenační primer byl vybrán universální primer pBR322 (EcoRI). Dva z rekombinovaných klonů obsáhovalv SDrávnou sekvenci -na Seal konci-fragmentu·17 27 * [Ser - ]hu G-CSF a všude v G-CSF pe.ptidové sekvencisamé.Klony byly identifikovány jako expresivní konstruovanýplasmid pCG300 (viz Obrázek 12). í C; •Í r ? ·.··; ř· . χ ' Η '··-»· ί :, ·; -VA* "·/<·.: . ;·' r · - :-' ' ' ' - 94 - i ... , ' . <:£·*Λ'-?·· '- - : Y · - ' ’ Ví- ’; . ' ίύ» ÍVV· :.; Sekvence ID c. 1 > j*! - . -. .,-v -·- / - Délka sekvence ♦ 62 basí 4 /typ 'sekvence' : nukleotid' 1. .· » · ' *’ ' .”L' . spirála .: jednoduchá - '1- ..- topologie ·: '·; - :····' lineární“ - • ......- - · — - -—·· ..... -r- · - ·* · AATTCAGT ACT CCA CTG GGT CCA CCA- AGC TC T CTG 'CCG CAG TCT 44 TTC CTG CTG AAG TGT CTC 62 Sekvence ID 5. 2 . Délka sekvence ζ 64 basí .ttyp sekvence : nukleotid spirála : jednoduchá topologie : lineární CTG TTC GAG ACA CTT CAG CAG GAA AGA CTG CGG CAG AGA GCT .. 42 .· TGC TGG ACC CAG TGG AGT ACTG l 64: Sekvence ID · č. :3 . ' Délka sekvence * 60 basí typ sekvence : nukleotid spirála : jednoduchá topologie : lineární * GAA CAG GTA CGT AAA ATT CAA.GGC GAT GGT GCG GCT CTG CAG 42 ' GAÁ AAG CTG TGC GCA ACC 60 «

Sekvence ID č.- 4 Délka sekvence 60 basí - 95 ' typ sekvence spirála : topologie : "ΛΑ1??»'; ·· &amp; 8

I &amp; #.’· &amp; nukleotid3 ednoduchálineární ' 'Z-/

Vfi $ ř'Ě 1

TTT OTA.GGT TGC GCA CAG CTT TTC CTC· CAG AGC CGC ACC

C-CC*TTG !TT ACG TAC·. 42 60

Sekvence ID .Délka, -sekvence 4S basí typ sekvence :spirála :tonologie : nukleotid jednoduchá 1 í η p í τ>η < TAC AAA CTG TGC CAC CCT.GAG GAA CTG GTG CTG CTC GGT CÁC 42 =T&amp;?=g-?:g= -

Sek.vence- ID č. 6 Délka sekvence : 51 basí typ sekvence : nukleotid· spirála : jednoduchá topologie : ’· · lineární

CGC· GAT CCC CAG

GTG GCA CAG

AC-A

GTG

CAC CAG TTC CTC AGG 42 51

Sekvence ID č. 7 Délka.sekvencetyp'sekvence.:spirála :topológďe- : nukleotidj ednoduchálineární 42 ,τλ^-ΤΛ - . • Λ·^' k · ,, £-.<λ i-r· - -" ; -·· Ιτ . '. :? . /* -96:- i ,·*! *'*' > Κ·•Λ'ί!:'"

GGG ATC GCG TGG GCT CCA CTG AGC TCT TGC CCG TCC CAATTA CAA CTG GCA GGC TGC TTG 63

Sekvence I.D c. 8 60 basínukleotidjednoduchálineární Délka sekvence':typ sekvence :spirála :topologie :

CTG GCT CAA GCA GCC TGC CAG TTG TAA’ AGC TTG GGA CGG GCAAGA GCT CAG TGG'AGC CCA 42 60

Sekvence ID c. 9 Délka sekvence':typ sekvence :spirála :tonologie : 63 basínukleotid j ednoduchálineární AGC CAG CTG CAC TCC GGT CTG TTC CTG TAC CAG GGT CTG. CTG 42CAG GCT CTA GAA GGC ATC TCT 63

Sekvence ID č. 10 63 basínukleotidjednoduchálineární Délka sekvence : ' typ sekvence :spirála :topologie : TTC AGG AGA GAT GCC TTC TAG AGC CTG CAG CAG ACC CTG GTA' 42

CAG GAA CAG ACC GGA GTC CAG 57 ...·

Sekvence ID č. 11 Délka sekvence :typ sekvence :spirála :topologie : 6Ó basí'nukleotidjednoduchálineární

CCT GAA TTG

CCC ACC CTG GAC AGA

fAft pr.f'L· r.v v λ \J 12

GCC GAG TTC GCT ACT ACC 60

Sekvence ID č. 12 Délka sekvence : čl basí typ sekvence : nukleotid =§ptrá-Ta7=:= j-edneducirá topologie : lineární

TTG CCA TAT GGT AGT AC-C GAA GTC. GGC’AAC GTC CAG CTG CAG 42 TGT GTC GAG GGT GGG CCC CAA' ČI

Sekvence ID č. 13 Délka sekvence : 63 basí typ sekvence : nukleotid spirála : jednoduchá topologie : lineární ATA TGG CAA CAG ATG GAG GAA CTG GGT ATG GCT CCG GCA CTG 42 CAG CCG ACT CAG GGT C-CG ATG 63 Sekvence ID č. 14 ř*.

