DE69129927T2

DE69129927T2 - G-CSF polypeptide derivatives

Info

Publication number: DE69129927T2
Application number: DE69129927T
Authority: DE
Inventors: Roger Macclesfield Cheshire Sk11 8Ny Camble; Heather Bollington Cheshire Carr; David Macclesfield Cheshire Timms; Anthony James Macclesfield Cheshire Wilkinson
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1990-04-30
Filing date: 1991-04-29
Publication date: 1999-04-01
Anticipated expiration: 2011-04-30
Also published as: US5416195A; HUT60769A; FI912086A; EP0459630B1; NZ237974A; CA2041454A1; GB9107846D0; PT97529A; GR3027590T3; KR910018406A; IE911440A1; HU911440D0; AU644647B2; ES2118737T3; IL97993A0; AU7628491A; EP0459630A3; DK0459630T3; TW226022B; BG94328A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Derivate des Granulocyten-Kolonie-stimulierenden Faktors mit guter Lösungsstabilität und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie sie enthaltende Arzneimittel.
Die Kolonie-stimulierenden Faktoren sind eine Klasse von Proteinhormonen, die die Proliferation und die Funktion spezifischer Blutzelltypen, wie Granulocyten, stimulieren. Granulocyten nehmen eindringende Mikroorganismen und Zelltrümmer auf und vernichten sie und stellen somit einen wesentlichen Faktor bei der Antwort auf eine Infektion dar. Im Hinblick darauf können Granulocyten Pseudopodien ausstrecken und zwischen den auskleidenden Endothelzellen aus dem Gefäßbaum herausgleiten. Die neutrophilen Granulocyten können dann in direkten Kontakt mit den Mikroorganismen kommen und sie unter Verwendung einzigartiger Enzymsysteme zerstören, wie zum Beispiel jene, die Peroxidanionen erzeugen. Da Granulocyten nur eine kurze Lebensdauer im Blutkreislauf haben (etwa 6-12 Stunden) und im Verlauf ihrer Funktion zerstört werden, müssen die Stammzellen des Knochenmarks jeden Tag so viele Granulocyten wie Erythrocyten erzeugen. Außerdem muß diese Produktionsrate der Granulocyten beträchtlich gesteigert werden, wenn die Anforderungen einer Infektion erfüllt werden sollen. Als Ergebnis ihres schnellen Umsatzes nimmt die Granulocytenzahl rasch ab, falls das Knochenmark zum Beispiel durch Krebschemotherapie, Bestrahlung, AIDS oder hämatologische Störungen geschädigt ist, und die Patienten werden für eine schwerwiegende Infektion anfällig. In der Tat ist Sepsis eine häufige Todesursache bei Krebspatienten, deren Knochenmark durch eine Strahlenbehandlung, Chemotherapie oder ihre neoplastische Erkrankung supprimiert ist.
Der Granulocyten-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF) wurde in der Literatur von Wallet K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Bd. 82, 1526-1530, und auch in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 169,566 sowie der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO-87/01132 beschrieben. Für G-CSF wurde gezeigt, daß er die Granulocytenproduktion in vivo stimuliert und mit minimalen Nebenwirkungen wirksam ist. Als Ergebnis ist erkennbar, daß der menschliche G-CSF bei der Behandlung der mit einer Chemotherapie, Strahlen therapie, einem Strahlenunfall oder einer autologen Knochenmarkstransplantation verbundenen Neutropenie potentiell nützlich ist. Außerdem kann G-CSF bei der Stimulierung einer in Verbindung mit AIDS stehenden Knochenmarkssuppression, bei der Behandlung von myelodysplastischen Syndromen, die durch funktionelle Granulocvten-Abnormalitäten gekennzeichnet sind, und als Hilfsmittel zur Behandlung schwerer Infektionen nützlich sein.
Zusätzlich zu dem Vorstehenden wurden bestimmte Analoga von G-CSF in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 87/01132, in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 243,153, in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 256,843, in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 272,703 und in Biochemical and Biophysical Research Communication, Bd. 159 (1989), Nr. 1, 103-111, Kuga T. et al., beschrieben. Darüber hinaus wurde eine Modifizierung von G-CSF und [Ser¹&sup7;] G-CSF durch Substitution der Cystein- und Serinreste in Position 17 durchgeführt, aber solche Austausche versagten bei der Erzielung der gewünschten Wirkung (Protein Engineering, Bd. 3 (1990), Nr. 4, 360).
G-CSF und die vorstehend erwähnten Analoga neigen dazu, eine Lösungsinstabilität insofern aufzuweisen, als sie beim Stehen dazu tendieren, aus der Lösung auszufallen, wodurch sich eine kurze Haltbarkeit und Probleme hinsichtlich der Lagerung bei hohen Konzentrationen ergeben. Außerdem neigen der G-CSF und bestimmte der vorstehend erwähnten Analoga bei der Lagerung zur kovalenten Aggregation.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung von Modifikationen, die bei einem G-CSF oder einem Derivat davon, das einen Teil oder die gesamte Aminosäuresequenz und mindestens eine der biologischen Eigenschaften eines natürlich vorkommenden G-CSFs, zum Beispiel eines natürlich vorkommenden menschlichen G-CSFs, aufweist, zur Verbesserung der Lösungsstabilität durchgeführt werden können.
So wird gemäß einem Merkmal der vorliegenden Erfindung ein Derivat eines natürlich vorkommenden G-CSFs bereitgestellt, das mindestens eine der biologischen Eigenschaften eines natürlich vorkommenden G-CSFs und eine Lösungsstabilität (wie nachstehend definiert) von mindestens 35% bei 5 mg/ml aufweist und bei dem mindestens Cys¹&sup7; der nativen Sequenz durch einen Ser¹&sup7;-Rest und Asp²&sup7; der nativen Sequenz durch einen Ser²&sup7;-Rest ersetzt ist.
Die erfindungsgemäßen Derivate können geeigneterweise mindestens eine weitere Modifikation aufweisen, die ausgewählt ist aus:
a) Glu¹¹ der nativen Sequenz, das durch einen Arg¹¹-Rest ersetzt ist;
b) Leu¹&sup5; der nativen Sequenz, das durch einen Glu¹&sup5;-Rest ersetzt ist;
c) Lys²³ der nativen Sequenz, das durch einen Arg²³-Rest ersetzt ist;
d) Gly²&sup6; der nativen Sequenz, das durch einen Ala²&sup6;-Rest ersetzt ist;
e) Gl²&sup8; der nativen Sequenz, das durch einen Ala²&sup8;-Rest ersetzt ist;
f) Ala³&sup0; der nativen Sequenz, das durch einen Lys³&sup0;- oder Arg³&sup0;-Rest ersetzt ist;
g) Gly&sup5;¹ der nativen Sequenz, das durch einen Arg³&sup4;-Rest ersetzt ist;
h) Lys&sup4;&sup0; der nativen Sequenz, das durch einen Arg&sup4;&sup0;-Rest er 30 etzt ist; ist;
i) Pro&sup4;&sup4; der nativen Sequenz, das durch einen Ala&sup4;&sup4;-Rest ersetzt ist;
j) Lys³&sup4; der nativen Sequenz, das durch einen Lys&sup4;&sup9;-Rest ersetzt ist;
k) Gly&sup5;¹ der nativen Sequenz, das durch einen Ala&sup5;¹-Rest ersetzt ist;
l) Gly" der nativen Sequenz, das durch einen Ala&sup5;&sup5;-Rest ersetzt ist;
m) Trp&sup5;&sup8; der nativen Sequenz, dass durch einen Lys&sup5;&sup8;-Rest ersetzt ist;
n) Pro&sup6;&sup0; der nativen Sequenz, das durch einen Ser&sup6;&sup0;-Rest ersetzt ist;
o) Pro&sup6;&sup5; der nativen Sequenz, das durch einen Ser&sup6;&sup5;-Rest ersetzt ist;
p) Pro¹¹¹ der nativen Sequenz, das durch einen Glu¹¹¹-Rest ersetzt ist;
q) Thr¹¹&sup5; der nativen Sequenz, das durch einen Ser¹¹&sup5;-Rest ersetzt ist;
r) Thr¹¹&sup6; der nativen Sequenz, das durch einen Ser¹¹&sup6;-Rest ersetzt ist; und
s) Tyr¹&sup6;&sup5; der nativen Sequenz, das durch einen Arg¹&sup6;&sup5;-Rest ersetzt ist.
Das Vorhandensein von mindestens einer weiteren Modifikation, die ausgewählt ist aus (b) bis (s), wird bevorzugt, jedoch wird das Vorhandensein von mindestens einer weiteren Modifikation, die ausgewählt ist aus (b), (d), (e), (f), (n) und (o), besonders bevorzugt, wobei die weitere Modifikation (o) am meisten bevorzugt wird.
Stärker bevorzugt umfaßt die weitere Modifikation mindestens eine der folgenden:
i) Gln¹¹, Pro60,65 der nativen Sequenz, die durch Arg¹¹, Ser60,65 ersetzt sind;
ii) Ala¹¹¹ Thr115,116 - der nativen. Sequenz, die durch Glu¹¹¹, Ser115,116 ersetzt sind;
iii) Gln¹¹, Trp&sup5;&sup8;, Tyr¹&sup6;&sup5; der nativen Sequenz, die durch Arg11,165, Lys&sup5;&sup8; ersetzt sind;
iv) Leu¹&sup5;, Gly26,28, Ala³&sup0; der nativen Sequenz, die durch Glu¹&sup5;, Ala26,28, Lys³&sup0; ersetzt sind; oder
v) Asp²&sup7;, Pro&sup4;&sup4;, Leu&sup4;&sup9;, Gly51,55, Trp&sup5;&sup8; der nativen Sequenz, die durch Lys49,58 Ala44,51,55 ersetzt sind.
Die weitere Modifikation kann auch vorzugsweise mindestens eine der folgenden umfassen:
vi) Leu¹&sup5;, Gly26,28, Ala³&sup0; der nativen Sequenz, die durch Glu¹&sup5;, Ala26,28 Arg³&sup0; ersetzt sind; oder
vii) Pro&sup6;&sup5; der nativen Sequenz, das durch Ser&sup6;&sup5; ersetzt ist; oder
viii) Pro60,65 der nativen Sequenz, die durch Ser60,65 ersetzt sind; oder
ix) Gln¹¹, Pro&sup6;&sup5; der nativen Sequenz, die durch Arg¹¹ Ser&sup6;&sup5; ersetzt sind.
Die vorstehend definierten Modifikationen können folglich gegebenenfalls in ein Polypeptid eingeführt werden, das mindestens eine der biologischen Eigenschaften eines natürlich vorkommenden G-CSFs aufweist, um die Lösungsstabilität des Moleküls zu verbessern. Die erfindungsgemäßen Modifikationen können folglich auf solche Polypeptide angewendet werden, die sich in der Aminosäuresequenz im Hinblick auf die Identität oder Lage eines oder mehrerer Reste (zum Beispiel Substitutionen, terminale und innerhalb der Sequenz vorkommende Additionen und Deletionen) von derjenigen unterscheiden, die hier für die natürlich vorkommenden G-CSFs angegeben wurde. Als Beispiele solcher Polypeptide können diejenigen eingeschlossen werden, die zum Beispiel durch Deletionen verkürzt sind: oder jene, die gegen eine Hydrolyse stabiler sind (und deshalb stärker ausgeprägte oder länger anhaltende Wirkungen als natürlich vorkommende G-CSFs aufweisen können); oder die, die verändert wurden, so daß eine oder mehrere potentielle Stellen zur O-Glykosylierung (die für in Hefe erzeugte Produkte eine höhere Aktivität ergeben kann) deletiert werden; oder die, worin ein oder mehrere Cysteinreste deletiert oder zum Beispiel durch Alanin- oder Serinreste ersetzt sind, und die in aktiver Form aus mikrobiellen Systemen möglicherweise einfacher isoliert werden; oder die, worin ein oder mehrere Tyrosinreste durch Phenylalanin ersetzt sind und die mehr oder weniger gut an menschliche G-CSF-Rezeptoren auf Zielzellen binden können. Die vorgeschlagenen Modifikationen (a) bis (s), vorzugsweise (i) bis (ix), können so zum Beispiel auf entweder einen nativen G-CSF, bei dem Cys¹&sup7; der nativen Sequenz durch Ser¹&sup7; ersetzt ist, oder auf allele Varianten und Analoga davon angewendet werden, von denen bekannt ist, daß sie mindestens eine der biologischen Eigenschaften eines natürlich vorkommenden G-CSFs aufweisen, wie zum Beispiel jene, die in den vorstehend angegebenen Veröffentlichungen beschrieben werden.
Für erfindungsgemäße getestete Polypeptide wurde festgestellt, daß sie im Vergleich zu dem entsprechenden unmodifizierten Polypeptid eine verbesserte Lösungsstabilität aufweisen, während sie entweder eine signifikante biologische Aktivität oder auch eine verbesserte biologische Aktivität beibehalten.
Aus dem Vorstehenden wird deutlich, daß die Eigenschaft der Lösungsstabilität von der der Löslichkeit verschieden ist. Die Lösungsstabilität ist die verminderte Neigung eines Stoffs aus einer Lösung unter physiologischen pH-, Temperatur- und Ionenstärkebedingungen auszufallen.
Die Lösungsstabilität wird hier durch Bestimmung des prozentualen Gehalts an G-CSF-Derivat gemessen, das in einer phosphatgepufferten Salzlösung nach 14 Tagen bei 37ºC bei einer vorgegebenen Anfangskonzentration von 1 mg/ml, 5 mg/ml oder 10 mg/ml in Lösung bleibt. Die Bestimmung der Lösungsstabilität wird nachstehend in Referenzbeispiel 4 ausführlich beschrieben. Günstigerweise weisen die erfindungsgemäßen Polypeptide eine Lösungsstabilität bei 5 mg/ml von mindestens 35%, vorteilhafterweise mindestens 50% und vorzugsweise mindestens 75% auf. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Polypeptide eine Lösungsstabilität bei 10 mg/ml von mindestens 75% und insbesondere mindestens 85% auf.
Der hier verwendete Begriff "natürlich vorkommender G-CSF" bezieht sich auf jene G-CSFs, für die festgestellt wurde, daß sie in der Natur vorkommen und die zwei Polypeptide enthalten, die die in SEQ ID No. 46 gezeigte Aminosäuresequenz aufweisen. Diese zwei Polypeptide unterscheiden sich nur insofern, als die Tripeptid-Insertion Val-Ser-Glu in einem Polypeptid zwischen den Positionen 35 und 36 vorliegt, aber in dem anderen nicht vorkommt. Das in der vorliegenden Beschreibung verwendete Numerierungssystem basiert auf dem natürlich vorkommenden Polypeptid ohne die Val-Ser-Glu-Insertion, und der hier verwendete Begriff "nativ" bezieht sich auf dieses Polypeptid ohne die Val-Ser-Glu-Insertion. Es ist erkennbar, daß die vorliegende Erfindung auf alle natürlich vorkommenden Formen des G-CSFs und Analoga davon gemäß der vorstehenden Beschreibung anwendbar ist, und daß eine sich daraus ergebende Korrektur der Positionsnummern des Polypeptids in Ab hängigkeit von der Form des natürlich vorkommenden G-CSFs, der zur Modifikation ausgewählt wurde, erforderlich sein kann.
Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird eine DNA- Sequenz bereitgestellt, die die gesamte Aminosäuresequenz eines Derivats eines natürlich vorkommenden G-CSFs gemäß der vorstehenden Definition codiert. Solche Sequenzen können zum Beispiel 1) den Einbau von zur Expression durch ausgewählte Nichtsäuger-Wirte bevorzugten Codons; 2) die Bereitstellung von Stellen zur Spaltung durch Restriktionsendonucleasen; und/oder 3) die Bereitstellung von zusätzlichen anfänglichen, terminalen oder eingeschalteten DNA-Sequenzen, die die Konstruktion von leicht exprimierbaren Vektoren erleichtern, einschließen. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen schließen diejenigen ein, die beim Erwirken der Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen nützlich sind, und die erfindungsgemäßen Derivate können in Abhängigkeit von der gewählten Wirtszelle in entweder glykosylierter oder nicht-glykosylierter Form vorliegen. Wenn das erfindungsgemäße Derivat in nicht-glykosylierter Form erhalten wird, zum Beispiel nach der Expression in prokaryontischen Wirtszellen, kann das Derivat gegebenenfalls zum Beispiel mit Säuger- oder anderen eukaryontischen Kohlenhydraten chemisch glykosyliert werden.
Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Merkmal wird ein rekombinanter Vektor bereitgestellt, der eine DNA-Sequenz gemäß der vorstehenden Definition enthält. Der rekombinante Vektor kann zum Beispiel ein biologisch funktionelles Plasmid oder ein viraler DNA-Vektor sein.
Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Vektors gemäß der vorstehenden Definition bereitgestellt, das die Insertion einer DNA-Sequenz gemäß der vorstehenden Definition in einen Vektor umfaßt.
Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird eine prokarvontische oder eukaryontische Wirtszelle bereitgestellt, die mit einem rekombinanten Vektor gemäß der vorstehenden Definition stabil transformiert oder transfiziert ist.
Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Merkmal wird ein Verfahren zur Herstellung einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle gemäß der vorstehenden Definition bereitgestellt, das die Transformation oder Transfektion einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle mit einem rekombinanten Vektor gemäß der vorstehenden Defi nition zum Erhalt eines stabil transformierten oder transfizierten prokaryontischen oder eukaryontischen Wirts umfaßt.
Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Derivats eines natürlich vorkommenden G-CSFs bereitgestellt, das die Züchtung einer erfindungsgemäßen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle zum Erhalt des Derivats umfaßt. Das Verfahren umfaßt vorteilhafterweise auch den Schritt der Isolierung des durch Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz in dem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor produzierten Derivats.
Die Wirtszellen zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren sind vorzugsweise prokaryontische Zellen, wie E. coli, aber können auch Hefezellen, wie Saccharomyces cerevisiae, oder Säugerzellen, wie CHO-Zellen (Ovarzellen des Chinesischen Hamsters), sein.
Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Merkmal wird ein Arzneimittel bereitgestellt, umfassend als Wirkstoff mindestens ein erfindungsgemäßes Derivat eines natürlich vorkommenden G-CSFs in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Nucleotidsequenz des 167 bp großen Fragments, auf das in Beispiel 1 verwiesen wird:
Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenz und die entsprechende Nucleotidsequenz eines nativen menschlichen (hu) G-CSF und die Restriktionsstellen;
Fig. 3 zeigt die Aminosäuresequenz und die entsprechende Nucleotidsequenz von [Ser17,27]hu G-CSFs und die Restriktionsstellen;
Fig. 4 zeigt die Nucleotidsequenz des T4-Transkriptionsterminators mit (a) terminalen SalI- und HindIII-Restriktionsstellen und (b) terminalen SalI- und StyI-Restriktionsstellen;
Fig. 5 zeigt eine Restriktionskarte von pTB357 (hier auch als pLB004 bezeichnet);
Fig. 6 zeigt die Nucleotidsequenz des EcoRI-SalI-Fragments, auf das in Referenzbeispiel 6(b) verwiesen wird, aber spart die Interferon α&sub2;-Gensequenz aus;
Fig. 7 zeigt eine Restriktionskarte von pLB015 (hier auch als pICI0080 bezeichnet);
Fig. 8 zeigt eine Restriktionskarte von pICI1079;
Fig. 9 zeigt eine Restriktionskarte von pICI54 (hier auch als pCG54 bezeichnet);
Fig. 10 zeigt eine Restriktionskarte von pCG61;
Fig. 11 zeigt eine Restriktionskarte von pICI1 107, worin der schraffierte Bereich die [Ser17,27]hu G-CSF codierende Gensequenz darstellt; und
Fig. 12 zeigt eine Restriktionskarte von pCG300 (hier auch als pICI1295 bezeichnet).

Ausführliche Beschreibung

Die erfindungsgemäßen Derivate werden vorteilhafterweise so ausgewählt, daß sie eine der weiteren Modifikationen (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii) oder (ix), oder wie vorstehend definiert, vorzugsweise eine der weiteren Modifikationen (i), (ii), (iv), (vi), (vii), (viii) oder (ix) und insbesondere eine weitere Modifikation (ii), (iv), (vi), (vii), (viii) oder (ix) aufweisen.
Auf Grund ihrer guten Lösungsstabilität besonders bevorzugte erfindungsgemäße Derivate umfassen:
Auf Grund ihrer ausgezeichneten Lösungsstabilität und guten spezifischen Aktivität besonders bevorzugte erfindungsgemäße Derivate umfassen:
von denen (i), (ii), (iii), (vi), (vii), (viii) und (xii) am meisten bevorzugt werden.
Diese letzteren menschlichen G-CSF-Derivate zeigen nicht nur ausgezeichnete Lösungsstabilitätseigenschaften, sondern besitzen im Vergleich zu einem natürlich vorkommenden menschlichen G-CSF auch eine verbesserte spezifische Aktivität.
Ein der Sequenz vorausgehendes Methionin kann in den erfindungsgemäßen Polypeptiden entweder vorhanden sein oder fehlen, ist aber geeigneterweise vorhanden.
Es wurde festgestellt, daß die Verwendung eines Produktionsvektors auf Grundlage von pAT153 vorteilhaft ist, umfassend:
i) einen Promotor und gegebenenfalls einen Operator dafür. zum Beispiel einen trp-Promotor oder einen T7A3-Promotor. Der T7A3-Promotor ist der A3-Promotor des Bakteriophagen T7 (vgl. Dunn J. J. und Studier F. W., J. Mol. Biol. 166 (1983), 477-535). In dieser Literaturstelle wird die vollständil; e Nucleotidsequenz der Bakteriophagen-T7-DNA und die Lage der genetischen T7-Elemente angegeben;
ii) eine Ribosomen-Bindungsstellensequenz, zum Beispiel eine trp-Leader-Ribosomen- Bindungsstellensequenz;
iii) eine Clonierungsstelle für das zu exprimierende Gen;
iv) eine T4-Transkriptions-Terminationssequenz (vgl. SEQ ID No. 51 und Fig. 4);
v) eine cer-Sequenz (Summers D. et al., MGG 201 (1985), 334-338);
vi) ein Tetracyclin-Repressorgen (Tet-R);
vii) ein Tetracyclin-Resistenzgen (Tet-A); und
viii) multiple Restriktionsenzym.-Erkennungssequenzen.
SEQ ID No. 50 zeigt eine Sequenz, die eine EcoRI-Restriktionsendonucleasestelle (Nucleotide 1-6), die A3-Promotorsequenz (Nucleotide 7-52), die trp-Leader-Ribosomen- Bindungsstellensequenz (Nucleotide 53-78) und das Translations-Initiationscodon (Nucleotide 79-81) umfaßt.
Es kann vorteilhaft sein, den zur Expression eines erfindungsgemäßen Derivats befähigten Wirt in einem Wachstumsmedium zu züchten und einen Hefeextrakt umfassenden Zusatz während der Züchtung zu dem Wachstumsmedium zuzugeben. Es wird bevorzugt, daß die Zugabe des Hefeextrakt umfassenden Zusatzes zu einem vorherbestimmten Zeitpunkt nach Beginn der Züchtung begonnen wird. Die Zugabegeschwindigkeit des Hefeextrakt umfassenden Zusatzes ist vorzugsweise derart, daß das Wachstumsmedium im Hinblick auf den Hefeextrakt nicht begrenzend wird. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn der Produktionsvektor zusammen mit einem T7A3-Promotor verwendet wird.
Es kann auch vorteilhaft sein, einen mit einem rekombinanten Vektor, der genetisches Material trägt, das ein erfindungsgemäßes Derivat codiert, transformierten Wirt in Gegenwart von Leucin und/oder Threonin in einer zum Erhalt einer verbesserten Anreicherung des erfindungsgemäßen Derivats ausreichenden Menge zu züchten. Dies ist insbeson dere zur Durchführung der Fermentation in Gegenwart von Leucin vorteilhaft, wenn der Produktionsvektor zusammen mit dem trp-Promotor verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung basiert zusätzlich zur Entdeckung von Modifikationen die bei einem G-CSF oder einem Derivat davon, das einen Teil oder die gesamte Aminosäuresequenz und mindestens eine der biologischen Eigenschaften eines natürlich vorkommenden G-CSFs aufweist, zur Verbesserung der Lösungsstabilität durchgeführt werden können, außerdem auf der Entdeckung modifizierter Verfahren zur Reinigung solcher G-CSFs und Derivate davon.
So gibt es zum Beispiel in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 87/01132 keine Offenlegung der Entfernung eines Detergens, insbesondere N-Lauroylsarcosin in der Salzform (z. B. Sarkosyl), aus den in dieser PCT-Veröffentlichung hergestellten G-CSF-Analoga. Es war deshalb erforderlich, ein solches Verfahren zu finden, um die Lösungsstabilität der erfindungsgemäßen G-CSF-Derivate bei hohen Konzentrationen beurteilen zu können und um Formulierungsstudien durchführen zu können. Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wurde die Entfernung des Detergens in Gegenwart einer phosphatgepuf ferten Salzlösung (pH 7,2-7,5) durchgeführt. Die phosphatgepufferte Salzlösung kann in einfacher Weise aus isotonischer Kochsalzlösung hergestellt werden, und kann auf diese Weise zum Beispiel eine Zusammensetzung aufweisen, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. In dieser Hinsicht wurde festgestellt, daß andere Puffer weniger bevorzugt waren, da entweder die Entfernung des Detergens, insbesondere von N-Lauroylsarcosin (in der Salzform), langsamer erfolgte oder mehr Protein ausfiel. Es wird außerdem bevorzugt, vorzugsweise in diesem Stadium eine Diafiltration durchzuführen, da festgestellt wurde, daß dies die Wirksamkeit verbessert, ohne eine erhöhte Proteinausfällung zu verursachen. Es wurde zum Beispiel festgestellt, daß eine Diafiltration der herkömmlichen Diffusionsdialyse vorzuziehen ist. Es wurde außerdem festgestellt, daß die Detergenskonzentration, insbesondere von N-Lauroylsarcosin in der Salzform (z. B. Sarkosyl), unter 1% verringert werden kann, während die Auftrennung während der Chromatographie beibehalten wird. Eine Verringerung der anfänglichen Detergenskonzentration ist bei Entfernung des Detergens nützlich und so wird im Einklang mit der Beibehaltung der Auftrennung während der Chromatographie die Verwendung der Minimalkonzentration eines Detergens, zum Beispiel N-Lauroylsarcosin (in der Salzform. z. B. Sarkosyl), bevorzugt. Eine bestimmte Konzentration eines Detergens, zum Beispiel N-Lauroylsarcosin (in der Salzform, z. B. Sarkosyl), ist folglich 0,8 bis 0,2%, vorzugsweise 0,5 bis 0,2% und insbesondere etwa 0,3%.
Zusätzlich zu dem Vorstehenden wurde festgestellt, daß die Entfernung eines Detergens, wie N-Lauroylsarcosin (in der Salzform, z. B. Sarkosyl), eine geringe proteolytische Aktivität zur Folge hat, die die Beurteilung des Produkts erschweren kann. Es wurde außerdem festgestellt, daß diese proteolytische Aktivität signifikant verringert und auch eliminiert werden kann, wenn der pH-Wert nach Entfernung des Detergens durch Diafiltration auf unter 7,0 vor einer wesentlichen Proteolyse in einfacher Weise durch Diafiltration und vorzugsweise durch Dialyse verringert wird. So kann gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform die Verringerung oder Beseitigung der geringen proteolytischen Aktivität bei einem pH-Wert durchgeführt werden, der unter 7,0 liegt, aber hoch genug ist, um eine signifikante Hydrolyse des Polypeptids zu vermeiden. Der pH-Wert liegt vorteilhafterweise im Bereich von 6.0 bis 4, 5, vorzugsweise 5,8 bis 5,0 und insbesondere etwa 5,4. Ein weiterer Vorteil dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform ist, daß E. coli- Verunreinigungen und/ oder abgebautes oder falsch gefaltetes Protein durch diese pH-Erniedrigung ausgefällt werden können. Es wird bevorzugt, daß die Reinigung den Schritt einer Größenausschlußchromatographie umfaßt, da sonst das Problem des proteolytischen Abbaus verstärkt wird, und obwohl die worliegende Ausführungsform einen solchen Abbau verringert, bereitet es Schwierigkeiten ihn zu eliminieren.
Zusätzlich zu den vorstehenden Verfahren ermöglicht die Verleihung von Lösungsstabilitäten für einen G-CSF oder ein Derivat davon eine wesentliche Vereinfachung des Extraktionsverfahrens. So wird gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Merkmal ein Verfahren zur Extraktion eines erfindungsgemäßen aktiven Derivats (wie vorstehend definiert) aus einem Einschlußkörper davon bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte: 1) die Suspension des Einschlußkörpers in einem Detergens, insbesondere N-Lauroylsarcosin in der Salzform (z. B. Sarkosyl), 2) die Oxidation, 3) die Entfernung des Detergens, zum Beispiel, wie hier beschrieben, und 4) die Aufbewahrung der nach der Entfernung des Detergens erhaltenen Lösung bei einer erhöhten Temperatur, zum Beispiel 30-450C. vorteilhafterweise 34-42ºC, zur Ausfällung von verunreinigendem Bakterienprotein, Produktoligomeren und/ oder Abbauprodukten. Die Lösung wird günstigerweise bei der erhöhten Tempe ratur 6 bis 24 Stunden, vorteilhafterweise 8 bis 18 Stunden, vorzugsweise 10 bis 14 Stunden und insbesondere etwa 12 Stunden aufbewahrt.
Das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren kann zum Beispiel durch Lyse der Wirtszellen, gefolgt von einer Zentrifugation zum Erhalt des Einschlußkörpers, zum Beispiel in Form eines Pellets, durchgeführt werden. Der Einschlußkörper kann dann in einem Detergens, wie zum Beispiel N-Lauroylsarcosin in der Salzform (z. B. Sarkosyl), vorzugsweise 1 bis 3% und insbesondere etwa 2% N-Lauroylsarcosin in der Salzform (z. B. Sarkosyl), suspendiert werden. An das Suspendieren in einem Detergens kann sich die Oxidation anschließen, zum Beispiel in Gegenwart von Kupfersulfat (CuSO&sub4;), an die sich wiederum eine Zentrifugation anschließen kann.
Wenn es möglich ist, den Einschlußkörper zu waschen, ist es bevorzugt Harnstoff anstatt zum Beispiel Desoxycholat zu verwenden.
Das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren ermöglicht, daß das Herstellungsverfahren zum Beispiel durch die Aufhebung der Notwendigkeit zur Verwendung von Größenausschiußsäulen vereinfacht werden kann. Außerdem scheint der hohe Produktgewinn aus dem Wärmebehandlungsschritt einer der Vorteile der erhöhten Lösungsstabilität der erfindungsgemäßen Derivate zu sein. Tatsächlich ist es der Fall, daß je größer die Lösungsstabilität ist, desto geeigneter ist das Protein für das neue Extraktionsverfahren. So wird zum Beispiel bevorzugt, dieses Extraktionsverfahren auf die Extraktion von erfindungsgemäßen Derivaten mit einer Lösungsstabilität von mindestens 85% bei 10 mg/ml anzuwenden. Wenn das bekannte Analogon [Met&supmin;¹, Ser¹&sup7;] G-CSF mittels des vorstehenden Verfahrens extrahiert wurde, zeigte die Umkehrphasen-HPLC (reverse phase HPLC, rpHPLC), daß nur 40% des gewünschten Produkts nach der Wärmebehandlung eines Retentats, das 1 mg/ml Protein insgesamt enthielt, in Lösung blieben. Bei 3 mg/ml Protein insgesamt verblieben nur 19% des Analogons in Lösung.
Alle hier gezeigten Nucleotidsequenzen sind im üblichen 5'-3'-Sinn angegeben.
Die erfindungsgemäßen Derivate basieren auf dem menschlichen G-CSF, der auch als hu G-CSF bezeichnet wird.
Da die in den Beispielen hergestellten Derivate alle unter Verwendung von E. coli- Zellen erzeugt werden, ist im allgemeinen ein der Sequenz vorausgehender Methioninrest vorhanden.
Auf die folgenden Materialien wird nachstehend in den Referenzbeispielen und Beispielen Bezug genommen, und ihre Zusammensetzung ist wie folgt:
Der hier verwendete Begriff "N-Lauroylsarcosin" bezieht sich auf die Verwendung dieses Stoffes in der Salzform. So wird in den Beispielen N-Lauroylsarcosin in Form des Natriumsalzes verwendet.
Puffer für Restriktionsenzyme
Stabilität: stabil bei -20ºC.
Pufferzusammensetzung
Die vorstehenden Puffer sind von Boehringer Mannheim erhältlich.
Puffer für das ortsspezifische Mutageneseverfahren - Referenzbeispiel 2
Puffer 1: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 100 mM NaCl 20 mM MgCh
Puffer 2: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 20 mM NaCl 1 mM EDTA
Puffer 3: 12 mM Tris-HCl, pH 7,7 30 mM NaCl 10 mM MgCl&sub2; 8 mM 2-Mercaptoethanol
Puffer 4: 60 mM Tris-HCl, pFI 8,0 90 mM NaCl 6 mM MgCl&sub2; 10 mM DTT

Nucleotidgemisch 1:

je 250 uM von dATP, dGTP, dCTP = S (Phosphorthioatderivat von dCTP) und dTTP und 1 mM ATP.

Nucleotidgemisch 2:

je 250 uM von dATP, dGTP, dCTP und dTTP und 350 uM ATP.
M9-Minimalmedium
Ammoniumchlorid 1 g
Dinatriumhydrogenorthophosphat 6 g
Kaliumdihydrogenorthophosphat 3 g
Natriumchlorid 0,5 g
in destilliertem Wasser 1 Liter
Zusätze/75 ml
300 ul 50%ige Glucose
75 ul 1 M MgSO&sub4;
75 ul 0,1 M CaCl&sub2;
75 ul 4 mg/ml Thiamin
75 ul 20% Caseinaminosäuren

Spureneiemenuosung (TES)

Die TES weist die folgende Zusammensetzung auf:
und wird zu dem Wachstumsmedium in einer Konzentration von 0,5 ml/l zugegeben.
Geneclean (TM)
Der Kit enthält: 1) 6 M Natriumiodid; 2) eine konzentrierte Lösung von Natriumchlorid, Tris und EDTA zur Durchführung eines Natriumchlorid/Ethanol/Wasser-Waschschritts; und 3) "Glassmilk" (TM) - ein 1,5 ml-Fläschchen, enthaltend 1,25 ml einer Suspension eines Silicagrundstoffs in Wasser.
Dies ist ein Verfahren zur DNA-Reinigung unter Zugrundelegung des Verfahrens von Vogelstein und Gillespie, das in "Proceedings of the National Academy of Sciences USA", Bd. 76 (1979), 615, veröffentlicht wurde.
Alternativ kann ein beliebiges der in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", zweite Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) beschriebenen Verfahren angewendet werden.
Zufallsmarkierungs-Kit ("Random Label Kit", Produkt von Pharmacia, Nr. 27-9250) Das Verfahren wird in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", zweite Auf lage, Sambrook, Fritsch und Maniatis (veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory. 1989), 10.13-10.17, beschrieben.

Sequenase (TM)

Chemisch modifizierte T7-DNA-Polymerase; unter Zugrundelegung des in "Proceedings of the National Academy of Sciences USA", Bd. 84 (1987), 4767-4771, veröffentlichten Verfahrens von Tabor und Richardson.
T4-DNA-Ligase, beschrieben in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", zweite Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis (veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), 5.60-5.64, und auch von Weiss B. et al., J. Biol. Chem., Bd. 243 (1968), 4543.
Die folgenden, aber nicht begrenzenden Beispiele werden nur zur Veranschaulichung angegeben.

Beispiel 1

Herstellung eines menschlichen [Ser17,27] G-CSFs

Das Verfahren für die Schritte a) bis b) in Referenzbeispiel 1 wurde mit den folgenden Modifikationen erneut durchgeführt:
Die Oligonucleotide SEQ ID Nos. 24, 25, 26 und 27 (wie nachstehend definiert) ersetzen SEQ ID Nos. 1, 2, 3 bzw. 4 (wie nachstehend definiert).

c) Clonierung des Gens für einen menschlichen [Ser17,27] G-CSF in einen Expressionsvektor

Das zuvor beschriebene Gen (vgl. Fig. 3 und SEQ ID No. 49) wurde in den Plasmidvektor pICI0020 cloniert. Dieser Vektor ist ein auf pAT153 basierendes Plasmid, worin der 651 bp große EcoRI-AccI-Bereich durch ein 167 bp großes EcoRI-ClaI-Fragment (SEQ ID No. 47) ersetzt ist, umfassend:
1) einem synthetischen E. coli-trp-Promotor und eine trp-Leader-Ribosomen-Bindungsstelle;
2) ein Translations-Initiationscodon;
3) eine aus M13mp18 stammende multiple Restriktionsenzym-Erkennungssequenz, die Stellen für KpnI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI und Hindlil enthält: und
4) eine synthetische Transkriptionsterminationssequenz.
Die DNA-Sequenz dieses Bereichs wird in Fig. 1 gezeigt.
Der pICI0020-Expressionsvektor wurde mit KpnI (BCL) in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 10 mM Magnesiumchlorid vollständig gespalten. Die DNA wurde mit Ethanol bei -20ºC aus einer 0,3 M Natriumacetat enthaltenden Lösung ausgefällt, und im Anschluß daran wurden die überhängenden 3'-Enden durch eine 10-minütige Behandlung mit T4-DNA-Polymerase bei 37ºC wie folgt entfernt:
DNA (1 ug) in Wasser (16 ul);
10 · T4-Polymerasepuffer (2 ul);
0,33 M Tris-Acetat, pH 7,9;
0,1 M Magnesiumacetat;
0,66 M Kaliumacetat;
5 mM Dithiotreit;
1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA PENTAX, Fraktion V);
2 mM dNTP-Gemisch (1 ul); und
T4-DNA-Polymerase (1 ul, 2,5 Einheiten/ul, BCL).
Wasser (80 ul) wurde zugegeben und das Gemisch mit Phenol/Chloroform (100 ul) und dann mit Chloroform (100 ul) extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol (250 ul) bei -20ºC nach Zugabe von 3 M Natriumacetat (10 ul) ausgefällt und dann mit SalI (BCL) in 150 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) vollständig gespalten. Der am KpnI- Ende mit einem glatten Ende versehene KpnI-SalI-Vektor wurde aus einem 0,7%igen Agarosegel gereinigt und durch die Verwendung von Geneclean (Warenzeichen) gemäß dem vom Hersteller (Bio 101, USA) empfohlenen Verfahren isoliert.
Das synthetische Gen wurde aus dem pSTPI-Vektoren wie folgt isoliert. Die Vektoren wurden mit ScaI und SalI (beide von BCL) in 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) gespalten. Das 530 bp große Fragment wurde aus einem 0,7%igen Agarosegel gereinigt und durch die Verwendung von Geneclean (Warenzeichen) gemäß dem vom Hersteller (Bio 101) empfohlenen Verfahren isoliert.
Zur Ligierung wurden ein Gemisch des ScaI-SalI-Genfragments (50 ng) und des pICI0020-Vektorfragments (100 ng) in 20 ul einer Lösung, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% (Gew./Vol.) PEG 8000 und T4-DNA- Ligase (2 Einheiten, BRL), bei 16ºC 20 Stunden inkubiert. Das so erhaltene Gemisch wurde zur Transformation von kompetenten E. coli HB101-Zellen (wie von BRL bereitgestellt) ge mäß der hier angegeben Beschreibung verwendet. Die Transformanten wurde durch die Züchtung auf 50 ug/ml Ampicillin enthaltenden L-Agarplatten selektiert und auf das Vorhandensein des Gens durch Kolonie-Hybridisierung mit einer ³²P-markierten Sonde (SEQ ID No. 24) gemäß der hier angegebenen Beschreibung durchmustert. Die Plasmid-DNA wurde aus 6 positiv hybridisierenden Kolonien präpariert und durch Zentrifugation in einem Cäsiumchloridgradienten gereinigt, und die Sequenz wurde mittels Didesoxy-Sequenzierung gemäß der hier angegebenen Beschreibung bestätigt.
Das dieses Gen enthaltende Plasmid wurde als pICI1080 bezeichnet.

d) Subclonierung einer ein Gen für [Ser17,27] G-CSF enthaltenden Expressionskassette in M13mp18

Die folgende Subclonierung wurde durchgeführt, um einen Ausgangspunkt zur Herstellung der in den Beispielen 3-8 ausführlich beschriebenen G-CSF-Derivate bereitzustellen.
Die Plasmid-DNA aus pICI1080 (gereinigt durch Cäsiumchlorid-Dichtezentrifugation) wurde mit EcoRJ und SalI (BCL) gemäß den Anweisungen des Herstellers vollständig gespalten. Das kleine EcoRI-SalI-Fragment, das den trp-Promotor und das [Ser17,27]- G-CSF-Gen enthält, wurde aus einem 0,7%igen Agarosegel durch die Verwendung von Geneclean (Warenzeichen) isoliert. Dieses Fragment wurde in einen EcoRI-SalI-gespaltenen M13mp18-Vektor cloniert (die DNA wurde von Amersham International bereitgestellt; Enzyme von BCL). Die Fragmente wurden in 5 · BRL-Ligierungspuffer unter Verwendung von T4-DNA-Ligase von BRL (zuvor beschrieben) miteinander ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde zur Transfektion von kompetenten E. coli TGl-Zellen (die gemäß dem in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Maniatis et al., Cold Spring Harbor, beschriebenen Calciumchloridverfahren von Mandel und Higa kompetent gemacht wurden) verwendet. Die transfizierten Zellen wurden in TY-Deckagar suspendiert, enthaltend 2% X-Gal in DMF und 200 ul in der logarithmischen Phase befindliche E. coli TG1-Zellen, und auf 2 · TY-Agarplatten ausplattiert (TY-Deckagar - 8 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt. 5 g NaCl und 3,75 g Bactoagar in 500 ul sterilem H&sub2;O; TY-Platten - 8 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt. 5 g NaCl und 7,5 g Bactoagar in 500 ml sterilem H&sub2;O). Vier weiße Plaques wurden entnommen und in 4 · 2 ml 1% E. coli TG1-Zellen in TY-Brühe-Aliquots (8 g Bactotrypton, 5 g Hefe extrakt und 5 g NaCl in 500 ml sterilem H&sub2;O) überführt und 6 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Die 2 ml-Kulturen wurden in Aliquots von 0,5 ml und 1,5 ml aufgeteilt. Die Bakterien wurden in einer Eppendorf (Warenzeichen)-Mikrozentrifuge aus der Lösung abzentrifugiert, und die Überstände wurden in sterile Eppendorf (Warenzeichen)-Röhrchen überführt. Die 0,5 ml-Aliquots wurden bei -20ºC als Phagenstammlösungen aufbewahrt. Die 1,5 ml-Aliquots wurden zur Präparation einzelsträngiger DNA gemäß dem Verfahren im M13-Sequenzierungshandbuch von Amersham International (vgl. nachstehend) verwendet. Diese DNA- Proben wurden dann unter Verwendung der Oligonucleotide SEQ ID No. 22 und SEQ ID No. 23 und universellem M13-Sequenzierungs-Primer sequenziert. Die Umsetzungen wturden unter Verwendung des Sequenase-Kits (Warenzeichen) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Alle 4 Clone wiesen die richtige DNA-Sequenz für [Ser17,27] G-CSF auf.