·, rtV-T”; Délka sekvence :

- t;í» “sr : «*£.?£*!·' ·3' fe-tytQ sekvence^.-spirála;: · 4 ’· , ’t. ' ' ^.Ft.o.po.logi.e :· . 60 basí , . 3* nukleotid í jednoduchá ' t 1« * * ,, , . '· i-nearni .... , TGC ?GG· CA? CGCvACC"ACC 'ÓAG' T7C" CTÓ~ CA? Λ p n f. ρ π> ‘41. Λ‘4 1

n r* pv -JaJ

CTG CAG TGC CG- Λ<1 Λ .ιυ CA? 42 60

Sekvence ID c. 15 Délka sekvencetyp sekvence :spirála :topologie : 60 basínukleotid.jednoduchálineární CCA GCA i XV GCC TCT ΛΠΓΠ rr.ttn p 5 P ΠΡ ·*» p^p rnpA •./v 1 ιΐν νΛα Vju joK, p^rn mm Lr \J v G - i v -l x 42 CTG C »tí i ,-í r"l \J V V m p p X L· v· CA? CT? 60

Sekvence ID c. 16 Délka sekvence • 6C basí typ sekvence : nukleotid spirála ; jednoduchá 4 topologie : lineární .ΊΛΡΙ Γ'φ:~’ H A P Λ ΤΡjuJ. AA'j ala GGA GGC AAC CAG-AAC ACC GCC TGC GCG CCG 42 CTG GAA AGC ADA PPP trvL· GAA 60

Sekvence ID č. 17 Délka sekvence : 55 basí typ sekvence : nukleotid spirála : jednoduchá . topologie : •••Z'-· · -:99.- lineární

____ _·>;-·/η'?Λπ4Γ. A-GC c?c Q*,g G?G_??C_TAC CGC GTT CTG CGT _CAC_'CTG_·. J

;cc CAG CCG TTAC 42' 55

C a V *,» a r r» 3 ! I C A 7 w i « K- — * Délka _sek venc_e _:·typ sekvence ;íso ir-ála—:—..v........: 18 53 'oasínukleotid,j ednoduchá topologie : lineární pc";Do,t: CGG CTG GGC CAG GTG ACG CAG AAC GCG GTA. AGA CAC 4453

Sekvence ID S. 19 Délka sekvence :typ sekvence i spirála : topologie : T AC AACTGGC AGGCT GCI1 T GA. 21 basí-nukleotid· 3ednoduchálineární 21

Sekvence ID č. 20 Délka sekvence :typ sekvencespirála :.·topologie ' 'GAC GTTGCCGACTTCGCTACT' 21 basínukleotid3 ednoduchálineární 21

?'

Sekvence ID Č* 21 Délka sekvence ':''typ·· sekvence··: ’ ' spirála :.topologie 21,basí’ nukleotid. jednoduchá - -lineární

TGCCGGAGCCAtACCCáGTTC 21 ,7

Sekvence ID č. 22 Délka sekvencetyp sekvence :spirála :topologie : 21 basínukleotidjednoduchálineární

GCCTGCCAGTTGTAAAGCTTG

Sekvence ID č. 23 Délka sekvence7:typ sekvence :spirála :topologie : 26 basínukleotidjednoduchálineární

GOACCATCGCCTTGAATTTTACGTAG

Sekvence ID č. 2.4 Délka sekvence :typ sekvencespirála :topologie : '62 basínukleotidjednoduchálineární 21 26

.··-·· •ý;<>ísš:-2? . '<' .. * AATTCAGT.ACT CCA CTG GGT CCA GCA AGC TCT CTG CCG CAG . 44V// A-JTTC CTG CTG_AAG TCT CTC- _ _ ._ __ 62

Sekvence ID č. 25 Délka sekvence : 64 basí typ sekvence : nukleotid spirála- ' - - "— ” "'jednoduchá-· topologie : . lineární.

CTG TTC GAG AGA CTT CAG CAG GAA AGA CTG CGG CAG AGA GCT 42TGS TGG ACC CAG TGG AGT ACGT , . 64

-I 8 i- -.ji »·:

Vf.· •Λ 'Sekvence ID č. 2'6 Délka sekvencetyp sekvence :spirála :topologie : 60 basínukleotid,j ednoduciiá;lineární ·' J·..·

GAA CAG GTA CGT'AAA ATT CAA GGC AGC GGT GCG GCT CTG CAGGAA AAG CTG TGC GCA ACC 42 60

Sekvence ID č. 27 Délka.sekvence 60 bas í typ sekvence : nukleotid spirála : . jednoduchá topologie- : -1 » * ** . I *i vi λ **» v, ....... — . ... n· cíj. ii-u *·· “*· “ — .... TTT GTAGGT TGC GCA t CAG CTT TTC CTG CAG AGC CGC ACC GCT 42 GCC TTG AAT TTT ACG TAC 60

‘X Ϊ?.