Präparation einzelsträngiger DNA im großen Maßstab

Für Präparationen einzelsträngiger DNA von zwischen 200-500 ug DNA/ml wurde das von Amersham International in "Oligonucleotide Directed Mutagenesis" beschriebene Verfahren angewendet. Das genaue Verfahren wird wie folgt durchgeführt:

Präparation einzelsträngiger DNA im großen Maßstab

A. Herstellung von 1 ml einer Phagenstammlösung

1. Entnehme eine einzelne E. coli TG1-Kolonie aus einer Glucose/Minimalmedium-Platte aus. Züchte sie über Nacht in 10 ml 2 · TY-Medium unter Schütteln bei 37ºC. Gebe 10 ul zu 20 ml frischem Medium zu und schüttle 3 Stunden bei 37ºC.
2. Beimpfe 1 ml 2 · TY-Medium in einem sterilen 10 ml-Kulturröhrchen mit 100 ul der 3 Stunden-Kultur von Schritt 1.
3. Beimpfe die 1 ml-Kultur mit einem rekombinanten Plaque.
4. Inkubiere 4 Stunden unter Schütteln bei 37ºC. Überführe den Inhalt in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
5. Zentrifugiere 5 Minuten bei Umgebungstemperatur. Gieße den Überstand in ein frisches Röhrchen.
rsewanre aas Konrcnen über Nacht bei 4ºC auf. Setze für den nächsten Schritt eine Übernachtkultur von E. coli TG1 an.

B. Züchtung von 100 ml Phagenkultur

1. Beimpfe 100 ml 2 · TY-Medium mit 1 ml der TG1-Übernachtkultur und schüttle bei 37ºC bis zu einem OD&sub5;&sub0;&sub0;-Wert von 0,3.
2. Gebe 1 ml Phagenüberstand von A(S) (vorstehend) zu der 100 ml-Kultur zu.
3. Inkubiere 5 Stunden unter Schütteln bei 37ºC. Übertrage den Inhalt in Zentrifugenröhrchen.
4. Zentrifugiere bei 5000 · g 30 Minuten bei 4ºC.
5. Übertrage den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen. Achte darauf, daß keine Zellen übertragen werden (behalte das Bakterienpellet zur RF-DNA-Präparation zurück).
6. Gebe 0,2 Volumenteile 20%iges (Gew./Vol.) PEG 6000 in 2,5 M NaCl zu dem Überstand zu. Mische gut und lasse das Gemisch dann 1 Stunde bei 4ºC stehen.
7. Zentrifugiere bei 5000 · g 20 Minuten bei 4ºC. Verwerfe den Überstand.
8. Zentrifugiere bei 5000 · g 5 Minuten und entferne alle Reste von PEG/NaCl mit einer ausgezogenen Pasteurpipette.
9. Resuspendiere das Viruspellet in 500 ul Wasser (zweifach destilliert) und überführe es in ein Mikrozentrifügenröhrchen (1,5 ml).
10. Zentrifugiere 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge, um alle restlichen Zellen zu entfernen. Übertrage den Überstand in ein frisches Mikrozentrifiigenröhrchen.
11. Gebe 200 ul 20%iges PEG 6000 12,5 M NaCl zu dem Überstand zu, mische gut und lasse das Röhrchen dann bei lJmgebungstemperatur 15 Minuten stehen.
12. Zentrifugiere 5 Minuten und verwerfe den Überstand.
13. Zentrifugiere 2 Minuten. Entferne vorsichtig alle Spuren von PEG/NaCl mit einer ausgezogenen Pasteurpipette.
14. Resuspendiere das Viruspellet in 500 ul zweifach destilliertem Wasser.
15. Gebe 200 ul von mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, und 1 mM EDTA gesättigtem Phenol zu. Mische kurz mit einem Vortexgerät.
16. Lasse das Röhrchen 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
17. Zentrifugiere 3 Minuten.
18. Überführe den Überstand in ein frisches Röhrchen.
19. Wiederhole die Schritte 15-18.
20. Gebe 500 ul Chloroform zu und extrahiere die wäßrige Phase zweimal.
21. Gebe 50 ul 3 M Natriumacetat und 1 ml absolutes Ethanol zu. Mische.
22. Stelle das Röhrchen 20 Minuten in ein Trockeneis/Ethanol-Bad.
23. Zentrifugiere 15 Minuten.
24. Wasche jedes Pellet mit 1 mil -20ºC kaltem Ethanol. Dekantiere.
25. Trockne das Pellet unter vermindertem Druck und nehme es in 50 ul zweifach destilliertem Wasser auf.
Dieses Verfahren ergibt 100-200 ug einzelsträngige DNA.

e) Fermentation

pICI1080 wurde in den E. coli-Stamm MSD-522 transformiert, und die so erhaltenen Rekombinanten wurden gereinigt und als Glycerin-Stammlösungen bei -80ºC aufbewahrt.
Ein Aliquot der Kultur wurde aus der Stammlösung entfernt und auf Agarplatten mit L-Ampicillin ausgestrichen, um einzelne Kolonien nach Züchtung über Nacht bei 37ºC abzutrennen. Eine einzelne gewünschte Kolonie wurde entfernt und in 10 ml L-Ampicillin- Brühe resuspendiert, und 100 ul davon wurden unmittelbar in einen jeden von 10 250 ml- Erlenmeyerkolben überimpft, die 75 ml L-Ampicillin-Brühe enthielten. Nach 16-stündiger Züchtung bei 37ºC in einer Schüttelvorrichtung wurden die Inhalte der Kolben vereinigt und zum Beimpfen eines 20 Liter LCM50-Wachstumsmedium enthaltenden Fermenters verwendet.

Zusammensetzung von LCM50

hergestellt aus destilliertem Wasser
KH&sub2;PO&sub4; 3,0
Na&sub2;HPO&sub4; 6,0
NaCl 0,5
Caseinhydrolysat (Oxoid L41)2,0
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 10,00
Hefeextrakt (Difco) 10,00
Glycerin 35,00
L-Leucin 2,5
L-Threonin 0,9
MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,5
CaCl2 · 2H&sub2;O 0,03
Thiamin 0,008
FeSO&sub4;/Citronensäure 0,94/0,02
Spurenelementlösung (TES)0,5 ml
Die Fermentationen wurden dann bei einer Temperatur von 37ºC und einem pH- Wert durchgeführt, der durch die automatische Zugabe von 6 M Natriumhydroxidlösung bei pH 6, 7 reguliert wurde. Der Partialdruck-Sollwert des gelösten Sauerstoffs (dOT) betrug 50% Luftsättigung und wurde anfangs durch die automatische Einstellung der Rührergeschwindigkeit des Fermenters reguliert. Der einem Volumenteil pro Volumen pro Minute (VVM) entsprechende Luftstrom in den Fermenter, anfangs 20 l/min. wurde auf 50 l/min (2,5 VVM) erhöht, wenn die Rührergeschwindigkeit des Fermenters 80-90% ihres Maximums erreichte. Da die Sauerstofftransferrate (OTR) der Fermenter die Sauerstoffaufnahmerate (OUR) der Bakterien bei einer Zelldichte, die größer war als die einem OD&sub5;&sub5;&sub0;-Wert von 50 unter den beschriebenen Bedingungen entsprechenden Dichte, nicht erreichte, wurde der dOT-Wert im Fermenter bei Zelldichten, die größer waren als diese, durch Begrenzung der Sauerstoff aufnahmerate der Bakterien bei 50% Luftsättigung gehalten. Dies wurde erreicht, indem das Medium so formuliert wurde, daß es bei einem OD&sub5;&sub5;&sub0;-Wert von 50 hinsichtlich der Kohlenstoffversorgung begrenzend wird, und im Anschluß daran durch Zufuhr eines Beschickungsmaterials der begrenzenden Kohlenstoffquelle zusammen mit Ammoniumsulfat und Hefeextrakt in einer Rate verabreicht wurde, die die Bakterienvermehrungsrate begrenzt.
Die Fermentationen wurden 16 Stunden durchgeführt, und während dieses Zeitraums wurden Proben zur Bestimmung der optischen Dichte (OD&sub5;&sub5;&sub0;), des Zelltrockengewichts und der Anreicherung des G-CSFs innerhalb der Zellen entnommen. Die G-CSF-Anreicherung wurde durch Scannen von mit Coomassie-Blau gefärbten SDS-PAGE-Gelen ganzer Zellysate der entnommenen Bakterien gemessen, wie auf dem Fachgebiet gut bekannt ist.
Erreichte der OD&sub5;&sub5;&sub0;-Wert einen Wert von 25, wurde Caseinhydrolysatlösung (100 g/l Oxzoid L41) in die Fermenter in einer Rate von 1,5 g/l/Std. gepumpt.
Erreichte der OD&sub5;&sub5;&sub0;-Wert einen Wert von etwa 50, erschöpfte sich die Verfügbarkeit der Kohlenstoffquelle im Fermentationsbatch, was eine schnelle Erhöhung des dOT- Werts über 50% Luftsättigung zur Folge hatte. Zu diesem Zeitpunkt wurde ein Glycerin (470 g/l), Hefeextrakt (118 g/l) und Ammoniumsulfat (118 g/l) enthaltendes Beschickungsmaterial in die Fermenter in einer Rate gepumpt, die den dOT-Wert wieder zurückführte und dann bei 50% Luftsättigung hielt, wobei der Fermenter bei ca. 80% seines Maximums gerührt wurde. Nach ca. 13-14 Stunden wurde dieses dem Batch zugeführte Beschickungsmaterial durch ein zweites Beschickungsmaterial ersetzt, das nur Glycerin (715 g/l) und Ammoniumsulfat (143 g/l) enthielt. Die Caseinhydrolysat-Zufuhr wurde die ganze Zeit über bei 1.5 g/l/Std gehalten. Nach etwa 16 Stunden, wenn die mikroskopische Untersuchung der Kultur das Vorhandensein großer Einschlußkörper in der Mehrzahl der Zellen zeigte, wurden die Bakterien in einer Sorvall RC3B-Zentrifuge geerntet (7000 · g, 30 Minuten. 4ºC) und bei -80ºC im gefrorenen Zustand gelagert.

f) Reinigung

Die gefrorene Zellpaste (500 g) wurde bei 4ºC in 50 mM Tris-HCl und 25 mM EDTA, pH 8,0 (5 Liter) unter Verwendung eines Silverson-Homogenisators, Modell AXR, resuspendiert. Die Suspension wurde durch drei Durchgänge durch einen Manton-Gaulin- Homogenisator bei 6000 psi lysiert und bei 5000 · g 30 Minuten in einer Sorvall RC3C-Zentrifuge unter Verwendung eines H6000A-Rotors zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Pelletfraktion vor der weiteren Reinigung bei -20ºC gelagert.
Die Pelletfraktion (60-100 g) wurde aufgetaut und in 1% (Gew./Vol) Desoxycholsäure (Natriumsalz) in 5 mM EDTA, 5 mM Dithiotreit und 50 mM Tris-HCl. pH 9,0 (1200 ml), enthaltend 1 mg/ml Natriumazid, unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators mit einer PTA 20-Sonde bei Geschwindigkeitseinstellung 5 resuspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gemischt und bei 600 · g 30 Minuten in einer Sorvall RC5C-Zentrifuge unter Verwendung eines GSA-Rotors zentrifugiert. Der Überstand wurde verworten und das Pellet noch zweimal in der gleichen Weise behandelt. Das Pellet wurde anschließend zweimal in Wasser (1 Liter) resuspendiert und bei 15 000 · g 20 Minuten zentrifugiert. Das letzte Pellet, das gewaschene Einschlußkörper enthielt, wurde in 2% (Gew./Vol.) N-Lauroylsarcosin (Natriumsalz, Sarkosyl) in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 (150 ml), enthaltend 1 mg/ml Natriumazid, solubilisiert. Kupfer(III)-sulfat wurde bis zu einer Konzentration von 20 uM zugegeben und das Gemisch wurde 16 Stunden bei 20ºC vor der Zentrifugation bei 30 000 · g 30 Minuten in einer Sorvall RC5C-Zentrifuge unter Verwendung eines SS34-Rotors gerührt. Der das Derivat enthaltende Überstand wurde vor der weiteren Reinigung in 50 ml-Aliquots bei -20ºC gelagert.
Das solubilisierte Derivat (20 ml) wurde aufgetaut und durch einen 5 um-Filter hindurchgeleitet, um alle partikelförmigen Stoffe zu entfernen. Das Filtrat wurde auf eine Ultrogel AcA54-Säule (5 · 90 cm), die mit 0,3% (Gew./Vol) N-Lauroylsarcosin (Natriumsalz) in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 1 mg/ml Natriumazid, äquilibriert worden war, bei 4ºC aufgetragen. Die Säule wurde mit demselben Puffer in einer Durchflußgeschwindigkeit von 2,5 ml/Minute eluiert, und Fraktionen von 10 ml wurden gesammelt. Fraktionen, die das Derivatprotein enthielten, wurden vereinigt (etwa 100 ml) und bei 4ºC gelagert.
Die vereinigten derivathaltigen Fraktionen aus mehreren Säulen wurden vereinigt (200-S00 ml) und gegen 10 mM Natriumphosphat und 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4 (3-5 Liter), enthaltend 1 mg/ml Natriumazid, unter Verwendung einer Amicon CH2A-1S-Spiralpatronen-Diafiltrationsvorrichtung dialysiert, die mit einer S 1 Y 10-Membran (mit einer Abtrennung von 10 kD) ausgestattet war. Das Retentat wurde bei 30 000 · g 30 Minuten in einer Sorvall RCSC-Zentrifuge unter Verwendung eines SS34-Rotors zentrifugiert, und der Überstand wurde in einem Spectropor-Dialyseschlauch mit einer Abtrennung von 6-8 kD 40 Stunden gegen einen dreimaligen Austausch (8 Liter/300 ml Überstand) von 20 mM Natriumacetat, 100 mM Natriumchlorid, pH 5,4, enthaltend 1 mg/ml Natriumazid, dialysiert. Das sich bildende Präzipitat wurde durch eine 30-minütige Zentrifugation bei 30 000 · g entfernt, und der Überstand wurde 24 Stunden gegen 1 mg/ml Natriumazid enthaltendes Wasser und anschließend 72 Stunden gegen einen sechsmaligen Austausch von Wasser dialysiert. Das letzte Retentat wurde durch eine 30-minütige Zentrifugation bei 30 000 · g geklärt und im gefrorenen Zustand bei -20ºC (Proteinkonzentration etwa 1 mg/ml) oder bei 4ºC nach dem Gefriertrocknen gelagert.
Die itonzentration von N-Lauroylsarcosin (Natriumsalz) tiel nach der Diafiltration auf unter etwa 0,001% (Gew./Vol.) und lag unter der Nachweisgrenze (etwa 0,0001%) des nach der Dialyse gegen Wasser ängewendeten rpHPLC-Verfahrens.

Beispiel 2

Herstellung eines menschlichen [Ser17,27] G-CSFs

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde mit den folgenden Änderungen erneut durchgeführt.
Der Doppelstrang I wurde mit T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert und mit MstII (10 Einheiten) in 1 · H-Puffer (BCL, 30 ul) 2 Stunden bei 37ºC gespalten.
Nach Fällung mit Ethanol wurde das 143 bp große EcoRl-MstII-Fragment in einem 7 M Harnstoff enthaltenden 10%igen Polyacrylamidgel gereinigt und mittels Elektroelution aus einem Gelteil isoliert, und die DNA-Stränge wurden gemäß der Beschreibung in Referenzbeispiel 1 aneinandergelagert (aneliert).
Das vorstehend beschriebene synthetische EcoRI-MstII-Fragment wurde in den in Referenzbeispiel 1 beschriebenen Plasmidvektor pAG88 cloniert. Zur Herstellung des Vektors wurde pAG88 (10 ug) mit MstII (20 Einheiten, BCL) in 1 · H-Puffer (BCL, 100 ul) 2 Stunden bei 37ºC gespalten. Die DNA wurde mit Ethanol aus 0,3 M Natriumacetat bei -20ºC ausgefällt und dann mit EcoRI (20 Einheiten, BCL) in 1 · H-Puffer (BCL, 100 ul) 2 Stunden bei 37ºC gespalten. Nach Fällung mit Ethanol wurde das große EcoRI-MstII-Fragment in einem 1%igen Agarosegel gereinigt und unter Verwendung von Geneclean (Warenzeichen) gemäß der Beschreibung; des Herstellers (Bio 101, USA) gereinigt. Kolonien, die das synthetische Fragment enthielten, wurden durch die Durchmusterung mit einer radioaktiven Sonde bestätigt, die aus einem Oligonucleotid (SEQ ID No. 24) hergestellt wurde, und die fehlerfreie Sequenz wurde gemäß der Beschreibung in Referenzbeispiel 1 durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Das Plasmid, welches das Gen für [Ser17,27]G-CSF enthält, wurde als pICI1107 bezeichnet. Das Gen wurde in den Expressionsvektor pICI0020 cloniert, und die Fermentation und die Proteinreinigung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 3

Herstellung eines menschlichen [Arg¹¹, Ser17,27,60,65] G-CSFs

Das in Referenzbeispiel 2 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung der mutagenen Matrize M13mp18, die das Gen für den in Beispiel 1 oder 2 beschriebenen [Ser17,27] G-CSF enthält, erneut durchgeführt. Die verwendeten mutagenen Oligonucleotide wurden als SEQ ID No. 28 und SEQ ID No. 29 (wie nachstehend definiert) bezeichnet. Das Triplett ACG in SEQ ID No. 28 dient zur Umwandlung von Gln in Position 11 in Arg, und die ersten und letzten AGA-Tripletts in SEQ ID No. 29 dienen zur Umwandlung von Pro in den Positionen 65 und 60 in Ser. Die Mutagenese wurde gemäß der Beschreibung in Referenzbeispiel 2 unter Verwendung von SEQ ID No. 29 in einer Mutagenese, die einen Primer verwendet, durchgeführt. Dies ergab einen einzigen Plaque, der die Pro 60 -> Ser- und Pro 65 -> Ser-Austausche aufgenommen hatte. Aus diesem Plaque wurde die einzelsträngige DNA gemäß der Beschreibung in Referenzbeispiel 2 präpariert. Diese DNA wurde als mutagene Matrize bei einer Mutagenese, die einen Primer verwendet, unter Verwendung von SEQ ID No. 28 als mutagenen Primer verwendet. Dies ergab > 100 Plaques, von denen 3 durch DNA-Sequenzierung gemäß der zuvor angegebenen Beschreibung durchmustert wurden. Alle 3 hatten den vollständigen Satz von Austauschen aufgenommen. Aus einem der Plaques wurde doppelsträngige Rh-DNA gemäß dem Verfahren zur Herstellung von einzelsträngiger DNA in einem großen Maßstab (Schritt d in Beispiel 1 bis Schritt B(5)) präpariert. Die RF-DNA wurde aus dem Bakterienpellet durch das alkalische Lyseverfahren von Birnboim und Doly (Nucleic Acids Research 7 (1979), 1513-1523) extrahiert und mittels Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt, wie in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", von Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Publication) beschrieben ist. Die gereinigte RF-DNA wurde mit EcoRI und SalI in H-Puffer gespalten, wie zuvor beschrieben, und das kleine Fragment, das den trp-Promotor, die Ribosomen- Bindungsstelle, das Translations-Initiationscodon und das Gen für [Arg¹¹, Ser17,27,60,65] G-CSF enthält, wurde aus einem 0,7%igen Agarosegel unter Verwendung von Geneclean (TM) isoliert. Das Fragment wurde in einen EcoRI-SalI-gespaltenen pICI0020-Vektor unter Verwendung eines molaren Überschusses von 2 : 1 von Insertion zu Vektor mit T4-DNA- Ligase (BRL) und Ligasepuffer ligiert, im wesentlichen wie zuvor beschrieben. Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation des E. coli-Stamms HB 101 verwendet. Die Transformanten wurden durch Züchtung auf 50 ug/ml Ampicillin enthaltenden L-Agarplatten selektiert. Die Kolonien wurden hinsichtlich der Anwesenheit der insertierten DNA mittels Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA durchmustert, die durch das Verfahren von Birnboim und Doly gemäß der Beschreibung in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", von Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Publication) präpariert wurde. Die Plasmid-DNA aus einer Kolonie, die die erwartete 619 bp große EcoRl-SalI-Insertion enthielt, wurde zur Transformation des E. coli-Stamms MSD-522 verwendet und als pICI1239 bezeichnet. Die Fermentation und die Reinigung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 4

Herstellung eines menschlichen [Ser17,27,115,116 Glu¹¹¹] G-CSFs

Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung der mutagenen Matrize M13mp18, die das Gen flur den in Beispiel 1 oder 2 beschriebenen [Ser17,27] G-CSF enthält, erneut durchgeführt. Das verwendete mutagene Oligonuclotid wird als SEQ ID No. 30 (wie nachstehend definiert) bezeichnet.
Das Triplett GCT dient zur Umwandlung von Thr in Position 116 in Ser, das Triplett AGA dient zur Umwandlung von Thr in Position 115 in Ser und das Triplett TTC dient zur Umwandlung von Ala in Position 111 in Glu. Das Mutageneseverfahren entsprach im wesentlichen dem in Beispiel 3 beschriebenen, und die Expressionskassette wurde zum Erhalt von pICI1243 in ein Expressionsplasmid übertragen. Die Fermentation und die Reinigung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 5

Herstellung eines menschlichen [Arg¹¹¹, Ser17,27, Lys&sup5;&sup8;, Arg165] G-CSFs

Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung der mutagenen Matrize M13mp18, die das Gen für den in Beispiel 1 oder 2 beschriebenen [Ser17,27] G-CSF enthält, erneut durchgeführt. Die verwendeten mutagenen Oligonucleotide werden als SEQ ID No. 28. SEQ ID No. 31 und SEQ ID No. 32 (wie nachstehend definiert) bezeichnet.
Das Triplett ITT in SEQ ID No. 31 dient zur Umwandlung von Trp in Position 58 in Lys, und in SEQ ID No. 32 dient das zweite GCG-Triplett zur Umwandlung von Tyr in Position 165 in Arg.
Das Mutageneseverfahren wurde zuerst als Experiment, das zwei Primer verwendet, unter Verwendung von SEQ ID No. 31 und SEQ ID No. 32 als mutagene Oligonucleotide gemäß der Beschreibung in Referenzbeispiel 2 durchgeführt. Dies ergab 2 Plaques, von denen beide den SEQ ID No. 32-Austausch (Tyr 165 -> Arg), aber nicht den SEQ ID No. 31- Austausch aufwiesen. Aus einem dieser Plaques wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 einzelsträngige DNA präpariert. Diese DNA wurde als mutagene Matrize bei einer Mutagenese, die zwei Primer verwendet, unter Verwendung von SEQ ID No. 28 und SEQ ID No. 31 als mutagene Primer verwendet. Dies ergab zwei Plaques, von denen einer den vollständigen Satz von Austauschen aufgenommen hatte, und die Expressionskassette wurde zum Erhalt von pICI1246 in ein Expressionsplasmid übertragen. Die Fermentation und die Reinigung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 6

Herstellung eines menschlichen [Glu¹&sup5;, Ser17,27, Ala26,28, Lys³&sup0;] G-CSFs

a) Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung der mutagenen Matrize M13mp18, die das Gen für den in Beispiel 1 oder 2 beschriebenen [Ser17,27] G-CSF enthält, erneut durchgeführt. Die verwendeten mutagenen Oligonucleotide werden als SEQ ID No. 33 und SEQ ID No. 34 (wie nachstehend definiert) bezeichnet.
Das Triplett TTC in SEQ ID No. 33 dient zur Umwandlung von Leu in Position 15 in Glu. In SEQ ID No. 34 dient das erste TTT-Triplett zur Umwandlung von Ala in Position 30 in Lys, und die Tripletts AGC dienen zur Umwandlung von Gly in den Positionen 26 und 28 in Ala.
Das Mutageneseverfahren wurde im wesentlichen gemäß der Beschreibung in Referenzbeispiel 2 als Experiment, das zwei Primer verwendet, durchgeführt, und die Expressionskassette wurde zum Erhalt von pICI1266 in ein Expressionsplasmid übertragen. Die Fermentation wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

b) Reinigung

Die gefrorene Zellpaste wurde lysiert und die rohe Pelletfraktion gemäß Beispiel 1 abgetrennt. Die dieses Protein enthaltenden Einschlußkörper im Pellet wurden durch den in Beispiel 1 beschriebenen Desoxycholsäure (Natriumsalz)-Puffer solubilisiert. Für dieses Protein wurde das folgende modifizierte Verfahren angewendet.
Die rohe Zelifraktion (60-100 g) wurde aufgetaut und in 25 mM EDTA und 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 (1200 ml) unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators mit einer PTA 20-Sonde bei Geschwindigkeitseinstellung 5 resuspendiert. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten gemischt und bei 6500 · g 30 Minuten in einer Sorvall RCSC- Zentrifuge unter Verwendung eines GSA-Rotors zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet noch zweimal in der gleichen Weise behandelt. Das Pellet wurde anschließend gemäß Beispiel 1 zweimal in Wasser (1 Liter) resuspendiert und zentrifugiert. Im Anschluß daran wurde das Reiriigungsverfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 7

Herstellung eines menschlichen [Ser17,27, Lys49,58, Ala44,51,55] G-CSFs

Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung der mutagenen Matrize M13mp18, die das Gen für den in Beispiel 1 oder 2 beschriebenen [Ser17,27] G-CSF enthält, erneut durchgeführt. Die verwendeten mutagenen Oligonucleotide werden als SEQ ID No. 35 und SEQ ID No. 36 (wie nachstehend definiert) bezeichnet. In SEQ ID No. 35 dienen die Tripletts AGC zur Umwandlung von Gly in Ala in Position 51 und von Pro in Ala in Position 44, und das Triplett TTT dient zur Umwandlung von Leu in Lys in Position 49. In SEQ ID No. 36 dient das Triplett TTT zur Umwandlung von Trp in Lys in Position 58 und das zweite AGC-Triplett dient zur Umwandlung von Gly in Ala in Position 55.
Die Mutagenese wurde als Experiment, das zwei Primer verwendet, gemäß der Beschreibung in Referenzbeispiel 2 durchgeführt. Dies ergab 16 Plaques. 8 Plaques wurden durch DNA-Sequenzierung gemäß der Beschreibung in Beispiel 3 durchmustert. Alle Plaques wiesen die SEQ ID No. 36-Austausche (Gly 55 -* Ala, Trp 58 -> Lys), aber nicht die SEQ ID No. 35-Austausche auf. Aus einem dieser Plaques wurde einzelsträngige DNA gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 (d) präpariert und als mutagene Matrize bei einer Mutagenese, die einen Primer verwendet, unter Verwendung von SEQ ID No. 35 als mutagenen Primer ver wendet. Dies ergab 5U Plaques, von denen 3 mittels DNA-Sequenzierung durchmustert wurden, wobei 2 den vollständigen Satz von Austauschen aufwiesen. Die Expressionskassette wurde in ein Expressionsplasrnid überführt, wobei pICI1297 erhalten wurde. Die Fermentation und die Reinigung vrurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 8

Herstellung eines menschlichen [Arg¹¹, Glu¹&sup5;, Ser17,27,60,65, Ala26,28, Lys³&sup0;]G-CSFs

Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung der mutagenen Matrize M13mp18, die das Gen für den in Beispiel 6 beschriebenen [Glu¹&sup5;, Ser17,27, Ala26,28, Lys³&sup0;] G-CSF enthält, erneut durchgeführt. Das verwendete mutagene Oligonucleotid wird als SEQ ID No. 28 bezeichnet, das zur Umwandlung von Gln in Position 11 in Arg dient. Das modifizierte Gen wurde isoliert und in den Vektor pICI0020 ligiert (Beispiel 1). Dieser Vektor wurde zur Transformation des E. coli-Stamms MSD-522 gemäß der Beschreibung in Beispiel 3 verwendet und als pICI1347 bezeichnet. Die pICI1347-Plasmid-DNA wurde aus MSD-522 isoliert, mittels Cäsiumchlorid-Dichtezentrifugation gereinigt und mit BamHI und SalI (BCL) vollständig gespalten. Die Plasmid-DNA (5 ug) wurde bei 37ºC 2 Stunden in einem BCL-Puffer mit hoher Salzkonzentration (100 ul) (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 1 mM Dithioerythrit) inkubiert, der BamHI (40 Einheiten) und SalI (50 Einheiten) enthielt. Die DNA wurde durch Zugabe von 3 M Natriumacetat (10 ul) und absolutem Ethanol (250 ul) und 2-stündigem Abkühlen auf -20ºC ausgefällt, durch Zentrifugation (10 Minuten bei 10 000 Upm) gewonnen, unter vermindertem Druck getrocknet und in Wasser (10 ul) gelöst. Probenauftragspuffer (2 ul, enthaltend 240 mM Tris-Acetat, pH 7, 8, 6 mM EDTA, 20% Saccharose, 0,2% Xylolcyanol und 0,2% Bromphenolblau) wurde zugegeben und das Gemisch auf ein präparatives 0,7%iges Agarosegel (in 40 mM Tris-Acetat (pl-1 7, 8) und 1 mM EDTA) geladen, das Ethidiumbromid (0,5 ug/ml) enthielt, und einer 1-stündigen Elektrophorese bei 100 Volt unterworfen. Das große BamHI-SalI-Vektorfragment wurde aus einem 0,7%igen Agarosegel unter Verwendung von Geneclean (Warenzeichen) isoliert. In ähnlicher Weise wurde die pICI1239-Plasmid-DNA aus Beispiel 3 isoliert und mit BamHI und SalI gespalten. Das die Ser-Codons in Position 60 und 65 enthaltende kleine BamHI- SalI-Fragment wurde isoliert und mit dem vorstehend beschriebenen großen BamHI-SalI- Vektor ligiert. Das Gemisch wurde zur Transformation des E. coli-Stamms MSD-522 ver wendet und das Plasmid als pICII348 bezeichnet. Die Fermentation und die Reinigung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 6 durchgeführt.

Beispiel 9

Das Verfahren von Beispiel 1 und 2 wurde unter Verwendung des E. coli-Stamms TG1 anstelle des E. coli-Stamms MSD-522 beim Fermentationsschritt erneut durchgeführt (vgl. beispielsweise Beispiel 1 (e)).

Beispiel 10

Alternatives Extraktionsverfahren für einen menschlichen [Mer&supmin;¹, Arg¹¹, Ser17,27,60,65] G-CSF

Die gefrorene Zellpaste (640 g) wurde bei 4ºC in 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 5 mM Dithiothreit und 2 M Harnstoff, pH 8,0, enthaltend 1 mg/ml Natriumazid (5 Liter), unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators mit einer PTA 20-Sonde bei Geschwindigkeitseinstellung 7/8 resuspendiert. Die Suspension wurde durch drei Durchgänge durch einen Manton-Gaulin Lab 60/60-Homogenisator bei 6000 psi lysiert und mit einem weiteren Liter Puffer durchspült. Die Kühlung erfolgte durch einen einzigen Durchgang durch einen Conair-Kühler bei -20ºC. Das Lysat wurde bei 5000 · g 30 Minuten in einer Sorvall RC3C- Zentrifuge unter Verwendung eines H6000A-Rotors zentrifugiert.
Der Überstand wurde verworfen und das Pellet (etwa 450 g) in demselben Puffer (10 Liter) resuspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gemischt und bei 5000 Upm 30 Minuten in zwei Sorvall RC3C-Zentrifugen unter Verwendung von H6000A-Rotoren zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet noch zweimal in der gleichen Weise behandelt. Das Pellet wurde anschließend zweimal in Wasser (10 Liter) resuspendiert und bei 5000 Upm 30 Minuten zentrifugiert. Die letzten Pellets, die gewaschene Einschlußkörper enthielten, wurden in 2% (Gew./Vol) N-Lauroylsarcosin (Natriumsalz) in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 (1 Liter), enthaltend 1 mg/ml Natriumazid, unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators bei Geschwindigkeitseinstellung 7 resuspendiert. 20 mM Kupfersulfat in Wasser (1,5 ml) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur vor einer 30-minütigen Zentrifugation bei 10 000 Upm in einer Sorvall RC5C -Zentrifuge unter Verwendung eines GSA-Rotors gerührt.
Der das Derivat enthaltende Üherstand wurde zur Entfernung alle partikelförmigen Stoffe durch einen 5 um-Filter gefiltert, mit 50 mM Tris-HCL, pH 8,0, enthaltend 1 mg/ml Natriumazid, bei 4ºC sechsfach verdünnt und bei Maximaldruck in einer mit einer S10Y10- Patrone (mit einer Abtrennung von 10 kD) ausgestatteten Amicon DC&sub2;&sub0;-Ultrafiltrationsvorrichtung gegen 10 mM Natriumphosphat und 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4 (90 Liter), enthaltend 1 mg/ml Natriumazid, diafiltriert. Gegen Ende der Diafiltration bildete sich ein Präzipitat.
Das Retentat (2,1 mg/ml Protein insgesamt, 1,7 mg/ml Produkt) wurde in 4 Liter- Polypropylenbehältern mit Schraubverschluß gesammelt und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Das sich bildende Präzipitat wurde durch eine 45-minütige Zentrifugation bei 5000 Upm in einer Sorvall RC3C-Zentrifuge entfernt und der Überstand bei 4ºC gelagert.
Die Überprüfung durch eine SDS-PAGE und rpHPLC zeigte, daß während der letzten Wärmebehandlung verunreinigende E. coli-Proteine, Produktoligomere und Abbauprodukte selektiv ausgefällt wurden, wobei etwa 85% des gewünschten Produkts in Lösung blieben. Die hochangereicherte, geklärte, wärmebehandelte Produktlösung war biologisch voll aktiv und bei 20 mg/ml bei 37ºC über einen Zeitraum von zwei Wochen ohne einen Hinweis auf einen proteolytischen Abbau und bei einer Ausfällung von weniger als 20% stabil. Auf diese Weise wurde ein ausgezeichnetes Zwischenprodukt für die weitere chromatographische Reinigung bereitgestellt.

Beispiel 11

Charakterisierung von G-CSF und Derivaten davon
Eine wäßrige Lösung von [Met&supmin;¹, Ser¹&sup7;] G-CSF und Derivaten davon (Beispiele 1- 9) (Proteinkonzentration etwa 1 rng/ml) wurde auf mindestens 11 mg/ml Protein an einer Amicon YM10-Membran bei 4ºC' konzentriert. Um einer Ausfällung während der Konzentrierung vorzubeugen, wurde der pH-Wert der Ausgangslösung zuerst durch Zugabe von Ammoniumhydroxid bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,25 mM von pH 5, 5 auf pH 8,5 eingestellt. Nach der Konzentrierung fiel der pH-Wert der Lösung auf etwa 8,0 ab.
Die konzentrierte Proteinlösung wurde durch Zugabe einer 20fach konzentrierten, phosphatgepufferten Salzlösung auf 10 mg/ml Protein eingestellt (abgeschätzt anhand einer 1 mg/ml-Lösung, die einen A980-Wert von 1,0 ergab). Diese 10 mg/ml-Lösung eines Derivats in 10 mM Natriumphosphat und 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4 (PBS) ergab eine übliche Stammlösung, mit der die Homogenität. Identität, biologische Aktivität und Lösungsstabilität des Proteins überprüft wurde.
Eine Stammlösung des menschlichen G-CSFs in einer Konzentration von 1 mg/ml in PBS wurde gemäß der Beschreibung in Referenzbeispiel 1 ebenfalls hergestellt. Für jedes Protein wurde durch einen SDS-PAGE-Lauf unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen und durch Umkehrphasen-HPLC gezeigt, daß es zu mindestens 95% aus einer Komponente besteht. Die erneut durchgeführte Analyse der Aminosäurezusammensetzung nach einer sauren Hydrolyse in 6 N HCl bei 110ºC lieferte für jedes Derivat Aminosäureverhältnisse und eine genaue Bestimmung der Proteinkonzentration in der Stammlösung. Diese Proteinkonzentration wurde zusammen mit dem Mittelwert von Biotest-Titern, die an mindestens sechs verschiedenen Tagen erhalten wurden, zur Bestimmung der spezifischen Aktivität des Derivats verwendet. Die N-terminale Sequenzanalyse und die massenspektrometrische Elektrosprayanalyse ausgewählter Derivate ergab die erwarteten Sequenzen und Molekulargewichte.

Beispiel 12

Herstellung eines menschlichen Arg¹¹, Ser17,27,60,65] G-CSFs unter Verwendung eines den trp- Promotor enthaltenden Produktionsvektors

a) Plasmid pICI1239 (beschrieben in Beispiel 3) wurde mit EcoRI und SalI in Puffer H gespalten, wie zuvor beschrieben. Das kleine EcoRI-SalI-Fragment, enthaltend den trp-Promotor, die Ribosomen-Bindungsstelle und das Gen für [Arg¹¹, Ser17,27,60,65] G-CSF, wurde aus einem 0,7%igen Agarosegel unter Verwendung von Geneclean (TM) isoliert. Aus pICI- 0080 (vgl. Referenzbeispiel 6) wurde durch Spaltung mit EcoRI und XhoI in Puffer H ein Vektorfragment hergestellt, und das große EcoRI-XhoI-Fragment wurde aus einem 0,7%igen Agarosegel unter Verwendung von Geneclean (TM) isoliert. Das kleine EcoRI-SalI-Fragment wurde in das EcoRl-XhoI-Vektorfragment unter Verwendung eines molaren Überschusses von 2 : 1 von Insertion zu Vektor ligiert, wie zuvor beschrieben, und das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation des E. coli-Stamms MSD-522 verwendet. Die Transformanten wurden hinsichtlich des Wachstums auf Tetracyclin (15 ug/ml) enthaltenden L-Agarplatten selektiert. Drei Kolonien wurden ausgewählt und in M9-Minimalmedien (75 ml), enthaltend Zusätze und letracyclin (15 ug/ml), bei 37ºC 20 Stunden in einer Schüttelvorrichtung gezüchtet. Die Proteinanreicherung wurde durch Scannen von mit Coomassie-Blau gefärbten SDS-PAGE-Gelen ganzer Zellysate gemessen. Alle drei Kolonien exprimierten den [Arg¹¹, Ser17,27,60,65]hu G-CSF. Die Plasmid-DNA aus einer der Kolonien wurde als pICI1327 bezeichnet, und die Sequenz des Promotors und des Gens wurde durch übliche Didesoxy- Sequenzierungsverfahren gemäß der zuvor angegeben Beschreibung bestätigt.
b) Fermentation
pICI1327 wurde in den E. coli-Stamm MSD-522 transformiert, und die so erhaltenen Rekombinanten wurden gereinigt und als Glycerin-Stammlösungen bei -80ºC aufrechterhalten.
Ein Aliquot der Kultur wurde aus der Stammlösung entfernt und auf Agarplatten mit Tetracyclin ausgestrichen, um einzelne Kolonien nach Züchtung über Nacht bei 37ºC abzutrennen. Eine einzelne gewünschte Kolonie wurde entfernt und in 10 ml Tetracyclin-Brühe resuspendiert, und je 100 ul davon wurden unmittelbar in 3 250 ml-Erlenmeyerkolben überimpft, die 75 ml Tetracyclin-Brühe enthielten. Nach 16-stündiger Züchtung bei 37ºC in einer Schüttelvorrichtung wurden die Inhalte der Kolben vereinigt und zum Beimpfen eines 20 Liter Wachstumsmedium enthaltenden Fermenters verwendet.

Zusammensetzung des Wachstumsmedium

hergestellt aus destilliertem Wasser
KH&sub2;PO&sub4; 3,0
Na&sub2;HPO&sub4; 6,0
NaCl 0,5
Caseinhydrolysat (Oxoid L41) 2,0
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 10,00
Hefeextrakt (Difco) 10,00
Glycerin 35,00
L-Leucin 0,625
MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,5
CaCl&sub2; · 2H&sub2;O 0,03
Thiamin 0,008
FeSO&sub4;/Citronensäure 0,04/0,02
Spurenelementlösung (TES) 0,5 ml 1&supmin;¹
Tetracyclin 10 mg 1&supmin;¹
Die Fermentationen wurden dann bei einer Temperatur von 37ºC und einem pH- Wert durchgeführt, der durch die automatische Zugabe von 6 M Natriumhydroxidlösung bei pH 6, 7 reguliert wurde. Der Partialdruck-Sollwert des gelösten Sauerstoffs (dOT) entsprach 50% Luftsättigung und wurde anfangs durch automatische Einstellung der Rührergeschwindigkeit des Fermenters reguliert. Der einem Volumenteil pro Volumen pro Minute (VVM) entsprechende Luftstrom in den Fermenter, anfangs 201/min. wurde auf 50 l/min (2,5 VVM) erhöht, wenn die Rührergeschwindigkeit des Fermenters 80-90% ihres Maximums erreichte. Da die Sauerstofftransferrate (OTR) der Fermenter die Sauerstoffaufnahmerate (OUR) der Bakterien bei einer Zelldichte, die größer war als die einem OD&sub5;&sub5;&sub0;-Wert von 50 unter den beschriebenen Bedingungen entsprechenden Dichte, nicht erreichen konnte, wurde der dOT- Wert im Fermenter bei Zelldichten, die größer waren als diese, durch Begrenzung der Sauerstoffaufnahmerate der Bakterien bei 50% Luftsättigung gehalten. Dies wurde erreicht, indem das Medium so formuliert wurde, daß es bei einem OD&sub5;&sub5;&sub0;-Wert von 50 hinsichtlich der Kohlenstoffversorgung begrenzend wird, und im Anschluß daran Beschickungsmaterial der begrenzenden Kohlenstoffquelle zusammen mit Ammoniumsulfat und Hefeextrakt in einer Rate verabreicht wurde, die die Bakterienvermehrungsrate begrenzt.
Die Fermentationen wurden 18 Stunden durchgeführt, und während dieses Zeitraums wurden Proben zur Bestimmung der optischen Dichte (OD55&sub0;), des Zelltrockengewichts und der Anreicherung des menschlichen [Arg¹¹, Ser17,27,60,65] G-CSFs innerhalb der Zellen entnommen. Die Anreicherung des menschlichen [Arg¹¹, Ser17,27,60,65] G-CSFs wurde durch Scannen von mit Coomassie-Blau gefärbten SDS-PAGE-Gelen ganzer Zellysate der entnommenen Bakterien gemessen, wie auf dem Fachgebiet gut bekannt ist.
Erreichte der OD&sub5;&sub5;&sub0;-Wert einen Wert von 35 (8,5 Stunden), wurde Caseinhydrolysatlösung (100g/l Oxzoid L41) in die Fermenter in einer Rate von 0,75 g/l/Std. gepumpt.
Erreichte der OD&sub5;&sub5;&sub0;-Wert einen Wert von etwa 50, erschöpfte sich die Verfügbarkeit der Kohlenstoffquelle in dem Fermentationsbatch, was eine schnelle Erhöhung des dOT Werts über Luftsättigung zur Folge hatte. Zu diesem Zeitpunkt wurde ein Glycerin (470 g/l), Hefeextrakt (118 g/l) und Ammoniumsulfat (118 g/l) enthaltendes Beschickungsmaterial in die Fermenter in einer Rate gepumpt, die den dOT-Wert wieder zurückführte und dann bei 50% Luftsättigung hielt, wobei der Fermenter bei ca. 70-80% seines Maximums gerührt wurde. Die Caseinhydrolysat-Zuführ wurde die ganze Zeit über bei 0,75 g/l/Std. gehalten. Nach etwa 18 Stunden, wenn die mikroskopische Untersuchung der Kultur das Vorhandensein großer Einschlußkörper in der Mehrzahl der Zellen zeigte, wurden die Bakterien in einer Sorvall RC3B-Zentrifuge geerntet (7000 · g, 30 Minuten, 4ºC) und bei -80ºC im gefrorenen Zustand gelagert.

c) Reinigung

Die Reinigung wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 1(f) durchgeführt.