O •'γ53®¥?*«Τ. * “

ϊ'^ΖϊτΐΤ-ώΐιίΛ.-' 28 . λ *&amp;&amp;&amp;’ - j uMsÉ í* τΐ%Λ Ji;.-' -‘ G/W/Í; Délka'sekvence,·’·'* ·.>£*., ,·* .. , .typ/.sekvence, : spirála :topologie :

CTT CAG CAG GAA AGA 29 basí' ,. . .nukleo.tid jednoduchá. lineární ~ _ »/>/'» ππ,-ν ·λ « /* a - 102 -'

ir 23

Sekvence ID č. 2í Délka sekvencetyp sekvence :spirála :topologie : 33 basí nukleotid jednoduchá lineární ffi mmr· /ίπα .« r> * A."’?, "πη r a λ \ a ít j/ ± I _? ΰση A'j-jx tr’vA /..j;-, συ i. u./σ “'jh α;Λ O'j.“2 33

Sekvence ID č. 30 Dálka.s ekvence :typ sekvence ispirála :topologie :

CTG TTO CCA TAT C-CT AGA AGC GAA GTC TTC AAC GTC CAG C 40 basí'..'nukleotidjednoduchálineární 40

Sekvence ID· č.· 31 Délka sekvencetyp. sekvence :spirála :topologie : 27 basínukleotidjednoduchálineární - 103 -

GCT CAG TGG AGC TTT

CGG GAT- CCC CAG 27

r

Sekvence ID Č. 32 Délka sekvencetyp sekvence :spirála :

-topologie·--: - -ACG CAG AAC GCG 27 basí nukleotid jednoduchá - -..... -lineá-r-ní - -

GCG AGA CAC CTC GAG 27

Sekvence ID' č. 33 7D.é7l'ka~s7e'k.vě nc-e: . ~ typ sekvence :spirála :topologie

G TTC GAG AGA.CTT TTC

Sekvence ID č. 34 Délka sekvencetyp sekvence :spirála :topologie :

C CTG CAG. TTT CGC AGC

Sekvence ID č. 35 ' Délka sekvence :typ sekvence : ~2D777baš~í-;~ nukleotid jednoduchá lineární

CAG GAA AGA CTG C 33 basínukleotidjednoduchálineární

GCT AGC TTG AAT TTT AC 37 basínukleotid' 29 33

αα c? - 104 - ·' t-V· 4· ' · ‘ > ·$ ' ' ·λ ·': · J/";. .· spirála : .topologie : CAG AGA GTC AGC GAG CTT CAC CAG TTC CTCAGC GTG G, jednoduchá lineární Λ 37 "'''Sekvence' ID' č.'3'6 Délka sekvence : -typ sekvence :spirála :topologie :

GCT CAG TGG AGC TTT CGG GAT AGC CAG AG - 23 basínukleotidjednoduchálineární 23

Sekvence ID S. 37 Délka sekvence : 30 basí typ sekvence : nukleotid spirála : jednoduchá - topologie : lineární

CAG CTT TTC CTG CAG ACG CGC AGC GCT AGC 30

Sekvence lD č. 38 Délka sekvence : 23 basí typ sekvence : nukleotid jednoduchá lineární spirála :topologie :

CC GCT GCC TTG AAT ACG ACG TAC CTG TTC 29

Sekvence ID č. 39

105 - ‘-'í; ·*>.,.J " ’T)> ' ·£π,+ 'ί?κ1Ι: !’''*Vf0:T··. ·, .-.Délka sekvence : 5itýjž; sekvence : i ·.-·’ 'Spirála' ’: ; ' topologie : 30 basínukleotidjednoduchálineární GGT TGC.GCA CAG ACG TTC CTG CAG AGO CGC' JS'·

Sekvence ID č. 40 Délka sekvence : - 29-basí - 'typ sekvence: nukleotid spirála : .jednoduchá topologie : lineární

G GTG GCA CAG ACG GTA GGT TGC GCA CAG C 2.9.

Sekvence ID č. 41 Délka sekvence :typ sekvence :.spirála :topologie : 45 basínukleotid .3 ednoduchálineární CG CGG CAG AGA GCT ŤGC ACG GTA GGT TGG AGC CAT TGTCGATACC 45

Sekvence ID č. 42 Délka Sekvence :typ sekvence :spirála :topologie. :

GCA AGA GCT CAG AGA AGC CCA CGG 24 basí nukleotidjednoduchá lineární 24

ί®·'^·.··.·-'· ·'- ' Λ-; - * .";Ρ;:1’ίιΚ:·'3Γ·>^Λ4* Í.-T.*- *//·'''” .' ·;.· 5 ,£ ν. 39/basínukleotidjednoduchá-· lineární -'--

Sekvence ID č. 43 Délka sekvence ·: ·. -typ.sekvence :spirála : topologie; :., _ ' .· /„„

Λ A p'fi Π ,ΤΠ Λ h m mA m ♦ a a ρ·.π ,Τ ~ ~s P i Λ P " Γ* \ 4 p i Γ Φ 'P

LA LrVb vjL· lib iAA AUU 1,'J -’lr."-· kjL x írO/i nW Vo i U 39

Sekvence ID č. 44 Délka sekvence :typ sekvence :spirála :topologie : 27 basínukleotidjednoduchálineární

GCT CAG AGA AGC TTT CGG GAT.CCC CAG 2?

Sekvence ID č. 4p .Délka..sekvence' : 'typ sekvence :spirála :topologie : . 46 basí · nukleotidjednoduchálineární

CGG GAT AGC CAG AGA GTG AGC GAG ITT CAC CAG TTC CTC AGC ρηπ ptriu v 4.2 46

Sekvence ID č. 46 Délka sekvence':Typ sekvence :topologie : 174/177. /aminokyselin aminokyselina lineární

- 107 "wrl. IW-^yThr ?ro -Leu Oly ' Pro Ala Ser α η V A. Leu Pro Glr. .. · s*ť/ --:4-. - Ser > p n 0 Leu Leu ___ Lys Cys Leu Glu Gin _:_l_o. Val - *!· r > . · . - * · ? Arg 15 20 τ »* 0 JJ? 0 ”! ώ Gin Gly Asp Gly Ala Ala . Leu Gin Glu ........' "tys- 2 5 "Ser "G 'Cys- 30 'Lyš_ • PíX / ? a 1 wT Aia Thr Leu 35 - 40- I Cys u·; s Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His 45 50 Ser Leu Gíy ΐ 1θ Pro Trp Ala· Pro Leu Ser Ser ..... -J-J- -3t- Cys X _V Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys 65 70 Leu P Q Τ’ Gin Leu HÍ£ Ser Gly . Leu Phe Leu. Tyr 75. SO. 55 ....... Gin G1 v Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Tle Ser 90 95 Pro Glu- Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin 100 105 Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile- Tm - 110 115 Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro; Ala - 1 ΠΛ Leu Gin Ero Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala. Phe 135 140 130 ·8·α{ .-- '· -’1' . '’’*· .vzii*í-r.", ;<Š;· -· - - --¾^. ’ -'fe'""· - < k * 4 , $"ti*^*ju,i'.*M··1 Λ-αΛΓ ť 4 í,- - 8. . > ? -« ť* jiřiA*.^ . -«,»*5·. Α.ς»'.XA<L-,-2 -'i. ~. • λ. tr·*·^ ·.-,.z.':?'· , ·., tj-s» ,, <« \í’ «· - -108 -

Leu /•'Ser Ala Phe Gin Arg Arg .Ala Gly Gly íř'· 145 150 .Val.’ Ala Ser. His t.. · -· Leu Gin Sér. Phe Leu '155 Í60 ·. Ser . - íyr, , Arg. ..V a í ..Leu- -Arg·. His ' Leu ’ - Ala- 7a’ 165 170

Pro /kde m je nula nebo jedna/

Sekvence ID č. 47 Délka sekvence : 168 + 166 basí typ sekvence : nukleotid. spirála : dvojitá topologie : lineární AATTCTGGCA AATATTCTGA AATGAGCTGT'; :T&amp;A£AATTÁA; . TfiATGGAACT 50 GACOGT TTATAAGACT TTACTCG.ACA' ACTG.TTAATT ’ AGTAGCTTGA. ·. 4 6. AGTTAACTAG- TACGCAAGTT CÁCGTAAAAA GGGTATCGAC 90 TCAATTGATC ATGCGTTCAA GTGCATTÍTT CCCATAGCTG 86 ' AATGGTACCC' GGGGATACTC TAGAGTCGAC CTGCAGGCAT GCAAGCTTAG 140 TTAGCATGGG CCCCTAGGAG ATCTCAGCTG GACGTCCGTA CGTTCGAATC 136 CCCGCCTAAT GAGCGGGCTT TTTTTTAT 16.8 GGGCGGATTA CTCGGCCGAA AAAAAATAGC 166 ' '••A' » •'eSřSf^fVí*·'..