Beispiel 13

Herstellung eines menschlichen [Arg¹¹, Ser17,27,60,65] G-CSFs unter Verwendung eines Produktionsvektors, der den T7A3-Promotor enthält

a) Ein EcoRI-SalI-Fragment, enthaltend den T7A3-Promotor, eine trp-Leader-Ribosomen-Bindungsstellensequenz und ein Gen für [Ser17,27]hu G-CSF, wurde in M13mp18 gemäß der Beschreibung in Teil d) von lBeispiel 1 subcloniert. Die Sequenz des EcoRI-SalI-Fragments ist in SEQ ID No. 50 und Fig. 3 angegeben. SEQ ID No. 50 weist die EcoRI-Restriktionsstelle (Nucleotide 1-6), die A3-Promotorsequenz des Bakteriophagen T7 (Nucleotide 7- 52), die trp-Leader-Ribosomen-Bindungsstellensequenz (Nucleotide 53-78) und das Translations-Initiationscodon (Nucleotide 79-81) auf. Fig. 3 gibt die Nucleotidsequenz eines menschlichen [Ser17,27] G-CSFs an, die an der SalI-Restriktionsstelle endet. Es ist erkennbar, daß das 3'-terminale ATG-Codon von SEQ ID No. 50 dem ACT-Codon unmittelbar vorausgeht, das in Fig. 3 Threonin (Aminosäure 1) codiert. Die 5'-Nucleotidsequenz AATTCAGT fehlt folglich in dem EcoRI-SalI-Fragment. Das EcoRI-SalI-Fragment kann auch durch Ausschneiden aus pICI1295 hergestellt werden (vgl. Referenzbeispiel 7). Die ortsspezifische Mutagenese wurde mit einzelsträngiger DNA gemäß der Beschreibung in Referenzbeispiel 2 unter Verwendung des Oligonucleotids SEQ ID No. 28 durchgeführt, um das Codon für Gln in Position 11 in Arg umzuwandeln. Aus einem Plaque, der den Gln¹¹ -> Arg¹¹-Austausch enthielt, wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 3 doppelsträngige RF-DNA präpariert, außer daß bei Schritt B3 die Inkubation statt 5 Stunden 3 Stunden dauerte und daß mit EcoRI (wie zuvor beschrieben) und SnaBI (wie in Referenzbeispiel 5 beschrieben) gespalten wurde. Das so erhaltene 144 bp große EcoRI-SnaBI-Fragment, das den T7A3-Promotor, die trp- Leader-Ribosomen-Bindungsstellensequenz und das Genfragment mit dem Arg¹¹-Codon enthielt, wurde isoliert und mit einem mit EcoRI und SnaBI aus pICI1327 (der Codons für Ser&sup6;&sup0; und Ser&sup6;&sup5; enthält und in Beispiel 12 beschrieben ist) ausgeschnittenen Vektor ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation des E. coli-Stamms MSD-522 verwendet, und die Transformanten wurden hinsichtlich des Wachstums auf Tetracyclin (15 ug/ml.g) enthaltenden L-Agarplatten selektiert. Die Plasmid-DNA aus einer Kolonie, die den erwarteten T7A3-Promotor und die [Arg¹¹, Ser17,27,60,65]hu G-CSF-Gensequenz enthielt, wurde durch DNA-Sequenzierung in dem isolierten Plasmid nachgewiesen und als pICI1386 bezeichnet.
Die Fermentation wurde gemäß den zwei nachstehenden alternativen Verfahren (b) und (c) durchgeführt. Verfahren (b) wurde bei 37ºC durchgeführt und nach einer 16-stündigen Fermentation gemäß der angegeben Beschreibung betrug die Biomasse der Mikroorganismen 35 g/l, und es wurde annähernd berechnet, daß der menschliche [Arg¹¹, Ser17,27,60,65] G-CSF in der Fermentationsbrühe bis zu einer Menge von 7 g/l anreichert wird. Verfahren (c) wurde bei 30ºC durchgeführt, und die Fermentation lief aufgrund der niedrigeren Fermentierungstemperatur entsprechend langsamer ab. Im Hinblick auf Verfahren (c) betrug die Biomasse der Mikroorganismen nach 35 Stunden 55 g/l und für die Ausbeute an menschlichem [Arg¹¹, Ser17,27,60,65]G-CSF wurde annähernd berechnet, daß er bis zu einer Menge von 15 g/l in der Fermentationsbrühe angereichert wird.
b) Der vom E. coli Genetic Stock Centre erhaltene E. coli-Stamm CGSC 6300 (Genotyp F&supmin;, λ&supmin;, lac&spplus;) wurde mit Plasmid pICI1386 transformiert. Der so erhaltene Stamm CGSC 6300 (pICI1386) wurde gereinigt und in Glycerin-Stammlösungen bei -80ºC aufbewahrt. Ein Aliquot der Kultur wurde aus der Stammlösung entnommen und auf Tetracyclin enthaltenden L-Agarplatten ausgestrichen, um einzelne Kolonien nach der Züchtung über Nacht (16 Stunden) bei 37ºC abzutrennen.
Eine einzelne Kolonie von CGSC 6300 (pICI 1386) wurde entnommen und in 10 ml L-Tetracyclin-Brühe resuspendiert, und je 100 ul davon wurden unmittelbar zum Beimpfen von zwanzig 250ml Erlenmeyerkolben verwendet, die 75 ml L-Tetracyclin-Bruhe enthielten. Nach 16-stündiger Züchtung bei 37ºC in einer Schüttelvorrichtung wurden die Inhalte der Kolben vereinigt und zum Beimpfen eines 20 Liter modifiziertes LCM50-Wachstumsmedium enthaltenden Fermenters verwendet. Die Zusammensetzung des Wachstumsmediums ist in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1: Zusammensetzung des Wachstumsmedium

Modifiziertes LCM50-Wachstumsmedium (A)
hergestellt aus destilliertem Wasser KH&sub2;PO&sub4; 3,0
Na&sub2;HP0&sub4; 6,0
NaCl 0,5
Caseinhydrolysat (Oxoid L41) 2,0
(NH&sub4;)2SO&sub4; 10,0
Hefeextrakt (Difco) 20,0
Glycerin 35,0
MgSO&sub4; · 7H,0 0,5
MgSO&sub4; · 2 H&sub2;O 0,03
Thiamin 0,008
FeSO&sub4;/Citronensäure 0,04/0,02
Spurenelementlösung (TES) (0,5 ml 1&supmin;¹)
Tetracyclin (10 mg 1&supmin;¹)
Die Fermentation wurde dann bei einer Temperatur von 37ºC und einem pH-Wert durchgeführt, der durch die automatische Zugabe von 6 M Natriumhydroxidlösung bei pH 6, 7 reguliert wurde. Der Partialdruck-Sollwert des gelösten Sauerstoffs (dOT) entsprach 50% Luftsättigung und wurde anfangs durch automatische Einstellung der Rührergeschwindigkeit des Fermenters reguliert. Der einem Volumenteil pro Volumen pro Minute (VVM) entsprechende Luftstrom in den Fermenter betrug anfangs 20 l/min und wurde manuell auf 45 1/min erhöht, wenn die Rührergeschwindigkeit des Fermenters ihr Maximum (1000 Upm) erreichte. Die Fermentation wurde 16 Stunden durchgeführt und während dieses Zeitraums wurden Proben zur Bestimmung der optischen Dichte der Kultur (OD&sub5;&sub5;&sub0;), der Biomasse konzentration, der Gesamtkonzentration an mikrobiellem Protein und der Anreicherung des menschlichen [Arg¹¹, Ser17,27,60,65] G-CSFs innerhalb der Bakterienzellen entnommen. Die Anreicherung wurde durch Scannen von mit Coomassie-Blau gefärbten SDS-PAGE-Gelen ganzer Zellysate der entnommenen Bakterien gemessen, wie auf dem Fachgebiet gut bekannt ist. Die Gesamtkonzentration an mikrobiellem Protein wurde durch das Verfahren von Lowry annähernd berechnet. Eine Hefeextraktlösung (225 g/l) wurde 4, 5 Stunden nach der Beimpfung in einer Rate von 1,7 g/l/Std. in den Fermenter gepumpt.
Wenn sich die Verfügbarkeit der Kohlenstoffquelle (Glycerin) im Wachstumsmedium erschöpfte, erhöhte sich der dOT-Wert rasch über 50% Luftsättigung. Zu diesem Zeitpunkt wurde ein Glycerin (714 g/l) und Ammoniumsulfat (143 g/l) enthaltendes Beschickungsmaterial hineingepumpt. Da die bakterielle Sauerstoff/Sulfat-Rate (OUR) sich der maximalen Sauerstofftransferrate (OTR) des Fermenters näherte, gerade bevor die Kohlenstoffquelle im Wachstumsmedium des Batches begrenzend wurde, wurde das Beschickungsmaterial in den Fermenter in einer Rate gepumpt, die den bakteriellen OUR-Wert auf etwa 80-90% des OTR-Maximalwerts des Fermenters begrenzte. Die Eintragsmenge wurde manuell zurückgeführt und der dOT-Wert dann unter den beschriebenen Bedingungen bei 50% Luftsättigung gehalten.
c) Das in (b) beschriebene Fermentationsverfahren wurde erneut durchgeführt, aber bei einer Temperatur von 30ºC für 35 Stunden. Bis auf die Fermentierungstemperatur von 30ºC waren das Medium und die Fermentationsbedingungen mit den in (b) beschriebenen identisch.
d) Die Reinigung wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 1(f) durchgeführt.

Beispiel 14

Herstellung von [Glu¹&sup5;, Ser17,27, Ala26,28, Arg³&sup0;]hu G-CSF

Die mutagene Matrize Ml3mpl8, die das Gen für [Glu¹&sup5;, Ser17,27], Ala26,28, Lys³&sup0;]-hu G-CSF enthält, wurde gemäß der Beschreibung in Teil (d) von Beispiel 1 hergestellt, wobei das Plasmid pICI1266 das Plasmid pICI1080 ersetzte. Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung der vorstehenden Matrize zusammen mit dem als SEQ ID No. 37 bezeichnet mutagenen Oligonucleotid erneut durchgeführt. Auf diese Weise wird das Codon für Lys in Position 30 in Arg umgewandelt. Aus einem Phagen, der den gewünschten Austausch enthielt, wurde doppelsträngige RF-DNA präpariert. Eine EcoRI- SalI-Expressionskassette wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 12 isoliert und in pICI0080 cloniert, wobei pICI1343 erhalten wurde.
Die weiteren Verarbeitungsschritte zum Erhalt der Titelverbindung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 3 durchgeführt, und die Reinigung wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 6 durchgeführt.

Beispiel 15

Herstellung von [Arg11,23 Ser17,27,60,65]]hu G-CSF

Die mutagene Matrize M13mp18, die das Gen für [Arg¹¹, Ser17,27,60,65]hu G-CSF enthält, wurde gemäß der Beschreibung in Teil (d) von Beispiel 1 hergestellt, wobei Plasmid pICI1239 das Plasmid pICI1080 ersetzte. Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung der vorstehenden Matrize zusammen mit dem als SEQ ID No. 38 bezeichneten mutagenen Oligonucleotid erneut durchgeführt. Auf diese Weise wird das Codon für Lys in Position 23 in Arg umgewandelt. Aus einem Phagen, der den gewünschten Austausch enthielt, wurde doppelsträngige RF-DNA präpariert, und die Expressionskassette wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 14 isoliert und cloniert, wobei pICI1388 erhalten wurde.
Die weiteren Verarbeitungsschritte zum Erhalt der Titelverbindung und die Reinigung der Titelverbindung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 16

Herstellung von [Arg¹¹, Ser17,27,60,65]hu G-CSF
Das in Beispiel 15 beschriebene Verfahren wurde erneut durchgeführt, wobei das als SEQ ID No. 38 bezeichnete Oligonucleotid durch SEQ ID No. 39 ersetzt wurde (dieses dient dazu, das Codon für Lys in Position 34 in Arg umzuwandeln), wobei pICI1389 erhalten wurde.
Die weiteren Verarbeitungsschritte zum Erhalt der Titelverbindung und die Reinigung der Titelverbindung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 17.

Herstellung von [Arg11,40 Ser17,27,60,65]hu G-CSF

Das in Beispiel 15 beschriebene Verfahren wurde erneut durchgeführt, wobei das als SEQ ID No. 38 bezeichnete Oligonucleotid durch SEQ ID No. 40 ersetzt wurde (dieses dient dazu, das Codon für Lys in Position 40 in Arg umzuwandeln), wobei pICI1390 erhalten wurde.
Die weiteren Verarbeitungsschritte zum Erhalt der Titelverbindung und die Reinigung der Titelverbindung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 18

Herstellung von [Ala¹, Thr³, Tyr&sup4;, Arg5,11, Ser17,27,60,65]hu G-CSF

Das in Beispiel 15 beschriebene Verfahren wurde erneut durchgeführt, wobei das als SEQ ID No. 38 bezeichnete Oligonucleotid durch SEQ ID No. 41 ersetzt wurde (dieses dient dazu, die Codons für Thr, Leu. Gly und Pro in den Positionen 1, 3, 4 bzw. 5 in Ala, Thr, Tyr bzw. Arg umzuwandeln), wobei pICI1391 erhalten wurde.
Das Polypeptid dieses Beispiels veranschaulicht, daß die erfindungsgemäße Modifizierung auf ein Polypeptid, von dem bekannt ist, daß es G-CSF-Aktivität aufweist, zur Verbesserung der Lösungsstabilität des Polypeptids angewendet werden kann. Das bekannte Peptid ist [Ala¹¹, Thr³, Tyr&sup4;, Arg5,11, Ser17,27,60,65]G-CSF, das in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 272,703 von Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., beschrieben wird.
Die weiteren Verarbeitungsschritte zum Erhalt der Titelverbindung und die Reinigung der Titelverbindung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 19

Herstellung von [Arg¹¹, Ser17,27]hu G-CSF

Das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren wurde erneut durchgeführt, wobei das als SEQ ID No. 30 bezeichnete Oligonucleotid durch SEQ ID No. 28 ersetzt wurde (dieses dient dazu, das Codon für Gln in Position 11 in Arg umzuwandeln). Die Expressionskassette wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 14 in das Expressionsplasmid pICI0080 anstelle von pICI0020 übertragen, wobei pICI1405 erhalten wurde.
Die weiteren Verarbeitungsschritte zum Erhalt der Titelverbindung und die Reinigung der Titelverbindung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 20

Herstellung von [Ser17,27,60,65]hu G-CSF

Das in Beispiel 19 beschriebene Verfahren wurde erneut durchgeführt, wobei das als SEQ ID No. 28 bezeichnete Oligonucleotid durch SEQ ID No. 29 ersetzt wurde (dieses dient dazu, die Codons für Pro in den Positionen 60 und 65 in Ser umzuwandeln), wobei pICI1400 erhalten wurde.
Die weiteren Verarbeitungsschritte zum Erhalt der Titelverbindung und die Reinigung der Titelverbindung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 21

Herstellung von [Arg¹¹, Ser17,27,60]hu G-CSF

Das in Beispiel 6 beschriebene Verfahren wurde erneut durchgeführt, wobei die als SEQ ID No. 33 und SEQ ID No. 34 bezeichneten Oligonucleotide durch SEQ ID No. 28 bzw. SEQ ID No. 42 ersetzt wurden. Diese dienen dazu, die Codons für Gln in Position 11 und Pro in Position 60 in Arg bzw. Ser umzuwandeln. Die Expressionskassette wurde in das Expressionsplasmid pICI0080 anstelle von pICI0020 übertragen, wobei pICI1401 erhalten wurde.
Die weiteren Verarbeitungsschritte zum Erhalt der Titelverbindung und die Reinigung der Titelverbindung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 22

Herstellung von [Arg¹¹, Ser17,27,65]hu G-CSF

Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde erneut durchgeführt, wobei das als SEQ ID No. 29 bezeichnete Oligonucleotid durch SEQ ID No. 43 ersetzt wurde (dieses dient dazu, das Codon für Pro in Position 65 in Ser umzuwandeln), wobei pICI1418 erhalten wurde.
Die weiteren Verarbeitungsschritte zum Erhalt der Titelverbindung und die Reinigung der Titelverbindung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 23

Herstellung von [Ser17,27,60]hu G-CSF

Das in Beispiel 19 beschriebene Verfahren wurde erneut durchgeführt, wobei das als SEQ ID No. 28 bezeichnete Oligonucleotid durch SEQ ID No. 42 ersetzt wurde (dieses dient dazu, das Codon für Pro in Position 60 in Ser umzuwandeln), wobei pICI1402 erhalten wurde.
Die weiteren Verarbeitungsschritte zum Erhalt der Titelverbindung und die Reinigung der Titelverbindung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 24

Herstellung von [Ser17,27,65]]hu G-CSF

Das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren wurde erneut durchgeführt, wobei das als SEQ ID No. 30 bezeichnete Oligonucleotid durch SEQ ID No. 43 ersetzt wurde (dieses dient dazu, das Codon für Pro in Position 65 in Ser umzuwandeln), wobei pICI1420 erhalten wurde.
Die weiteren Verarbeitungsschritte zum Erhalt der Titelverbindung und die Reinigung der Titelverbindung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 25

Herstellung von [Arg¹¹, Glu15,111, Ser17,27,60,65,115,116 ,Ala26,28, Lys³&sup0;]hu G-CSF

Das in Beispiel 8 beschriebene Plasmid pICI1348 wurde mit XbaI in Puffer M und dann mit SalI in Puffer H gespalten, und das große XbaI-SalI-Vektorfragment wurde aus einem 0,7%igen Agarosegel isoliert, wie zuvor beschrieben. Das in Beispiel 4 beschriebene Plasmid pICI1243 wurde mit XbaI und SalI gespalten, wie zuvor beschrieben, und das kleine XbaI-SalI-Fragment wurde aus einem 0,7%igen Agarosegel isoliert und mit dem vorstehenden XbaI-SalI-Vektorfragment ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation des E. coli-Stamms MSD-522 verwendet, und die Transformanten wurden hinsichtlich des Wachstums auf Ampicillin (50 ug/ml) enthaltenden L-Agarplatten selektiert. Drei Kolonien wurden auf die Expression des Proteins gemäß der Beschreibung in Beispiel 12 durchmustert, aber Tetracyclin wurde durch Ampicillin in einer Konzentration von 50 ug/ml ersetzt. Die Plasmid-DNA aus der einer Kolonie, die das richtige Protein experimentierte, wurde als pICI1421 bezeichnet.
Die weiteren Verarbeitungsschritte zum Erhalt der Titelverbindung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 3 durchgeführt, und die Reinigung wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 6 durchgeführt.

Beispiel 26

Herstellung von [Arg11,165, Glu¹&sup5;, Ser17,27,60,65, Glu26,28, Lys30,58]hu G-CSF

Die mutagene Matrize M13mp18, die das Gen für [Arg¹¹, Glu¹&sup5;, Ser17,27,60,65, Ala26,28, Lys³&sup0;]hu G-CSF enthält, wurde gemäß der Beschreibung in Teil (d) von Beispiel 1 hergestellt, wobei Plasmid pICII 348 (beschrieben in Beispiel 8) das Plasmid pICI1080 ersetzte. Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung der vorstehenden Matrize erneut durchgeführt, wobei die als SEQ ID No. 28 und SEQ ID No. 29 bezeichneten mutagenen Oligonucleotide durch SEQ ID No. 44 und SEQ ID No. 32 ersetzt wurden (diese dienen dazu, die Codons für Trp in Position 53 in Lys und Tyr in Position 165 in Arg umzuwandeln), wobei pICI1422 erhalten wurde.
Die weiteren Verarbeitungsschritte zum Erhalt der Titelverbindung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 3 durchgeführt, und die Reinigung wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 6 durchgeführt.

Beispiel 27

Herstellung von [Arg¹¹, Glu¹&sup5;, Ser17,27,60,65 Ala26,28,44,51,55, Lys30,49,58]hu G-CSF

Gemäß der Beschreibung in Beispiel 26 wurde eine mutagene Matrize hergestellt. Das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung der vorstehenden Matrize erneut durchgeführt, wobei das als SEQ ID No. 30 bezeichnete mutagene Oligonucleotid durch SEQ ID No. 45 ersetzt wurde (dieses dient dazu, die Codons für Pro in Position 44. Leu in Position 49 und Gly in den Positionen 51 und 55 in Ala, Lys, Ala bzw. Ala umzuwandeln), wobei pICI1423 erhalten wurde.
Die weiteren Verarbeitungsschritte zum Erhalt der Titelverbindung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 3 durchgeführt, und die Reinigung wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 6 durchgeführt.