Sekvence ID č. 48 Délka sekvencetyp sekvence :spirála :topologie : '534'basi ", ' í ' ·. · nukleotid s odpovídajícím.proteinemj ednoduchálineární ' " AATTCA.GT ACT.CCA CTG GGT CCA GCA AGC TCT CTG CCG CAG TCT 44------ . . .. Thr-Pro-Leu- GTy -Pro---Al^SOr“Ser'nteu-i?ro^G-l-n—Ser-------------- 1 5 .’ 10 TTC CTG CTG Phe Leu Leu AAG Lys TGT Cys CTC GAA Leu Glu GAG GTA CGT AAA ATT CAA GGC Gly 86 Gin Val A.rg Lys Ile Gin 15“ 2tr GAT GGT GCG GCT CTG CAG GAA AAG CTG TGC C-CA ACC TAC' AAA i 28 Asp Gly Ala Ala Leu Gin Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys ♦ ·. . 30 /35 40 ř CTG TGC CAC CCT GAG GAA. CTG GTG CTG ctc' GGT CAC TCT CTC- 170 Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Glv His Ser Leu 45 50 GGG ATC CCG TGG GCT CCA CTG AGC TCT TGC CCG TCC CAA GCT 212 Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gin Ala ' ' 55 60 65 --- <ϊ #?*ΓΛ' * / ‘-iv “ X; '*‘;t /-<Λ:··:ίγ'Λ- ; , - v·'··' ‘f . * 9 ·< A A · ; 'V - w - ' 6' ' K /íij·^, «.^ > ίττ*5*?^", ·'; ; ?? fy = iií^·-.·»,', ‘ J . V · ·. ' . *»ν·-< ' · K 110 ji Ϊ - &amp;. */’' .v.· s·^.. ? ΐ ; TTA; -,ΐ,χ ;CAA CTG GCA GGC TGC TTG 5 cA-jl · CAG ΓΤ3í J fl 4 s*L λ L· TCC GGT CTI- 254 jrttr- fL" --'. ::i.Wv-i ' - i,“ -* · S »ir· · ·* ..;\a \ '< -íi£ř,· ·<· · V ,\ * Λ vffl. ' «J?r 3» -yřLěu Λ · iGln Leu Ala-· Gly Cys Leu Ser Gin Leu His Ser Gly. Leu ’w?i V“.° ’ι * 70 75 ιιιχ,ι ™ so· v , R· » . . ... í ř '•y···.· -.m - - „ TTC CTG TAC. CAG GGT CTG CTG ri ί r•uAtf GCT Γΐφ Av- L Λ GAA η fi ri ATC u V x. 296 · ?he Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile Ser i 85 so 95 í COT GAA TTG GGG CCC ACC CTG GAC ACA CTG r ůfi CTG GAC GTT 338 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Val Ti ICC· 105 110 GCC GAC ΦΤ 0 GCT ACT ACC AT A TGG CAA CAG λ m r* Λ X 'J 4Q- GAA CTG 380 ? . Ala Asp Phe Ala Thr Thr Tle Trp Gin Gin ilet Glu Glu Leu 115 120 GGT ATG GCT CCG GCA' CTG CAG CCG ACT CAG GGT GCG ήίΓΠ CCA 422 í’r % &amp; Gly Het Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin. Gly Ala líT - Α»:tl6 u Pro s h! 125 130 135 '*?' • >’· $ -} GCA TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGG CGC GCA fi GGT GTT CTG 464 Ala Phe Ala- Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu ΐ· i !r 140 145 145 £ £ '· GTT GCC TCC CAT CTT CAG AGC TTC CTC Λ ΠV Λ -j GTG TCT TAO CGC 506 i Val Ala Ser His Leu Gin Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg 155 160 165

111

GCC. CAG CCG TAA G

Ala_Gln .Pro__\ 534 í*’. GTT CTG CGT.CAC CTGVal Leu Arg_His Leu 170 174 -

Sekvence ID č, 49 ' "Dé'l‘k a' s e'kvene etyp. sekvence :spirála :topologie : '5'3’4'haší" " .......... ...... nukleotid s odpovídajícím proteinemJednoduchá lineární AATXCAOT_AC.T_C.C.A_C.T.C-_G-G.T_C-C.A—GCA-AGC—T-C-T—C-T-G-CCG-CAG—T-GT—44

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser1 5 . 10 TTC' GTG. CTG ..AAG. TCT CTC GAA CAG GTA CC-T' AAA ATT CAA GGC 86 Phe Leu Leu Lys . Ser Leu Glu Gin Val" ' Arg Lys Ile Gin Gly 15 20 25 AGC n.qm GCG GCT CTG CAG GAA AAG CTG TGC GCA ACC TAC AAA. 128 Ser Gly Ala Ala Leu Gin Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys 30 35 40 CTG mpn xkJO CAC CCT. GAG GAA CTG GTG CTG CTC GGT CAC TCT CTG 170 Leu 'Cys His Pro' Glu Glu Leu Val Leu Leu- 'Gly His Ser Leu 45 50 V*». y/'Λ Αΰ· Γ* '.· 'i' ' jŽfc, • r.** ; ’? ..vvt· · - 112'

I

I I* ílí-lU ” f · fr» 1 •U 000’ATC CCG φΟ’Π ,i -JV -GCT CCA CTG AGC TCT TGC CCG TCC CAA GCT 212 ,;^r- ' tJř'», ' ^‘ř^Gí^ne^ .-' Přo TroAla. Pro Leu Ser Ser Cys' ' Pro Ser Gin Ala r.i**r. - íff* .' A": .., Λΐί,ψ; 1 » “' > . ,'? ’->·% . ; ' 7 55.' 60 ...... ,65 ... -w.r- -J . „. ;TTA- .CAA n-TC •J» i w GCA GGC -TGC. •TTG' TAGC CAG GTC' CAC TC'0 GGT" 'CTG' 254 Leu Gin Leu Ala Oly Cys Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu · '! 70 75 80. TTC OLG TAC CAG GGT CTG CTG CAG GCT . CTA GAA GGC ATC TCT 296 Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile Ser 85' 50 95 CCT GAA TTG r* CCC ACC CTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GIT 338 Pro Glu Leu kllv Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu As o Val 100 105 110 ·,.! GCC GAC- TTC GCT ACT ACC ATA TGG CAA CAG ATG GAG· GAA CTG . 380 Ala Asp Pne .Ala Thr Thr Ile Trp Gin Gin' Meť Glu Glu Leu 115 12C GGT ATG GCT ς/k/lr GCA CTG CAG CCG ACT CAG GGT GCG ►< rn πa1'j CCA 422 Gly Met Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro 125· 130 135 GCA TTC GCC _ TCT GCT TTC CAG CGG CC-C GCA GGC GGT GIT CTG 4č4 Ala Pne· Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu 140 145 150 ,5>l ^| Aíl ?ί tfj :ώ1 Γι,Ι

i?;J Λ·. tv t* íd $ £ a

I li' • {íd$;Ί> Ή

)·*', ♦A SíJT-Č*·' f 113 - >G?T GCC TCC CATCTT CAG AGC TTC CTC; GAG GTG' TCT TAC CGC^^^•νβΙ^ΑΪβ^βΓ'-ΗίΈ-’Ιί-βπ· -Gln-Ser-Ph·'©-'Leu·' Glu * Val'* Ser Ťyr Arg155 160 165 506 GTT CTG CTG CAC CTG GCC CAG CCG TAA G 534

Val Leu Arg His Leu Ala Gin Pro " 170 ...... .......174 ' ...... ............

Sekvence ID č. 50 3)el~ka s.ek.v-ence—:........... IZZ8I~baší----—: typ sekvence : nukleotid spirála : jednoduchá topologie : lineární. GAATTCAACA-AAACGGTTGA CAACATGAAG TAAACACGGT.ACGATGTACC 50 ACAAGTTCAC? G.TAAAAAGGG TATCGACAATG , ‘ · 8-1

Sekvence ID č. 51." Délka sekvence : 67+ 67 basí ’ .--7,- typ sekvence : nukleotid spirála : dvoj itá topologie : lineární TCGACATTAT ATTACTAATT AATTGGGGAC CCTAGAGGTC CCCTTTTTTA • 50 GTAATA' TAÁTGATTAA TTAACCCCTG GGATCTCCAG GGGÁAAAAAT iiO TTTTAAAÁAG CATGCGA 67 aaaatttttc GTACGCTTCGA 67 - 114.- 114. ·- i .SXifí/řt-J-ř; J~ ; Sekvence. ID č. 52 ’«*-- "“í. - ” ^T1·' j. .V1;· '.'. ..f- £; ' . ·· .,α* * "> Délka" sekvence : 1 '"~f " *”Ίγρ/ sekvence' : ·· spirála· : · • - - - topologie ; ’ 72 + 72 basínukleotiddvojitálineární........

TCGACATTAT ATTACTAATT

GTAATA TAATGATTAA

AATTGGGG AG CCTAG AGGTC

TTAACCCCTG GGATCTCCAG

CGCTTTTTTA r» n . ·, * > Λ » fR, !^ΙΤ7λΛλΛ.ΛΛ i 50 46 TTTTAAAAG CATGCGGATC CC 72 AAAATTTTC..GTACSGCTAG GGGAAC 72

Sekvence ID č. 53 Délka sekvence : 118 basí ' · · typ sekvence : nukleotid spirála : jednoduchá topologie : lineární . AATTCTGGCA AATATTCTC-A AATGAGCTGT TGACAATTAA TCATCGAACT. 50 AGTTAACTAG TACGCAGAGC TCAATCTAGA GGGTATTAAT AATGTTCCGA WC TTGGAGGATG ATTAAATG í 118

Sekvence ID č. 54 Délka sekvence :typ sekvence :spirála :topologie : 35 + 35 basínukleotiddvojitá. ., .lineární .

AGCTCCATAT GGTACCAGAT CTCTCGAGAG TACTT 35

- 115 - ť- · ..... - --

GGDATA CCATGGTCTA GAGA.GCTCTC ATGAAGATC 35 ’Χ'τ'Άι a· '·> Ά -' · ·. ' . \M> · 'Sekvence. ID c. 55 Délka sekvence’typ sekvence :spirála :_to_p.o.lcg.i.e__:....... 23"+ 15 basínukleotiddvojitálin.e.ární

AGCTCAGCTG CAGCATATGG TAC 23 GTCOAG GTCGTATAC ' 15 ;Sek v enc-e—ID—g—5± Délka sekvencetyp sekvence :spirála :topologie : 72 + 72 basínukleotiddvoj itálineární TCGACATTAT ATTACTAATT AATTGGGGAC CCTAGAGGTC CCCTTTTTTA 50 GTAATA TAATGATTAA TTAACCCCTG GGATCTCCAG GGGAAAAAAT 46 TTTTAAAAAG CATGCGGATC cc 72 AAAATTTTTC GTACGCCTAG GGGAAC 72