Beispiel 28

Herstellung von [Arg11,165, Glu15,111, Ser17,27,60,65,115,116 Ala26,28,44,51,55, Lys30,49,58]hu G-CSF

Gemäß der Beschreibung in Teil (d) von Beispiel 1 wurde eine mutagene Matrize hergestellt, wobei pICI1080 durch das in Beispiel 27 beschriebene pICI1423 ersetzt wurde. Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung der vorstehenden Matrize erneut durchgeführt, wobei die als SEQ ID No. 28 und SEQ ID No. 29 bezeichneten Oligonucleotide durch SEQ ID No. 32 und SEQ ID No. 30 zum Erhalt von pICI1424 ersetzt wurden.
Die weiteren Verarbeitungsschritte zum Erhalt der Titelverbindung wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 3 durchgeführt, und die Reinigung wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 6 durchgeführt.

Referenzbeispiel 1

Herstellung eines menschlichen G-CSFs

a) Herstellung eines synthetischen Gens für einen menschlichen G-CSF

Ein DNA-Sequenz (Fig. 2), die die Aminosäuresequenz des Polypeptids von Fig. 2 (menschlicher G-CSF) codiert, wurde im Einklang mit den folgenden Überlegungen konstruiert:
1) Einzelsträngige kohäsive Enden, um die Ligierung in geeignete Stellen in ein Plasmid zu erlauben.
2) Eine Reihe von Restriktionsendonuclease-Sequenzen im ganzen Gen zur Erleichterung der späteren genetischen Manipulation.
3) Ein Translations-Terminationscodon; und
4) die Codons am 5'-Ende des codierenden Bereichs wurden üblicherweise so gewählt, daß sie A/T-reich sind. Die anderen Codons wurden üblicherweise nach solchen Gesichtspunkten ausgewählt, die zur Expression in E. coli bevorzugt werden. Das Gen wurde aus 18 Oligonucleotiden zusammengesetzt, die als SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 18 bezeichnet wurden und nachstehend gezeigt werden.

Herstellung der Uligonucleotide

Die nachstehend gezeigten Oligonucleotidsequenzen wurden mit einem Applied Biosystems 380A-DNA-Synthetisiergerät aus 5'-Dimethoxytrityl-Basen-geschützten Nucleosid-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramiditen und geschützten Nucleosiden, die an Glasträgern mit kontrollierter Porengröße in einem 0,2-Mikromol-Maßstab gebunden waren, gemäß den von Applied Biosystems Inc. gelieferten Protokollen hergestellt.
Alternativ können die Oligonucleotidsequenzen durch manuelle Verfahren hergestellt werden, wie von Atkinson und Smith in "Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach" (Gait M. T., Hrsg., IRL-Press, Oxford, Washington DC, 35-81) beschrieben ist. Die Herstellung der Oligonucleotidsequenzen unter Verwendung des Applied Biosystems 380A-DNA- Synthetisiergeräts wurde im einzelnen wie folgt durchgeführt:
Jedes Oligonucleotid wurde nach Abspaltung von dem festen Träger und Entfernung aller Schutzgruppen in Wasser (1 ml) gelöst. Eine Lösung von 3 M Natriumacetat (pH 5,6, 40 ul) und Ethanol (1 ml) wurde zu den Oligonculeotidlösungen (400 ul) zugegeben, und die Gemische wurden 20 Stunden bei -70ºC gelagert. Die so erhaltenen Präzipitate wurden durch Zentrifugation (13 000 Upm, 10 Minuten) gewonnen, und die Pellets wurden mit Ethanol:Wasser (7 : 3) (200 ul) gewaschen, dann unter vermindertem Druck kurz getrocknet und in Wasser (15 ul) und 10 ul eines Formamid/Farbstoff Gemisches (10 mM NaOH; 0,5 mM EDTA, 0,01% Bromphenolblau, 0,01% Xylolcyanol und 80% Formamid) gelöst.
Die Oligonucleotide wurden in einem 10%igen Polyacrylamidgel in 8,3 M Harnstoff enthaltendem 50 mM Tris-Borat (pH 8,3) gereinigt. Oligonucleotide mit der richtigen Länge wurden durch UV-Abschattung (Narang et al. in Methods in Enzymology, Bd. 68 (1979), 90-98) identifiziert, aus dem Gel ausgeschnitten (normalerweise die stärkste Bande) und in 5 mM Tris-Borat (pH 8,3) 3-4 Stunden bei 300 mV elektroeluiert. Die wäßrigen Lösungen wurden durch die Behandlung mit n-Butanol auf etwa 200 ul konzentriert (Mischen, Zentrifugieren und Entfernen der oberen organischen Schicht). Die gereinigten Oligonucleotide wurden 20 Stunden bei -70ºC aus einer 0,3 M Natriumacetatlösung durch Zugabe von Ethanol (2.5 Volumenteile) ausgefällt.

Genzusammenlagerung

Die Oligonucleotide SEQ ID No. 2 bis SEQ ID No. 17 (je 400 pM) (wie nachstehend definiert) wurden mit T4-Polynucleotidkinase (3,6 Einheiten) 2 Stunden bei 37ºC in 25 ul einer Lösung phosphoryliert, die ATP (800 pM, enthaltend 25 pM γ-³²P-ATP), 100 uM Spermidin, 20 mM MgCl&sub2;, 50 mM Tris-HCl (pH 9,0) und 0,1 mM EDTA enthielt. Die Lösungen wurden zur Beendigung der Umsetzung 5 Minuten bei 100ºC erhitzt und dann in Paaren gemischt, wie in Tabelle 1 gezeigt, wobei die Doppelstränge A bis I erhalten wurden (die Oligonucleotide mit SEQ ID No. 1 und SEQ ID NO. 18 (400 mM in 25 ul) wurden unphosphoryliert verwendet). 0,3 M Natriumacetat (pH 5, 6, 200 ul) und Ethanol (850 ul) wurden zugegeben und die Doppelsträ nge 20 Stunden bei -20ºC ausgefällt. Die so erhaltenen Präzipitate wurden durch Zentrifugation gewonnen und mit Ethanol : Wasser (7 : 3) gewaschen und dann in Wasser (50 ul) gelöst. Die Oligonucleotidpaare wurden aneinandergelagert, indem die Lösungen zuerst 2 Minuten auf 100ºC in einem siedenden Wasserbad erhitzt wurden. Man ließ das Bad sich dann langsam auf 40ºC abkühlen (etwa 4 Stunden). Lösungen, die drei Paare von Doppelsträngen enthielten, wurden wie gezeigt vereinigt (vgl. Tabelle 1), wobei die Gruppen I bis III erhalten wurden, gefriergetrocknet und gelöst in 30ul einer Lösung, enthaltend T4-DNA-Ligase (1 Einheit, BRL), 50 mM Tris (pH 7,6), 10 mM Magnesiumchlorid. 5% (Gew./Vol.) PEG 8000, 1 mM ATP und 1 mM DTT (BRL, Focus, Bd. 8, Nr. 1. Winter 1986), und die DNA wurde 5 Minuten bei 30ºC, gefolgt von 20 Stunden bei 16ºC ligiert. 3 M Natriumacetat (20 ul) und Wasser (150 ul) wurden zugegeben, und das Produkt wurde durch Zugabe von Ethanol (750 ul) und Kühlen auf -20ºC für 20 Stunden ausgefällt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gewonnen und mit Ethanol (1 ml) gewaschen, dann in Wasser (15 ul) und FormamidlFarbstoff Gemisch (10 ul) gelöst und in einem 10%igen Polyacrylamidgel in 50 mM Tris-Borat (pH 8,3), 1 mM EDTA und 8,3 M Harnstoff gereinigt. Banden, die Strängen mit geeigneten Längen (173-186 Basen) entsprachen, wurden durch Autoradiographie identifiziert und gemeinsam durch Elektroelution aus einem einzigen Gelteil isoliert, wie vorstehend für die einzelnen Oligonucleotidsequenzen beschrieben ist. Die DNA-Stränge wurden aneinandergelagert, indem man zuerst eine wäßrige Lösung (50 ul) bei 100ºC 2 Minuten erhitzte und sie dann über einen Zeitraum von 4 Stunden auf 40ºC abkühlen ließ.
Die Gruppen I, II und III wurden miteinander ligiert, im wesentlichen wie für die Herstellung der Gruppe beschrieben wurde, wobei als Produkt die in Fig. 2 gezeigte Gensequenz erhalten wurde. Nach der Fällung wurde das Gen mit T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert, wie zuvor für die einzelnen Oligonucleotide beschrieben wurde, und dann in Wasser (20 ul) gelöst. Tabelle 1
b) Clonierung des synthetischen Gens für einen menschlichen G-CSF Das vorstehend beschriebene synthetische Gen wurde in den Plasmidvektor pSTP 1 (Windass et al., Nucleic Acids Research, Bd. 10 (1983), 6639) cloniert.
Zur Herstellung des Vektors wurden 10 ug STP1 in Wasser (37,5 ul) und 10 · Restriktionspuffer B (4,5 ul) (BCL) gelöst. Die Restriktionsendonuclease SalI (3 ul) (BCL, 8 Einheiten/ul) wurde zugegeben und das Gemisch bei 37ºC 1 Stunde inkubiert, bis das linearisierte Plasmid im Vergleich zu Formen mit Überhelixstruktur und zirkulären Formen mit Einzelstrangbrüchen überwiegte. Die DNA wurde mit Ethanol bei 4ºC 30 Minuten ausgefällt, mit Ethanol : Wasser (7 : 3) gewaschen und dann in Wasser (39,5 ul) und 10 · H-Puffer (4,5 ul) (BCL) gelöst. Die Restriktionsendonuclease EcoRI (1 ul) (BCL, 90 Einheiten/ul) wurde zugegeben und das Gemisch bei 370C 1 Stunde inkubiert, bis das große EcoRI-SalI-Fragment überwiegte. Die DNA wurde 20 Stunden bei -20ºC ausgefällt, mit Ethanol : Wasser (7 : 3) gewaschen und dann in Wasser (20 ul) gelöst.
Das große EcoRI-SalI-Fragment wurde in einem präparativen 1%igen Agarosegel gereinigt, elektroeluiert und ausgefällt, wie zuvor beschrieben, und dann in Wasser (20 ul) gelöst. Zur Ligierung des synthetischen Gens wurde ein Gemisch aus Vektor-DNA (2 ul der EcoRI-SalI-Fragmentlösung), synthetischem Gen (5 ul der zuvor beschriebenen wäßrigen Lösung), 5 · Ligasepuffer (6 ul, 250 mM Tris, pH 7,6, 50 mM MgCl&sub2;, 25% (Gew./Vol.) PEG 8000, 5 mM ATP und 5 mM DTT, von BRL), Wasser (15 ul) und T4-DNA-Ligase (2 ul, 1 E/ul) bei 16ºC 4 Stunden inkubiert. Das DNA-Gemisch wurde direkt (entweder 1 ul des reinen Ligierungsgemisches oder 2 ul Ligierungsgemisch mit Wasser Sfach verdünnt) zur Transformation des E. coli-Stamm s HB 101 verwendet. Das DNA-Gemisch (1 oder 2 ul) wurde zu kompetenten E. coli HB101-Zellen (20 ul, BRL) auf Eis zugegeben und das Gemisch auf Eis 45 Minuten inkubiert und dann bei 42ºC 45 Sekunden einem Wärmeschock unterzogen. Nach 2 Minuten auf Eis wurden 100 ul SOC-Puffer (2% Bactotrypton, 0,5% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 20 mM MgCl&sub2; und 20 mM MgSO&sub4; (je 10 mM) und 20 mM Glucose) zugegeben und das Gemisch 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Aliquots der Suspensionen wurden auf L-Platten mit 50 ul/ml Ampicillin ausplattiert. Die Transformanten wurden hinsichtlich der Anwesenheit des clonierten synthetischen Gens mittels Kolonie-Hybridisierungsanalyse unter Anwendung von in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" von Maniatis et al. (Cold Spring Harbor) und in der GB-Patentanmeldung Nr. 8502605 beschriebenen Standardverfahren durchrnustert. Insgesamt wurden 100 Kolonien auf Filtern (Schleicher und Schuell) ausgestrichen, 20 Stunden bei 37ºC gezüchtet, lysiert und gebacken. Die Filter wurden bei 65ºC 20 Stunden mit einer radioaktiven Sonde hybridisiert, die aus der Oligonucleotidsequenz SEQ ID No. 1 unter Verwendung eines Zufallsmarkierungs-Kits (Pharmacia) hergestellt wrde. Die fünf Kolonien 1-5, die ein positives Hybridisierungssignal ergaben, wurden in L-Brühe bei 37ºC 20 Stunden in einem kleinen Maßstab (100 ml) gezüchtet, und die Plasmid-DNA wurde durch Zentrifugation in einem Cäsiumchloridgradienten präpariert, im wesentlichen wie in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" von Maniatis et al. (Cold Spring Harbor) beschrieben ist.
Die DNA wurde durch das herkömliche Didesoxy-Kettenterminationsverfahren gemäß der Beschreibung von Sanger et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977). 5463- 5467, unter Verwendung eines Sequenase (Warenzeichen)-Kits (United States Biochemical Corporation) sequenziert. Die Oligonucleotide SEQ ID No. 19 bis SEQ ID No. 23 (wie nachstehend definiert und in Tabelle 2 gezeigt) wurden als Sequenzierungs-Primer verwendet. Tabelle 2
Die Plasmid-DNA aus Clon 5 enthielt die in Fig. 2 gezeigte DNA-Sequenz. Das Plasmid (pAG88) wurde zur Transformation von kompetenten Zellen der folgenden E. coli- Stämme durch Standardverfahren verwendet:
HB101; und
CGSC 6300 (nachstehend auch als MSD-522 bezeichnet).
Die E. coli-Stämme HB101 und MSD-522 (CGSC 6300) sind frei zugänglich. So können sie zum Beispiel vom E. coli Genetic Stock Centre, Yale University, USA, erhalten werden. Außerdem kann E. coli HB101 zusätzlich bezogen werden von zum Beispiel BRL, vertrieben von GIBCO Limited, Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, UB8 2YG, Middlesex, England, oder GIBCO Laboratories, Life Technologies Inc., 3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072. USA. Der Genotyp von Stamm HB101 wird im vorstehend erwähnten "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" als Sup E44 hsd S20 (rBmB) rec A 13 ara-14 F&supmin;leu 6 thi-1 proA2 lac Y1 gal K2 rps L20 xyl&supmin;5 mtl&supmin;1 beschrieben. Der Genotvp von MSD-522 (CGSC 6300) wird in Beispiel 13 angegeben.

c) Clonierung des Gens für einen menschlichen G-CSF in einen Expressionsvektor

Das vorstehend beschriebene Gen wurde in das Plasmid pICI0020 gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 (c) cloniert, wobei das Expressionsplasmid pICI1056 erhalten wurde.

d) Fermentation

Das Plasmid pICI1056 wurde transformiert und die Fermentation gemäß der Beschreibung in Beispiel 1(e) durchgeführt, um die Expression des menschlichen G-CSFs zu bewirken.

e) Reinigung

Die Reinigung wurde gemäß der Beschreibung des zum Erhalt großer Mengen von hu G-CSF entwickelten zweiten Reinigungsverfahrens durchgeführt, das auf den Seiten 48 und 49 der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 87/01132 dargelegt ist, wobei die letzte Dialyse gegen phosphatgepufferte Salzlösung durchgeführt wurde.

Referenzbeispiel 2

Herstellung von Genen für Derivate des menschlichen G-CSFs durch ortsspezifische Mutagenese
Es wurde das Phosphorthioatverfahren von Eckstein und Mitarbeitern angewendet:
Taylor J. W. et al., Nucleic Acids Research, Bd. (1985), 8749-8764; Taylor J. W et al., Nucleic Acids Research, Bd. (1985), 8765-878; Nakamaye K. et al., Nucleic Acids Research, Bd. (1986), 9679-9698; und Sayers J. R. et al., Nucleic Acids Research, Bd. (1988), 791-802.
Das Verfahren kann unter Verwendung eines von Amersham International angebotenen Kits durchgeführt werden. Das Verfahren wird nachstehend beschrieben und schließt Änderungen in bezug auf das ursprüngliche Verfahren im Hinblick auf die Verwendung von mehr als einem mutagenen Oligonucleotid und die Inkubationstemperatur für Oligonucleotide mit einer Länge von größer als 30 Basen ein.

1. Anlagerung des mutierten Oligonucleotids an eine Einzelstrang-DNA-Matrize:

Einzelstrang-DNA-Matrize (1 ug/pl) 5 ul
Phosphoryliertes mutagenes Oligonucleotid (1,6 pMol/l ul) 2,5 ul
Puffer 1 3,5 ul
Wasser 6 ul
(bei gleichzeitiger Verwendung von zwei mutagenen Oligonucleotiden wurden 2,5 ul (1,6 pMol/l ul) jedes phosphorylierten Oligonucleotids zu 5 ul Einzelstrang-DNA-Matrize (1 ug/pl) in 3,5 ul Puffer 1 und 3,5 ul Wasser zugegeben. Bei Verwendung von 3 mutagenen Oligonucleotiden wurden 2,5 ul (1,6 pMoUul) jedes phosphorylierten Oligonucleotids zu 5 ul Einzelstrang-DNA (1 ug/pl in 3,5 ul Puffer 1 und 1 ul Wasser) zugegeben). Die vorstehenden Bestandteile wurden in einem verschlossenen Röhrchen 3 Minuten in ein 70ºC warmes Wasserbad gestellt, wenn das OLigonucleotid eine Länge von < 30 Basen aufwies, oder 3 Minuten in ein siedendes Wasserbad, wenn das Oligonucleotid eine Länge von > 30 Basen aufwies. Das Röhrchen wurde dann 30 Minuten in ein 37ºC warmes Wasserbad gestellt.

2. Synthese und Ligierung des mutierten DNA-Strangs

Zu der Aneinanderlagerungsreaktion wurden zugegeben:
MgCl&sub2;-Lösung 5 ul
Nucleotidgemisch 1 (enthält alpha S-dCTP) 19 ul
Wasser 6 ul
Klenow-Fragment (6 Einheiten) 1,5 ul
T4-DNA-Ligase (5 Einheiten) 2 ul
Die vorstehenden Bestandteile wurden in ein 16ºC warmes Wasserbad eingebracht und darin über Nacht belassen.

3. Entfernung der einzelsträngigen (nicht mutierten) DNA unter Verwendung von Einmal-Zentrifugenfiltereinheiten

Zu der Reaktion von Schritt 2 wurden die folgenden Bestandteile zugegeben: Wasser 170 ul
5 M NaCl 30 ul
Die 250 ul-Probe wurde auf die obere Hälfte der Filtereinheit aufgetragen und bei 100 Upm 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer Sorvall RT6000B-Tischzentrifuge unter Verwendung eines Sorvall H1000B-Ausschwingrotors zentrifugiert. Die Probe durchläuft zwei Nitrocellulosemembranen, die die einzelsträngige DNA binden, aber die doppelsträngige DNA in das darunter befindliche Sammelröhrchen hindurchlaufen lassen. 100 ul 500 mM NaCl wurden zugegeben und das Gemisch wurde noch einmal 10 Minuten zentrifugiert, um alle Reste von RF-DNA herauszuwaschen.
Zu dem Filtrat wurden die folgenden Bestandteile zugegeben:
3 M Natriumacetat (pH 6,0) 28 ul
kaltes Ethanol (-20ºC) 700 ul
Das Gemisch wurde 20 Minuten in ein Trockeneis/Ethano1-Bad gestellt und in einer Eppendorf Mikrofuge 15 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde dann in 10 ul Puffer 2 resuspendiert.

4. Einführung von Einzelstrangbrüchen in den nicht mutierten Strang unter Verwendung von NciI

Zu dem Reaktionsgemisch von Schritt 3 wurden 65 ul Puffer 3 und 8 Einheiten NciI (1 ul) zugegeben. Das Gemisch wurde 90 Minuten in ein 37ºC warmes Wasserbad gestellt.

5. Spaltung des nicht mutierten Strangs unter Verwendung von Exonuclease III Zu dem Reaktionsgemisch von Schritt 4 wurden

500 mM NaCl 12 ul
Puffer 4 10 ul
Exonuclease III (50 Einheiten) 2 ul
zugegeben. Das Gemisch wurde in ein 37ºC warmes Wasserbad gestellt und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert (50 Einheiten Exonuclease III spalten etwa 3000 Basen in 30 Minuten). Das Gemisch wurde dann 15 Minuten in ein 70ºC warmes Wasserbad gestellt, um die Enzyme zu inaktivieren.

6. Repolymerisierung und Ligierung der Lücken aufweisenden DNA

Zu dem Reaktionsgemisch von Schritt 5 wurden
Nucleotidgemisch 2 13 ul
MgCl&sub2;-Lösung 5 ul
DNA-Polymerase I (4 Einheiten) 1 ul
T4-DNA-Ligase (2,5 Einheiten) 1 ul
zugegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden in ein 16ºC warmes Bad gestellt.
7. Transformation von kompetenten E. coli TG1-Wirtszellen mit der DNA
300 ul frisch hergestellte kompetente E. coli TG1-Zellen (hergestellt gemäß dem Verfahren von Mandel und Higa) wurden mit 20 ul des Reaktionsgemisches von Schritt 6 transformiert (in doppelter Ausfertigung).
Die Transformanten wurden auf einem Rasen von in der logarithmischen Phase befindlichen TG1-Zellen in TY-Deckagar auf TY-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert.
Der E. coli-Stamm TG1 ist zum Beispiel vom E. coli Genetic Stock Centre, Yale University, USA, und von Amersham International Plc, Amersham Place, Little Chalfont, Amersham, Buckinghamshire HP7 9NA, England, wie in ihrem Oligonucleotid-gerichteten "In vitro"-Mutagenesesystem-Kit (Produktcode RPN 1523) angeboten, frei zugänglich.