Sekvence ID Č. 57 Délka sekvence ·: ’.typ sekvence :soirála : 84 basí- nukleotid jednoduchá ΊΆ&amp;&amp;:ν;τ'·· - ^>W<XíŤ-\ . · '· ’ -^Λ1^’’^’ - •'«.-'u-V ’ r P ’ ť*l ' 1 ,*>../.· ,λ Ϊ ;?*-; -Ě /,·« vy· -.· •^•^‘l.v. - *' .·> ΤΓΐ'Ύ’*? - S./yj.řT^Ť.řwr \^ώ>τ '·'. %,·£'. .-V ·> i,- - · » ·'«-!* -»'·7.·· .,,·«; '· ' ·.·»'· .vV?·· 'X' T >*^> · '- ΑΪ Jv ,'/χύ'Χ··’' ' .4.7-.', i··»,· .$Γ. ’*.....-to do logie ':: '•;7. ·Ά";- ' " * ·· .', lineární . .. ^c^XsAAT^TCAyACAíAAAjCGG· TTG. ACA' ACA, TGAÍAGT ?AAA<CÁCrGGT<-ÁCG. -WK-^·.·*..<* í'r'rf · 1 -Kl.---v.-JT3.tijA·-·..(,».í .' .. ’. »^v .·»-.·.· - ... _;· - . - ·' i* ;-··'Λ · ··· . — ’· > **·’ " . , . <..... ... ·. ν·^>·>..;-..-31'·-;.i:r -....,·.·. ., ...... : : - v >. : - <^Ál^AOlcSc.:,AAG-rT.TCf- ACG Τ·Α·Α-AÁA-GGG TAT CGA CAA· TGG'-TAC: ΛΛ.· • jwJ-< „42- 84

Sekvence ID č. 58 Délka sekvence :typ sekvence :spirála :topologie : 76 basínukleotidJednoduchálineární

CAT TGT CGA TAC

CCG TGT TTA CTT

CCT

CAT

TTT'.TAC

GTT GTC

GTG AA.C . TTG

AAC CGT TTT

TGG TAC

GTT G íTC gta 42 3 76 í

Sekvence ID Č. 59 Délka sekvence : .. 24 + 24 .basí" typ sekvence : nukleotid spirála : dvojitá topologie : lineární AATTCGCATG CGGATCCATC GATC 24 GCGTAC GCCTAGGTAG CTAGAGCC 24

Claims (12)

1. *#Λ* _- , 117 - Patentové' nároky *Ί1«#···ι» Λ *·' .- " *· /·' Τ*ί · . < ‘ ' ř ‘V’ .·· *'.['>.

   1. Způsob přípravy derivátu v přírodě se vyskytujícíhoG-CSF, vyzná č-u j i c í s e tím, že obsahujealespoň jednu z biologických vlastností přírodního G-CSF a má stabilitu roztoku, alespoň 35¾ při 5mg/ml, který má 17 .17 . .. alespoň __Cy_s__nativní_.s.ekve.nc.e nahrazen residuem Ser a 27 17 Asp nativní sekvence nahrazen residuem Ser
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím,žě obsahuje alespoň jednu z následujících modifikacíselektovaných z : - T)-GIu11_lia'ťivňí_^ěkvence nahrazený residuem ATg11; b) Leu^ nativní sekvence nahrazený residuem Glu^^; 23 23 c) Lys nativní sekvence nahrazený residuem. Arg ; 26 26 d) Gly nativní sekvence nahrazený residuem Ala ; 28 - 28 e) Gly nativní sekvence nahrazený residuem Ala ; f) Ala^O nativní sekvence nahrazený residuem Lys^® nebo Arg^; 34 34 g) Lys nativní sekvence nahrazený residuem Arg ; 40 40 h) Lys nativní sekvence nahrazený residuem Arg ; i) Pro^ nativní sekvence nahrazený residuem Ala*1**; 49 , . 49 j) Leu nativní sekvence nahrazený residuem Lys ;

   ··· .· >?&amp;···&amp;&amp;.•řiSB^-írh • ' · '·. -- ν'-ρ ..' '. 7;*'?;,' -' ' ". ’. ’· J '“ 'rt** - 118 - - í ΐ Γ:ζ š ρΪ5/ \ ' . r7- ' * ti >/; “ - * * >. . .'jí ’Γ^. ·. Λ ., ·.·'·· -ř^C-ΐψ· •'í- -,*·&amp;**.. >· ,γ·Λγ*τ· í'·’»·" ·%£♦: 2 i , « . \7~!ΓΓ ?££·&amp; A .:- ζχί.-.-^Λςρ __í J____ 1 *i — -^ -* . : Gly^ nativní sekvence nahrazený residuem-Ala ··; 55 55 l) Gly nativní sekvence^ nahrazený residuem „Ala _ c 53 m) Trp nativní sekvence nahrazený residuem Lys ; nj Pro60 nativní sekvence nahrazený residuem Ser60; o) Pro65 nativní sekvence nahrazený residuem Ser65; p) Pro111 nativní sekvence nahrazený residuem Glu111; q) Thr115 nativní sekvence nahrazený residuem Ser11'5; r) Thr116 nativní sekvence nahrazený residuem Ser116 a s) Tyr165 nativní sekvence nahrazený residuem Arg165.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím,že v další modifikaci zahrnuje alespoň jednu znásledujících :1 a) Gin11,Pro60'6 nativní sekvence nahrazený Atg11, Ser60'65, b) Ala111,Thr115'116 nativní sekvence nahrazený Glu111,Ser115'116 1158 158 1118 5 c) Gin ,Trp , Tyr nativní sekvence nahrazený Arg ' , Lys58,