Referenzbeispiel 3

G-CSF-Biotest
Die faktorabhängige Zellinie Paterson-G-CSF (FDCP-G), die vom Paterson Institute, Manchester, England, erhalten wurde, wurde mittels Grenzverdünnungsverfahren in Gegenwart von G-CSF cloniert. Ein auf G-CSF antwortender Clon, der als Clon E7 bezeichnet wurde, wurde zum Nachweis der Aktivität des rekombinanten menschlichen G-CSFs verwendet. 2,5 Y 10 FDCP-G-Clon E7-Zellen in 100 ul RPMI 1640 + 10% FCS wurden zu einem gleichen Volumenteil von G-CSF enthaltendem RPMI 1640 + 10% FCS zugegeben. Jede G-CSF-Probe wurde über 10 doppelte Verdünnungen gemessen. Das Endvolumen von RPMI 1640 (vgl. Moore G. E. et al., JAMA 199 (1967), 519) + 10% FCS (fötales Kälberserum) in jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen betrug 200 ul. Die Mikrotiterplatte wurde bei 37ºC in 5% CO&sub2; in einem Brutschrank mit befeuchteter Atmosphäre 4 Tage inkubiert. 1,0 uCl Tritium-markiertes Thymidin wurden pro Vertiefung zugegeben und während den letzten Ei Stunden mitinkubiert. Die Zellen wurden auf Glasfaser- Filterpapier geerntet, und die Radioaktivitätsmenge wurde durch Flüssigszintillationszählung bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die Einbaurate des Tritium-markierten Thymidins direkt proportional zu der vorhandenen Menge an G-CSF ist. Der FDCP-G-Clon E7-Test wurde unter Verwendung eines rekombinanten menschlichen G-CSFs kalibriert, der von Amersham International mit einer angegebenen spezifischen Aktivität von 10&sup8; Einheiten/mg Protein erhalten wurde.
Die Wirksamkeit der G-CSF-Proben wurde durch den Vergleich mit einem Standard bekannter Aktivität bestimmt.
Die Einheiten der G-CSIF-Aktivität pro ml wurden gemäß der folgenden Formel berechnet:

Referenzbeispiel 4

Lösungsstabilität des G-CSFs und von Derivaten davon

Geeignete Verdünnungen der in Beispiel 9 beschriebenen Stammlösung von G-CSF und den Derivaten in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) wurden bei 4ºC auf ihre Lösungsstabilität untersucht. Lösungen von 1 mg/ml, 5 mg/ml und zuweilen 10 mg/ml Protein in PBS wurden bei 37ºC 14 Tage inkubiert. Die Lösungen wurden in regelmäßigen Abständen visuell auf Anzeichen einer Ausfällung überprüft. Nach 14 Tagen wurde jede Lösung bei 14 000 Upm 20 Minuten zentrifugiert, der Überstand durch Dekantieren entfernt und das Pellet in 1% (Gew./Vol.) N-Lauroylsarcosin enthaltender PBS wieder gelöst. Der Proteingehalt insgesamt in jedem Überstand und in dem wieder gelösten Präzipitat wurde durch A&sub2;&sub8;&sub0;-Messungen annähernd abgeschätzt, und der Monomergehalt in jedem wurde mittels Umkehrphasen-HPLC annähernd berechnet. Diese Werte wurden als Prozentsatz der entsprechenden Daten ausgedrückt, die von den Lösungen zu Beginn der Inkubation und von einer 1 mg/ml-Lösung, die bei 4ºC 14 Tage inkubiert wurde, erhalten wurden. Variationen zwischen den Gesamtprotein- umd Monomerabschätzungen wurden nur bei einigen der wieder gelösten Pellets beobachtet. Der in Lösung bleibende Prozentsatz an Protein in den Überständen einer jeden Ausgangskonzentration ist in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Es wurde gezeigt, daß die spezifische Aktivität des Produkts in jedem Überstand nach der Inkubation die gleiche wie in der Ausgangslösung ist, und bei einer SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen wurden keine Unterschiede beobachtet.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
*: In Lösung bleibender Prozentsatz in PBS nach 14 Tagen bei 37ºC (nachgewiesen durch UV, Werte durch HPLC erhältlich);
nd bedeutet: nicht durchgeführt;
[Met&supmin;¹, Ser17]hu G-CSF kann gemäß der Beschreibung in Referenzbeispiel 5 erhalten werden.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Modifikationen die Lösungsstabilität ohne Verlust der G-CSF-Aktivität verbessern; [Met&supmin;¹, Ser¹&sup7;]hu G-CSF in einer Konzentration von 5 mg/ml begann innerhalb von 3 Stunden auszufallen.

Referenzbeispiel 5

Herstellung von [Ser¹&sup7;]hu G-CSF

Das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren zur Herstellung von [Met&supmin;¹, Ser17,27]hu G-CSF wurde mit den folgenden Ausnahmen erneut durchgeführt:
1) Der Doppelstrang zur Phosphorylierung wurde aus den Oligonucleotidsequenzen SEQ ID Nos. 24, 25, 3 und 4 hergestellt, wobei die Sequenzen SEQ ID Nos. 3 bzw. 4 die in den Beispielen 1 und 2 verwendeten Sequenzen SEQ ID Nos. 26 und 27 ersetzten.
2) Der unter 1) erwähnte Doppelstrang wurde mit T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert, aber mit SnaBI (10 Einheiten) in 1 · M-Puffer (BCL, 30 ul) 2 Stunden bei 37ºC gespalten.
3) Nach der Reinigung mit Ethanol wurde im Gegensatz zu dem 143 bp großen EcoRI- MstII-Fragment das 72 bp große EcoRl-SnaBI-Fragment gereinigt.
4) Das synthetische EcoRI-SnaBI-Fragment wurde gemäß der Beschreibung in Referenzbeispiel 1 in den Plasmidvektor pAG88 cloniert, und pAG88 wurde zur Vektorherstellung mit SnaBI (20 Einheiten, BCL) in I x M-Puffer (BCL, 100 ul) anstelle von MstII in 1 · H-Puffer 2 Stunden bei 37ºC gespalten.
5) Nach der Fällung mit Ethanol wurde im Gegensatz zu dem großen EcoRl-MstII-Fragment das große EcoRl-SnaBl-Fragment in einem 1%igen Agarosegel gereinigt.
6) Das das Gen für [Ser¹&sup7;]hu G-CSF enthaltende Plasmid wurde als pICI1 105 bezeichnet.

Referenzbeispiel 6

Konstruktion von pICI0080
a) Konstruktion von pTB357 (hier auch als pLB004 bezeichnet)
Das Plasmid pTB357 benutzt eine reprimierte Tetracyclin-Resistenzdeterminante, wie sie auf dem natürlich vorkommenden Plasmid vorkommt. Dieses reprimierte System schaltet die Expression des tetA-Gens in Abwesenheit von Tetracyclin ab, während die meisten wirkstoffresistenten Mechanismen eine konstitutive Expression aufweisen.
Der tet-Locus wurde zuerst auf RP4 von Barth und Grinter (J. Mol. Biol. 113 (1977), 455-474) kartiert. Es wurde zeigte, daß er aus benachbarten Genen besteht: tetA, dem Resistenzstrukturgen, und tetR, dem Repressorgen, und dieser Bereich wurde sequenziert (Klock et al., J. Bacteriol. 161 (1985), 326-332). Diese Gene sind auf benachbarten BgIII- SmaI- und SmaI-SmaI-Fragmenten angeordnet. Die BgIII-Stelle kommt in RP4 nur einmal vor, aber es gibt fünf SmaI-Stellen (Lanka, Lurz und Furste, Plasmid 10 (1983), 303-307).

i) Clonierung der tetA- und tetR-Gene

Das Plasmid RP4 ist gut dokumentiert (Datta et al., J. Bacteriol. 108 (1971), 1244) und ist frei zugänglich. Darüber hinaus wurde das Plasmid RP4 bei der National Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London. NW9 5HT, unter den Hinterlegungsnummern 50078 und 50437 hinterlegt. E. coli-Stämme, die dieses Plasmid enthalten, wurden in selektiven Brühe-Kulturen gezüchtet, und die Plasmid-DNA wurde gemäß dem Verfahren von Holmes und Quigley (Holmes und Quigley, Anal. Biochem. 114 (1981), 193-197) iri einem größeren Maßstab isoliert. Sie wurde durch die Behandlung mit 2,5 M Ammoniumacetat deproteiniert und mit Isopropanol wieder ausgefällt. Diese Plasmid-DNA wurde gemäß den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen mit dem Restriktionsenzym BgIII behandelt und vollständig gespalten. Sie wurde dann mit XmaI unter Verwendung des verdünnten Enzyms und kurzen Inkubationszeiten teilweise gespalten. XmaI ist ein Isoschizomer von SmaI, das jedoch kohäsive 4-Nucleotid-Enden an seinen Spaltstellen erzeugt.
Das Vektorplasmid pUCB (Yanisch-Perron, Vieira und Messing, Gene 33 (1985), 103-119) wurde auf ähnliche Weise hergestellt und mit BamHI und XmaI vollständig gespalten. Die RP4-Fragmente wurden durch eine 16-stündige Ligierung mit T4-Ligase bei 12ºC in diesen Vektor cloniert. Dieser wurde zur Transformation von E. coli C600-Zellen verwendet, die durch das Calciumchloridverfahren (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) kompetent gemacht worden waren. Die Kulturen wurden dann auf ein Medium ausplattiert, das hinsichtlich der Tetracyclin-Resistenz selektiv war.
E. coli C600 ist aus zahlreichen Quellen frei zugänglich, einschließlich vielen Kultursammlungen, wie zum Beispiel vom E. coli Genetic Stock Centre, Yale University, USA, unter der Hinterlegungsnummer GCSC-3004. Der Genotyp von E. coli C600 ist K12 thr-1 leuB6 thi-1 hsdSl lacYl tonA2λsupE44.
Mehrere Kolonien mit dieser Resistenz wurden auf den erwarteten Phenotyp überprüft (Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz, aber nicht die für RP4 selbst indikative Kanamycin-Resistenz). Kolonien mit dem richtigen Resistenzen wurden einer Clon-Analyse durch Isolierung der Plasmid-DNA unterzogen (Verfahren von Holmes und Quiglev). Diese Präparationen wurden mit EcoRI und Hindlil gespalten und mittels Gelelektrophorese analysiert. Auf diese Weise wurde die Größe der clonierten Insertion überprüft, für die festgestellt wurde, daß sie die für das BgIII-XmaI-XmaI-Fragment aus RP4 erwartete Größe von 2,45 kb aufwies. Ein Clon, der dieses die tetA- und tetR-Gene enthaltende Fragment trägt, wurde als pTB344 bezeichnet.

ii) Entfernung des tet-Gens aus pAT153

Es war erforderlich, das tet-Gen aus dem Vektorplasmid pATI53 vor der Insertion der tetA + tetR-Kassette aus RP4 zu entfernen, um einer Genverdopplung vorzubeugen, die eine Quelle genetischer Instabilität sein kann. Auch kann das tet-Gen durch das nicht verwandte tetR-Gen nicht wirksam supprimiert werden. Die Entfernung wurde durchgeführt, indem die pAT153-Plasmid-DNA isoliert und mit EcoRI und Aval gespalten wurde. Zwischen diesen Stellen wurden synthetische Oligonucleotide mit der Sequenz SEQ ID No. 59:
cloniert. Diese stimmen mit den kohäsiven EcoRI- und Aval-Enden überein und enthalten zusätzlich SphI-. BamHI- und ClaI-Stellen. Nach der Transformation und Selektion wurden Kolonien hinsichtlich des Verlustes der Tetracyclin-Resistenzdeterminante untersucht. Die Plasmid-DNA aus einem Clon wurde sequenziert, um zu bestätigen, daß die vorhergesagte Sequenz richtig war. Dieses Plasmid wurde als pCH19 bezeichnet.

iii) Insertion der tetA- und tetR-Gene

Die tetA- und tetR-Gene wurden aus pTB344 auf einem EcoRI-PstI-Fragment isoliert. Der Vektor pUC8 wurde durch Nachbehandlung mit SspI zerstört, da er die gleiche Selektionsdeterminante (Ampicillin-Resistenz) wie pCH19 trägt. Die pCH19-Plasmid-DNA wurde mit EcoRI und PstI gespalten und dann mit dem 2.45 kb großen Fragment ligiert, das die tet-Gene trägt. Dieses wurde zur Transformation von E. coli C600 verwendet, wobei die Kultur unter Selektionsbedingungen für Tetracyclin-resistente Kolonien ausplattiert wurde. Die Insertion der tet-Gene wurde entwickelt, um den größten Teil der bla-Gene in pCH19 zu ersetzen, das folglich seine Ampicillin-Resistenzdeterminante verlieren sollte. Der Vertust der Ampicilin-Resistenz aus den Transformanten wurde bestätigt. Einige wenige Clone wurden dann zur Isolierung der Plasmid-DNA verwendet, die einer Restriktionsanalyse unterzogen wurde. Diese bestätigte, daß das konstruierte Plasmid die gewünschte Struktur aufwies. Es wurde als pTB351 bezeichnet.

iv) Insertion der cer-Sequenz

Das natürlich vorkommende Plasmid CoIEI wird in E. coli sehr stabil beibehalten, während seine Derivate pBR322 und pAT153 nicht stabil beibehalten werden. Summers und Sherratt (Cell 36 (1984), 1097-1103) zeigten, daß dies darauf zurückzuführen ist, daß die Derivate nicht die als cer bezeichnete kurze (283 bp) Sequenz enthalten, die im Elternplasmid vorliegt. Diese Sequenz enthält ein ortsspezifisches Plasmid-Multimer-Resolutionssystem, das die Anreicherung von durch homologe Rekombination erzeugten Plasmid-Multimeren verhindert. Solche Multimere haben eine nachteilige Wirkung auf den Verteilungsprozeß, der normalerweise die stabile Vererbung der Tochterplasmide während der bakteriellen Zellteilung sicherstellt.
Die cer-Sequenz (Summers D. et al., MGG 201 (1985), 334-338) wurde aus Plasmid pKS492 (bereitgestellt von D. Sherratt) als 289 bp großes Fragment durch Spalten mit BamHI und TaqI isoliert. Das Plasmid pTB351 wurde als DNA-Molekül aus einem dam- Stamm von E. coli isoliert, um zu verhindern, daß seine ClaI-Stelle durch das dam&spplus;-Methylierungssystem blockiert wird. Diese DNA wurde mit BamHI und ClaI gespalten (beide Stellen wurden in das synthetische Oligonucleotid für diese Clonierung eingeführt). Das cer-Fragment wurde mit dem gespaltenen Vektor ligiert und dann zur Transformation von E. coli C600 verwendet, wobei die Selektion hinsichtlich einer Tetracyclin-Resistenz erfolgte. Die Transformanten-Kolonien wurden einer Clon-Analyse mittels Aval-Restriktion und Gelelektrophorese unterworfen. Das Vorhandensein einer zusätzlichen DNA-Bande von etwa 300 bp zeigte den Erwerb des cer-Fragments an. Weitere Restriktionsanalysen wurde durchgeführt, um zu bestätigen, daß die so erhaltenen Plasmide die richtige Struktur aufwiesen. Eines von diesen wurde als pTB357 (Fig. 5) und auch als pLB004 bezeichnet.

b) Plasmid pCH101

Plasmid pCH101 entspricht pICI0020 (vgl. Beispiel 1(c)), außer daß das EcoRI- SalI-Fragment (vgl. Fig. 1) durch ein Fragment ersetzt ist, das die SEQ ID No. 53 (vgl. auch Fig. 6) und die Interferon α&sub2;-Gensequenz aufweist, wie von Edge M. D. et al., Nucleic Acids Research, Bd. 11 (1983), 6419-6435, beschrieben. In dieser Hinsicht geht das 3'-terminale ATG-Codon von SEQ ID No. 53 dem TGT-Codon unmittelbar voraus, das in der Interferon α&sub2;-Sequenz der vorstehend erwähnten Literaturstelle von Edge et al., Nucleic Acids Research. Cystein (Aminosäure 1) codiert. Die 5'-Nucleotidsequenz GATCCATG und die komplementäre 3'-Nucleotidsequenz GTAC werden somit von der Nucleotidsequenz der zuvor erwähnten Literaturstelle ausgelassen.
c) Insertion einer Expressionskassette in pTB357
Eine Expressionskassette, die den trp-Promotor, eine Ribosomen-Bindungsstelle und das Interferon α&sub2;-Gen aufweist, wurde aus Plasmid pCH101 (vgl. (b) vorstehend) auf einem EcoRI-SphI-Restriktionsfragment isoliert. Dieses wurde in den Produktionsvektor (pTB357) (vgl. (a) vorstehend) ligiert, der in ähnlicher Weise mit EcoRI und SphI gespalten worden war. Diese DNA wurde zur Transformation einer kompetenten Kultur von E. coli C600 verwendet, und Tetracyclin-resistente Kolonien wurden isoliert. Einige wenige von diesen wurden mittels DNA-Clon-Analyse hinsichtlich des Erwerbs der SstI-Restriktionsstelle getestet, die von der Expressionskassette getragen wird. In dieser Hinsicht positive Clone wurden durch eine Restriktionskartierung weiterhin getestet, um zu überprüfen, ob das erwartete Konstrukt fehlerfrei war. Sie wurden auch hinsichtlich der verliehenen Fähigkeit zur Produktion des Interferon α&sub2;-Proteins getestet, wie in einem mit Coomassie-Blau gefärbten Polyacrylamid-SDS-Gel analysiert wurde. Ein solcher bestätigter Clon wurde als pLB005 bezeichnet.
d) Insertion des T4-Transkriptionsterminators in pTB244
Die T4-Transkriptionsterminatorsequenz in Form des SalI-HindIII-Fragments (67 Basenpaare lang) (vgl. SEQ ID No. 51 und Fig. 4a) wurde in die Multiclonierungsstelle des Vektor-Zwischenprodukts pTB244 (beschrieben in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 237,269) zwischen dessen SalI- und Hindlil-Stellen insertiert. Zur Bestätigung der Struk tur dieses Konstruktes (pTB244.T4-ter) wurde eine Clon-Analyse durchgeführt. Aus diesem Vektor wurde dann ein SstI-SphI-Fragment isoliert, das den größten Teil der Multiclonierungsstelle und den T4-Terminator enthielt. Dieses wurde in pLB005 insertiert, das in ähnlicher Weise mit SstI und Sphl gespalten worden war, wodurch das Interferon α&sub2;-Gen ersetzt, aber eine Expressionskassette hinterlassen wurde, die den trp-Promotor, die Multiclonierungsstelle und den T4-Terminatar aufwies. Dieses Konstrukt wurde mittels Clon-Analyse bestätigt und das Plasmid als pLBO 13 bezeichnet.

e) Substitution der Multiclonierungsstelle

Die Multiclonierungsstelle in pLB013 ist für diesen Vektor unter mehreren Gesichtspunkten ungeeignet: die SalI-, BamHI- und Smal-Stellen sind nicht einzigartig, sondern liegen irgendwo auf dem Plasmid. Dieses Fragment wurde deshalb durch Spalten mit SstI und XbaI (beide einzigartig) ausgeschnitten, und synthetische Oligonucleotide mit der Sequenz SEQ ID No. 54:
wurden an seiner Stelle insertiert. Die Clone wurden hinsichtlich des Erwerbs der neuen Restriktionsstellen analysiert und dann durch Sequenzierung bestätigt. Ein solches Plasmid wurde als pLB014 bezeichnet. Die auf diese Weise insertierten neuen Clonierungsstellen sind: NdeI, KpnI, BglII, XhoI und ScaI, wobei ihnen die vorherigen XbaI- und SalI-Stellen folgen.

f) Weitere Modifizierung

Es wurde festgestellt, daß die benachbarten SstI- und NdeI-Stellen in pLB014 durch diese beiden Restriktionsenzyme weder gleichzeitig noch aufeinanderfolgend gespalten werden konnten, wahrscheinlich aufgrund ihrer unmittelbaren Nachbarschaft. Deshalb wurde eine zusätzliche Sequenz dazwischen insertiert. Dies wurde durch die Spaltung von pLB014 mit SstI und KpnI und die anschließende Insertion des synthetischen Oligonucleotids der SEQ ID No. 55 erreicht
Die Clone wurden hinsichtlich des Erwerbs einer zusätzlichen PvuII- oder PstI- Stelle untersucht und dann durch Sequenzieren bestätigt. Ein solches Plasmid wurde als pLB015 ( = pICI0080) (vgl. Fig. 7) bezeichnet. Dieses Plasmid wird anders als pLB014 von SstI und NdeI wirksam gespalten. Auf diese Weise wird eine Stelle zur Insertion einer Vielzahl von Ribosomen-Bindungsstellensequenzen bereitgestellt, die im Hinblick auf den stromaufwärts angeordneten trp-Promotor und der NdeI-Stelle, die konstruiert wurde, um das ATG-Startcodon des zu exprimierenden Gens bereitzustellen, richtig positioniert sind.