   ' -z ^·,^·ΐ'Λ··^··ν - -f f.:.·/ž’SiJ-3--£ti’íiJ:Ív5\'. >’ tt", '·'··. .. .. -iř - Γ X ' :f '-' ·· *sjnT< ;. „ · *" ·“ ,·"’ ' .; -'' . , >£??·< ·. ;· · » < ??r ;·’ ...„L Χ'ήί-·;-'“ XX' ?- .- - 119 -

   28., 3 - «π 15 Ala nativní sekvence nahrazený. Glu ,- , Lys^O nebo \ 44 T 49 51,55 m__58 e) Pro*1**,Leu", Gly^'^J, TrpJP nativní-sekvence nahrazenyLys49'58, Ala44'51'55. 4.„Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků,vyznačující se tím, že je odvozený z [Arg11Ser17'27'60/65]hu G-CSF; [Glu15,Ser17'27,Ala26'28, Lys3°]hu G-CSF; [Arg11,165,Glu15,Ser17'27'6°'65,Ala26'28,Lys30' 58]hu G-CSF; [Arg11'23,Ser17'27'60'65Jhu G-CSF;[Arg11'40,Ser17'27'60'65]hu G-CSF; [Glu15' U1, Ser17' 27' 6°' 65'115' 116Ala26' 28, Lys30]hu G-CSF;[Ala1,Thr3,Tyr4, Arg5' U, Ser17' 27' 60' 65]hu G-CSF; [Glu15,Ser17'27,Ala26'2S,Arg30]hu G-CSF uvedeného derivátu, tak aby požadovaný derivát obsahovalpre-sekvenci methioninu.
4. 5. Způsob přípravy DNA sekvence podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím,
5. 6. Způsob přípravy rekombinovaného vektoru/,, v y z n a č u - jící se tím, že obsahuje DNA sekvence podle nároku 5,
6. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující..se tím, žezahrnuje včlenění DNA sekvence podle definice v bodu 5.
7. 8. Způsob přípravy prokaryotické nebo eukaryotické hostitelskébuňky, vyznačující se tím, že je stabilnětransformovaná nebo transfektovaná rekombinantnim vektorempodle nároku 6.
8. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím,že zahrnuje transformaci nebo trahsfekci prokaryotické neboeukaryotické buňky rekombinantnim vektorem podle nároku 6,za získání stabilně transformovaného nebo transfektovanéhohostitelského prokaryota.nebo eukaryota.
9. 10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznaču-j í c i s e tím, že zahrnuje kultivaci prokaryotickýchnebo eukaryotických buněk, podle nároku 8, za získáníuvedeného derivátu.
10. 11. Způsob přípravy farmaceutické kompozice, vyznač ů-.jící se tím, že obsahuje jako aktivní složku alespoň jeden z derivátů v přírodě se vyskytujícího G-CSF, podlenároků 1 až 4, ve směsi s farmaceuticky vyhovujícím ... nosičem nebo plnidlem.

    »’SOfiaiC»%žy ΧΛ?.·" .Vgfc~š;.'« -- '·.’../pfe#;;y ...- .,*<·•*^aar.^?2í. /''·..'·'.. 'J 1 ^^'l·^'??*“'^.’·.'; j'*' ·...j,*A. '"*"· - Λ&amp;*ϊ±?*·κ„ 'Ί/, , · ,• u-Λ-^Λ'ί Z,. 'i W##w L2t?í -- -. ..- ·7··»·ΐ čťfH.i''; ’*"v! *·£: 'i-’ r >* í^.wórbýg.úTsávců;%j35>y;zin <a ;c?.u- jrí.c,: '-. <·< .·.· ·«· .•-?s;·' eí tím, z^^-zkbřXuj&amp;s^oskytpvání efektivního množství ibílěčenítKi .71:: derivátu podle^kteréj 'nároků 1 až 4. c u.
11. 13. Způsob zabraňující dělení, leukemických TSunak, vyznác í se tím/^ žev^poskytuje efektivní intro^stvíocLLe-4tteréhukoli 'Σ~ nároků i az 47" -1A. Způsob podle kteréhokoli z nároků l až 4, extrakcí z inkluzní částice, vyznačující se tím, žezahrnuje : 1) suspendování řečených inkluzních částic v detergentu 2j~oxi"ďa"ci 3) odstranění detergentu 4) uchovávání roztoku, získaného po odstranění detergentupři zvýšené teplotě,jako sraženiny s kontaminujícíbakteriální bílkovinou, oligomérními a/nebodegradačními produkty, zatímco řečený, derivát jeudržován v roztoku v aktivní formě.
12. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující setím, že extrahovaný derivát má stabilitu roztoku alespoň85¾ při lOmg/ml.