Referenzbeispiel 7

Konstruktion von Plasmid pICI1295 (auch als pCG300 bezeichnet)

a) Herstellung von pCG54 aus pICI1079
pICI1079 ist ein Ampicillin-resistentes, von pAT1 53 stammendes Plasmid, das die folgenden Elemente zwischen den EcoRI- und StyI-Restriktionsstellen einschließt: (i) CI857 aus dem λ-Phagen;
(ii) einen λPL-Promotor;
(iii) eine synthetische Ribosomen-Bindungsstelle;
(iv) eine synthetische Interferon α&sub2;-Gensequenz; und
(v) eine vom T4-Phagen stammende synthetische Transkriptionsterminatorsequenz zwischen den SalI- und StyI-Restriktionsstellen. Die DNA-Sequenz dieses Transkriptionsterminators wird in Fig. 4 und SEQ ID No. 56 gezeigt.
pICI1079 wird in Fig. 8 veranschaulicht pICI1079 wurde gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt bei der National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Schottland, GB (NCIMB Nr. 40370, Datum der Hinterlegung: 19. Februar 1991).
pCG54 wurde konstruiert, um einen Expressionsvektor zur Verfügung zu stellen, der die gleichen Promotor-, Ribosomen-Bindungsstellen- und Transkriptionsterminatorsequenzen wie vorstehend enthält, d. h.; λPL, RBS7 und T4, dem jedoch eine Gensequenz fehlt, die die Herstellung eines spezifischen Proteins codiert. Ein solches Konstrukt würde die Voraussetzung für einen Basisvektor zur Expression liefern, der essentielle Elemente enthält, die die Transkription und Translation zur Herstellung eines beliebigen Proteins von Interesse erlauben, das in diesen Vektor durch folgende Clonierungsereignisse eingeführt werden kann.
Die Konstruktion des Vektors wurde durch die Spaltung von pICI1079 mit Restriktionsendonucleasen an seinen jeweiligen EcoRI- und SalI-Stellen eingeleitet. Dieser Spaltungsschritt setzt ein Vektorfragment frei, das das pICI1079-Gerüst komplett zusammen mit Genen zur Plasmidreplikation und antibiotischen Resistenzfunktionen zuzüglich der T4- Transkriptionsterminatorsequenz enthält. Das Fragment wurde durch Agarosegel-Reinigungsschritte unter Verwendung von Geneclean für die letzte Reinigung des DNA-Fragments isoliert.
In dieses Vektorfragment wurde ein zweites kleineres DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 1,2 kb eingeführt. Dieses zweite Fragment kann zum Beispiel durch DNA- Synthese oder durch ortsspezifische oder PCR-Mutagenese des kleineren EcoRI-SalI- Restriktionsfragments hergestellt werden, das gemäß der vorstehenden Beschreibung aus pICI1079 erhalten wurde. Dieses zweite Fragment enthielt genau die gleichen Promotor- und Ribosomen-Bindungsstellensequenzen, die ursprünglich in pICI1079 vorlagen, und wies an seinen 5'- bzw. 3'-Enden zusätzlich EcoRI- und SalI-Stellen auf, so daß es kompatible Enden zur Ligierung des pICI1079-Fragments bereitstellt. Eine Ligierungsreaktion in Gegenwart des Gibco-BRL-Enzyms T4-DNA-Ligase und seines entsprechenden Puffers führte zur Herstellung des Konstrukts pCG54.
Zuerst wurden Clone isoliert, die dieses Konstrukt enthielten, daran schloß sich die Transformation eines Aliquots des Ligierungsreaktionsgemisches in kompetente E. coli-Zellen des Stamms HB101 an.
Das gewonnene Konstrukt pCG54 wies eine Größe von 3,682 kb auf und enthielt wesentliche Merkmale, wie in der in Fig. 9 dargestellten Karte beschrieben ist.
b) Herstellung von pCG61 aus pCG54 (auch als pICI54 bezeichnet)
Synthetische Oligonucleotidsequenzen wurden derart konstruiert, daß sie sowohl die natürliche Sequenz für den T7A3-Promotor als auch eine Sequenz enthielten, die einen wirksamen Translations-Initiationsbereich bereitstellten, um die fehlerfreie Prozessierung einer Polypeptid-Gensequenz zu ermöglichen, die benachbart zu ihm cloniert ist. Eine ge eignete Kandidatensequenz für diesen letzteren Bereich wurde als RBS1 bezeichnet, die trp- Ribosomen-Bindungsstellensequenz. Deshalb wurden zwei komplementäre Oligonucleotide synthetisiert, die als SEQ ID No. 57 und SEQ ID No. 58 bezeichnet wurden, um einen doppelsträngigen DNA-Linker herzustellen, der die T7A3-Promotor- und RBS 1-Sequenzen umfaßt.
Die Oligonucleotide wurden mittels Standardprotokollen unter Verwendung eines AB1-Gensynthetisiergeräts als 84-Mere hergestellt. So wurden derart konstruiert, daß die synthetischen Fragmente in der doppelsträngigen Form die Restriktionsendonucleasestellen EcoRI und KpnI an den 5'- bzw. 3'-Enden aufweisen. Auf Grund ihrer Länge konnten die Oligomere nicht durch HPLC gereinigt werden, und so wurde die Reinigung mittels Acrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung eines 10% Acrylamid: 7 M Harnstoff enthaltenden Gels durchgeführt.
Vor der Reinigung wurden die Oligomere zuerst in einem nach Größe auf trennenden Gel überprüft, um sicherzustellen, daß nicht nur sie die richtige Größe aufweisen, sondern daß auch die hergestellten Proben überwiegend die erforderlichen Oligomere und nicht einen hohen verunreinigenden Anteil an kleineren sekundären Oligonucleotiden enthalten, die als Nebenprodukte bei der Synthese entstehen.
Die Acrylamidgele wurden durch Standardverfahren unter Verwendung von Ammoniumpersulfat und N. N,N',N'-Tetramethylethylendiamin als Katalysatoren zur Gelpolymerisierung hergestellt.
Die Auftrennung nach Größe der Oligonucleotide erforderte, daß sie nach der Elektrophorese sichtbar gemacht werden konnten. Es war deshalb erforderlich, die Proben unter Verwendung von ³²P radioaktiv zu markieren. Dies ermöglichte die Abschätzung der Probenqualität nach der Elektrophorese durch Autoradiographie.
Die Oligonucleotidproben wurden in roher Form unphosphoryliert verwendet. Von diesem Umstand wurde zur Zwecke der radioaktiven Markierung insofern Gebrauch gemacht, als die Proben an den 5'-Enden durch Phosphorylierung unter Verwendung des Enzyms T4-Polynucleotidkinase "heiß" markiert werden konnten.
Die Oligomere wurden durch die Synthese in unphosphorylierter Form bereitgestellt, und so wurde nach der Reinigung jedes Oligomer einzeln einer Phosphorylierungsreaktion unterworfen, bei der ATP zur Phosphoylierung des 5'-Endes eines jeden Moleküls in Gegenwart von T4-Polynucleotidkinase verwendet wurde (vgl. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". 2. Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis, 5.68-5.71). Nach der Phosphorylierung wurden die zwei komplementären Oligonucleotide zur Bildung eines doppelsträngigen DNA-Duplexmoleküls aneinandergelagert, das den T7A3-Promotor und die RBSI-Sequenz enthielt.
Das Vektormolekül pCG54 wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und KpnI gespalten. Bei der Restriktionsspaltung werden ein 2, 3 kb großes Vektorfragment und ein den λPL-Promotor und die RBS1-Sequenz enthaltendes, 1,1 kb großes Fragment erzeugt. Dieser Clonierungsschritt wird vorgesehen, um die λPL-RBS1-Sequenz durch das synthetische EcoRl-KpnI-Fragment zu ersetzen, das die T7A3-RBS1-Sequenz umfaßt. Das aus der Spaltung von pCG54 erhaltene 2,3 kb große Vektorfragment wurde mittels des üblichen Protokolls unter Anwendung einer Agarose-Gelelektrophorese und der Geneclean-Methodik zur Entfernung von DNA aus Agarosefragmenten gereinigt.
Das 84 bp große synthetische EcoRI-KpnI-Fragment wurde in das zuvor hergestellte Vektormolekül ligiert, und die ligierte DNA wurde zur Transformation von E. coli HB101-Zellen verwendet. Die Selektion hinsichtlich positiver rekombinanter Clone erfolgte über eine Ampicillin-Resistenz. Nach der Transformation wurde eine Anzahl von das rekombinante Plasmid enthaltenden Kolonien für Durchmusterungszwecke ausgewählt.
Das während der Clonierung in den Vektor eingeführte synthetische Fragment wies eine solche Größe (84-Mer) auf, daß die Restriktionsanalyse von rekombinanten DNA-Proben als einfaches Durchmusterungsverfahren ungeeignet war. Insertionen mit einer derartig kleinen Größe sind bei einer Agarose-Gelelektrophorese nicht ohne weiteres sichtbar. Das Fragment selbst enthält keine interne Restriktionsendonuclease-Spaltstelle, die seine Anwesenheit anzeigen könnte. Die erste Durchmusterung der rekombinanten Clone erfolgte deshalb mit dem Kolonie-Hybridisierungsverfahren (vgl. Grunstein und Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975), 3961). Nitrocellulosefilter, die immobilisierte Plasmid-DNA aus rekombinanten Clonen enthielten, wurden mit einer Sonde hybridisiert, die durch zufällige radioaktive Markierung der synthetischen aneinandergelagerten Oligonucleotide SEQ ID No. 57 und SEQ ID No. 58 hergestellt wurde. Die DNA wurde unter Verwendung von α³²P dCTP und durch eine 2-stündige Inkubation mit der Klenow-Polymerase bei 37ºC markiert. Rekombinante Kolonien, die eine positive Hybridisierungsreaktion erzeugten, wurden zur Präparation von Plasmid-DNA ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurden in jedem Fall durch ein Verfahren in einem verhältnismäßig großen Maßstab präpariert, das eine CsCI-Gradientendichtezentrifugation umfaßte, um die Reinheit sicherzustellen, vgl. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". 2. Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), 1.42-1,52. Die DNA-Präparation mittels eines solchen Verfahrens garantiert ein hochwertiges Material, das zur Verwendung bei den folgenden Manipulationen durch Clonierung und zur Sequenzanalyse geeignet ist.
Die gesamte aus den rekombinanten Clonen isolierte Plasmid-DNA wurde bei einer zweiten Durchmusterung mittels Sequenzanalyse eingeschlossen, um sicherzustellen, daß die Oligonucleotidsequenz an den Verbindungsstellen der Clonierung und das T7A3-RBS1-Fragment selbst absolut fehlerfrei waren. Das verwendete Sequenzierungsprotokoll entsprach dem der Sequenase und der ausgewählte verwendete Sequenzierungs-Primer war zum Beispiel pBR322 UP (universeller pBR322-Primer). Die Sequenzierung wurde unter Anwendung des Didesoxy-Kettenterminations-Sequenzierungsverfahrens von Sanger durchgeführt. Clone mit der richtigen Sequenz wurden als das neue Expressionskonstrukt pCG61 bezeichnet und enthielten den T7A3-Promotor, die RBS1-Sequenz und die T4-Terminatorsequenz (vgl. Fig. 10).
c) Herstellung von pCG300 (auch als pICI1295 bezeichnet) aus pCG61
Die bei der Konstruktion des G-CSF-Analogons [Ser17,27]hu G-CSF beteiligte Sequenz und die beteiligten Syntheseschritte entsprechen den in Beispiel 1 beschriebenen (vgl. Fig. 3). Diese G-CSF-Analogon-Sequenz wurde aus einem Konstrukt isoliert, in dem das Gen in das Plasmid pSTPI eingebaut worden war, wobei pICI1107 erhalten wurde (vgl. Beispiel 2). pICI1107 wurde mit ScaI gespalten, und das große Fragment wurde nach einer Agarose-Gelelektrophorese und Geneclean-Reinigung isoliert. Dieses Fragment wurde dann mit der Restriktionsendonuclease SalI gespalten, um ein [Ser17,27]hu G-CSF-Gen in einem ScaI-SalI-Restriktionsfragment zu erzeugen, das zur Clonierung in pCG61 geeignet war (vgl. Fig. 10).
Nach der Restriktion mit SalI wurde das erforderliche Fragment unter Anwendung von Agarosegel-Reinigungsverfahren noch einmal isoliert.
Das Vektormolekül pCG6l wurde mit dem Restriktionsenzym KpnI gespalten. Die Spaltung mit diesem Enzym erzeugt ein überhängendes 3'-Ende, das dann unter Verwendung des Enzyms T4-Polymerase in ein glattes Ende überführt wurde, vgl. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis, 5.44-5.47. Die T4-Polymeraseaktivität wurde durch eine 30-minütige Inkubation bei 70ºC durch Wärme inaktiviert und die DNA durch eine Ethanolfällung gewonnen. Das Pellet wurde in sterilem destilliertem Wasser gelöst und die solubilisierte DNA mit SalI gespalten. Das (am KpnI-Ende nun mit einem glatten Ende versehene) KpnI-SalI-Vektorfragment wurde mittels Ethanolfällung, gefolgt von einer Agarose-Gelelektrophorese und Reinigungsverfahren gewonnen.
Das ScaI-Sall-Fragment von [Ser17,27]hu G-CSF wurde dann in den mit glatten Enden versehenen Kpnl-SalI-Vektor ligiert. Die ligierte DNA wurde in den E. coli-Stamm HB101 transformiert. Die Selektion der rekombinanten Clone erfolgte hinsichtlich einer Ampicillin-Resistenz.
Die erste Durchmusterung der potentiellen rekombinanten Clone erfolgte durch Hybridisierung. Eine radioaktiv markierte Sonde wurde durch die zufällige Markierung eines EcoRI-SalI-Fragments (enthaltend die [Ser17,27]hu G-CSF-Gensequenz) aus dem Plasmid pICI1107 hergestellt. Diese wurde bei der Hybridisierung von Kolonien verwendet, deren DNA auf der Oberfläche von Nitrocellulosefiltern immobilisiert worden war. Anschließend wurde die Plasmid-DNA aus 24 Clonen präpariert, die bei dieser Durchmusterung hybridisiert worden waren. Alle DNA-Präparationen wurden mit dem schnellen Minipräparations- Verfahren durchgeführt, vgl. Birriboim und Doly, Nucleic Acids Research 7 (1979), 1513. Diese rekombinanten DNA-Präparationen wurden einer zweiten Durchmusterung mittels Restriktionsanalyse unterworfen. Die Linearisierung der DNA mit BamHI, deren Spaltstelle innerhalb der Expressionskassette einzigartig ist, deutet auf das Vorhandensein der [Ser17,27]hu G-CSF-Gensequenz hin.
Eine Sequenzanalyse wurde durchgeführt, um die Anwesenheit des [Ser17,27]hu G-CSF-Gens zu bestätigen und um die Basensequenz an den Verbindungsstellen der Clonierung sowie im ganzen [Ser17,27]hu G-CSF-Gen auf ihre Richtigkeit hin zu überprüfen. Für diesen Zweck wurden Plasmid-DNA-Proben im uroßen Maßstab aus 16 rekombinanten Clonen unter Anwendung des CsCI-Gradienten-Dichtezentrifugationsverfahrens hergestellt, um die Reinheit zu garantieren. Die Sequenzierungsschritte wurden gemäß dem Sequenzierungs protokoll durchgeführt und der ausgewählte Sequenzierungs-Primer war der universelle pBR322-Primer (EcoRI). Zwei der rekombinanten Clone wiesen am ScaI-Ende des [Ser17,27]hu G-CSF-Fragments und in der ganzen G-CSF-Peptidsequenz selbst die richtige Sequenz auf. Die Clone wurden als Expressionskonstrukt pCG300 (vgl. Figur. 12) identifiziert.

Claims

1. Derivat eines natürlich vorkommenden G-CSFs (der natürlich vorkommende G-CSF weist eine Sequenz auf, wie in SEQ ID No. 46 gezeigt), das mindestens eine der biologischen Eigenschaften eines natürlich vorkommenden G-CSFs und eine Lösungsstabilität (bestimmt gemäß Referenzbeispiel 4) von mindestens 35% bei 5 mg/ml aufweist und bei dem mindestens Cys¹&sup7; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt) durch einen Ser¹&sup7; und Asp²&sup7; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt) durch einen Ser²&sup7;-Rest ersetzt ist.

2. Derivat nach Anspruch 1 mit mindestens einer weiteren Modifikation, die ausgewählt ist aus:

a) Leu¹&sup5; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch einen G1u¹&sup5;-Rest ersetzt ist;

b) Lys²³ der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch einen Arg²³-Rest ersetzt ist;

c) G1y²&sup6; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch einen Ala²&sup6;-Rest ersetzt ist;

d) G1y²&sup8; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch einen Ala²&sup8;-Rest ersetzt ist;

e) A1a³&sup0; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch einen Lys³&sup0;- oder Arg30-Rest ersetzt ist;

f) Lys³&sup4; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch einen Arg³&sup4;-Rest ersetzt ist;

g) Lys&sup4;&sup0; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch einen Arg&sup4;&sup0;-Rest ersetzt ist;

h) Pro44 der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt) das durch einen A1a44-Rest ersetzt ist;

i) Leu49 der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt) das durch einen Lys49-Rest ersetzt ist;

j) Gly&sup5;¹ der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch einen Ala&sup5;¹-Rest ersetzt ist;

k) Gly&sup5;&sup5; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt) das durch einen Ala&sup5;&sup5;-Rest ersetzt ist;

l) Trp&sup5;&sup8; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch einen Lys&sup5;&sup8;-Rest ersetzt ist;

m) Pro&sup6;&sup0; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch einen Ser&sup6;&sup0;-Rest ersetzt ist;

n) Pro&sup6;&sup5; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch einen Ser&sup6;&sup5;-Rest ersetzt ist;

o) Prolll der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch einen Glu¹¹¹-Rest ersetzt ist;

p) Thr¹¹&sup5; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch einen Ser¹¹&sup5;-Rest ersetzt ist;

q) Thr¹¹&sup6; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch einen Ser¹¹&sup6;-Rest ersetzt ist; und

r) Tyr165 der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch einen Arg¹&sup6;&sup5;-Rest ersetzt ist.

3. Derivat nach Anspruch 1 oder 2, wobei die weitere Modifikation mindestens eine der folgenden umfaßt:

a) Gln¹¹, pro60,65 der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), die durch Arg¹¹, Ser60,65 ersetzt sind;

b) Ala¹¹¹, Ihr115,116 der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), die durch Glu¹¹¹, Ser115,116 ersetzt sind;

c) Gln¹¹, Trp&sup5;&sup8;, Tyr¹&sup6;&sup5; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), die durch Arg11,165, Lys&sup5;&sup8; ersetzt sind;

d) Leu¹&sup5;, Gly²&sup6;,²&sup8;, Ala³&sup0; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), die durch Glu¹&sup5;, Ala²&sup6;,²&sup8;, Lys³&sup0; ersetzt sind; oder

e) Pro&sup4;&sup4;, Leu&sup4;&sup9;, Gly51,55, Trp&sup5;&sup8; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), die durch Lys49,58, Ala&sup4;&sup4;, 51, &sup5;&sup5; ersetzt sind;

f) Leu¹&sup5;, Gly26,28, Ala³&sup0; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), die durch Glu¹&sup5;, Ala26,28, Arg³&sup0; ersetzt sind; oder

g) Pro&sup6;&sup5; der nativen Sequenz (wie in Fig. 2 gezeigt), das durch Ser&sup6;&sup5; ersetzt ist.

4. Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ausgewählt aus

wobei das Derivat gegebenenfalls ein der Sequenz vorausgehendes Methionin aufweist.

5. Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das ausgewählt ist aus

6. Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das ausgewählt ist aus

7. DNA-Sequenz, die ein Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche codiert.

8. Rekombinanter Vektor, der eine DNA-Sequenz gemäß der Definition in Anspruch 7 enthält.

9. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Vektors gemäß der Definition in Anspruch 8, das die Insertion einer DNA-Sequenz gemäß der Definition in Anspruch 7 in einen Vektor umfaßt.

10. Prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Vektor gemäß der Definition in Anspruch 8 stabil transformiert oder transfiziert ist.

11. Verfahren zur Herstellung einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle gemäß der Definition in Anspruch 10, umfassend die Transformation oder Transfektion einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle mit einem rekombinanten Vektor gemäß der Definition in Anspruch 8 zum Erhalt eines stabil transformierten oder transfizierten prokaryontischen oder eukaryontischen Wirts.

12. Verfahren zur Herstellung eines Derivats eines natürlich vorkommenden G-CSFs gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend die Züchtung einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle gemäß der Definition in Anspruch 10 zum Erhalt des Derivats, wobei der natürlich vorkommende G-CSF die in SEQ ID No. 46 gezeigte Sequenz aufweist.

13. Arzneimittel, umfassend als Wirkstoff mindestens ein Derivat eines natürlich vorkommenden G-CSF gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 6 in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten, wobei der natürlich vorkommende G-CSF die in SEQ ID No. 46 gezeigte Sequenz aufweist.

14. Verfahren zur Extraktion eines Derivats gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 6 aus einem Einschlußkörper, umfassend 1) die Suspension des Einschlußkörpers in einem Detergens, 2) die Oxidation, 3) die Entfernung des Detergens und 4) die Aufbewahrung der nach der Entfernung des Detergens erhaltenen Lösung bei einer Temperatur von 30 bis 45ºC zur Ausfällung von verunreinigendem Bakterienprotein, Produktoligomeren und/oder Abbauprodukten, während das Derivat in Lösung in aktiver Form zurückbehalten wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das zu extrahierende Derivat eine Lösungsstabilität (bestimmt gemäß dem Referenzbeispiel 4) von mindestens 85% bei 10 mg/ml aufweist.